Wysokoprzepustowa analiza obrazu sferoid nowotworowych: przyjazna dla użytkownika aplikacja do automatycznego i dokładnego pomiaru wielkości sferoid

Summary

Prezentujemy aplikację do analizy obrazów o wysokiej przepustowości do pomiaru wielkości trójwymiarowych sferoid guza obrazowanych za pomocą mikroskopii jasnego pola. Ta aplikacja zapewnia szybki i skuteczny sposób badania wpływu leków terapeutycznych na sferoidy, co jest korzystne dla badaczy, którzy chcą używać sferoid w badaniach przesiewowych leków.

Abstract

Rosnąca liczba zastosowań trójwymiarowych (3D) sferoid nowotworowych jako modelu in vitro do odkrywania leków wymaga ich dostosowania do formatów badań przesiewowych na dużą skalę na każdym etapie badania przesiewowego leków, w tym analizy obrazu na dużą skalę. Obecnie nie ma gotowego i darmowego oprogramowania do analizy obrazu, które spełniałoby wymagania tego formatu na dużą skalę. Większość istniejących metod polega na ręcznym rysowaniu długości i szerokości obrazowanych sferoid 3D, co jest żmudnym i czasochłonnym procesem. W tym badaniu przedstawiono wysokoprzepustową aplikację do analizy obrazu – SpheroidSizer, która automatycznie i dokładnie mierzy główną i mniejszą długość osiową obrazowanych sferoid guza 3D; oblicza objętość każdej pojedynczej sferoidy guza 3D; Następnie wyświetla wyniki w dwóch różnych formach w arkuszach kalkulacyjnych w celu łatwego manipulowania w późniejszej analizie danych. Główną zaletą tego oprogramowania jest potężna aplikacja do analizy obrazu, która jest dostosowana do dużej liczby obrazów. Zapewnia wysoką przepustowość obliczeń i przepływ pracy związany z kontrolą jakości. Szacowany czas przetwarzania 1 000 obrazów to około 15 minut na minimalnie skonfigurowanym laptopie lub około 1 minuty na wielordzeniowej stacji roboczej o wysokiej wydajności. Graficzny interfejs użytkownika (GUI) został również zaprojektowany z myślą o łatwej kontroli jakości, a użytkownicy mogą ręcznie nadpisać wyniki komputera. Kluczowa metoda stosowana w tym oprogramowaniu jest zaadaptowana z algorytmu aktywnego konturu, znanego również jako Węże, który jest szczególnie przydatny w przypadku obrazów o nierównomiernym oświetleniu i hałaśliwym tle, które często nękają automatyczne przetwarzanie obrazu na ekranach o wysokiej przepustowości. Bezpłatne narzędzia "Ręczna inicjalizacja" i "Rysowanie ręczne" zapewniają SpheroidSizer elastyczność w radzeniu sobie z różnymi typami sferoid i obrazami o różnej jakości. To wysokowydajne oprogramowanie do analizy obrazów znacznie zmniejsza nakład pracy i przyspiesza proces analizy. Wdrożenie tego oprogramowania jest korzystne dla sferoid nowotworów 3D, które stają się rutynowym modelem in vitro do badań przesiewowych leków w przemyśle i środowisku akademickim.

Introduction

Trójwymiarowe (3D) sferoidy nowotworowe to "sferycznie symetryczne agregaty komórek nowotworowych analogiczne do tkanek, bez sztucznego podłoża do przyczepiania komórek"^1-3. Cytologia i morfologia sferoid guza lepiej naśladuje organizację i mikrośrodowiska tkanki nowotworowej in vivo niż jednowarstwowe komórki dwuwymiarowe (2D). Sferoidy nowotworowe 3D stały się praktycznym modelem in vitro do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków przeciwnowotworowych lub badania skuteczności potencjalnych leków przed testami in vivo na zwierzętach lub testami klinicznymi⁴. Klinicznie skuteczność każdego leczenia przeciwnowotworowego ocenia się na podstawie zmniejszonego wzrostu guza. Analogicznie, objętość sferoidalna może być wykorzystana jako miara skuteczności w badaniach in vitro nad lekami przeciwnowotworowymi. Objętość sferoidalna (V = 0,5 * Długość * Szerokość²) jest określana na podstawie głównej i pobocznej długości osiowej (bardziej znanej jako długość i szerokość) sferoid ^6,7. Większość badaczy musi ręcznie narysować długość i szerokość każdej sferoidy, często korzystając z oprogramowania oferowanego przez firmy mikroskopowe i sprzedawanego razem z instrumentami do obrazowania. Technika ta staje się problematyczna, gdy wykonywane są wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków i generowanych jest więcej niż setki obrazów. Niektóre niedawne badania donosiły o wykorzystaniu zestawów narzędzi do analizy obrazu typu open source, takich jak CellProfiler^8-10 i ImageJ¹¹, do opracowania podstawowych procedur/makr segmentacji, które obejmowały korekcję oświetlenia i proste progowanie. Procedury te często muszą być ponownie dostosowywane do różnych partii obrazów w zależności od warunków oświetlenia i zmiany kontrastu obrazu; W związku z tym te pakiety oprogramowania nie są w stanie spełnić wymagań dotyczących niezawodności wysokoprzepustowej analizy obrazu. Friedrich i współpracownicy (2009) użyli zastrzeżonego oprogramowania do półautomatycznego pomiaru objętości sferoidy⁵. Metoda opisana^{w artykule} Monazzama i jego kolegów była półautomatyczną metodą pomiaru rozmiaru sferoidy tylko dla niewielkiej liczby obrazów. W związku z tym istnieje wyraźne zapotrzebowanie na solidne, elastyczne, zautomatyzowane i gotowe do użycia narzędzia do analizy obrazu sferoidów 3D.

W tym badaniu opisujemy SpheroidSizer - opartą na MATLAB aplikację typu open source do automatycznego i dokładnego pomiaru wielkości sferoid guza. SpheroidSizer jest przeznaczony do przetwarzania wielu różnych partii obrazów sferoid 3D w tej samej sesji. Wykorzystując aktywny algorytm konturowy^12-14, SpheroidSizer może tolerować zmiany kontrastu obrazu, zdecydowanie ignorować stopniowe zmiany oświetlenia tła i rozpoznawać sferoidy na obrazie. Może również tolerować wiele typowych artefaktów, np. szczątków, pochodzących z okazu. Przepływ pracy został zaprojektowany w taki sposób, aby użytkownicy mogli przeprowadzać kontrolę jakości w trakcie lub po obliczeniach. Ręczne nadpisywanie wyniku analizy można łatwo wykonać na miejscu. Korzystając z zestawu narzędzi do obliczeń równoległych, szybkość analizy można jeszcze bardziej zwiększyć poprzez koordynację wielu rdzeni obliczeniowych w celu jednoczesnej pracy nad obliczeniami na komputerze użytkownika. Co więcej, SpheroidSizer generuje wyniki w dwóch różnych formach, aby umożliwić łatwe połączenie z dalszymi narzędziami analitycznymi.

Protocol

1. 3D tworzenie sferoid nowotworowych, leczenie farmakologiczne i zbieranie obrazów odbywa się tak, jak opisano w naszym poprzednim artykule¹⁵.

2. Instalacja oprogramowania

1. Zainstaluj licencjonowane oprogramowanie MATLAB na komputerze używanym do analizy obrazu. Wymagane jest również zainstalowanie następujących zestawów narzędzi z programu MATLAB — Zestaw narzędzi do przetwarzania sygnału, Zestaw narzędzi do przetwarzania obrazu i Zestaw narzędzi do obliczeń równoległych* (*potrzebne tylko w trybie obliczeń równoległych).
   UWAGA: Wiele uniwersytetów kupuje i utrzymuje licencje grupowe, dzięki czemu oprogramowanie można bezpłatnie pobrać i używać przez stowarzyszonych naukowców.
2. Zainstaluj program SpheroidSizer z SpheroidSizer.zip pliku (zobacz pliki dodatkowe):
   1. Zapisz plik zip w lokalnym systemie plików.
   2. Rozpakuj plik SpheroidSizer.
   3. Zapisz pliki w wyznaczonym katalogu/folderze, który będzie następnie określany jako "Katalog instalacyjny".
      UWAGA: SpheroidSizer został gruntownie przetestowany w systemie operacyjnym Windows 7. Oczekuje się, że będzie działać na alternatywnych systemach operacyjnych z minimalnymi poprawkami (nie testowany).

3. Przygotowanie do analizy obrazu przez SpheroidSizer

1. Określ skalę/rozdzielczość obrazu systemu obrazowania (bezwzględna skala obrazu w mikronach na piksel (μm/pix)).
   UWAGA: Jeśli rozmiar każdego piksela na chipie aparatu jest znany, skalę obrazu można obliczyć jako powiększenie obiektywu x rozmiar piksela (μm/pix). Wartość tę można uzyskać z oprogramowania do obrazowania wyposażonego w mikroskop jako wbudowane metadane lub z pomocą dostawcy systemu obrazowania. Ta wartość będzie wymagana w kroku 4.6.
2. Konwertuj dowolne zastrzeżone formaty plików obrazów na akceptowane formaty plików — TIFF, JPEG i inne popularne formaty plików obrazów.
3. Nazwij pliki obrazów i uporządkuj katalogi (Rysunek 5A).
   UWAGA: Oprogramowanie opiera się na odpowiednim układzie struktury katalogów i nazwach plików, aby sformatować wyniki do formatu płyty:
   1. Nazwij pliki obrazów w następującym formacie: [nazwa tablicy]_[wiersz][kolumna]. [rozszerzenie] lub [nazwa tablicy][spacja][wiersz][kolumna]. [rozszerzenie]. [wiersz] jest zgodny z porządkiem alfabetycznym, a [kolumna] jest zgodny z porządkiem numerycznym.
      UWAGA: Można znaleźć bezpłatne oprogramowanie do automatycznej zmiany nazw partii, aby pomóc użytkownikom w tym kroku.
   2. Ułóż katalog/folder na podstawie eksperymentu w następujący sposób: Każdy eksperyment powinien mieć jeden katalog. W katalogu każdego eksperymentu powinny znajdować się podkatalogi dla każdego punktu czasowego. W każdym podkatalogu punktu czasowego powinny znajdować się wszystkie obrazy ze wszystkich płyt.
      UWAGA: Aby wyniki analizy były optymalnie posortowane w sformatowanych wynikach, sugerujemy zachowanie tej samej liczby cyfr dla każdego identyfikatora poprzez wypełnienie 0 po lewej stronie, np. punkty czasowe są nazwane jako 000H, 072H i 144H.

4. Analiza obrazu sferoid przez SpheroidSizer

1. Otwórz MATLAB, a następnie otwórz "Okno poleceń", wpisz cd "[Katalog instalacyjny]" i naciśnij [RETURN].
2. Wpisz "SpheroidSizer1_0" w "Oknie poleceń" i naciśnij [RETURN], aby uruchomić program SpheroidSizer.
3. Kliknij przycisk "Przeglądaj" w oknie SpheroidSizer1.0, aby wybrać katalog eksperymentu, który zawiera wszystkie obrazy.
4. Wybierz przełącznik "Uwzględnij podfoldery" pod polem tekstowym "Folder", aby przetworzyć wiele zagnieżdżonych folderów obrazów w wyznaczonym katalogu.
   UWAGA: Jeśli przełącznik "Uwzględnij podfoldery" nie jest wybrany, przetwarzane są tylko obrazy znajdujące się bezpośrednio w katalogu, a wszystkie podfoldery są ignorowane.
5. Wybierz opcję "Wyświetlanie w locie", aby wyświetlić każdy podzielony na segmenty obraz na obrazie źródłowym w celu kontroli jakości podczas wykonywania obliczeń.
   UWAGA: Szybkość obliczeń jest większa, jeśli nie wybrano opcji "Wyświetlanie w locie".
6. Określ "Rozdzielczość" (skala obrazu/rozdzielczość w μm/pix) analizowanych obrazów w polu, aby program poprawnie przekonwertował wymiary sferoidy z piksela na μm.
   UWAGA: Wszystkie obrazy w tym samym folderze lub analizowane razem powinny być wykonane pod tym samym mikroskopem z tym samym obiektywem, tak aby skala/rozdzielczość obrazu pozostała stała dla każdego eksperymentu.
7. (Opcjonalnie) użytkownicy mogą wykonać krok 5, aby uzyskać dostęp do zaawansowanych ustawień zdefiniowanych przez użytkownika.
8. Kliknij "Obliczenia", aby rozpocząć obliczenia.
   UWAGA: Oprogramowanie przeprowadza automatyczne sprawdzanie nazwy pliku przed przystąpieniem do obliczeń. Jeśli pojawi się okno dialogowe z informacją - "Błąd występuje w nazwie pliku", kliknij "Wyjdź i pokaż listę błędów" i napraw błędy w wymienionych nazwach plików (patrz krok 3.3). Następnie kliknij "Obliczenia", aby ponownie rozpocząć obliczenia.
9. Kliknij przycisk "Pauza", aby wstrzymać obliczenia, a obliczenia można wznowić, klikając ten sam przycisk z napisem "Kontynuuj".
   UWAGA: W "Tabeli wyników" wyświetlane są "Folder", "Plik", "Objętość" (w mm³), "Długość" (w μm), "Szerokość" (w μm) i "Prawidłowa" (pole wyboru) dla wszystkich analizowanych sferoid (Rysunek 5C). Objętość jest obliczana na podstawie zmierzonej osi głównej (długość) i osi pomocniczej (szerokość) (V=0,5 * Długość * Szerokość²). Pole wyboru "Prawidłowy" to opcja, którą użytkownik może wybrać, czy analiza obrazu jest prawidłowa, czy nieważna po kontroli jakości, patrz krok 6.

5. Zaawansowane ustawienia zdefiniowane przez użytkownika

1. Kliknij przycisk "Zaawansowane" w oknie SpheroidSizer1.0, aby wyświetlić okno Zaawansowane konfiguracje w celu dostosowania ustawień zdefiniowanych przez użytkownika (Rysunek 5B).
2. Wprowadź interesujące Cię nazwy plików w polach "Format wyjściowy" i "Wyjście listy" w oknie Zaawansowane konfiguracje w sekcji "Wejście".
3. Wprowadź liczbę z zakresu "2-10" w polu "Zmniejsz". Jest to współczynnik dla oprogramowania, który zmniejsza rozmiar obrazu w obliczeniach w celu poprawy szybkości obliczeń. Im większa liczba, tym większa szybkość obliczeń. Domyślna wartość "Zmniejsz" jest ustawiona na 10.
4. Wprowadź rozszerzenie pliku obrazu do przetworzenia w polu "Uwzględnij typ".
5. Wprowadź rozszerzenia lub zakończenia plików graficznych, które nie będą przetwarzane przez program, w polu "Wyklucz typ" w następujący sposób: "_crude.jpg".
6. Wybierz "Brak" dla opcji "Kolor specjalny", aby poprawnie przetwarzać obrazy kolorowe 8-bitowe i 16-bitowe; wybierz "12-bitowy" dla opcji "Kolor specjalny", aby poprawnie przetwarzać obrazy kolorowe 12-bitowe
7. Zaznacz opcję "Użyj obliczeń równoległych", jeśli komputer używany do analizy obrazu jest wyposażony w wiele procesorów i/lub procesory wielordzeniowe. Jeśli to prawda, przejdź do kroku 5.7.1; jeśli nie, pomiń kroki 5.7.1 i 5.7.2.
   UWAGA: Jeśli używany komputer nie obsługuje wybranej konfiguracji, wystąpi błąd.
   1. Zaznacz opcję "Użyj obliczeń równoległych" w oknie Konfiguracja zaawansowana.
      UWAGA: Trybu obliczeń równoległych należy używać tylko wtedy, gdy w komputerze dostępne są 4 lub więcej rdzeni.
   2. Wprowadź liczbę z zakresu od 4 do 12 w polu "#Workers" (rdzenie obliczeniowe).
      UWAGA: Ta liczba musi być równa lub mniejsza niż liczba rdzeni obliczeniowych w komputerze użytkownika. Maksymalnie 12 jest narzucane przez zestaw narzędzi do obliczeń równoległych MATLAB, który obsługuje maksymalnie 12 rdzeni. Podczas wykonywania obliczeń równoległych wyświetlane jest małe okno dialogowe z prośbą o poczekanie na zakończenie obliczeń równoległych; obliczenia nie mogą zostać wstrzymane, a funkcja "Wyświetlacz w locie" nie jest wykonywana w trybie obliczeń równoległych.

6. Kontrola jakości

1. Kliknij odpowiednią komórkę w "Tabeli wyników", aby potwierdzić dokładny kontur graniczny sferoidy na analizowanych obrazach,
   UWAGA: Oryginał i obrazy kontroli jakości pojawią się po prawej stronie do wglądu. Użytkownik może przeglądać wszystkie obrazy sekwencyjnie za pomocą strzałki w dół na klawiaturze.
2. W razie potrzeby doprecyzuj granicę sferoidy na wybranym obrazie, korzystając z następujących dwóch narzędzi:
   1. Kliknij przycisk "Inicjalizacja ręczna", aby wyświetlić oryginalny obraz. Następnie kliknij i przytrzymaj mysz tuż poza sferoidą i przeciągnij narzędzie elipsy tak, aby zakryć sferoidę na oryginalnym obrazie.
      UWAGA: Algorytm aktywnego konturu inicjuje się przy użyciu konturu przesłanego przez użytkownika i wykonuje się w celu zbieżności do żądanego konturu sferoidalnego. "Tabela wyników" zostanie automatycznie zaktualizowana o nowe wyniki. Narzędzie "Ręczna inicjalizacja" pozwala użytkownikowi na ręczne wprowadzenie inicjalizacji dla active-contour.
   2. Kliknij przycisk "Rysowanie ręką", aby wyświetlić oryginalny obraz. Następnie użyj myszy lub ekranu dotykowego, aby precyzyjnie narysować granicę sferoidy.
      UWAGA: Ten kontur jest mierzony bezpośrednio w celu wygenerowania osi głównych i pomocniczych, które są aktualizowane w "Tabeli wyników". Narzędzie "Rysowanie ręczne" jest używane tylko wtedy, gdy narzędzie "Inicjalizacja ręczna" nie zbiega się na żądanej granicy sferoidy.
3. Usuń zaznaczenie pola wyboru w kolumnie "Prawidłowy" w odpowiednim wierszu "Tabeli wyników", jeśli obraz nie zawiera żadnego prawidłowego sferoidu podczas inspekcji. W lewym górnym rogu obrazu kontroli jakości pojawi się etykieta "Nieprawidłowa". Jeśli opcja "Prawidłowy" nie jest zaznaczona, wartości wszystkich pomiarów są puste dla sferoidy w eksportowanych sformatowanych i wyjściowych plikach wyników.
   UWAGA: w "Tabeli wyników" dostępne są następujące skróty klawiaturowe: "strzałka w dół" dla następnego obrazu; "v" oznacza ważny/nieważny; "m" dla narzędzia "Inicjalizacja ręczna" i "h" dla narzędzia "Rysowanie ręczne".

7. Zapisywanie i eksportowanie danych

1. Kliknij przycisk "Eksportuj badanie" w oknie SpheroidSizer1.0, aby wyeksportować pośredni stan analizy, jeśli użytkownik musi wyjść z oprogramowania przed zakończeniem projektu. Określ nazwę i katalog pliku, który ma zostać zapisany.
2. Kliknij przycisk "Importuj badanie", aby przywrócić powyższy wynik stanu pośredniego z "Eksportuj badanie" i kontynuować pracę nad nim.
   UWAGA: Pliki stanu pośredniego są w natywnym formacie MATLAB (.mat) i nie mogą być bezpośrednio odczytywane przez żadne inne programy. Funkcja bezpieczeństwa wbudowana w oprogramowanie umożliwia automatyczne eksportowanie otwartego projektu w przypadku niezamierzonego zamknięcia programu. W razie potrzeby użytkownik może znaleźć ten plik, którego nazwa zaczyna się od "~tmp", który zawiera odpowiedni znacznik czasu w [Katalogu instalacyjnym].
3. Kliknij "Formatuj wyniki" w oknie SpheroidSizer1.0, aby zapisać wyniki.
   UWAGA: W katalogu eksperymentu zapisywane są dwie formy wyników. Wyeksportowane nazwy plików można skonfigurować w oknie Konfiguracja zaawansowana (patrz Krok 5.2 protokołu). Plik wyjściowy formatu jest tabelą wyznaczoną tabulatorami, która porządkuje wartość objętości w oryginalnym formacie płyty w kolejności rosnącego numeru płyty dla każdego punktu czasowego; a wszystkie punkty czasowe są zorganizowane w porządku rosnącym (rysunek 5D). Plik wyjściowy listy jest tabelą wyznaczoną tabulatorami, która zawiera wszystkie pomiary w postaci uporządkowanych list (Rysunek 5E).

Results

SpheroidSizer jest przeznaczony do automatycznego wykrywania, wyznaczania i pomiaru sferoid 3D, przy znacznie zmniejszonym nakładzie pracy i znacznie zwiększonej wydajności dla dużych ilości obrazów. Rysunek 1A przedstawia przebieg pracy SpheroidSizer. Podstawowe kroki obliczeniowe obejmują automatyczną inicjalizację, algorytm aktywnego konturu i kwantyfikację konturów. Po zautomatyzowanych obliczeniach funkcja kontroli jakości wykorzystuje kombinację narzędzi "Inicjalizacja ręczna" i "Rysowanie ręczne", aby uratować niedoskonałą segmentację. Rysunek 1B ilustruje szczegółowy algorytm automatycznego aktywnego konturu. Krok inicjalizacji (iteracja 0) wykorzystuje podstawowe etapy przetwarzania obrazu w celu wygenerowania przybliżonego rozmiaru i lokalizacji sferoidy oraz wygenerowania sferycznego konturu inicjacji o szacowanym rozmiarze. Kontur inicjacji jest zasilany przez aktywny algorytm konturu. Z kolei iteruje się, aby dostosować się do lokalnego gradientu obrazu i krzywizny kształtu. Algorytm aktywnego konturu kończy się, gdy kontur ustabilizuje się (zbiegnie), tj. 477 iteracji dla tego obrazu, lub gdy zostanie wykonana predefiniowana maksymalna liczba iteracji. W tym przykładzie kontur inicjalizacji jest celowo powiększony, aby lepiej zaprezentować algorytm. W rzeczywistości inicjalizacja jest zwykle bardzo zbliżona do rzeczywistej granicy i potrzeba znacznie mniej iteracji, aby algorytm był zbieżny. Następnie algorytm wykonuje pomiary morfometryczne wykrytej granicy sferoidalnej. Osie główna i pomocnicza sferoidy są mierzone za pomocą zestawu narzędzi do przetwarzania obrazów MATLAB (rysunek 1C). Oś główna jest definiowana jako odcinek linii łączący pojedynczą parę najdalszych punktów na konturze, który jest określany jako długość (L). Oś pomocnicza jest definiowana jako najdłuższa linia prostopadła do osi głównej, która jest określana jako szerokość (W). W tym przypadku wartości L i W są bardzo zbliżone, ponieważ sferoida jest kulista. Objętość sferoidy oblicza się jako V = 0,5 * L * W².

Jedną z cech SpheroidSizer jest automatyczne wykrywanie granic sferoid, nawet na obrazach z nierównym lub zaszumionym tłem, wykorzystując algorytm aktywnego konturu (Rysunki 2B-D). Przetwarzanie obliczeniowe obrazów w jasnym polu jest często nękane przez nierówne tło, które wprowadza w błąd metody oparte na adaptacyjnym progowaniu w celu uzyskania niepożądanych wyników progowania. Problem jest szczególnie widoczny, gdy używane są płytki wielodołkowe, a ścianki studzienek mogą powodować efekty cieniowania na obrazach. Ponieważ jednak algorytm aktywnego konturu nie jest wrażliwy na stopniową zmianę cieniowania tła, jest w stanie zidentyfikować segmentację sferoidów na tych obrazach w jasnym polu przy odpowiedniej inicjalizacji. Rysunek 2 przedstawia kilka przykładów obrazów z nierównym lub zaszumionym tłem, takich jak nierównomierne oświetlenie (Rysunek 2B), szczątki (Rysunek 2C) lub nekrotyczne jądro (Rysunek 2D). Dzięki zautomatyzowanemu algorytmowi aktywnego konturu, SpheroidSizer dokładnie wyznacza te sferoidy na wszystkich tych obrazach, jak pokazano na czerwonym konturze w dolnym panelu każdej figury.

Funkcja kontroli jakości w SpheroidSizer jest kluczem do przepływu pracy o wysokiej przepustowości. Narzędzia "Inicjalizacja ręczna" i "Rysowanie ręczne" są cennymi narzędziami uzupełniającymi dla tej aplikacji. Wśród setek lub tysięcy obrazów nieuniknione jest, że zautomatyzowany algorytm nie jest w stanie poprawnie wykryć sferoid na niektórych obrazach. Jak pokazano na rysunku 3A, gdy niewłaściwe wykrycie sferoidy jest spowodowane etapem inicjalizacji, tj. niewłaściwym rozmiarem lub lokalizacją konturu inicjacji na obrazie (górny panel), narzędzie "Inicjalizacja ręczna" działa poprzez umożliwienie użytkownikowi prawidłowego ręcznego zdefiniowania lokalizacji i rozmiaru sferoidy (dolny panel). Uruchamia aktywny algorytm konturu, który inicjuje się ręcznie zdefiniowanym konturem i wykonuje w celu zbieżności do żądanego konturu. W przypadku tych trudnych obrazów, takich jak oryginalny obraz na rysunku 3B, sferoida znajduje się na rozpraszającym i hałaśliwym tle. SpheroidSizer nie jest w stanie poprawnie zidentyfikować sferoidy za pomocą metody automatycznej (górny panel) lub narzędzia "Ręczna inicjalizacja" z odpowiednią inicjalizacją (środkowy panel). W takim przypadku narzędzie "Rysowanie ręczne" może być użyte do ręcznego narysowania konturu sferoidy, jak pokazano w dolnym panelu. Program wykorzystuje granicę zdefiniowaną przez użytkownika do pomiaru osi głównej i pomocniczej sferoidy oraz obliczenia objętości. Wszystkie poprawione wyniki są natychmiast włączane do "Tabeli wyników" i mogą być odpowiednio eksportowane.

Aby określić wydajność SpheroidSizer w większych zestawach danych, najpierw porównujemy czas działania, analizując ten sam zestaw 288 obrazów za pomocą 1) ręcznych pomiarów za pomocą oprogramowania dostarczonego przez dostawcę mikroskopu; 2) SpheroidSizer ze zwykłym laptopem jednordzeniowym; oraz 3) SpheroidSizer z wielordzeniową stacją roboczą o wydajności obliczeń równoległych. Pomiary ręczne są zgodne z naszym typowym protokołem przed opracowaniem oprogramowania: długość i szerokość każdej sferoidy są rysowane ręcznie i mierzone za pomocą programu dostawcy (jak widać czerwone linie w górnym panelu na rysunku 4A); Następnie użytkownik kopiuje wartości pomiarów. SpheroidSizer przetwarza każdy obraz, generując granicę sferoidalną (jak pokazano na czerwonym konturze w dolnym panelu rysunku 4A), mierząc osiową długość główną i poboczną oraz eksportując wyniki do arkuszy kalkulacyjnych. Jak widać w tabeli 1, na podstawie obliczeń z 288 obrazów, ręczny pomiar jednej sferoidy na obraz zajmuje średnio 31,67 sekundy; podczas gdy zajmuje to tylko mniej niż 2 sekundy podczas uruchamiania na zwykłym laptopie jednordzeniowym; i mniej niż 1 s w przypadku pracy na 12-rdzeniowej stacji roboczej o wysokiej wydajności. Dlatego analiza obrazu jest ponad 18 razy szybsza na obraz przy użyciu SpheroidSizer niż pomiary ręczne. Znacznie zmniejsza to nakład pracy, gdy analizowanych jest więcej niż tysiące obrazów. Następnie porównujemy zmienność pomiarów 24 sferoid pokazanych na rysunku 4A między pomiarami ręcznymi a SpheroidSizer. 24 sferoidy są mierzone trzykrotnie obiema metodami; i oblicza się odchylenie standardowe każdej pojedynczej sferoidy. Jak widać na rysunku 4B, odchylenie standardowe od SpheroidSizer (zielona linia i kropki) jest bliskie zeru, z wyjątkiem trzech sferoid, które są korygowane na etapie kontroli jakości, które nadal wykazują mniejsze odchylenie standardowe niż te z metody pomiarów ręcznych. Wszystko to wskazuje na to, że SpheroidSizer przeprowadza analizę obrazu wydajniej i dokładniej.

Przeprowadziliśmy badanie przesiewowe leków przy użyciu ludzkich sferoidów guza BON-1 3D, aby dowiedzieć się, które związki w połączeniu z inhibitorem hsp90 są potencjalnymi kandydatami do testowania działania przeciwnowotworowego in vivo. Ludzkie sferoidy guza BON-1 3D hodowano na 96-dołkowych płytkach pokrytych agarozą, jak opisano w poprzednim artykule¹⁵. Osiem różnych związków z sześcioma seryjnymi rozcieńczeniami oraz pożywką i nośnikiem przebadano pod kątem ich pojedynczych i kombinatorycznych efektów z inhibitorem hsp90 odpowiednio 10 nM i 20 nM w duplikatach. Dla każdego stężenia pojedynczego związku lub połączonych związków zastosowano dwie sferoidy. Użyto czterech 96-dołkowych płytek o łącznej liczbie 384 sferoid. Wszystkie sferoidy zostały sfotografowane w godzinach 0, 72, 144, 168 i 192. W sumie w wyniku tego eksperymentu wykonano 1920 obrazów. SpheroidSizer potrzebował tylko 30 minut, aby zakończyć analizę obliczeniową 1 920 obrazów z dodatkowymi 50 minutami na kontrolę jakości i eksport danych. SpheroidSizer ogromnie przyspiesza proces analizy obrazu. Rysunek 5A przedstawia zrzut ekranu przedstawiający rozmieszczenie folderów i nazwy plików dla tego eksperymentu jako przykład kroku 3.3 protokołu. Rysunki 5B-E pokazują zrzuty ekranu wyskakujących okienek analizy obrazu i wyniki przy użyciu SpheroidSizer jako ilustracje dla kroków protokołu 4, 5 i 7. Biorąc objętości sferoid 3D ze sformatowanej tabeli wyników wyeksportowanej ze SpheroidSizer, wykonaliśmy wykresy - wzrost sferoid guza 3D po leczeniu złożonym w porównaniu z czasem zabiegów. Dwa reprezentatywne wykresy z tego eksperymentu pokazano na rysunkach 5F i 5G. Rycina 5F pokazuje, że skojarzone leczenie inhibitorem hsp90 i kladrybiną (zielona linia) hamuje wzrost sferoidów 3D bardziej niż pojedyncze leczenie inhibitorem hsp90 (fioletowa linia) lub kladrybiną (pomarańczowa linia), co sugeruje, że skojarzone leczenie inhibitorem hsp90 i kladrybiną może mieć działanie przeciwnowotworowe in vivo. Rysunek 5G pokazuje, że skojarzone leczenie inhibitorem hsp90 i adriamycyną (zielona linia) nie hamuje wzrostu sferoidów 3D bardziej niż pojedyncze leczenie adriamycyną (linia pomarańczowa) lub inhibitorem hsp90 (linia fioletowa), co sugeruje, że skojarzone leczenie inhibitorem hsp90 i adriamycyną może nie mieć działania przeciwnowotworowego in vivo. Ten eksperyment pomógł nam lepiej dobrać związki do przetestowania ich działania przeciwnowotworowego in vivo, a SpheroidSizer jest kluczem do szybkiej analizy danych eksperymentalnych.

Tabela 1. Porównanie czasu pracy na analizie obrazu między pomiarami ręcznymi a SpheroidSizer podczas analizy tego samego zestawu 288 obrazów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej tabeli.

Rysunek 1. SpheroidSizer - aplikacja typu open source do pomiaru rozmiaru sferoidy. ZA)Podstawowy przepływ pracy aplikacji. ZA)Ilustracja algorytmu aktywnego konturu na różnych etapach iteracji. Należy pamiętać, że kontur inicjalizacji (iteracja 0) został celowo powiększony w celu zaprezentowania algorytmu. C)Pomiary głównej i pobocznej długości osiowej oraz obliczanie objętości za pomocą SpheroidSizer. L - oś główna: odcinek linii łączący pojedynczą parę najdalszych punktów na konturze (w odniesieniu do długości); W - oś mniejsza: najdłuższa linia prostopadła do osi głównej (odniesiona do szerokości).

Rysunek 2. Reprezentatywne wyniki automatycznej segmentacji SpheroidSizer, wykazujące odporność na różne warunki obrazu. ZA)Typowe obrazy dobrej jakości. ZA)Obrazy o różnej jasności i kontraście. C)Obrazy z rozpraszającymi szczątkami. d)Obrazy sferoid z nekrotycznym jądrem. Obrazy w górnym panelu każdej figury są obrazami źródłowymi/oryginalnymi; Obrazy w dolnym panelu każdego rysunku są obrazami kontroli jakości; A czerwony kontur to segmentacja sferoidalna narysowana za pomocą automatycznych obliczeń.

Rysunek 3. Ilustracja narzędzi "Inicjalizacja ręczna" i "Rysowanie ręczne". ZA)Narzędzie "Inicjalizacja ręczna" umożliwia narysowanie pasującego kształtu elipsy w poprzek sferoidy w celu inicjalizacji, gdy po automatycznej inicjalizacji nastąpi niedokładna segmentacja sferoidy. ZA)Narzędzie "Rysowanie ręczne" umożliwia dokładne ręczne narysowanie granicy sferoidy, gdy wystąpią niedokładne segmentacje sferoidów zarówno przy automatycznej, jak i ręcznej inicjalizacji. Niebieska linia wokół sferoidy pokazuje kontur inicjalizacji; Czerwony kontur to zidentyfikowana granica sferoidalna. Należy pamiętać, że sferoida w "Ręcznej inicjalizacji" w A) i sferoida w "Ręcznym rysowaniu" w B) są celowo powiększone, aby lepiej zaprezentować narzędzia.

Rysunek 4. Porównanie wydajności analizy obrazu między SpheroidSizer a pomiarami ręcznymi podczas analizy tego samego zestawu 24 obrazów. A) Reprezentatywne sferoidy pokazujące, w jaki sposób długość i szerokość sferoid są określane za pomocą pomiarów ręcznych i SpheroidSizer. 24 pierwsze obrazy zawierają ręcznie narysowaną długość/szerokość każdej sferoidy w czerwonych liniach przy użyciu pomiarów ręcznych; dolne 24 obrazy (te same 24 obrazy) zawierają komputerowo narysowaną granicę sferoidalną w czerwonym konturze za pomocą SpheroidSizer. ZA)Odchylenie standardowe długości lub szerokości z trzech pomiarów dla każdej pojedynczej sferoidy.

Rysunek 5. Reprezentatywny przykład wykorzystania SpheroidSizer w badaniach przesiewowych leków - analiza obrazu na obrazach sferoidów, które zostały zebrane z badania przesiewowego leku przy użyciu sferoid guza BON-1 3D. ZA)Zrzut ekranu przedstawiający rozmieszczenie folderów i nazwy plików dla tego projektu. ZA)Zrzut ekranu okna konfiguracji zaawansowanych w SpheroidSizer. C)Zrzut ekranu okna SpheroidSizer1.0 z wyświetloną tabelą wyników. d)Zrzut ekranu pliku wyjściowego w formacie wyeksportowanego ze SpheroidSizer. E)Zrzut ekranu pliku wyjściowego listy wyeksportowanego z programu SpheroidSizer. F)Wzrost sferoid guza 3D po leczeniu inhibitorem hsp90 i kladrybiną. g)Wzrost sferoid guza 3D po leczeniu inhibitorem hsp90 i adriamycyną. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Pliki uzupełniające: oprogramowanie SpheroidSizer.Kliknij tutaj, aby pobrać te pliki.

Discussion

Badanie to przedstawia szybki, elastyczny, skuteczny i zautomatyzowany program - SpheroidSizer do dokładnego określania wielkości sferoid guza 3D. SpheroidSizer jest łatwy w użyciu i wymaga minimalnego wkładu użytkownika. Do najważniejszych etapów dokładnego, płynnego i udanego działania SpheroidSizer należą: obrazowanie sferoid w środku pola bez dotykania krawędzi studni; wszystkie pliki, które mają być analizowane razem jako jeden projekt, powinny być zobrazowane pod tym samym mikroskopem w tym samym celu; wszystkie pliki, które mają być analizowane, są poprawnie nazwane i ułożone zgodnie ze wskazaniami w protokole; i poprawne ustawienia zdefiniowane przez użytkownika są wprowadzane przed obliczeniami.

Do zalet SpheroidSizer należy to, że toleruje stopniową zmianę tła na obrazie, a także generuje gładkie kontury, które odpowiadają ogólnym sferycznym kształtom sferoid przy użyciu algorytmu aktywnego konturu. Wydajność aktywnego konturu może być zagrożona w dwóch sytuacjach: słaba inicjalizacja lub obecność innych lokalnych krawędzi odwracających uwagę od pożądanego konturu. Szczególnie w naszych testowanych przypadkach druga sytuacja czasami ma miejsce, gdy nekrotyczne jądro dużego sferoidu przyciąga aktywny kontur, co skutkuje zgłoszeniem mniejszego konturu. Warto zauważyć, że inne zautomatyzowane metody oparte na progach również cierpią w tej sytuacji, chyba że próg jest specjalnie ustawiony ręcznie. W związku z tym oprogramowanie dokłada wszelkich starań, aby pomóc użytkownikom w wykrywaniu i usuwaniu naruszonej segmentacji, zapewniając łatwe funkcje kontroli jakości. Jeśli błąd segmentacji wynika ze złej inicjalizacji, użytkownicy mogą użyć narzędzia "Inicjalizacja ręczna", aby zastąpić automatyczną inicjalizację. Gdy jakość obrazu jest zbyt niska dla aktywnego konturu, użytkownicy mogą łatwo "ręcznie narysować" kontur, który jest zasilany przez kwantyfikację. Istniejące oprogramowanie, takie jak CellProfiler, można dostosować do tego zastosowania w sposób półautomatyczny. Przepływ pracy może być uciążliwy, gdy prezentowane są duże ilości obrazów w różnych warunkach obrazowania lub gdy podzbiór obrazów wymaga większej interwencji człowieka w celu prawidłowego pomiaru. SpheroidSizer zapewnia kompleksowy pakiet do obliczeń i kontroli jakości do zarządzania przepływem pracy związanym z analizą obrazów o wysokiej przepustowości.

SpheroidSizer jest obecnie ograniczony do wykrywania jednego sferoidy na obraz i mierzy tylko długość osiową sferoidy. Program może zostać rozszerzony w celu wsparcia dalszej kwantyfikacji potrzebnej badaczom, takiej jak kwantyfikacja sferoid z nekrotycznym rdzeniem, wykrywanie wielu sferoid na jednym obrazie lub monitorowanie kształtu sferoid. Co więcej, program może być modyfikowany w celu wykrywania i mierzenia wielkości wyciętych guzów od zwierząt lub ludzi, co z pewnością będzie korzystne dla badaczy podczas prowadzenia badań przedklinicznych lub klinicznych in vivo . Przetwarzanie końcowe wykrytych sferoid może być również badane w celu zmniejszenia wysiłku ludzkiego potrzebnego do kontroli jakości i dalszej poprawy przepustowości. SpheroidSizer to uogólniona aplikacja do analizy obrazu dla sferoid guzów 3D, które są wytwarzane z dowolnych typów komórek, a zatem mogą być używane przez szeroką społeczność badaczy raka.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mikroskop odwrócony Axiovert 200M	Carl Zeiss Microscopy, LLC		mikroskop do obrazowania
Vostro 1720	Dell Inc.		jednordzeniowy zwykły laptop
HP Z820	HP Inc.		wielordzeniowa wydajna stacja robocza
MATLAB i Simulink R2013a	Oprogramowanie Mathworks, Inc, Natick, MA		MATLAB