Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In vivo (in vivo) Klonalne śledzenie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych oznaczonych pięcioma białkami fluorescencyjnymi przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej

12.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51669

⸱

6 sierpnia 2014

 ,  , 
1Light Microscopy Core Facility, NHLBI/NIH, 2Hematology Branch, NHLBI/NIH

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Kombinatoryczne oznaczanie 5 fluorescencyjnych białek hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych pozwala na śledzenie klonów in vivo za pomocą mikroskopii konfokalnej i dwufotonowej, dostarczając wglądu w architekturę hematopoetyczną szpiku kostnego podczas regeneracji. Metoda ta umożliwia nieinwazyjne mapowanie losów kodowanych spektralnie komórek pochodzących z HSPC w nienaruszonych tkankach przez długi czas po przeszczepie.

Streszczenie

Opracowaliśmy i zatwierdziliśmy metodologię znakowania fluorescencyjnego do klonalnego śledzenia hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową, aby badać hematopoezę in vivo przy użyciu eksperymentalnego modelu przeszczepu szpiku kostnego u myszy. Genetyczne znakowanie kombinatoryczne przy użyciu wektorów lentiwirusowych kodujących białka fluorescencyjne (FP) umożliwiło mapowanie losu komórek za pomocą zaawansowanego obrazowania mikroskopowego. Wektory kodujące pięć różnych FP: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato i mCherry zostały użyte do jednoczesnej transdukcji HSPC, tworząc różnorodną paletę komórek oznaczonych kolorem. Obrazowanie za pomocą konfokalnej/dwufotonowej mikroskopii hybrydowej umożliwia jednoczesną ocenę w wysokiej rozdzielczości jednoznacznie oznaczonych komórek i ich potomstwa w połączeniu ze składnikami strukturalnymi tkanek. Analizy wolumetryczne na dużych obszarach ujawniają, że spektralnie kodowane komórki pochodzące z HSPC mogą być wykrywane nieinwazyjnie w różnych nienaruszonych tkankach, w tym w szpiku kostnym (BM), przez długi czas po przeszczepie. Badania na żywo łączące obrazowanie wielofotonowe z szybkością wideo i konfokalne obrazowanie poklatkowe w 4D pokazują możliwość dynamicznego śledzenia komórkowego i klonalnego w sposób ilościowy.

Wprowadzenie

Produkcja komórek krwi, określana jako hematopoeza, jest utrzymywana przez małą populację hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC). Komórki te znajdują się w szpiku kostnym (BM) w złożonej niszy mikrośrodowiskowej składającej się z osteoblastów, komórek zrębu, tkanki tłuszczowej i struktur naczyniowych, z których wszystkie są zaangażowane w kontrolę samoodnawiania i różnicowania1,2. Ponieważ nienaruszony BM był tradycyjnie niedostępny dla bezpośrednich obserwacji, interakcje między HSPC a ich mikrośrodowiskiem pozostają w dużej mierze niescharakteryzowane in vivo. Wcześniej opracowaliśmy metodologię wizualizacji architektury 3D nienaruszonego BM za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej i refleksyjnej3. Scharakteryzowaliśmy ekspansję HSPC oznaczonych EGFP w BM, ale użycie tylko jednego FP wykluczyło analizę regeneracji na poziomie klonalnym. Całkiem niedawno wykorzystaliśmy wektory Lentiviral Gene Ontology (LeGO) konstytuujące ekspresję białek fluorescencyjnych (FPs), aby skutecznie oznaczać komórki4,5. Kotransdukcja HSPC z 3 lub 5 wektorami generuje zróżnicowaną paletę kombinatorycznych kolorów, umożliwiając śledzenie wielu pojedynczych klonów HSPC.

Oznaczone HSPC w połączeniu z nową technologią obrazowania pozwalającą na śledzenie indywidualnego naprowadzania i wszczepienia HSPC w BM napromieniowanych myszy. Wektory LeGO wykorzystano do oznaczenia HSPC za pomocą 3 lub 5 różnych FP (od Cerulean, eGFP, Venus, tdTomato i mCherry) i śledzenia ich wszczepienia w czasie w BM za pomocą mikroskopii konfokalnej i 2-fotonowej, co pozwoliło na wyraźną wizualizację struktur kostnych i innych struktur macierzy oraz relacji klonów HSPC ze składnikami ich mikrośrodowiska. HSPC oczyszczono jako ujemne komórki linii myszy C57Bl / 6 BM, transdukowane wektorami LeGO i ponownie podawane przez wstrzyknięcie żyły ogonowej do myszy kongenicznych z ablacją mielogiczną. Monitorując duże objętości tkanki BM mostka, uwidoczniliśmy wszczepienie śródkostne występujące na wczesnym etapie regeneracji BM. Skupiska komórek o zróżnicowanym widmie kolorystycznym pojawiały się początkowo w bliskiej odległości od kości i rozwijały się centralnie w czasie. Co ciekawe, po ponad 3 tygodniach szpik składał się z makroskopowych klastrów klonalnych, co sugeruje rozprzestrzenianie się hematopoezy pochodzącej z poszczególnych HSPC sąsiadujących ze szpikiem kostnym, a nie powszechne rozprzestrzenianie się HSPC przez krwioobieg. Różnorodność kolorów była mniejsza w późnych punktach czasowych, co sugeruje trudności w transdukcji długoterminowego ponownego zasiedlania komórek wieloma wektorami.

Ponadto, HSPC tworzyły skupiska w śledzionie, organie odpowiedzialnym również za hematopoezę u myszy. Pojedyncze komórki pochodzące z HPSC mogą być rozpoznawane w grasicy, węzłach chłonnych, śledzionie, wątrobie, płucach, sercu, skórze, mięśniach szkieletowych, tkance tłuszczowej i nerkach. Obrazy 3D mogą być oceniane jakościowo i ilościowo, aby ocenić rozmieszczenie komórek przy minimalnych zaburzeniach tkanek. Na koniec zilustrowaliśmy wykonalność dynamicznych badań na żywo w 4D, łącząc rezonansowe skanowanie wielofotonowe i konfokalne obrazowanie poklatkowe. Metodologia ta umożliwia nieinwazyjne, wielowymiarowe śledzenie losu komórek o wysokiej rozdzielczości populacji komórek oznaczonych spektralnie w ich nienaruszonej architekturze 3D, zapewniając potężne narzędzie w badaniach nad regeneracją i patologią tkanek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie myszy były trzymane i traktowane zgodnie z Przewodnikiem dla Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych National Institutes of Health, a także zarejestrowane w zatwierdzonym przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt NHLBI. Kobieta B6. SJL-Ptprc(d)Pep3(b)/BoyJ (B6. SJL) i myszy C57Bl/6, w wieku 6-12 tygodni, wykorzystano odpowiednio jako dawcę i biorcę.

Lista materiałów, odczynników i sprzętu znajduje się w Tabeli 1.

1. Transdukcja LeGO mysich HSPC i przeszczep szpiku kostnego

Wykonaj procedury opisane poniżej w certyfikowanym gabinecie bezpieczeństwa biologicznego poziomu 2 (BSL-2) (kaptur do hodowli tkankowych).

  1. Produkcja wektorów LeGO kodujących 5FP
    1. Użyj plazmidów wektorowych lentiwirusowych "Gene Ontology" (LeGO), z których każdy koduje inny FP z silnego konstytutywnego promotora SFFV, w tym LeGO-Cer2 (Cerulean), LeGO-G2 (EGFP), LeGO-V2 (Venus), LeGO-T2 (tdTomato) i LeGO-C2 (mCherry) dzięki uprzejmości dostarczonej przez dr Borisa Fehse (Uniwersyteckie Centrum Medyczne Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Niemcy); teraz dostępne również od Addgene5-7.
    2. Aby wyprodukować wektory LeGO, wysiewaj 5 x 106 komórek 293T w 10-centymetrowych szalkach (użyj 12 szalek na każdy wektor) 24 godziny przed transfekcją w 8 ml pożywki I10 (IMDM uzupełniony 10% FCS i glutaminą / penicyliną / streptomycyną).
    3. Transfekcja komórek fosforanem wapnia przy użyciu nieznacznie zmodyfikowanego zestawu CAPHOS Zalecenia:
      1. Na każdą płytkę wymieszaj 15 μg wektora LeGO, 12 μg pCDNA3.HIVgag/pol.4xCTE, 4 μg pRev-TAT i 1 μg plazmidów pMD2.G-VSV-G w obecności 50 μl 2,5 M CaCl2 i dodaj wodę, aby uzyskać 500 μl całkowitej objętości.
      2. Wytrój plazmidy DNA za pomocą 500 μl 2x HeBS (HEPES-Buffered Saline) i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej przed dodaniem do każdej płytki komórek 293T.
      3. Inkubować komórki przez 6 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °C i stężeniu 5% CO2 ; usunąć pożywkę i dodać świeże pożywki hodowlane 6 godzin po transfekcji.
    4. Zbieraj supernatanty hodowlane zawierające cząstki lentiwirusa z każdej płytki, codziennie, przez 3 dni. Każdego dnia po zebraniu supernatantu dodać świeżą pożywkę I10 do każdej płytki.
      1. Filtrować przez pory 0,22 μm, gromadzić i zagęszczać supernatanty przez ultrawirowanie na wirniku SW28 przez 2 godziny w temperaturze 71 900 x g i 4 °C.
      2. Zawiesić supernatanty w 1 ml pożywki StemSpan. Podwielokrotnić zapasy lentiwirusa w 200 μl i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  2. Miareczkowanie cząstek lentiwirusowych
    Określ miano cząstek wektora LeGO w zebranych supernatantach poprzez ilościowe oznaczanie jednostek transdukcji/ml przy użyciu komórek NIH3T3. Miana umożliwiają obliczenie objętości każdego supernatantu wektora potrzebnego do uzyskania pożądanej względnej wielokrotności infekcji (MOI) dla eksperymentalnych komórek docelowych.
    1. Płytka 5 x 104 komórki NIH3T3 na basenik (płytka 12-dołkowa) w 2 ml pożywki I10 na dzień przed miareczkowaniem.
    2. Przygotować 5-krotne seryjne rozcieńczenia supernatantów wektorowych w pożywce I10 uzupełnionej siarczanem protaminy (4 mg/ml to 1,000x).
    3. Usunąć pożywkę z komórek i zastąpić 500 μl roztworów supernatantu zawierających równoważnik 2, 0,8, 0,32 i 0,128 μl stężonego wirusa.
    4. Określić liczbę (liczbę) komórek obecnych w studzience w czasie transdukcji, licząc jedną studzienkę kontrolną.
    5. 6 godzin po transdukcji dodać 2 ml pożywki I10 i inkubować przez 3 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    6. Zbierz komórki z każdej studzienki za pomocą trypsyny-EDTA i określ procent komórek fluorescencyjnych (%FP) za pomocą cytometrii przepływowej.
    7. Obliczyć miano w następujący sposób, uśredniając miana uzyskane dla każdego dołka (rozcieńczenie), co daje %FP między 1 a 50%: Miano (cząstki wektorowe/ml) = Brak x %FP/ Objętość supernatantu wektorowego (ml). Uśrednić miana uzyskane dla każdego rozcieńczenia, jeżeli %FP mieści się w przedziale od 1 do 50%.
  3. Pobieranie, oczyszczanie, transdukcja i przeszczepianie komórek myszy (schematycznie pokazane na rysunku 1A zaadaptowanym z Malide i wsp.4).
    1. Uśmiercać myszy dawców za pomocą zatwierdzonej procedury. Pobrać szpik kostny z kończyn przednich i tylnych: wypreparować kość ramienną, udową i piszczelową, dokładnie usunąć wszystkie mięśnie, więzadła i nadmiar tkanki z kości, przeciąć koniec każdej kości jak najbliżej stawu i wypłukać szpik kostny z kości za pomocą igły 27-0 G na strzykawce zawierającej I10 media.
    2. Osadzać całe komórki szpiku kostnego przez 10 minut w temperaturze 500 x g, w temperaturze 4 °C i dwukrotnie poddać lizie krwinki czerwone za pomocą 50 ml buforu ACK. Ponownie zawieś komórki w 10 ml pożywce I10.
    3. Oczyść komórki progenitorowe ujemne (Lin-) za pomocą zestawu do zmniejszania linii MACS zgodnie ze zmodyfikowanym protokołem zestawu:
      1. Użyj 30 μl mikrokulek antybiotynowych zamiast 10 μl / 107 komórek; zakończ etapy mycia za pomocą pożywki I2 (IMDM uzupełniony 2% FCS) zamiast buforu.
      2. Wprowadzić jeden etap płukania między inkubację z koktajlem biotyny i przeciwciała a inkubacją z mikrokulkami anty-biotyny; i zrównoważyć kolumnę z I10 zamiast buforem.
    4. Hodowla komórek Lin przez 48 godzin przy początkowej gęstości 5 x 105 komórek/ml w pożywce StemSpan uzupełnionej 10 ng/ml mysiej IL-3, 100 ng/ml mysiej IL-11, 100 ng/ml ludzkiego liganda Flt-3 i 50 ng/ml mysiego czynnika komórek macierzystych.
    5. Przenieś 1 do 4 x 105 komórek na 12-dołkowe płytki pokryte retronektyną i transdukuj za pomocą supernatantów LeGO, każdy przy wielokrotności infekcji (MOI) 6-7, aby osiągnąć 50% wydajności ekspresji dla każdego FP, w obecności pożywki StemSpan i cytokin opisanych powyżej oraz 4 μg/ml siarczanu protaminy.
    6. Transdukuj komórki z każdym wektorem LeGO indywidualnie, jak opisano w kroku 1.3.5 i mieszaj komórki po transdukcji (określanej jako Mix) lub współtransdukuj komórki ze wszystkimi 5 supernatantami wektorów LeGO jednocześnie (określanymi jako Co). Usuń komórki 24 godziny później, przemyj je raz pożywką StemSpan bez cytokin i ponownie zawieś je w pożywce StemSpan bez cytokin do przeszczepu lub przenieś je na świeże podłoże z cytokinami i hodowlę przez dodatkowe 96 godzin przed mikroskopią konfokalną i cytometrią przepływową.
      1. Przeszczep szpiku kostnego należy przeprowadzić, podając transdukowane Lin-HSPC przez wstrzyknięcie do żyły ogonowej biorcom 11 Gy z pojedynczą dawką wstępnie napromieniowanych (6-18 godzin przed przeszczepem), w objętości 100 μl, w dawce komórek na mysz odpowiadającej 1-4 x 105 Lin- komórek pierwotnie posianych do transdukcji. W każdym eksperymencie przeszczep całą kohortę zwierząt z tą samą populacją transdukowanych komórek BM dawcy.
      2. W celu scharakteryzowania in vitro transdukowanych HSPC, hoduj komórki przez dodatkowe 4-5 dni w StemSpan uzupełnionym cytokinami i analizuj za pomocą cytometrii przepływowej pod kątem wydajności transdukcji oraz za pomocą mikroskopii pod kątem różnorodności kolorów.
        1. Składaj w ofierze pojedyncze myszy i pobieraj tkanki i narządy do obrazowania, w różnych punktach czasowych do 120 dni po przeszczepie.
          1. Spryskaj etanolem sierść myszy i naciąć skórę po stronie brzusznej, unikając rozprzestrzeniania się włosów.
          2. Wypreparuj i wyciąć zgodnie ze standardowymi procedurami śledzionę, węzły chłonne podkolanowe, płuca, serce, skórę, tkankę tłuszczową, mięśnie szkieletowe, nerki, wątrobę, a także głowę do dostępu do kalwarii.
          3. Alternatywnie, użyj kalwarii lub ustaw okno kostne do wielokrotnego obrazowania na żywo w czasie2,8,9 lub zobrazuj powierzchowne narządy, takie jak skóra i węzły chłonne u żywego zwierzęcia.
        2. Umieścić poszczególne narządy w szklanych szalkach hodowlanych o średnicy 35 mm nr 0 w PBS o pojemności 50–100 μl w celu zobrazowania ich w stanie nienaruszonym bez cięcia, utrwalania lub dalszej obróbki, jak opisano w kroku 2.5.
        3. W przypadku obrazowania wolumetrycznego należy przechowywać narządy w zimnym PBS do czasu użycia. W przypadku obrazowania poklatkowego należy natychmiast przejść do obrazowania narządów w DMEM, 10% FBS zawierających 20 mM HEPES w temperaturze 37 °C

2. Mikroskopia konfokalna i dwufotonowa oraz analiza obrazu

  1. Wykonuj obrazowanie mikroskopowe za pomocą pięciokanałowego systemu konfokalnego i wielofotonowego Leica SP5 wyposażonego w wieloliniowe lasery argonowe, diodowe 561 nm, HeNe 594 nm i HeNe 633 nm. Stosować w trybie 2-fotonowym impulsowy laser femtosekundowy Ti:Sapphire (Ti-Sa), przestrajany do wzbudzenia od 680 do 1 080 nm z korekcją dyspersji. Zastosowanie w eksperymentach z udziałem FP z przesunięciem ku czerwieni (tdTomato i mCherry), lasera optycznego oscylatora parametrycznego (OPO) w celu rozszerzenia zakresu długości fali wyjściowej do 1,030-1,300 nm, sekwencyjnie lub jednocześnie z laserem Ti-Sa.
  2. Obrazuj różne tkanki za pomocą obiektywu HCX-IRAPO-L 25X/0,95 NA do zanurzania w wodzie (WD = 2,5 mm), suchego obiektywu HC-PLAPO-CS 20X/0,70 NA (WD = 0,6 mm) lub obiektywu HC-PL-IRAPO 40X/1,1 NA (WD = 0,6 mm).
  3. Uzyskanie konfokalnych widm fluorescencyjnych zbierających stosy lambda (xyλ) emitowanego światła w pasmach 5 nm widma widzialnego z komórek BM transdukowanych pojedynczym wektorem FP LeGO, a także kontrolnych, nieprzeszczepionych BM.
    1. Przetwarzaj obrazy za pomocą oprogramowania Leica LAS-AF v2.4.1, aby utworzyć widma referencyjne dla wszystkich 5 FPs, a także dla autofluorescencji (Rysunek 2A). Korzystając z indywidualnych widm FP i różnicy w jasności fluorescencji (wyrażonej jako % EGFP) Cerulean (79%), Venus (156%), tdTomato (283%) i mCherry (47%) ustawiono 5 kanałów obrazowania sekwencyjnego w następujący sposób: Cerulean (458/468-482 nm), EGFP (488/496-514 nm), Venus (514/523-558 nm), tdTomato (561/579-597 nm) i mCherry (594/618-670 nm) (Rysunek 2B).
    2. Sprawdź dokładną separację FPs, ponieważ komórki transdukowane za pomocą każdego pojedynczego FP są widoczne tylko w odpowiednim kanale i nieobecne w pozostałej (Rysunek 2C). Ponadto to zdefiniowane wielokanałowe podejście tworzy unikalny 5-kanałowy "kolorowy wydruk", który umożliwia późniejszą analizę kolorów i śledzenie klonów oraz ma tę zaletę, że skraca czas akwizycji w porównaniu z obrazowaniem spektralnym.
  4. Oddzielna emisja fluorescencji, w trybie 2-fotonowym, za pomocą wysokowydajnych niestandardowych zwierciadeł dichroicznych i zbieranie za pomocą czterokanałowego detektora bez deskryptencji (NDD) w następujący sposób: zwierciadło dichroiczne o długości fali 568 nm, zwierciadło dichroiczne o długości fali 465 nm, po którym następuje filtr emisyjny 452/45 nm dla SHG lub autofluorescencji i Cerulean, filtr emisyjny 525/40 nm dla EGFP lub Wenus, oraz lustro dichroiczne 648 nm i filtr emisji 620/60 nm dla tdTomato lub mCherry.
    1. Ujawnienie informacji strukturalnych za pomocą mikroskopii dwufotonowej wewnętrznego obrazowania kontrastowego (jak opisano powyżej) autofluorescencji tkanek z elastyny, NADH (wzbudzonej przy 780 nm) i sygnału generowanego przez drugą harmoniczną (SHG) z kolagenu kostnego i fibrylarnego (wzbudzonego przy 920 nm lub 860 nm zebranego w kierunku rozpraszania wstecznego)10,11.
  5. W przypadku renderowania objętościowego 3D, zbierz serię obrazów x-y-z (zwykle 1 x 1 x 4 μm3 woksele) wzdłuż osi z w odstępach 5 μm na różnych głębokościach (150-300 μm) w szpiku kostnym i innych tkankach, na dużych obszarach, korzystając z funkcji kafelków oprogramowania do automatycznego generowania zszytych objętości obejmujących cały dół mostka, około 2,5 x 1,2 mm2 (x-y) i 300 μm (z) (rysunki 2D-2E) i film 1.
    1. Obraz szpiku calwarialnego bezpośrednio przez czaszkę bez sekcji2, 8.
    2. Przekrój mostka wzdłuż płaszczyzny strzałkowej (bisekcja), a następnie poprzecznie na stawie między 2 dołami mostka a obrazem przez przeciętą powierzchnię3,4,12 (przegląd na rycinie 1B zaadaptowany z Takaku i wsp. 3).
  6. W przypadku obrazowania poklatkowego 4D należy umieścić świeżo wycięte próbki węzłów chłonnych podkolanowych, śledziony, płuc lub kości nazębnych nieoszlifowane na szalkach hodowlanych ze szkła nakrywkowego o średnicy 35 mm 0, w 50-100 μl DMEM, 10% FBS zawierającym 20 mM HEPES w temperaturze 37 °C i zastosować wzbudzenie 2-fotonowe Ti-Sa (860 nm) połączone ze wzbudzeniem konfokalnym (458 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm, 594 nm) i skaner rezonansowy Leica (8000 Hz/s), rejestrujący stosy z (~80 μm) w odstępach 20 sekund przez maksymalnie 1 godzinę.
    1. Do jednoczesnego trójkolorowego obrazowania 2P należy użyć Ti-Sa dostrojonego do 860 nm jednocześnie z laserem OPO (dostrojonym do 1,130 nm dla tdTomato; lub 1,140 nm mCherry) (Film 2).
  7. Rekonstrukcja i analiza objętości 3D i sekwencji czasowych 4D
    1. Użyj oprogramowania Imaris x64 w wersji 7.6 lub alternatywnych pakietów oprogramowania, aby przekształcić kafelkowe stosy surowych obrazów w renderowane objętościowo (3D) dane komórek fluorescencyjnych wewnątrz szpiku kostnego i różnych tkanek oraz wyeksportować je jako filmy z rotacją 3D, jak opisano wcześniej3,4 (Film 1) przykład krok po kroku:
      1. W Imaris otwórz obraz z-stack; Wybierz "Przekrocz", aby wyświetlić wizualizację objętości 3D.
      2. Użyj "nawigacji", aby obrócić głośność o 360°.
      3. Wybierz "Animacja", aby utworzyć animację; użyj klatek kluczowych, aby dodać wybrane widoki, powiększenie, obroty objętości; Wyświetl podgląd filmu, edytuj go w razie potrzeby i zapisz plik w żądanym formacie filmu (np. avi, mov).
    2. W celu ilościowej oceny częstotliwości, pozycji, rozmiarów i rozkładu komórek 3D i klonów, należy dalej przetwarzać stosy z za pomocą modułów Imaris XT, które integrują aplikacje MATLAB wykonujące pomiary odległości (przy użyciu algorytmu transformacji odległości) i analizę klastrów, jak opisano wcześniej3,4. Przekształć sekwencje stosów obrazów w czasie w czterowymiarowe filmy (4D) renderowane objętościowo za pomocą oprogramowania Imaris x64 i wykorzystaj analizę punktową i powierzchniową do półautomatycznego śledzenia ruchliwości komórek w trzech wymiarach przy użyciu algorytmów ruchu autoregresyjnego.
    3. Przeprowadź analizę wielospektralną komórek w następujący sposób: wyodrębnij plamki oznaczone wielokolorem, dodając wszystkie 5 kanałów za pomocą arytmetyki kanałów Imaris XT do nowego kanału; określ dla wszystkich plamek (komórek) średnią intensywność fluorescencji w każdym z 5 kanałów składowych. Eksportuj wartości w oprogramowaniu Excel, aby wykreślić wykresy wyświetlające unikalny "colorprint", tj. względny % każdego FP w pojedynczej komórce (wykres Rysunek 2E). Skoryguj zestaw danych pod kątem dryfu tkanek i oblicz prędkość i przemieszczenie komórek w czasie, długości ścieżek, ścieżki i odległości; eksportuj wartości w oprogramowaniu Excel, aby wykreślić wykresy. Składaj figury kompozytowe za pomocą oprogramowania Adobe Photoshop CSS 5.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rekonstrukcje 3D wykonane za pomocą mikroskopii konfokalnej/dwufotonowej całych preparatów szpiku kostnego mostka w czasie ujawniły rozwój i ekspansję przeszczepionych co-5FPs w schemacie o wyjątkowych charakterystykach: klony wydawały się wyraźnie odgraniczone, początkowo homogenicznie znakowane szeroką paletą kolorów, a z czasem ewoluowały w stronę preferencyjnego zawierania komórek głównie jednego koloru. Układ mikroskopii konfokalnej oraz reprezentatywne przykłady obrazowania HSPC znakowanych 5FPs w szpiku kostnym mo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisujemy tutaj szczegóły potężnej metodologii opracowanej niedawno do śledzenia komórek klonalnych, łączącej dużą różnorodność generowaną przez znakowanie kombinatoryczne z wektorami LeGO kodującymi 5FP oraz obrazowanie z tandemową mikroskopią konfokalną i 2-fotonową w celu uzyskania wolumetrycznego i dynamicznego obrazowania w żywych tkankach. Rozszerzyło to zastosowanie znakowania kolorami opartego na FP poprzez rejestrowanie konfokalnej tożsamości widmowej w 5 "odrębnych" kanałach 8-bitowych. W ten sposób względny st...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Intramural Research Program of the National Heart, Lung, Blood Institute of the National Institutes of Health. Dziękujemy Borisowi Fehse (Uniwersyteckie Centrum Medyczne Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Niemcy) za dostarczenie pięciu plazmidów wektorowych LeGO; Christianowi A. Combsowi i Nealowi S. Youngowi (NHLBI, NIH) za dyskusje, wsparcie i zachętę podczas tego badania oraz Andre LaRochelle (NHLBI, NIH) za pomoc w iniekcjach do żył ogonowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Produkcja wirusów
LeGO-Cer2Addgene27338Ekspresja Cerulean
LeGO-G2Addgene25917Ekspresja eGFP
LeGO-V2Addgene27340Ekspresja Venus
LeGO-T2Addgene27342Ekspresja tdTomato
LeGO-C2Addgene27339Ekspresja
zestawu do transfekcji fosforanu wapniaSigmaCAPHOS-1KT
Naczynie do hodowli tkankowychBD Falcon353003
IMDMGibco, Life Technology12440-053
Płodowa surowica bydlęca inaktywowana termicznieSigmaF4135-500ML
Pen Strep GlutaminaGibco, życie Technologia10378-016
Probówki wirówkoweBeckman Coulter326823
SW28 UltrawirówkaBeckman CoulterL60
Millex Filtr napędzany strzykawką Unite (0,22 &mikro; m)MilliporeSLGS033SS
Pobieranie, oczyszczanie, transdukcja i przeszczepianie komórek myszy
ACK bufor lizującyQuality Biologicals Inc.118-156-101
Zestaw do zubożania komórek linii (mysz)Miltenyi Biotec Inc. USA130-090-858
Kolumny LS + rurkiMiltenyi Biotec Inc. USA130-041-306
Filtry do wstępnej separacji (30 &mikro; m)Miltenyi Biotec Inc. USA130-041-407
Pożywka bez surowicy StemSpan SFEM do hodowli i ekspansji komórek krwiotwórczych (500 ml)StemCell Technologies Inc 9650
Mysz IL-11 CFR & D Systems Inc418-ML-025/CF100 &mikro; g / ml wynosi 1,000x
Rekombinowany mysi SCFRDI Division of Fitzgerald Industries Intl RDI-2503100 &mikro; g / ml wynosi 2,000x
Rekombinowana mysia IL-3R & D Systems Inc403-ML-05020 & mikro; g / ml wynosi 2,000x
FLT-3 LigandMiltenyi Biotec Inc. USA130-096-480100 &mikro; g/ml to 1,000x
płytki 12-dołkowe, CostarCorning Inc.3527
RetronectinTakara Bio IncT100A/BPonowne zawieszenie przy 50 &mikro; g/ml
Siarczan protaminySigmaP-40204 & mikro; g / ml wynosi 1,000x
mikroskopia konfokalna i dwufotonowa
DMEMLonza12-614F
1 M HepesCellgro, Mediatech Inc.25-060-CI
Naczynie hodowlane ze szklanym dnem P35G-0-20-CMatTek CorporationP35G-0-20-C
Naczynie hodowlane ze szklanym dnem P35G-0-14-CMatTek CorporationP35G-0-14-C
Nunc Lab-Tek Komorowe szkło nakrywkowe #1 Borokrzemianowe szkło nakrywkowe; 4-dołkoweThermo Scientific155383
Szkiełka nakrywkowe 22 mm Nr 2Thomas Scientific6662-Q55
Leica TCS SP5 AOBS pięciokanałowy mikroskop konfokalny i wielofotonowyLeica Microsystems
Chameleon Vision II -TiSaph zasięg lasera 680-1,080 nmCoherent
Chameleon Compact OPO zasięg lasera 1,030-1,350 nmwodzie Coherent
HCX-IRAPO-L 25X/0.95 NA (WD=2.5 mm)Leica Microsystems
Suchy obiektyw HC-PLAPO-CS 20X/0.70 NA (WD=0.6 mm)Obiektyw doLeica Microsystems
HC-PL-IRAPO 40X/1.1 NA (WD=0.6 mm)Leica Microsystems
Imaris w wersji 7.6Bitplane
mCherry Obiektyw do zanurzania w zanurzenia w wodzie Oprogramowanie

Bibliografia

  1. Lo Celso,, C,, Scadden, D. T. The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).
  2. Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
  3. Takaku, T., et al. Hematopoiesis in 3 dimensions human and murine bone marrow architecture visualized by confocal microscopy. Blood. 116, e41-e55 (2010).
  4. Malide, D., Metais, J. Y., Dunbar, C. E. Dynamic clonal analysis of murine hematopoietic stem and progenitor cells marked by 5 fluorescent proteins using confocal and multiphoton microscopy. Blood. 120, e105-e116 (2012).
  5. Weber, K., Mock, U., Petrowitz, B., Bartsch, U., Fehse, B. Lentiviral gene ontology (LeGO) vectors equipped with novel drug-selectable fluorescent proteins new building blocks for cell marking and multi-gene analysis. Gene Ther. 17, 511-520 (2010).
  6. Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral 'gene ontology' (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16, 698-706 (2008).
  7. Weber, K., et al. RGB marking facilitates multicolor clonal cell tracking. Nat Med. 17, 504-509 (2011).
  8. Lo Celso,, Lin, C. P., Scadden, D. T. In vivo imaging of transplanted hematopoietic stem and progenitor cells in mouse calvarium bone marrow. Nature protocols. 6, 1-14 (2011).
  9. Kohler, A., et al. Altered cellular dynamics and endosteal location of aged early hematopoietic progenitor cells revealed by time-lapse intravital imaging in long bones. Blood. 114, 290-298 (2009).
  10. Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82, 493-508 (2002).
  11. Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).
  12. Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119, 238-250 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A correction was made to In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.

This was corrected in the discussion from:

This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and “on-the-fly”) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 30 μm, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.

to:

This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and “on-the-fly”) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 300 μm, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.

Tagi

Hematopoetyczne kom rki macierzyste i progenitoroweznakowanie bia kami fluorescencyjnymimikroskopia konfokalnamikroskopia dwufotonowaprzeszczep szpiku kostnegotransdukcja wektorem lentiwirusowymanaliza ledzenia klonalnegoobrazowanie wielokolorowe4D time lapserozdzielanie spektralne
In vivo (in vivo) Klonalne śledzenie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych oznaczonych pięcioma białkami fluorescencyjnymi przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.