Ten protokół opisuje procedurę seryjnego pobierania próbek szpiku kostnego kości udowej (BM) bez konieczności poświęcania myszy. Procedura ta ułatwia badania podłużne składu BM myszy w czasie i zapewnia szeregowy dostęp do komórek w BM do badań ex vivo i transplantacji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Aspiracja szpiku kostnego kości udowej u żywych myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Seryjne pobieranie próbek składu komórkowego szpiku kostnego (BM) jest rutynową procedurą krytyczną dla hematologii klinicznej. Protokół ten opisuje szczegółową procedurę techniczną krok po kroku dla analogicznej procedury na żywych myszach, która pozwala na seryjną charakterystykę komórek obecnych w BM. Procedura ta ułatwia badania mające na celu wykrycie obecności egzogennie podawanych komórek w BM myszy, tak jak miałoby to miejsce na przykład w badaniach ksenoprzeszczepów. Co więcej, procedura ta pozwala na pobranie i scharakteryzowanie komórek wzbogaconych w BM, takich jak hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC) bez poświęcania myszy. Biorąc pod uwagę, że skład komórkowy krwi obwodowej niekoniecznie odzwierciedla proporcje i typy komórek macierzystych i progenitorowych obecnych w szpiku, bardzo pomocne są procedury, które zapewniają dostęp do tego przedziału bez konieczności terminacji myszy. Zastosowanie aspiracji szpiku kostnego kości udowej przedstawiono tutaj do analizy cytologicznej komórek szpiku, charakterystyki cytometrii przepływowej hematopoetycznego przedziału macierzystego/progenitorowego oraz hodowli posortowanych HSPC uzyskanych przez aspirację BM kości udowej w porównaniu z konwencjonalnym pobraniem szpiku.
Wprowadzenie
Wszystkie komórki krwi pochodzą z hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC). Procedury, które umożliwiają dostęp do szpiku kostnego (BM), miejsca występowania zdecydowanej większości HSC u myszy i ludzi, bez konieczności składania ofiar ze zwierząt, zapewniają zasoby do seryjnego monitorowania źródła hematopoezy. Ogólnym celem opisanej tutaj procedury jest dostarczenie szczegółowego protokołu pobierania próbek komórek BM z kości udowej żywych myszy, który zapewnia materiał reprezentatywny dla komórek, które zostałyby odzyskane przez konwencjonalne pobieranie komórek BM poprzez poświęcenie myszy. Przewagą tej procedury nad konwencjonalnym pobieraniem komórek BM jest to, że procedura ta nie wymaga poświęcania myszy, a zatem pozwala na podłużne badanie przedziału szpiku kostnego myszy w czasie.
Chociaż ta procedura aspiracji szpiku kostnego była stosowana w wielu badaniach i opisana wcześniej (zobacz Sundberg et al. W przypadku przeglądu historycznego1), formalne procedury krok po kroku ilustrujące tę technikę nie zostały wcześniej opublikowane. Protokół ten umożliwia rutynowe seryjne pobieranie próbek BM do celów takich jak ocena wszczepienia do BM komórek egzogennie wprowadzonych do myszy (jak miałoby to miejsce w badaniach ksenoprzeszczepów na przykład2,3), analiza chimeryzmu w BM w celu porównania z krwią obwodową (gdzie wyniki niekoniecznie są zgodne), monitorowanie obfitości określonych typów komórek normalnie wzbogaconych w szpiku, takich jak hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe, oraz pobieranie komórek BM do hodowli ex vivo i/lub przeszczepu. Ponadto ocena zawartości szpiku może być bardzo przydatna w mysich modelach choroby hematologicznej, ponieważ aspiracja jest pomocna w ocenie obciążenia chorobą hematologiczną w momentach, w których choroba może nie być widoczna we krwi obwodowej3-5. Ponadto technika ta może być wykorzystana do oceny odpowiedzi choroby hematologicznej szpiku kostnego na leki podawane w badaniach terapeutycznych. W związku z tym opisana tutaj procedura jest idealna dla badaczy chcących uzyskać dostęp do komórek krwiotwórczych szpiku kostnego od myszy do analizy cytologicznej, analizy cytometrii przepływowej, hodowli in vitro i / lub badań transplantacyjnych in vivo bez konieczności poświęcania lub szkodzenia myszom.
Protokół pobierania próbek BM opisany tutaj jest dość podobny do techniki stosowanej do wstrzykiwania materiału bezpośrednio do jamy szpiku3,6. Kluczowa różnica polega na tym, że protokół ten szczegółowo opisuje procedurę usuwania komórek ze szpiku, w przeciwieństwie do wkraplania materiału bezpośrednio do przestrzeni jamy szpiku, jak ma to miejsce w przypadku wstrzyknięcia doudowego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury na zwierzętach opisane w tym protokole zostały przeprowadzone zgodnie z Wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.
1. Aspiracja komórek szpiku kostnego (BM) z kości udowej
- Mysz, która będzie poddawana aspiracji szpiku kostnego kości udowej, należy znieczulić izofluranem (1-4%) podawanym za pomocą precyzyjnego waporyzatora. Głębokość znieczulenia powinna być monitorowana co 5-10 minut przez cały zabieg, obserwując, że nie ma zmian w częstości oddechów związanych z manipulacją chirurgiczną i/lub szczypaniem ucha, palców u nóg i ogona. Znieczulenie jest wywoływane izofluranem i utrzymywane przez cały zabieg z izofluranem. Prewencyjna dawka przedzabiegowa buprenorfiny w dawce 0,05-0,1 mg/kg mc. podawana podskórnie co 6-12 godzin może być stosowana w celu zapobiegania bólowi związanemu z zabiegiem jako uzupełnienie karprofenu.
- Nałóż maść okulistyczną na oczy myszy po indukcji znieczulenia, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.
- Sierść jest starannie przycinana z obszaru skóry o około 150% większego niż obszar zamierzonego miejsca aspiracji. Luźne futro usuwa się wilgotnym gazikiem. Proszę trzymać mysz na podkładce z cyrkulującą ciepłą wodą lub innej bezpiecznej powierzchni kontrolowanej termostatycznie, aby zapobiec hipotermii podczas zabiegu.
- Zdezynfekuj całą nogę, w której znajduje się kość udowa, która zostanie poddana aspiracji, za pomocą trzech zestawów naprzemiennych peelingów (na przemian z powidonem (Betadine) lub chlorheksydyną (Nolvasan) i 70% alkoholem izopropylowym lub 70% gąbkami z gazy nasączonymi etanolem).
- Zwilż strzykawkę tuberkulinową o pojemności 0,5 ml (objętość: 0,5 cm³; rozstaw: 27,5 g) sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) przed zasysaniem BM. Napełnij strzykawkę 200-500 μl PBS i natychmiast wydal PBS. Powtórz tę procedurę 2-3 razy.
- Utrzymuj kość piszczelową zgiętą od kości udowej, popychając kość piszczelową palcem serdecznym lub piątym palcem. Upewnij się, że osiągnięto odpowiednią płaszczyznę znieczulania. Strzykawkę trzyma się kciukiem i palcem wskazującym. Pozwala to na odsłonięcie kłykci i ułatwia wprowadzenie igły.
- Po zwilżeniu strzykawki należy wprowadzić igłę przez ścięgno rzepki tak, aby igła była bezpiecznie osadzona między dwoma kłykciami kości udowej. Trzymając trzon blisko nasady kości udowej kciukiem i palcem wskazującym, igła jest łatwo wprowadzana do trzonu kości udowej.
- Obrócić igłę na zewnątrz i do góry, tak aby była równoległa do trzonu kości udowej. Działanie to ułatwia pobieranie zawartości szpiku kostnego z trzonu kości udowej.
- Obróć igłę zgodnie z ruchem wskazówek zegara i przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, powoli wpychając ją do jamy szpiku udowego. Potwierdzić prawidłowe ułożenie igły, delikatnie przesuwając strzykawkę na boki.
- Delikatnie pociągnąć tłok igły do tyłu, wytwarzając podciśnienie, jednocześnie przesuwając igłę do przodu i do tyłu w jamie BM. Uwaga: Objętość zasysanego BM będzie wynosić około 5 μl, co zwykle odpowiada 0,4-0,8 x 106 komórek jednojądrzastych. Pomyślne aspiracje zostanie potwierdzone wizualnie przez pojawienie się krwi w górnej części igły w podstawie strzykawki. Jeśli w strzykawce nie widać krwi, prawdopodobnie w igle utknął mały fragment kości lub tkanki. Można go usunąć z igły, przesuwając tłok w górę i w dół w PBS (jest to jeden z powodów, dla których strzykawka powinna być wstępnie napełniona PBS przed zassaniem BM). Jeśli nie można usunąć tkanki ze strzykawki, należy użyć nowej igły i strzykawki (ponownie zwilżyć strzykawkę 200-500 μl PBS).
- Po pomyślnym odessaniu BM z kości udowej należy wyjąć igłę i strzykawkę z kości udowej i myszy.
- Przenieś zasysany BM do probówki do mikrofuge wstępnie napełnionej 500 μl PBS. W przypadku większości zastosowań komórki BM powinny być następnie przechowywane na lodzie do czasu dalszego przetwarzania, jeśli to możliwe.
- Po zakończeniu zabiegu podać podskórnie środek przeciwbólowy z karprofenem w dawce 5 mg/kg. Następnie wyjmij mysz ze znieczulenia i umieść ją na rozgrzanej podkładce, aż do całkowitego wyzdrowienia. UWAGA: Po zabiegu aspiracji nie powinno wystąpić żadne komplikacje ani niepokój, jeśli zostanie on wykonany prawidłowo.
- Przed powrotem myszy do pomieszczenia mieszkalnego upewnij się, że są w stanie poruszać się i docierać do jedzenia i wody. Obserwuj myszy pod kątem oznak niepokoju lub infekcji po zabiegu w ciągu najbliższych 24 godzin. Objawy obejmują: ciągłe krwawienie, niedokrwistość, letarg. Jeśli którykolwiek z tych objawów zostanie zauważony po zabiegu, zwierzę (zwierzęta) powinno zostać poddane eutanazji. Uwaga: Aspirację/pobieranie próbek BM można powtórzyć, ale powtórzoną procedurę należy wykonać na przeciwległej kości udowej, aby zapobiec powtarzającym się urazom tej samej nogi. Dostępnych jest niewiele informacji na temat częstotliwości, z jaką można wykonywać aspirację BM. Aspirację szpiku kostnego kości udowej powtarza się na ogół nie częściej niż co 2 tygodnie.
2. Ocena zawartości komórkowej w aspirowanych komórkach BM
- Komórki osadu pobrane z aspiracji BM i umieścić w probówce do mikrofuge przez odwirowanie w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 oC lub RT.
- Odessać supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad w 500 μl buforu do lizy czerwonych krwinek ACK (bufor do lizy (bufor do lizy amon-chlorek-potas).
- Inkubować komórki w buforze do lizy krwinek czerwonych przez 10 minut, a następnie dodać 1 ml PBS i ponownie odwirowywać mieszaninę przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 oC lub RT. Uwaga: Osad z lizy krwinek czerwonych składa się teraz z komórek jednojądrzastych BM. Można je ponownie zawiesić w celu barwienia FACS, zliczania komórek, przeszczepu, analizy cytospinowej i / lub dowolnego innego zastosowania (tak jak użyto by komórek BM pobranych od ofiarowanych myszy).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Do pobrania mononuklearnych komórek szpiku kostnego (BM) wykorzystano aspirację z kości udowej żywej myszy C57/B6, a następnie przeprowadzono konwencjonalny pobór szpiku z tej samej myszy po jej uśmierceniu. Komórki mononuklearne BM uzyskane dwiema metodami poddano następnie (1) analizie cytologicznej komórek BM, (2) oznaczeniu względnej częstości występowania krwiotwórczych komórek macierzystych/progenitorowych (HSPCs) oraz (3) hodowli ex vivo wyselekcjonowanych komórek HSPCs. W tym ostatnim eksperymencie komór...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Seryjna aspiracja BM jest rutynową procedurą o kluczowym znaczeniu dla klinicznego badania zaburzeń hematologicznych u ludzi. Bardzo cenna jest również możliwość przeprowadzenia analogicznego seryjnego pobierania próbek BM u myszy w celu scharakteryzowania składu komórkowego i składników BM podczas długotrwałych eksperymentów. Procedura ta jest przydatna do charakteryzowania HSPC bez poświęcania myszy, ale także do wykrywania obecności dodatkowych typów komórek w BM w przypadkach, gdy zawartość krwi obwodowej może nie od...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
O.A.-W. jest wspierany przez NIH K08 Clinical Investigator Award (1K08CA160647-01), U.S. Department of Defense Postdoctoral Fellow Award in Bone Marrow Failure Research (W81XWH-12-1-0041), Josie Roberston Investigator Program, oraz Damon Runyon Clinical Investigator Award ze wsparciem Evan's Foundation.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| PBS | PAA | H15-002 | |
| Albumina surowicy bydlęcej | PAA | K41-001 | |
| ACK bufor do lizy | Domowej roboty | w 1 L. Dostosuj pH 7,2 ~ 7,4 i filtruj sterylnie za pomocą 0,22 μ m filtr próżniowy. | |
| 8,3 g Chlorek amonu | Fisher Scientific | A661-500 | |
| 1 g Wodorowęglan potasu | Fisher Scientific | P184-500 | |
| 200 μ l 0,5 M EDTA pH 8 | Gibco | 15575-038 | |
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| 0,5 ml Strzykawka tuberkulinowa 27,5 G | Becton Dickinson | 305620 | |
| Sterylne sitko komórkowe 70 μ m | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Isoflurane, USP | Attane | NDC: 66794-014-25 | |
| Igła z końcem | Stemcell Technologies | 28110 | |
| Igła PrecisionGlide 23 G | Becton Dickinson | 305193 | |
| 3 ml Strzykawka Luer-Lok 3 ml Becton | Dickinson | 309657 | |
| Płytka niepoddana hodowli tkankowej, 6 Studnia | Becton Dickinson | 351146 | |
| 12 x 75 mm 5 ml probówki | Barwienie Becton Dickinson | 352054 | FACS |
| 12 x 75 mm 5 ml probówki z nasadką z sitkiem do komórek | Barwienie Becton Dickinson | 352235 | FACS |
| NK1.1 APC-Cy7 | Biolegend | 108723 | |
| CD11b APC-Cy7 | Biolegend | 101225 | |
| CD45R (B220) APC-Cy7 | Biolegend | 103223 | |
| CD3 APC-Cy7 | Biolegend | ||
| Ly-6G i Ly-6C (Gr-1) APC-Cy7 | Biolegend | 108423 | |
| Ter119 APC-Cy7 | Biolegend | 116223 | |
| CD19 APC-Cy7 | Biolegend | 302217 | |
| CD4 APC-Cy7 | BioLegend | 317417 | |
| CD117 (c-KIT) PE | BioLegend | 105808 | |
| Ly-6A/E (SCA-1) PE-Cy7 | Biolegend | ||
| CD34 APC | Biolegend | 128612 | |
| CD16/32 e450 | eBioscience | 48-0161-82 | |
| DAPI (dichlorowodorek 4&,6-diamidyno-2-fenyloindolu) | Sigma-Aldrich | 32670 | |
| MethoCult GF M3434 | STEMCELLTECHNOLOGIES | 3434 | Do hodowli metocelulozy |
| Carprofen | Crescent Chemical Firma | C11045850 | 1 dawka (5mg/kg) |
| Cytometr przepływowy, LSRFortessa | Becton Dickinson | ||
| Puralube maść weterynaryjna (sterylna maść okulistyczna do wazeliny) | Dechra-US | 17033-211-38 |
Bibliografia
- Sundberg, R., Hodgson, R. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4, 557-561 (1949).
- Schmitz, M., Bourquin, J. -P., Bornhauser, B. C. Alternative technique for intrafemoral injection and bone marrow sampling in mouse transplant models. Leukemia & lymphoma. 52, 1806-1808 (2011).
- Warner, J. K., et al. Direct evidence for cooperating genetic events in the leukemic transformation of normal human hematopoietic cells. Leukemia. 19, 1794-1805 (2005).
- Chiu, P. P., Jiang, H., Dick, J. E. Leukemia-initiating cells in human T-lymphoblastic leukemia exhibit glucocorticoid resistance. Blood. 116, 5268-5279 (2010).
- Guan, Y., Gerhard, B., Hogge, D. E. Detection, isolation, and stimulation of quiescent primitive leukemic progenitor cells from patients with acute myeloid leukemia (AML). Blood. 101, 3142-3149 (2003).
- Nolta, J. A. The gold standard improves: a better assay for HSCs. Blood. 106, 1141-1142 (2005).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Purton, L., Scadden, D. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell stem cell. 1, 263-270 (2007).
- Dykstra, B., et al. Long-term propagation of distinct hematopoietic differentiation programs in vivo. Cell stem cell. 1, 218-229 (2007).
- Jordan, C., Lemischka, I. Clonal and systemic analysis of long-term hematopoiesis in the mouse. Genes & development. 4, 220-232 (1990).
- Challen, G., et al. Dnmt3a is essential for hematopoietic stem cell differentiation. Nature genetics. 44, 23-31 (2012).
- Hess, D. A., et al. Selection based on CD133 and high aldehyde dehydrogenase activity isolates long-term reconstituting human hematopoietic stem cells. Blood. 107, 2162-2169 (2006).
- Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nat Med. 9, 959-963 (2003).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
