Bezkarmowe wyprowadzanie komórek progenitorowych grzebienia nerwowego z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) i ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) wykazały ogromny potencjał, w szczególności do badania i przyszłego leczenia chorób ludzkich, dla których nie są dostępne ani dobre modele zwierzęce, ani pierwotne tkanki. Przykłady zastosowań technologii hESC/hiPSC są następujące: Komórki o szczególnym znaczeniu mogą być generowane z hESC/hiPSC dla medycyny regeneracyjnej w nieograniczonej ilości¹. Komórki mogą być wytwarzane od pacjentów będących nosicielami określonej choroby i wykorzystywane do tworzenia modeli chorób in vitro ^2,3. Takie modele chorób można następnie wykorzystać do badań przesiewowych leków na dużą skalę w poszukiwaniu nowych związków leczniczych⁴ , a także do testowania istniejących leków pod kątem skuteczności i toksyczności⁵ . Modele chorób in vitro mogą prowadzić do identyfikacji nowych mechanizmów chorobowych. W przypadku wszystkich zastosowań technologii hESC/iPSC ważna jest praca z konkretnymi, dobrze zdefiniowanymi typami komórek dotkniętych chorobą będącą przedmiotem zainteresowania. W związku z tym dostępność solidnych i powtarzalnych protokołów różnicowania in vitro ma kluczowe znaczenie dla wszystkich zastosowań technologii hESC/hiPSC. Pożądane są protokoły, które wykazują minimalną zmienność, nakład czasu, wysiłek, trudność i koszt, a także maksymalną odtwarzalność między liniami hESC/hiPSC i różnymi badaczami.

Komórki grzebienia nerwowego (NC) pojawiają się podczas neurulacji kręgowców między naskórkiem a nabłonkiem nerwowym. Namnażają się i migrują w znacznym stopniu w rozwijającym się zarodku i dają początek imponującej różnorodności typów komórek potomnych, w tym kości/chrząstek, szkieletu twarzoczaszki, nerwów czuciowych, komórek Schwanna, melanocytów, komórek mięśni gładkich, neuronów jelitowych, neuronów autonomicznych, komórek chromochłonnych, komórek przegrody serca, zębów i komórek gruczołowych nadnerczy/tarczycy⁶. Tak więc komórki NC są atrakcyjnym typem komórek dla pola komórek macierzystych i ważnymi dla modelowania różnych chorób, takich jak choroba Hirschsprunga⁷, rodzinna dysautonomia⁸, a także nowotwory, takie jak nerwiak zarodkowy⁹. Ponadto dają one możliwość badania aspektów rozwoju embrionalnego człowieka in vitro.

Obecnie dostępny i szeroko stosowany protokół różnicowania in vitro do wyprowadzania komórek NC z hESC^10,11 wymaga do 35 dni różnicowania i obejmuje indukcję neuronalną na komórkach zrębowych, takich jak komórki MS5, a zatem jest przeprowadzany w słabo zdefiniowanych warunkach. Chociaż można go zwiększyć w celu wygenerowania dużych ilości komórek NC, na przykład wymaganych do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków⁴, jest to pracochłonne i kosztowne. Ponadto wiąże się z ręcznym pasażowaniem rozet nerwowych, które mogą być trudne do odtworzenia, a zatem podlegają ogólnej zmienności, w szczególności gdy są stosowane do wielu różnych linii hESC lub hiPSC. Tutaj pokazano stopniowe wyprowadzanie komórek NC w 18-dniowym protokole, który jest wolny od komórek zasilających. Ta metoda jest krótsza i bardziej zdefiniowana niż obecnie używany protokół. Ponadto jest bardzo wytrzymały w generowaniu komórek NC wśród różnych linii hiPSC. Co ważne, wykazano, że komórki NC uzyskane przez oba protokoły wyłaniają się na granicy rozet nerwowych (zwanych dalej rozetami-NC lub R-NC). Komórki uzyskane przy użyciu jednego z dwóch protokołów wyglądają morfologicznie identycznie, wyrażają te same markery NC i grupują się razem w analizie mikromacierzy. Komórki NC uzyskane przy użyciu nowego protokołu (R-NC) są funkcjonalne, podobnie jak komórki NC uzyskane przy użyciu starego protokołu (MS5-R-NC), dzięki czemu mogą migrować i dalej różnicować się w neurony. W związku z tym ogniwa mogą być używane jednocześnie z ogniwami MS5-R-NC. Protokół komórkowy R-NC do wyprowadzania komórek NC z hESC/iPSC będzie przydatny we wszystkich zastosowaniach technologii hESC/iPSC obejmujących linię NC.

1. Przygotowanie pożywek hodowlanych, panierowanych naczyń i utrzymanie hPSC

1.1 Przygotowanie mediów

Uwaga: Przefiltruj wszystkie media do sterylizacji i przechowuj w temperaturze 4 °C w ciemności przez okres do 2 tygodni. Nazwy odczynników, numery firmowe i katalogowe są wymienione w Tabeli materiałów.

1. DMEM/10%FBS: Połącz 885 ml DMEM, 100 ml FBS, 10 ml Pen/Strep i 5 ml L-glutaminy.
2. HES-medium: Połącz 800 ml DMEM/F12, 200 ml KSR, 5 ml L-glutaminy, 5 ml Pen/Strep, 10 ml roztworu minimum aminokwasów egzogennych MEM, 1 ml β-merkaptoetanolu. Dodać 10 ng/ml FGF-2 po przefiltrowaniu pożywki.
   UWAGA: β-merkaptoetanol jest toksyczny, należy unikać wdychania, spożycia i kontaktu ze skórą.
3. Pożywka różnicująca KSR: Połącz 820 ml Knockout DMEM, 150 ml KSR, 10 ml L-glutaminy, 10 ml Pen/Strep, 10 ml roztworu minimalnych aminokwasów egzogennych MEM i 1 ml β-merkaptoetanolu.
4. Pożywka różnicująca N2: Rozpuścić 12 g proszku DMEM/F12 w 980 ml dH₂O, dodać 1,55 g glukozy, 2 g wodorowęglanu sodu i 100 mg ludzkiego transferyny APO. Zmieszać 2 ml dH₂O z 25 mg insuliny ludzkiej i 40 μl 1 N NaOH, dodać rozpuszczony roztwór do pożywki. Dodać 100 mM dichlorowodorku putrescyny, 0,5 mM selenitu, 1 mM progesteronu i zwiększyć objętość do 1 l za pomocą dH2O.

1.2 Powlekanie naczyń hodowlanych

1. Otoczka matrigelu: Rozmrozić 1 ml zamrożonej porcji matrigelu, pipetując 19 ml DMEM/F12 na podwielokrotność, aż się rozpuści. Usuń grudki, przepuszczając je przez sitko o wielkości 40 μm i umieść na talerzu naczynie o pojemności 8 ml/10 cm. Inkubować szalki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Odessać matrycę bezpośrednio przed posiewem komórek.
   Uwaga: Pracuj szybko z matrigelem, ponieważ może się zbrylać w temperaturach powyżej 4 °C.
2. Powłoka PO/Lam/FN: Dodać 10 ml 1x PBS zawierającego 15 μg/ml bromowodorku Poly-L Ornithin do 10 cm naczynia. Inkubować naczynie przez noc w temperaturze 37 °C. Umyć płytki 1x PBS raz i dodać 10 ml/10 cm naczynie z 1x PBS zawierającym 2 μg/ml mysią Laminin-I i 2 μg/ml fibronektyny. Inkubować naczynia przez noc w temperaturze 37 °C. Przed posiewem komórek należy całkowicie usunąć roztwór i pozostawić płytki do całkowitego wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 15-20 minut, stawiając je na ścianie kaptura do hodowli tkankowych bez zakładanej pokrywy.
   Uwaga: Naczynia są całkowicie suche i gotowe do posiewu komórkowego, gdy na powierzchni można zobaczyć struktury krystaliczne (widoczne gołym okiem). W tym wysuszonym stanie płytki można przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka godzin. Dania PO/Lam/FN należy przygotować 2 dni wcześniej. W nagłych przypadkach Lam/FN można inkubować tylko przez 2-4 godziny. Może to jednak grozić nieoptymalnymi wynikami różnicowania/przeżycia.

1.3 Utrzymanie komórek hPSC

Uwaga: hPSC są utrzymywane na 0,1% żelatyny i mitotycznie inaktywowanych mysich fibroblastach embrionalnych (MEF) w pożywce HES uzupełnionej 10 ng/ml FGF-2, jak opisano wcześniej ^10,12. Komórki należy dzielić co 6-8 dni.

1. Posmaruj 10 cm naczynie 8 ml 0,1% żelatyny (w 1x PBS bez magnezu i wapnia) w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
2. Zamrożone MEF-y należy szybko rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Dodaj 1 milion MEF do 10 ml DMEM/10% FBS.
3. Odessać żelatynę i ułożyć komórki na płytce. Inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 6 godzin.
4. Odessać DMEM/10% FBS z przygotowanej płytki MEF, przemyć płytkę 1x PBS raz i dodać 10 ml pożywki HES uzupełnionej 10 μM dichlorowodorkiem Y-27632. Pozostawić podłoże do ogrzania w temperaturze 37 °C przez 20 minut.
   Uwaga: Do ręcznego rozdzielania hPSC stosuje się okap z przepływem laminarnym z wbudowanym mikroskopem. Jednak komórki mogą być pasażowane przy użyciu odpowiednich metod alternatywnych.
5. Pod kapturem z przepływem laminarnym z wbudowanym mikroskopem odłącz oddzielne kolonie za pomocą podnośnika komórkowego i pozwól im unosić się na wodzie.
6. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml odessać pływające kolonie i przesłać je na świeżą, ciepłą płytkę MEF. Przenieś około jednej czwartej komórek do nowego naczynia. Inkubować w temperaturze 37 °C.
7. Codziennie karmić komórki świeżą pożywką HES.

2. Posiewanie hPSC w celu różnicowania

Uwaga: hPSC powinny być dzielone lub powlekane w celu rozróżnienia, gdy kolonie są duże, ale nadal mają ostre krawędzie z jak najmniej różnicującymi komórkami na ich granicach (patrz Rysunek 1B). Gdy komórki są utrzymywane za pomocą ręcznego pasażu, kolonie powinny być wystarczająco duże, aby były łatwo widoczne gołym okiem. Aby uzyskać właściwe wyczucie tego punktu czasowego, można utrzymywać oddzielną szalkę hPSC przez dwa tygodnie bez pasażowania i obserwować, jak komórki osiągają i mijają idealny punkt czasowy do ich pasażowania/różnicowania.

1. Przygotuj 10 cm naczynia z matrigelem na 1 godzinę przed rozpoczęciem różnicowania. Udane powlekanie matrigelem można zweryfikować przy 4-krotnym powiększeniu.
2. Gdy hPSC są gotowe do podziału, odessać pożywkę i dodać 4 ml 0,05% trypsyny-EDTA do komórek.
3. Potrząsaj naczyniem poziomo przez 2 minuty energicznie, aż będzie można zobaczyć MEF-y jako pojedyncze komórki unoszące się z płytki pod mikroskopem. Kolonie hPSC pozostają połączone jako kolonie.
4. Natychmiast i dokładnie odessać trypsynę i odstawić płytkę w temperaturze RT na 2-4 minuty.
5. Dodać 2 ml pożywki HES do płytki i za pomocą pipety P1000 oderwać komórki.
   Uwaga: Jeśli komórek nie można łatwo podnieść z powierzchni, płytkę można inkubować pustą w temperaturze pokojowej przez kolejne 2-3 minuty.
6. Przenieść komórki do 8 ml pożywki HES uzupełnionej 10 μM dichlorowodorkiem Y-27632.
7. Odessać matrygel z wcześniej przygotowanego naczynia o średnicy 10 cm. Ułóż komórki w stosunku 1:1 lub 1:2 (na przykład: komórki z jednej 10-centymetrowej szalki są dzielone na dwie 10-centymetrowe szalki) na płytce matrycowej. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
   Uwaga: To posiewanie powinno dać około 100 000 komórek/cm².

3. Indukcja różnicowania neuronalnego

Uwaga: Różnicowanie może być zainicjowane (dzień 0), gdy komórki są w 90-100% zlewające się (patrz Rysunek 1C), zwykle następnego dnia. Jeśli dokładna konfluencja nie została jeszcze osiągnięta, komórki mogą być codziennie karmione pożywką HES, aż będą gotowe do różnicowania. Alternatywnie można zwiększyć początkową liczbę posianych komórek.

1. W dniach od 0 do 3 należy codziennie karmić komórki pożywką różnicującą KSR o pojemności 10 ml/10 cm, zawierającą 0,1 μM LDN193189 i 10 μM SB431542.
2. W 4 i 5 dniu nakarm komórki 75% pożywką różnicującą KSR i 25% pożywką różnicującą N2, obie zawierające LDN193189 i SB431542.
3. W dniu 6 i 7 nakarm komórki 50% pożywką różnicującą KSR i 50% pożywką różnicującą N2, obie zawierające LDN193189 i SB431542.
4. W dniach 8 i 9 nakarm komórki 25% pożywką różnicującą KSR i 75% pożywką różnicującą N2, obie zawierające LDN193189 i SB431542.
5. W dniu 9 i 10 przygotować szalki PO/Lam/FN, jak wskazano w ppkt 1.2.2, w celu ponownego posiewu komórek w dniu 11.
6. W dniu 10 komórki żywią się pożywką różnicującą N2 zawierającą LDN193189 i SB431542.

4. Powtarzanie w kropelkach dla specyfikacji NC

1. W dniu 11 odessać Lam/FN z wcześniej przygotowanych płytek i pozostawić je do całkowitego wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 20-30 minut, jak wyjaśniono w 1.2.2.
2. Usunąć pożywkę z komórek różnicujących, przemyć komórki raz 1x PBS i dodać 8 ml akutazy/10 cm naczynia. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
3. Za pomocą podnośnika komórek odłączyć komórki i ponownie zawiesić je w aptazie za pomocą pipety o pojemności 5 ml. Przenieść zawiesinę do probówki o pojemności 15 ml.
4. Dodać 5 ml 1x PBS i wirować komórki przez 5 minut w 114 x g.
5. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml 1x PBS. Aby zapewnić zawieszenie pojedynczych komórek, przefiltruj je przez sitko o wielkości 40 μm i policz komórki za pomocą hemocytometru lub równoważnej techniki.
6. Odwiruj komórki i ponownie zawieś je w pożywce różnicującej N2 zawierającej 200 μM kwasu askorbinowego (AA), 20 ng/ml BDNF, 100 ng/ml FGF8, 20 ng/ml SHH, 10 μM Y-27632 dichlorowodorku w stężeniu 100 000-150 000 komórek/10 μl.
7. Za pomocą pipetora wielokrotnego rozłóż 10 μl kropel blisko siebie, tak aby nie dotykały one wysuszonych szalek PO/Lam/FN o średnicy 15 cm.
   Uwaga: Z jednego 10-centymetrowego naczynia ze zróżnicowanymi komórkami zwykle powstaje około 2-3 razy 15 cm szalki lub około 100 x 10 μl kropel/15 cm szalka.
8. Pozostawić kropelki w temperaturze pokojowej na 20-30 minut, następnie bardzo ostrożnie (aby nie zakłócić działania kropelek) dodać 30 ml N2/AA/BDNF/FGF8/SHH/Y i inkubować w temperaturze 37 °C.
9. W 12 dniu ostrożnie nakarm komórki naczyniem o pojemności 20 ml/15 cm N2/AA/BDNF/FGF8/SHH.
10. Od 14 do 17 dnia karmić komórki co drugi lub trzeci dzień N2/AA/BDNF/FGF8.
11. W dniu 16 i 17 przygotuj płytki PO/Lam/FN do ponownego nawarstwienia komórek NC po sortowaniu FACS.

5. Sortowanie komórek NC aktywowane fluorescencją (FACS)

Uwaga: Przygotowanie komórek do FACS zajmuje około 2 godzin.

1. W dniu 18 usuń pożywkę, umyj komórki raz 1x PBS w naczyniu i dodaj 12 ml akutazy. Inkubować komórki przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
2. Za pomocą podnośnika komórkowego odłącz komórki od powierzchni i pozwól im unosić się na wodzie. Odpipetować komórki do zawiesiny za pomocą pipety o pojemności 5 ml, przenieść je do probówki o pojemności 50 ml i dodać 30 ml 1x PBS. Wiruj komórki przez 5 minut w 114 x g.
3. Za pomocą pipety P1000 ponownie zawiesić komórki w 1 ml 2% FBS/HBSS (HBSS zawiera 15 mM HEPES). Dodać 19 ml 2% FBS/HBSS i przefiltrować komórki przez sitko o wielkości 40 μm, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. Inkubować komórki na lodzie przez 15 minut w celu zablokowania przeciwciał, a następnie policzyć je za pomocą hemocytometru.
4. Odwiruj komórki i zawieś je ponownie w stężeniu 10 milionów komórek/ml w 2% FBS/HBSS.
5. Odłóż 1 milion komórek na niebarwione, barwione pojedynczo (tylko HNK-1 i tylko p75) i tylko drugorzędowe przeciwciała (tylko APC i tylko 488) kontrole FACS.
6. Dodać 5 μl HNK-1 i 5 μl pierwszorzędowego przeciwciała p75 na 10 milionów komórek w 1 ml zawiesiny do odpowiednich próbek i inkubować przez 20 minut na lodzie.
7. Umyć komórki w 10 ml 1x PBS (odwirować 5 minut przy 114 x g) i ponownie zawiesić komórki w 1 ml 2% FBS/HBSS. Dodać 2 μl APC i 1 μl 488 przeciwciał drugorzędowych na 10 milionów komórek w 1 ml zawiesiny do odpowiednich próbek i inkubować przez 20 minut na lodzie w ciemności.
   Uwaga: APC i 488 są przeciwciałami drugorzędowymi stosowanymi tutaj odpowiednio do barwienia HNK-1 i p75.
8. Umyj komórki w 10 ml 1x PBS dwukrotnie, ponownie zawieś 10 milionów komórek w 500 μl 2% FBS/HBSS zawierających DAPI (w stężeniu 0,5 ng/μl) lub alternatywnym odpowiednim barwniku żywych komórek, aby wykluczyć martwe komórki z analizy FACS.
9. Przenieść próbki do odpowiednich probówek FACS.
10. Przygotować probówki FACS z 0,5 ml 2% FBS/HBSS do pobierania komórek.
    Uwaga: Komórki i probówki zbiorcze są trzymane na lodzie w ciemności w czasie sortowania.
11. Korzystanie z maszyny do sortowania komórek z laserami, które mogą wykrywać podwójnie dodatnie komórki DAPI, APC i 488 sortowane DAPI-/HNK-1+/P75+.
    Uwaga: Czas przygotowania i obchodzenia się z komórkami prowadzi do niewielkiego procentu śmierci komórek, DAPI barwi tylko martwe komórki, a tym samym pozwala na wykluczenie tych komórek z posortowanej populacji. Każda alternatywna żywa/martwa plama działa równie dobrze w tym celu. DAPI sam w sobie nie powoduje cytotoksyczności w populacji żywych komórek.

6. Ponowne sortowanie komórek, utrzymanie NC i rozbudowa

Uwaga: Z komórkami posortowanymi przez FACS należy obchodzić się ze szczególną ostrożnością, aby zapewnić optymalne przetrwanie. Trzymaj je na lodzie do momentu ponownego pokrycia. Nie należy ich ostro wirować ani pipetować. Komórki można ponownie zawiesić, przesuwając rurkę.

1. Po posortowaniu FACS policz komórki NC, a następnie odwiruj je i ponownie zawieś w pożywce różnicującej N2 uzupełnionej 10 ng/ml FGF2, 20 ng/ml EGF i 10 μM dichlorowodorku Y-27632 w objętości odpowiedniej do ich ponownego naszczepienia na 30 000 komórek/10 μl kropel.
2. Dokładnie osuszyć wcześniej przygotowane płytki PO/Lam/FN i podać około 50-70 kropelek na 10 cm naczynie. Odstaw naczynia na RT na 20-30 minut.
3. Bardzo ostrożnie dodaj 20 ml/10 cm naczynie N2/FGF2/EGF/Y-27632, nie naruszając kropelek. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C.
4. Karmić komórki co 2-3 dni N2/FGF2/EGF.
   Uwaga: Komórki NC są rozszerzane lub pasażowane mniej więcej co 4-5 dni lub gdy zaczynają gromadzić się w kropelkach.
5. Aby przejść przez komórki NC, usuń pożywkę, umyj komórki raz 1x PBS i dodaj 8 ml akutazy/10 cm naczynia. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
6. Odpipetować komórki z płytki za pomocą pipety o pojemności 5 ml i przenieść je do probówki o pojemności 15 ml. Dodać 6 ml 1x PBS.
7. Wiruj komórki przez 5 minut w 114 x g.
8. Ponownie zawiesić komórki w pożywce różnicującej N2 uzupełnionej 10 ng/ml FGF2, 20 ng/ml EGF i 10 μM dichlorowodorku Y-27632, aby uzyskać 20 000 komórek/10 μl kropli.
9. Ponownie przesiać komórki w kropelkach o objętości 10 μl na wysuszonych płytkach PO/Lam/FN. Odstaw naczynia na RT na 20-30 minut.
10. Ostrożnie dodaj 20 ml/10 cm naczynie N2/FGF2/EGF/Y-27632. Inkubować w temperaturze 37 °C.
    Uwaga: Komórki NC mogą być utrzymywane lub namnażane przez okres do 2 tygodni jako stosunkowo jednorodna populacja progenitorowa. Dłuższa hodowla może prowadzić do różnicowania się w różne typy komórek potomnych.

Dwa najważniejsze ulepszenia protokołu R-NC w stosunku do protokołu MS5-R-NC 11 to bezobsługowe, zdefiniowane warunki różnicowania i ogólne skrócenie wymagań czasowych. Komórki żywicielskie MS5 13 to mysie komórki zrębu pochodzące ze szpiku kostnego, które, jak wykazano, wspierają różnicowanie neuronalne od hESC 14. HESC hodowane na komórkach zasilających MS5 o niskiej gęstości tworzą struktury nabłonkowe i rozety nerwowe 15, na obrzeżach których wyłaniają się komórki NC 10, naśladując w ten sposób wczesny rozwój neuronalny człowieka. Nie jest jednak jasne, jakie cząsteczki sygnałowe i czynniki wzrostu są uwalniane z komórek zasilających MS5. W związku z tym warunki różnicowania są słabo zdefiniowane, co utrudnia ich odtworzenie w powtarzających się eksperymentach i w poprzek linii hPSC. Aby zapewnić odpowiednią indukcję neuronalną, hESC muszą być wysiewane w małej gęstości w małych koloniach na komórkach zasilających MS5, co komplikuje skalowanie i osiąganie wysokiej wydajności zróżnicowanych komórek. W 2009 r. opracowano metodę, która miała na celu bardzo skuteczną neuralizację hPSC 12. W tej metodzie hPSC wysiewa się w dużej gęstości, w monowarstwach pod nieobecność komórek zasilających MS5, osiągając wysoką wydajność indukcji neuronalnej w ciągu 10 dni. Postępowaliśmy zgodnie ze schematem tej metody, dostosowując protokół różnicowania MS5-R-NC (rysunek 1A). HPSC hodowane w koloniach na MEF (ryc. 1B) są rozpraszane i wysiewane na matrigel jako pojedyncze komórki w hodowli jednowarstwowej o dużej gęstości (ryc. 1C). W 11 dniu różnicowania większość komórek pomyślnie uległa neuralizacji (pax6-dodatni, nie pokazano 12). Ponowne zagęszczenie komórek w kropelkach pozwala na tworzenie się skondensowanych rozet nerwowych w kropelce (ryc. 1D i ryc. 2). Komórki NC pojawiają się na granicach rozet nerwowych (ryc. 1D) i migrują z kropelki (ryc. 1E). Po 7 dniach dalszej hodowli komórki NC można wyizolować metodą sortowania FACS. Podwójnie dodatnie ogniwa NC HNK-1 / p75 można izolować z wydajnością 20-40% (rysunek 1F). Ten protokół wymaga 18 dni, podczas gdy protokół MS5-R-NC wymaga do 35 dni, dzięki czemu protokół komórkowy R-NC jest bardziej przydatny w różnych aplikacjach podrzędnych.

Celem tej pracy jest wygenerowanie komórek NC w krótszym, bardziej powtarzalnym i tańszym protokole, uzyskując te same komórki, co stary protokół NC. Wykorzystaliśmy ten nowy protokół, aby z powodzeniem rozróżnić co najmniej 10 linii hESC i hiPSC pochodzących od pacjentów i zdrowych osób z grupy kontrolnej (dane nie pokazane), wykazując solidną odtwarzalność protokołu w różnych liniach hPSC. Nowy protokół pozwala zaoszczędzić koszty dzięki zastosowaniu LDN w porównaniu z nogginem, mniejszemu zużyciu SHH i brakowi kosztów produkcji MS5. Nowy protokół trwa 18 dni w porównaniu do 35 dni w starym protokole, co pozwala zaoszczędzić około 5 karmień, a tym samym związane z nimi koszty mediów. Aby zbadać, czy komórki wyprodukowane za pomocą tych dwóch protokołów mają podobną tożsamość, pokazujemy, że rozwój komórek NC w obu protokołach przebiega zgodnie z tym samym wzorcem różnicowania (ryc. 2). Komórki przechodzą przez etap rozety neuronalnej i po sortowaniu FACS dają komórki NC o identycznej morfologii. Mniejszy rozmiar rozet nerwowych w nowym protokole w porównaniu ze starym protokołem wynika z dużej gęstości komórek po ponownym posiewie w 11 dniu. Natomiast w starym protokole rozety tworzą się w koloniach hPSC, które nie są tak skondensowane. Komórki NC uzyskane za pomocą tych dwóch protokołów wyrażają te same biologiczne markery NC, takie jak HNK-1, AP2 i nestyna. Przeanalizowaliśmy komórki NC wygenerowane za pomocą dwóch protokołów na globalnym poziomie ekspresji genów (Figura 3A) i stwierdziliśmy, że komórki NC wygenerowane za pomocą tych dwóch protokołów grupują się blisko siebie. Komórki NC, które zostały wygenerowane przez aktywację szlaku sygnałowego wnt (wnt-NC) i wykazano, że mają potencjał generowania melanocytów 16, grupują się oddzielnie podczas analizy przez globalną ekspresję genów, co wskazuje, że może to być inna populacja NC. Rzeczywiście, nie byliśmy w stanie wygenerować komórek progenitorowych melanocytów in vitro z komórek R-NC lub MS5-R-NC (dane nie pokazane). Podobnie komórki neuroepitelialne (LSB), różnicujące się przez 10 dni w LDN193189 i SB431542 wykazują tylko wyraźnie wyraźny wzorzec ekspresji genów. Komórki neuroepitelialne są wczesnymi przodkami układu nerwowego, a zatem są mniej zróżnicowane w porównaniu z komórkami NC i są tutaj zaliczane do populacji kontroli negatywnej. Aby ocenić, czy wygenerowane tutaj komórki R-NC są podobne do komórek wykonanych przy użyciu starego protokołu, pokazujemy ich zdolność migracji w teście zadrapań in vitro (Figura 3B). 48 godzin po zadrapaniu zlewającej się studzienki posortowanych komórek R-NC, komórki pomyślnie migrują do zadrapania. Na koniec pokazujemy, że komórki R-NC mają potencjał do różnicowania się w komórki autonomicznego układu nerwowego. Komórki były spontanicznie różnicowane przez 4 dni po HNK1 + / p75 + FACS i wybarwione pod kątem Mash1 i Tuj1, genów, które ulegają ekspresji w autonomicznych neuronach (Figura 3C).

Rysunek 1. Krytyczne kroki w protokole różnicowania R-NC. A. Schemat protokołu różnicowania MS5-R-NC10,11 i R-NC. Przedstawiono konkretne etapy różnicowania tych dwóch protokołów. MS5: komórki zrębowe podajnika, KSR: pożywka różnicująca KSR, N2: pożywka różnicująca N2, LDN: LDN193189, SB: SB431542, S: jeż soniczny, 8: FGF8, A: kwas askorbinowy, B: BDNF. B. Pokazuje niezróżnicowane kolonie hPSC barwione Oct-4 i DAPI przed indukcją różnicowania. C. Pokazuje gęstość komórek (90-100% konfluencji) w dniu różnicowania, zwykle 1 dzień po posianiu hPSC. D. Pokazuje rozety nerwowe wybarwione Pax6 i pojawiające się komórki NC wybarwione HNK-1 w kropelce. E. Pokazuje komórki dnia 13, ponownie posiane w dniu 11 w kropelkach i komórkach NC wyłaniających się z krawędzi kropli. F. Reprezentatywny wykres sortowania FACS, przedstawiający podwójnie dodatnie komórki NC HNK-1 / p75 w 18 dniu różnicowania. Bramy zostały wybrane na podstawie niebarwionych i pojedynczo barwionych elementów sterujących (nie pokazano). Wykresy sortowania FACS mogą różnić się w zależności od eksperymentów, linii hPSC i zastosowania starego lub nowego protokołu pod względem odsetka komórek podwójnie dodatnich i pojedynczych dodatnich. Dlatego ważne jest, aby wyizolować podwójnie dodatnią populację, aby zapewnić ekstrakcję odpowiednich komórek NC. Obrazy od C do F zostały wygenerowane przy użyciu nowego protokołu R-NC. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Porównywalna tożsamość komórek grzebienia nerwowego komórek pochodzących z protokołu MS5-R-NC lub R-NC. W obu protokołach komórki przechodzą przez etap rozety neuronalnej. Posortowane komórki NC wyglądają identycznie pod względem morfologii i ekspresji markerów NC, takich jak HNK-1 i AP2. Komórki NC są gnieździsko-dodatnie, co pokazuje, że są komórkami progenitorowymi. Podziałka: 200 μm. Wszystkie obrazy fluorescencyjne są barwione przeciwstawnie dla DAPI. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Komórki NC wygenerowane za pomocą starego i nowego protokołu mają podobną tożsamość. A. Nienadzorowane grupowanie danych dotyczących ekspresji genów mikromacierzy Illumina porównujące komórki NC pochodzące z protokołu MS5-R-NC i R-NC. Komórki NC uzyskane za pomocą protokołu MS5-R-NC lub R-NC odpowiednio w dniu 35 lub 18 analizowano w trzech egzemplarzach przez hybrydyzację z ludzką matrycą 12 oligonukleotydów Illumina. Analizę danych przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Partek Genomic Suite. Istotne różnice zdefiniowano jako te ze zmianą krotności większą niż 2 i FDR mniejszą niż 0,05. Przeanalizowano 1421 genów. Użyto ustawień domyślnych, takich jak odmienność próbki euklidesowej, metoda średniego klastra sprzężeń i 25 dla długości dendrogramu. Uwzględniono komórki NC indukowane przez aktywację sygnalizacji wnt (wnt-NC) (komórki różnicowały się w LDN193189 dniu 0-3, SB431542 dniu 0-4, CHIR99021 dniu 0-11 i FACS posortowanym w dniu 11 dla sox10) 16. Komórki te grupują się oddzielnie od komórek R-NC, co wskazuje, że komórki wnt-NC i komórki R-NC są odrębnymi populacjami. Komórki różnicowane przez 11 dni w LDN193189 i SB431542 włączono do kontroli neuroepitelialnej (LSB). Komórki R-NC i MS5-R-NC grupują się blisko siebie w porównaniu z komórkami kontrolnymi. Surowe dane dotyczące ekspresji genów są dostępne na stronie GEO (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) akces #: GSE50643. B. Test migracji. Komórki R-NC posortowane przez HNK1 + / p75 + FACS zostały posiane na PO / Lam / FN w 96 dołkach i ręcznie zarysowane 24 godziny później. Zdjęcie o godzinie 0 zostało zrobione natychmiast po zadrapaniu i zabarwieniu po zabarwieniu za pomocą Hoechst. Pozostałym odwiertom pozwolono migrować przez 48 godzin, zanim wykonano drugie zdjęcie. Podziałka: 200 μm C. Posortowane komórki R-NC pozostawiono do spontanicznego różnicowania przez 4 dni i wybarwiono pod kątem Mash1, Tuj1 i DAPI. Podziałka skali: 500 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają sprzecznych interesów do ujawnienia.