Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Bezkarmowe wyprowadzanie komórek progenitorowych grzebienia nerwowego z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

14K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51609

⸱

22 maja 2014

 ,  ,  , 
1Developmental Biology, Center for Stem Cell Biology, Sloan-Kettering Institute for Cancer Research, 2St. Giles Laboratory of Human Genetics of Infectious Diseases, The Rockefeller University

W tym artykule

Podsumowanie

Komórki grzebienia nerwowego (NC) pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) mają ogromny potencjał w modelowaniu rozwoju i chorób człowieka oraz w terapiach zastępczych komórek. W tym artykule przedstawiono bezżywieniową adaptację obecnie powszechnie stosowanego protokołu różnicowania in vitro do wyprowadzania komórek NC z hPSC.

Streszczenie

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) mają ogromny potencjał do badania rozwoju ludzkiego embrionalnego, do modelowania ludzkich chorób w naczyniu oraz jako źródło komórek do przeszczepów do zastosowań regeneracyjnych po chorobie lub wypadkach. Komórki grzebienia nerwowego (NC) są prekursorami wielu różnych dorosłych komórek somatycznych, takich jak komórki obwodowego układu nerwowego i gleju, melanocyty i komórki mezenchymalne. Są cennym źródłem komórek do badania aspektów rozwoju embrionalnego człowieka, w tym specyfikacji losu komórek i migracji. Dalsze różnicowanie komórek progenitorowych NC w terminalnie zróżnicowane typy komórek daje możliwość modelowania chorób człowieka in vitro, badania mechanizmów chorobowych i generowania komórek na potrzeby medycyny regeneracyjnej. W artykule przedstawiono adaptację obecnie dostępnego protokołu różnicowania in vitro do wyprowadzania komórek NC z hPSC. Ten nowy protokół wymaga 18 dni różnicowania, nie wymaga karmienia, jest łatwo skalowalny i wysoce odtwarzalny wśród linii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC), a także linii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC). Zarówno stare, jak i nowe protokoły dają komórki NC o jednakowej tożsamości.

Wprowadzenie

Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) i ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) wykazały ogromny potencjał, w szczególności do badania i przyszłego leczenia chorób ludzkich, dla których nie są dostępne ani dobre modele zwierzęce, ani pierwotne tkanki. Przykłady zastosowań technologii hESC/hiPSC są następujące: Komórki o szczególnym znaczeniu mogą być generowane z hESC/hiPSC dla medycyny regeneracyjnej w nieograniczonej ilości1. Komórki mogą być wytwarzane od pacjentów będących nosicielami określonej choroby i wykorzystywane do tworzenia modeli chorób in vitro 2,3. Takie modele chorób można następnie wykorzystać do badań przesiewowych leków na dużą skalę w poszukiwaniu nowych związków leczniczych4 , a także do testowania istniejących leków pod kątem skuteczności i toksyczności5 . Modele chorób in vitro mogą prowadzić do identyfikacji nowych mechanizmów chorobowych. W przypadku wszystkich zastosowań technologii hESC/iPSC ważna jest praca z konkretnymi, dobrze zdefiniowanymi typami komórek dotkniętych chorobą będącą przedmiotem zainteresowania. W związku z tym dostępność solidnych i powtarzalnych protokołów różnicowania in vitro ma kluczowe znaczenie dla wszystkich zastosowań technologii hESC/hiPSC. Pożądane są protokoły, które wykazują minimalną zmienność, nakład czasu, wysiłek, trudność i koszt, a także maksymalną odtwarzalność między liniami hESC/hiPSC i różnymi badaczami.

Komórki grzebienia nerwowego (NC) pojawiają się podczas neurulacji kręgowców między naskórkiem a nabłonkiem nerwowym. Namnażają się i migrują w znacznym stopniu w rozwijającym się zarodku i dają początek imponującej różnorodności typów komórek potomnych, w tym kości/chrząstek, szkieletu twarzoczaszki, nerwów czuciowych, komórek Schwanna, melanocytów, komórek mięśni gładkich, neuronów jelitowych, neuronów autonomicznych, komórek chromochłonnych, komórek przegrody serca, zębów i komórek gruczołowych nadnerczy/tarczycy6. Tak więc komórki NC są atrakcyjnym typem komórek dla pola komórek macierzystych i ważnymi dla modelowania różnych chorób, takich jak choroba Hirschsprunga7, rodzinna dysautonomia8, a także nowotwory, takie jak nerwiak zarodkowy9. Ponadto dają one możliwość badania aspektów rozwoju embrionalnego człowieka in vitro.

Obecnie dostępny i szeroko stosowany protokół różnicowania in vitro do wyprowadzania komórek NC z hESC10,11 wymaga do 35 dni różnicowania i obejmuje indukcję neuronalną na komórkach zrębowych, takich jak komórki MS5, a zatem jest przeprowadzany w słabo zdefiniowanych warunkach. Chociaż można go zwiększyć w celu wygenerowania dużych ilości komórek NC, na przykład wymaganych do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków4, jest to pracochłonne i kosztowne. Ponadto wiąże się z ręcznym pasażowaniem rozet nerwowych, które mogą być trudne do odtworzenia, a zatem podlegają ogólnej zmienności, w szczególności gdy są stosowane do wielu różnych linii hESC lub hiPSC. Tutaj pokazano stopniowe wyprowadzanie komórek NC w 18-dniowym protokole, który jest wolny od komórek zasilających. Ta metoda jest krótsza i bardziej zdefiniowana niż obecnie używany protokół. Ponadto jest bardzo wytrzymały w generowaniu komórek NC wśród różnych linii hiPSC. Co ważne, wykazano, że komórki NC uzyskane przez oba protokoły wyłaniają się na granicy rozet nerwowych (zwanych dalej rozetami-NC lub R-NC). Komórki uzyskane przy użyciu jednego z dwóch protokołów wyglądają morfologicznie identycznie, wyrażają te same markery NC i grupują się razem w analizie mikromacierzy. Komórki NC uzyskane przy użyciu nowego protokołu (R-NC) są funkcjonalne, podobnie jak komórki NC uzyskane przy użyciu starego protokołu (MS5-R-NC), dzięki czemu mogą migrować i dalej różnicować się w neurony. W związku z tym ogniwa mogą być używane jednocześnie z ogniwami MS5-R-NC. Protokół komórkowy R-NC do wyprowadzania komórek NC z hESC/iPSC będzie przydatny we wszystkich zastosowaniach technologii hESC/iPSC obejmujących linię NC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie pożywek hodowlanych, panierowanych naczyń i utrzymanie hPSC

1.1 Przygotowanie mediów

Uwaga: Przefiltruj wszystkie media do sterylizacji i przechowuj w temperaturze 4 °C w ciemności przez okres do 2 tygodni. Nazwy odczynników, numery firmowe i katalogowe są wymienione w Tabeli materiałów.

  1. DMEM/10%FBS: Połącz 885 ml DMEM, 100 ml FBS, 10 ml Pen/Strep i 5 ml L-glutaminy.
  2. HES-medium: Połącz 800 ml DMEM/F12, 200 ml KSR, 5 ml L-glutaminy, 5 ml Pen/Strep, 10 ml roztworu minimum aminokwasów egzogennych MEM, 1 ml β-merkaptoetanolu. Dodać 10 ng/ml FGF-2 po przefiltrowaniu pożywki.
    UWAGA: β-merkaptoetanol jest toksyczny, należy unikać wdychania, spożycia i kontaktu ze skórą.
  3. Pożywka różnicująca KSR: Połącz 820 ml Knockout DMEM, 150 ml KSR, 10 ml L-glutaminy, 10 ml Pen/Strep, 10 ml roztworu minimalnych aminokwasów egzogennych MEM i 1 ml β-merkaptoetanolu.
  4. Pożywka różnicująca N2: Rozpuścić 12 g proszku DMEM/F12 w 980 ml dH2O, dodać 1,55 g glukozy, 2 g wodorowęglanu sodu i 100 mg ludzkiego transferyny APO. Zmieszać 2 ml dH2O z 25 mg insuliny ludzkiej i 40 μl 1 N NaOH, dodać rozpuszczony roztwór do pożywki. Dodać 100 mM dichlorowodorku putrescyny, 0,5 mM selenitu, 1 mM progesteronu i zwiększyć objętość do 1 l za pomocą dH2O.

1.2 Powlekanie naczyń hodowlanych

  1. Otoczka matrigelu: Rozmrozić 1 ml zamrożonej porcji matrigelu, pipetując 19 ml DMEM/F12 na podwielokrotność, aż się rozpuści. Usuń grudki, przepuszczając je przez sitko o wielkości 40 μm i umieść na talerzu naczynie o pojemności 8 ml/10 cm. Inkubować szalki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Odessać matrycę bezpośrednio przed posiewem komórek.
    Uwaga: Pracuj szybko z matrigelem, ponieważ może się zbrylać w temperaturach powyżej 4 °C.
  2. Powłoka PO/Lam/FN: Dodać 10 ml 1x PBS zawierającego 15 μg/ml bromowodorku Poly-L Ornithin do 10 cm naczynia. Inkubować naczynie przez noc w temperaturze 37 °C. Umyć płytki 1x PBS raz i dodać 10 ml/10 cm naczynie z 1x PBS zawierającym 2 μg/ml mysią Laminin-I i 2 μg/ml fibronektyny. Inkubować naczynia przez noc w temperaturze 37 °C. Przed posiewem komórek należy całkowicie usunąć roztwór i pozostawić płytki do całkowitego wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 15-20 minut, stawiając je na ścianie kaptura do hodowli tkankowych bez zakładanej pokrywy.
    Uwaga: Naczynia są całkowicie suche i gotowe do posiewu komórkowego, gdy na powierzchni można zobaczyć struktury krystaliczne (widoczne gołym okiem). W tym wysuszonym stanie płytki można przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka godzin. Dania PO/Lam/FN należy przygotować 2 dni wcześniej. W nagłych przypadkach Lam/FN można inkubować tylko przez 2-4 godziny. Może to jednak grozić nieoptymalnymi wynikami różnicowania/przeżycia.

1.3 Utrzymanie komórek hPSC

Uwaga: hPSC są utrzymywane na 0,1% żelatyny i mitotycznie inaktywowanych mysich fibroblastach embrionalnych (MEF) w pożywce HES uzupełnionej 10 ng/ml FGF-2, jak opisano wcześniej 10,12. Komórki należy dzielić co 6-8 dni.

  1. Posmaruj 10 cm naczynie 8 ml 0,1% żelatyny (w 1x PBS bez magnezu i wapnia) w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  2. Zamrożone MEF-y należy szybko rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Dodaj 1 milion MEF do 10 ml DMEM/10% FBS.
  3. Odessać żelatynę i ułożyć komórki na płytce. Inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 6 godzin.
  4. Odessać DMEM/10% FBS z przygotowanej płytki MEF, przemyć płytkę 1x PBS raz i dodać 10 ml pożywki HES uzupełnionej 10 μM dichlorowodorkiem Y-27632. Pozostawić podłoże do ogrzania w temperaturze 37 °C przez 20 minut.
    Uwaga: Do ręcznego rozdzielania hPSC stosuje się okap z przepływem laminarnym z wbudowanym mikroskopem. Jednak komórki mogą być pasażowane przy użyciu odpowiednich metod alternatywnych.
  5. Pod kapturem z przepływem laminarnym z wbudowanym mikroskopem odłącz oddzielne kolonie za pomocą podnośnika komórkowego i pozwól im unosić się na wodzie.
  6. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml odessać pływające kolonie i przesłać je na świeżą, ciepłą płytkę MEF. Przenieś około jednej czwartej komórek do nowego naczynia. Inkubować w temperaturze 37 °C.
  7. Codziennie karmić komórki świeżą pożywką HES.

2. Posiewanie hPSC w celu różnicowania

Uwaga: hPSC powinny być dzielone lub powlekane w celu rozróżnienia, gdy kolonie są duże, ale nadal mają ostre krawędzie z jak najmniej różnicującymi komórkami na ich granicach (patrz Rysunek 1B). Gdy komórki są utrzymywane za pomocą ręcznego pasażu, kolonie powinny być wystarczająco duże, aby były łatwo widoczne gołym okiem. Aby uzyskać właściwe wyczucie tego punktu czasowego, można utrzymywać oddzielną szalkę hPSC przez dwa tygodnie bez pasażowania i obserwować, jak komórki osiągają i mijają idealny punkt czasowy do ich pasażowania/różnicowania.

  1. Przygotuj 10 cm naczynia z matrigelem na 1 godzinę przed rozpoczęciem różnicowania. Udane powlekanie matrigelem można zweryfikować przy 4-krotnym powiększeniu.
  2. Gdy hPSC są gotowe do podziału, odessać pożywkę i dodać 4 ml 0,05% trypsyny-EDTA do komórek.
  3. Potrząsaj naczyniem poziomo przez 2 minuty energicznie, aż będzie można zobaczyć MEF-y jako pojedyncze komórki unoszące się z płytki pod mikroskopem. Kolonie hPSC pozostają połączone jako kolonie.
  4. Natychmiast i dokładnie odessać trypsynę i odstawić płytkę w temperaturze RT na 2-4 minuty.
  5. Dodać 2 ml pożywki HES do płytki i za pomocą pipety P1000 oderwać komórki.
    Uwaga: Jeśli komórek nie można łatwo podnieść z powierzchni, płytkę można inkubować pustą w temperaturze pokojowej przez kolejne 2-3 minuty.
  6. Przenieść komórki do 8 ml pożywki HES uzupełnionej 10 μM dichlorowodorkiem Y-27632.
  7. Odessać matrygel z wcześniej przygotowanego naczynia o średnicy 10 cm. Ułóż komórki w stosunku 1:1 lub 1:2 (na przykład: komórki z jednej 10-centymetrowej szalki są dzielone na dwie 10-centymetrowe szalki) na płytce matrycowej. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
    Uwaga: To posiewanie powinno dać około 100 000 komórek/cm2.

3. Indukcja różnicowania neuronalnego

Uwaga: Różnicowanie może być zainicjowane (dzień 0), gdy komórki są w 90-100% zlewające się (patrz Rysunek 1C), zwykle następnego dnia. Jeśli dokładna konfluencja nie została jeszcze osiągnięta, komórki mogą być codziennie karmione pożywką HES, aż będą gotowe do różnicowania. Alternatywnie można zwiększyć początkową liczbę posianych komórek.

  1. W dniach od 0 do 3 należy codziennie karmić komórki pożywką różnicującą KSR o pojemności 10 ml/10 cm, zawierającą 0,1 μM LDN193189 i 10 μM SB431542.
  2. W 4 i 5 dniu nakarm komórki 75% pożywką różnicującą KSR i 25% pożywką różnicującą N2, obie zawierające LDN193189 i SB431542.
  3. W dniu 6 i 7 nakarm komórki 50% pożywką różnicującą KSR i 50% pożywką różnicującą N2, obie zawierające LDN193189 i SB431542.
  4. W dniach 8 i 9 nakarm komórki 25% pożywką różnicującą KSR i 75% pożywką różnicującą N2, obie zawierające LDN193189 i SB431542.
  5. W dniu 9 i 10 przygotować szalki PO/Lam/FN, jak wskazano w ppkt 1.2.2, w celu ponownego posiewu komórek w dniu 11.
  6. W dniu 10 komórki żywią się pożywką różnicującą N2 zawierającą LDN193189 i SB431542.

4. Powtarzanie w kropelkach dla specyfikacji NC

  1. W dniu 11 odessać Lam/FN z wcześniej przygotowanych płytek i pozostawić je do całkowitego wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 20-30 minut, jak wyjaśniono w 1.2.2.
  2. Usunąć pożywkę z komórek różnicujących, przemyć komórki raz 1x PBS i dodać 8 ml akutazy/10 cm naczynia. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
  3. Za pomocą podnośnika komórek odłączyć komórki i ponownie zawiesić je w aptazie za pomocą pipety o pojemności 5 ml. Przenieść zawiesinę do probówki o pojemności 15 ml.
  4. Dodać 5 ml 1x PBS i wirować komórki przez 5 minut w 114 x g.
  5. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml 1x PBS. Aby zapewnić zawieszenie pojedynczych komórek, przefiltruj je przez sitko o wielkości 40 μm i policz komórki za pomocą hemocytometru lub równoważnej techniki.
  6. Odwiruj komórki i ponownie zawieś je w pożywce różnicującej N2 zawierającej 200 μM kwasu askorbinowego (AA), 20 ng/ml BDNF, 100 ng/ml FGF8, 20 ng/ml SHH, 10 μM Y-27632 dichlorowodorku w stężeniu 100 000-150 000 komórek/10 μl.
  7. Za pomocą pipetora wielokrotnego rozłóż 10 μl kropel blisko siebie, tak aby nie dotykały one wysuszonych szalek PO/Lam/FN o średnicy 15 cm.
    Uwaga: Z jednego 10-centymetrowego naczynia ze zróżnicowanymi komórkami zwykle powstaje około 2-3 razy 15 cm szalki lub około 100 x 10 μl kropel/15 cm szalka.
  8. Pozostawić kropelki w temperaturze pokojowej na 20-30 minut, następnie bardzo ostrożnie (aby nie zakłócić działania kropelek) dodać 30 ml N2/AA/BDNF/FGF8/SHH/Y i inkubować w temperaturze 37 °C.
  9. W 12 dniu ostrożnie nakarm komórki naczyniem o pojemności 20 ml/15 cm N2/AA/BDNF/FGF8/SHH.
  10. Od 14 do 17 dnia karmić komórki co drugi lub trzeci dzień N2/AA/BDNF/FGF8.
  11. W dniu 16 i 17 przygotuj płytki PO/Lam/FN do ponownego nawarstwienia komórek NC po sortowaniu FACS.

5. Sortowanie komórek NC aktywowane fluorescencją (FACS)

Uwaga: Przygotowanie komórek do FACS zajmuje około 2 godzin.

  1. W dniu 18 usuń pożywkę, umyj komórki raz 1x PBS w naczyniu i dodaj 12 ml akutazy. Inkubować komórki przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
  2. Za pomocą podnośnika komórkowego odłącz komórki od powierzchni i pozwól im unosić się na wodzie. Odpipetować komórki do zawiesiny za pomocą pipety o pojemności 5 ml, przenieść je do probówki o pojemności 50 ml i dodać 30 ml 1x PBS. Wiruj komórki przez 5 minut w 114 x g.
  3. Za pomocą pipety P1000 ponownie zawiesić komórki w 1 ml 2% FBS/HBSS (HBSS zawiera 15 mM HEPES). Dodać 19 ml 2% FBS/HBSS i przefiltrować komórki przez sitko o wielkości 40 μm, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. Inkubować komórki na lodzie przez 15 minut w celu zablokowania przeciwciał, a następnie policzyć je za pomocą hemocytometru.
  4. Odwiruj komórki i zawieś je ponownie w stężeniu 10 milionów komórek/ml w 2% FBS/HBSS.
  5. Odłóż 1 milion komórek na niebarwione, barwione pojedynczo (tylko HNK-1 i tylko p75) i tylko drugorzędowe przeciwciała (tylko APC i tylko 488) kontrole FACS.
  6. Dodać 5 μl HNK-1 i 5 μl pierwszorzędowego przeciwciała p75 na 10 milionów komórek w 1 ml zawiesiny do odpowiednich próbek i inkubować przez 20 minut na lodzie.
  7. Umyć komórki w 10 ml 1x PBS (odwirować 5 minut przy 114 x g) i ponownie zawiesić komórki w 1 ml 2% FBS/HBSS. Dodać 2 μl APC i 1 μl 488 przeciwciał drugorzędowych na 10 milionów komórek w 1 ml zawiesiny do odpowiednich próbek i inkubować przez 20 minut na lodzie w ciemności.
    Uwaga: APC i 488 są przeciwciałami drugorzędowymi stosowanymi tutaj odpowiednio do barwienia HNK-1 i p75.
  8. Umyj komórki w 10 ml 1x PBS dwukrotnie, ponownie zawieś 10 milionów komórek w 500 μl 2% FBS/HBSS zawierających DAPI (w stężeniu 0,5 ng/μl) lub alternatywnym odpowiednim barwniku żywych komórek, aby wykluczyć martwe komórki z analizy FACS.
  9. Przenieść próbki do odpowiednich probówek FACS.
  10. Przygotować probówki FACS z 0,5 ml 2% FBS/HBSS do pobierania komórek.
    Uwaga: Komórki i probówki zbiorcze są trzymane na lodzie w ciemności w czasie sortowania.
  11. Korzystanie z maszyny do sortowania komórek z laserami, które mogą wykrywać podwójnie dodatnie komórki DAPI, APC i 488 sortowane DAPI-/HNK-1+/P75+.
    Uwaga: Czas przygotowania i obchodzenia się z komórkami prowadzi do niewielkiego procentu śmierci komórek, DAPI barwi tylko martwe komórki, a tym samym pozwala na wykluczenie tych komórek z posortowanej populacji. Każda alternatywna żywa/martwa plama działa równie dobrze w tym celu. DAPI sam w sobie nie powoduje cytotoksyczności w populacji żywych komórek.

6. Ponowne sortowanie komórek, utrzymanie NC i rozbudowa

Uwaga: Z komórkami posortowanymi przez FACS należy obchodzić się ze szczególną ostrożnością, aby zapewnić optymalne przetrwanie. Trzymaj je na lodzie do momentu ponownego pokrycia. Nie należy ich ostro wirować ani pipetować. Komórki można ponownie zawiesić, przesuwając rurkę.

  1. Po posortowaniu FACS policz komórki NC, a następnie odwiruj je i ponownie zawieś w pożywce różnicującej N2 uzupełnionej 10 ng/ml FGF2, 20 ng/ml EGF i 10 μM dichlorowodorku Y-27632 w objętości odpowiedniej do ich ponownego naszczepienia na 30 000 komórek/10 μl kropel.
  2. Dokładnie osuszyć wcześniej przygotowane płytki PO/Lam/FN i podać około 50-70 kropelek na 10 cm naczynie. Odstaw naczynia na RT na 20-30 minut.
  3. Bardzo ostrożnie dodaj 20 ml/10 cm naczynie N2/FGF2/EGF/Y-27632, nie naruszając kropelek. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C.
  4. Karmić komórki co 2-3 dni N2/FGF2/EGF.
    Uwaga: Komórki NC są rozszerzane lub pasażowane mniej więcej co 4-5 dni lub gdy zaczynają gromadzić się w kropelkach.
  5. Aby przejść przez komórki NC, usuń pożywkę, umyj komórki raz 1x PBS i dodaj 8 ml akutazy/10 cm naczynia. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
  6. Odpipetować komórki z płytki za pomocą pipety o pojemności 5 ml i przenieść je do probówki o pojemności 15 ml. Dodać 6 ml 1x PBS.
  7. Wiruj komórki przez 5 minut w 114 x g.
  8. Ponownie zawiesić komórki w pożywce różnicującej N2 uzupełnionej 10 ng/ml FGF2, 20 ng/ml EGF i 10 μM dichlorowodorku Y-27632, aby uzyskać 20 000 komórek/10 μl kropli.
  9. Ponownie przesiać komórki w kropelkach o objętości 10 μl na wysuszonych płytkach PO/Lam/FN. Odstaw naczynia na RT na 20-30 minut.
  10. Ostrożnie dodaj 20 ml/10 cm naczynie N2/FGF2/EGF/Y-27632. Inkubować w temperaturze 37 °C.
    Uwaga: Komórki NC mogą być utrzymywane lub namnażane przez okres do 2 tygodni jako stosunkowo jednorodna populacja progenitorowa. Dłuższa hodowla może prowadzić do różnicowania się w różne typy komórek potomnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Dwiema najważniejszymi ulepszeniami protokołu R-NC w stosunku do protokołu MS5-R-NC 11 są zdefiniowane warunki różnicowania bez użycia komórek dokarmiających (feeder-free) oraz ogólne skrócenie czasu trwania procesu. Komórki dokarmiające MS5 13 to pochodne szpiku kostnego myszy komórki stromalne, o których wykazano, że wspierają różnicowanie neuronalne hESC 14. hESC hodowane na komórkach dokarmiających MS5 przy niskiej gęstości tworzą struktury nabłonkowe i rozety neuronalne 15...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W celu pomyślnego różnicowania komórek R-NC od hESC/hiPSC należy wziąć pod uwagę następujące kwestie. Bardzo ważne jest, aby przez cały czas pracować w sterylnych warunkach hodowli. W szczególności ważne jest regularne badanie kultur hPSC pod kątem zanieczyszczenia mykoplazmą, ponieważ zanieczyszczenie to utrudnia pomyślne różnicowanie, ale nie można go łatwo wykryć wizualnie w hodowlach hPSC. Różnicowanie R-NC należy rozpocząć przy 90-100% gęstości komórek; mniejsza gęstość komórek wpływa na przeżycie komórek i efektywn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają sprzecznych interesów do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez stypendium dla zaawansowanych badaczy ze Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki oraz przez granty z NYSTEM (C026446; C026447) oraz trójinstytucjonalna inicjatywa na rzecz komórek macierzystych (Starr Foundation).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEMGibco-Life Technologies11965-092
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Atlanta BiologicalsS11150
DMEM/F12Gibco-Life Technologies11330-032
Zamiennik serum do nokautuGibco-Life Technologies10828-028Partia powinna zostać przetestowana
L-glutaminaGibco-Life Technologies25030-081
Penicylina/StreptomycynaGibco-Life Technologies15140-122
MEM Roztwór minimalnych aminokwasów egzogennych Gibco-Life Technologies11140-050
β-Merkaptoetanol Gibco-Life Technologies21985-023toksyczny
rekombinowany ludzki FGF zasadowy (FGF2)R& D Systems233-FB-001MG/CF
Knockout DMEMGibco-Life Technologies10829-018
Proszek DMEM/F12 Invitrogen12500-096
GlukozaSigmaG7021
Wodorowęglan sodu SigmaS5761
APO Transferyna ludzkaSigmaT1147
Insulina ludzka SigmaI2643
Dichlorowodorek putriscynySigmaP5780
SelenitSigmaS5261
ProgesteronSigmaP8783
Matrigel MatrixBD Biosciences354234
Poly-L Bromowodorek ornitynySigmaP3655
Mysz Laminin-IR& Amp; D Systems3400-010-01
FibronektynaBD Biosciences356008
Dyspaza w zrównoważonym roztworze soli Hanka 5 U/mlTechnologie komórek macierzystych7013
Trypsyna-EDTA Gibco-Life Technologies25300-054
Y-27632 dichlorowodorekTocris-R& D Systems1254
LDN193189Stemgent04-0074
SB431542Tocris-R& D Systems1614
AccutaseInnowacyjne technologie komórkoweAT104
Kwas askorbinowy SigmaA4034
BDNFR& D Systems248-BD
FGF8R& D Systems423-F8
Mysz rekombinowany jeż soniczny (SHH)R& D Systems464SH
HBSSGibco-Life Technologies14170-112
HEPESGibco-Life Technologies1563-080
Rekombinowany ludzki EGFR& D Systems236EG
żelatyna (PBS bez Mg / Ca)w domu
Przeciwciała:
Anti HNK-1 / N-Cam (CD57) mIgMSigmaC6680-100TSTpartia powinna być testowana
Anty-p75 mIgG1 (receptor czynnika wzrostu nerwów)Zaawansowane systemy celowaniaAB-N07być testowana
APC anty-mIgMBD Parmingen550676partia powinna być testowana
AlexaFluor 488 kozia anty-mysie IgG1 przetestować partięInvitrogenA21121
Oct4 mIgG2b (stosowaną w rozcieńczeniu 1:200)przetestować partięSanta Cruzsc-5279
Materiał/Sprzęt:
Fibroblasty embrionalne myszy (7 milionów komórek / fiolkę)GlobalStemGSC-6105M
Naczynia do hodowli komórkowych: płytki 10 cm i 15 cm, probówki wirówkowe, probówki FACS,  pipety, pipety Wskazówki Szklany
hematocytometr
Wirówka
Inkubator do hodowli komórkowych (CO2, kontrolowany wilgotnością i temperaturą)
Kaptur z przepływem laminarnym do hodowli komórkowych z wbudowanym mikroskopem
Kapturbezpieczeństwa biologicznego do hodowli komórkowych
Maszyna do sortowania komórek, i.e. MoFlo
Mikroskop
1 ml TB strzykawka 27Gx1/2BD Biosciences309623
Podnośnik komórek PolietylenCorning Incorporated3008
partia powinna Należy Anti należy do hodowli komórkowychodwrócony

Bibliografia

  1. Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat Methods. 7, 25-27 (2010).
  2. Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
  3. Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
  4. Lee, G., et al. Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nat Biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).
  5. Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).
  6. Dupin, E., Sommer, L. Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood. Dev Biol. 366, 83-95 (2012).
  7. McKeown, S. J., Stamp, L., Hao, M. M., Young, H. M. Hirschsprung disease: a developmental disorder of the enteric nervous system. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 113-129 (2013).
  8. Slaugenhaupt, S. A., et al. Tissue-specific expression of a splicing mutation in the IKBKAP gene causes familial dysautonomia. Am J Hum Genet. 68, 598-605 (2001).
  9. Cheung, N. K., Dyer, M. A. Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat Rev Cancer. 13, 397-411 (2013).
  10. Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).
  11. Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
  12. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  13. Itoh, K., et al. Reproducible establishment of hemopoietic supportive stromal cell lines from murine bone marrow. Exp Hematol. 17, 145-153 (1989).
  14. Barberi, T., et al. Neural subtype specification of fertilization and nuclear transfer embryonic stem cells and application in parkinsonian mice. Nat Biotechnol. 21, 1200-1207 (2003).
  15. Elkabetz, Y., et al. Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22, 152-165 (2008).
  16. Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell Rep. 3, 1140-1152 (2013).
  17. Molofsky, A. V., et al. Bmi-1 dependence distinguishes neural stem cell self-renewal from progenitor proliferation. Nature. 425, 962-967 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

r nicowanie bez kom rek karmioneksortowanie kom rek aktywowane fluorescencjstadium rozet neuralnychmarkery HNK 1 i p75test migracji kom rekzdefiniowane cz steczki sygna owepowlekanie poli L ornitynpo ywka do r nicowania N2
Bezkarmowe wyprowadzanie komórek progenitorowych grzebienia nerwowego z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.