Ocena aktywności przeciwgrzybiczej izolowanych makrofagów pęcherzykowych za pomocą mikroskopii konfokalnej

Podsumowanie

Metoda oceny zdolności izolowanych makrofagów pęcherzykowych myszy do kontrolowania wzrostu fagocytozowanych zarodników Aspergillus za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Streszczenie

Płuco jest interfejsem, gdzie komórki gospodarza są rutynowo narażone na działanie mikrobów i produktów mikrobiologicznych. Makrofagi pęcherzykowe to komórki fagocytarne pierwszej linii, które napotykają wdychane grzyby i inne drobnoustroje. Makrofagi i inne komórki odpornościowe rozpoznają motywy Aspergillus przez receptory rozpoznające patogeny i inicjują dalsze reakcje zapalne. Oksydaza NADPH fagocytów wytwarza reaktywne produkty pośrednie tlenu (ROI) i ma kluczowe znaczenie dla obrony gospodarza. Chociaż oksydaza NADPH ma kluczowe znaczenie dla obrony gospodarza za pośrednictwem neutrofili^1-3, znaczenie oksydazy NADPH w makrofagach nie jest dobrze zdefiniowane. Celem tego badania było określenie specyficznej roli oksydazy NADPH w makrofagach w pośredniczeniu w obronie gospodarza przed A. fumigatus. Odkryliśmy, że oksydaza NADPH w makrofagach pęcherzykowych kontroluje wzrost fagocytozowanych zarodników A. fumigatus ⁴. W tym miejscu opisujemy metodę oceny zdolności mysich makrofagów pęcherzykowych (AM) do kontrolowania wzrostu fagocytozowanych zarodników Aspergillus (konidiów). Makrofagi pęcherzykowe są barwione in vivo, a dziesięć dni później izolowane od myszy przez płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL). Makrofagi są siane na szklanych szkiełkach nakrywkowych, a następnie wysiewane zarodnikami A. fumigatus wykazującymi ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP). W określonych momentach komórki są utrwalane, a liczba nienaruszonych makrofagów z fagocytozowanymi zarodnikami jest oceniana za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Wprowadzenie

Makrofagi pęcherzykowe to komórki fagocytarne pierwszej linii, które napotykają wdychane drobnoustroje. Makrofagi rozpoznają motywy Aspergillus poprzez receptory rozpoznające patogeny, połykają i ograniczają wzrost wdychanych zarodników (konidiów) oraz inicjują reakcje zapalne. Oksydaza fagocytowa NADPH przekształca tlen cząsteczkowy w anion ponadtlenkowy i reaktywne produkty pośrednie tlenu (ROI). Przewlekła choroba ziarniniakowa (CGD) jest dziedzicznym zaburzeniem oksydazy NADPH charakteryzującym się ciężkimi infekcjami bakteryjnymi i grzybiczymi oraz nadmiernymi reakcjami zapalnymi.

Chociaż oksydaza NADPH jest kluczowa dla obrony gospodarza za pośrednictwem neutrofili^1-3, znaczenie oksydazy NADPH w makrofagach nie jest dobrze zdefiniowane. Wcześniejsze badania wykazały, że makrofagi pęcherzykowe połykają i zabijają zarodniki Aspergillus, podczas gdy neutrofile celują głównie w stadium^{strzępek 5}. Istnieją jednak sprzeczne wyniki co do roli oksydazy NADPH w makrofagach w kontrolowaniu wzrostu zarodników A. fumigatus ^6,7.

Celem tej metody było określenie specyficznej roli oksydazy NADPH w makrofagach w pośredniczeniu w obronie gospodarza przed zarodnikami A. fumigatus. Odkryliśmy, że oksydaza NADPH w makrofagach pęcherzykowych kontroluje wzrost fagocytozowanych zarodników A. fumigatus ⁴. Aby jak najdokładniej modelować reakcję gospodarza na wdychane grzyby, użyliśmy makrofagów pęcherzykowych zebranych przez płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe od niestymulowanych myszy bezpośrednio po uśmierceniu. Zastosowanie wyizolowanych makrofagów pęcherzykowych pozwoliło nam skupić się na ich działaniu przeciwgrzybiczym przy braku innych komórek odpornościowych (np. rekrutowanych neutrofili), które bronią się przed Aspergillus in vivo. W tej metodzie makrofagi pęcherzykowe barwiono in vivo przed zbiorem, aby zminimalizować ilość manipulacji po zbiorach.

Kolejną zaletą tego protokołu jest użycie szczepu A. fumigatus wykazującego ekspresję GFP. Grzyb ten wyraża GFP od stadium konidialnego do etapu strzępek i nie ma potrzeby dalszego barwienia. Aby uzyskać obrazy o większej szczegółowości, zdecydowaliśmy się na mikroskopię konfokalną, która umożliwia rekonstrukcję trójwymiarowych struktur na podstawie uzyskanych obrazów. Rekonstrukcja trójwymiarowa daje możliwość rozróżniania strzępek rosnących wokół makrofaga, a nie w nim lub przez makrofagi. Konidia można również precyzyjnie rozróżnić jako wewnątrzkomórkowe i zewnątrzkomórkowe.

Protokół

Wszystkie procedury wykonywane na zwierzętach w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania w Roswell Park Cancer Institute i były zgodne ze wszystkimi przepisami stanowymi, federalnymi i National Institutes of Health.

1. Znakowanie makrofagów in vivo

Uwaga: PHK26 to barwnik lipofilowy, który jest pobierany przez komórki fagocytarne zarówno w krążeniu, jak i w tkankach, gdy jest podawany dożylnie (i.v.). PKH26 wykorzystano do znakowania in vivo w celu zminimalizowania ilości manipulacji makrofagami po zbiorach. PKH-26 ma tę zaletę, że stabilnie gromadzi się w makrofagach pęcherzykowych przez dłuższy czas. Odczekanie 10 dni po podaniu pozwala na usunięcie wszystkich znakowanych komórek z krążenia, pozostawiając tylko makrofagi pęcherzykowe stabilnie znakowane PKH26 ^8,9. PKH26 jest czerwonym fluorochromem, który ma charakterystykę wzbudzenia (551 nm) i emisji (567 nm) zgodną z systemami wykrywania rodaminy lub fikoerytryny. Każda procedura etykietowania może wprowadzić artefakt, w tym utratę żywotności. Ponieważ jednak używamy tego samego podejścia do znakowania makrofagów w różnych genotypach myszy (np. WT vs. niedobór oksydazy NADPH), efekty tych artefaktów byłyby jednolite.

1. Rozcieńczyć roztwór podstawowy PKH26 (1 x ^10-3 M w etanolu) w stosunku 1:5 w rozcieńczalniku C dostarczonym przez producenta.
2. Załadować 100 μl rozcieńczonego PKH26 do strzykawki insulinowej o pojemności 1/2 ml (29 G x 1/2") dla każdej myszy.
3. Podawać myszom przez wstrzyknięcie dożylne (do żyły ogonowej lub wstecz oczodołu) co najmniej 10 dni przed pobraniem.

2. Zbieranie makrofagów pęcherzykowych metodą płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL)

Liczba myszy do wykorzystania w eksperymencie może się różnić. Typowy plon z niestymulowanej myszy mieści się w zakresie 3-5 x 10⁵ makrofagów pęcherzykowych, jednak liczba ta może się znacznie różnić w zależności od takich czynników, jak wielkość myszy, doświadczenie osoby wykonującej płukanie oraz liczba wkropleń płynu z płukania i objętość pobrana z płuc. W tym protokole płukanie płuc jest wykonywane przy zamkniętej jamie klatki piersiowej, co wraz z powtarzającymi się płukaniami o pojemności 1 ml pomaga zwiększyć wydajność komórek.

1. Poddaj mysz eutanazji, podając śmiertelną dawkę środka znieczulającego avertin (12,5 mg) dootrzewnowo (i.p.) w warunkach aseptycznych, aby utrzymać sterylność roztworu.
2. Spryskaj mysz dokładnie 70% etanolem.
3. Usuń skórę z końca czaszki zwierzęcia, odsłaniając klatkę piersiową (ryc. 1A).
   1. Wykonaj małe nacięcie w skórze tuż pod membraną.
   2. Włóż palec do nacięcia i odciągnij skórę od końca czaszki zwierzęcia (ryc. 1A).
   3. Lekko podnieś głowę, wydłużając brzuszną stronę szyi (ryc. 1A).
4. Wytnij mały otwór w klatce piersiowej po prawej stronie klatki piersiowej, aby opróżnić płuca, a także umożliwić wizualizację płuc podczas kolejnych kroków.
5. Zlokalizuj tchawicę i ostrożnie wypreparuj otaczającą tkankę.
   1. Usuń gruczoły ślinowe, mięśnie mostkowo-gnykowe i krtań itp. za pomocą zakrzywionych kleszczy.
   2. Ostrożnie podnieś zakrzywionymi kleszczami i odetnij nożyczkami cienką tkankę pokrywającą tchawicę (przydankę), odsłaniając leżącą pod spodem strukturę chrząstki pierścieniowej.
6. Wprowadzić cewnik do tchawicy.
   1. Za pomocą zakrzywionych kleszczy umieść szew za (grzbietowo do) tchawicy i przeciągnij przez otwór o długości 10 cm.
   2. Zaczynając od cricoid (pogrubionego pierścienia chrząstki), ostrożnie poprowadź cewnik 22 G w dół tchawicy, zatrzymując się w miejscu, w którym tchawica znika za mostkiem.
   3. Mocno zawiąż szew wokół tchawicy i cewnika, aby uzyskać dokładne dopasowanie. Wyjmij igłę z cewnika.
7. Zamontuj 4-drogowy kran odcinający.
   1. Napełnij jedną strzykawkę o pojemności 6 ml DPBS, 1% FBS i podłącz do 4-kierunkowego kranu, jak pokazano na rysunku 1B.
   2. Podłączyć pustą strzykawkę o pojemności 6 ml we wskazanym miejscu na 4-kierunkowym zaworze odcinającym (Rysunek 1B).
   3. Podłącz otwarty port na 4-kierunkowym kurku do cewnika (Rysunek 1B). Uważaj, aby nie usunąć cewnika z tchawicy.
8. Zbierz płyn popłuczyn z płuc.
   Uwaga: Badacze mogą zdecydować się na użycie mniejszych objętości płynu do płukania, aby zminimalizować możliwość uszkodzenia tkanki. Ważne jest, aby to samo podejście było konsekwentnie stosowane we wszystkich grupach myszy.
   1. Przekręć uchwyt na kurku tak, aby pusta strzykawka była zamknięta i powoli wstrzyknij ~1 ml DPBS, 1% FBS, aby napełnić płuca. Obserwuj napompowanie płuc przez otwór wycięty w kroku 2.4.
   2. Uważaj, aby NIE przesadzić z płucami.
   3. Przekręć uchwyt na kurku tak, aby cała strzykawka była zamknięta i ostrożnie wyciągnij płyn z płuc.
   4. Obserwuj, jak płuca opróżniają się przez otwór wycięty w kroku 1.4. Cewnik może wymagać lekkiego przesunięcia do przodu lub do tyłu, aby uzyskać dobre pobranie. Należy podjąć szczególne środki ostrożności, aby cewnik utrzymywał się w tchawicy.
   5. Powtarzaj kroki 2.8.1-2.8.4 5-6 razy, aż wszystkie DPBS, 1% FBS zostaną wstrzyknięte i wycofane z płuc. Uwaga: odzyskanie płynu płucnego nie będzie w 100% pokryte wstrzykniętym płynem.
9. Opróżnić strzykawkę z płynem do płukania do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Utrzymuj komórki w temperaturze pokojowej.
10. Komórki osadu rozdrabniać przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odlać z supernatantu. W razie potrzeby można to zachować do analizy cytokin.
11. Zawieś komórki w 1-5 ml RPMI 1640 z 10% FBS i policz na hemocytometr. Oczekuje się, że u myszy niestymulowanej > 95% komórek zebranych przez BAL to makrofagi, co można potwierdzić za pomocą cytologii.

3. Hodowla i zbiór grzybów

Aspergillus fumigatus używany w tym protokole wyraża GFP na wszystkich etapach swojego cyklu życia: zarodniki, zarodki i strzępki. Ten szczep grzyba został dostarczony przez dr Margo Moore z Simon Fraser University, Burnaby, BC, Kanada.

1. Konidia płytkowe szczepu Aspergillus fumigatus wykazujące ekspresję GFP na agarze Sabouraud brain heart infusion (BHI) skosy z chloramfenikolem (0,05 g/l) i gentamycyną (0,5 g/l).
2. Inkubować w ciemności luźno zakryte przez 7 do 10 dni w temperaturze pokojowej.
3. Zbierz konidia, myjąc skos 10 ml 0,01% Tween 20 w DPBS. Lekko zeskrob grzyba paskiem, aby się poluzował. Kilkakrotnie spłucz skos, aby zwiększyć wydajność.
4. Przepuścić zawiesinę konidialną przez sitko o wielkości 100 μm do stożkowego o pojemności 50 ml.
5. Konidia w granulkach przez odwirowanie przy 400 x g przez 10 min.
6. Ponownie zawiesić konidia w 50 ml DPBS i policzyć za pomocą hemocytometru.
7. Przemyć dwukrotnie DPBS i rozcieńczyć do pożądanego stężenia.

4. Wyzwanie grzybowe i mikroskopia konfokalna

Aby zbadać rolę oksydazy NADPH makrofagów w obronie gospodarza, oceniono zdolność izolowanych makrofagów pęcherzykowych od myszy o trzech genotypach do kontrolowania wzrostu fagocytozowanych zarodników Aspergillus. Genotypy użyte w tym badaniu obejmują; 1) myszy typu dzikiego, 2) myszy Ncf1*/* Mn- z naturalnie występującą mutacją Ncf1 (Ncf1 koduje^{p47 phox}, wymagany składnik oksydazy fagocytów NADPH), pozostawiając je z niedoborem oksydazy NADPH, oraz 3) myszy transgeniczne Ncf1*/* Mn + (MN oznacza transgen zawierający Ncf1 typu dzikiego pod kontrolą ludzkiego promotora CD68), u których aktywność oksydazy NADPH została odtworzona w populacji monocytów / makrofagów^10,11.

Mikroskopia konfokalna najlepiej nadaje się do tego testu ze względu na obecność i wzrost niefagocytozowanych konidiów na szkiełkach. Mikroskop konfokalny pozwoli na wizualizację poszczególnych płaszczyzn w obrębie osi Z i umożliwi rozróżnienie grzybów rosnących wokół makrofagów, a nie wewnątrz nich. Wszystkie obrazy konfokalne są uzyskiwane za pomocą soczewki immersyjnej z olejkiem 63X. Stosy Z są pozyskiwane ze współczynnikiem zoomu elektronicznego wynoszącym 2,5. Grubość stosu Z jest określana za pomocą DAPI i obrazów jasnego pola w celu zlokalizowania górnej i dolnej części pola. Stosy Z wahały się od 14 do 24 μm, z pojedynczymi warstwami o grubości ~1 μm. W celu ilościowego określenia makrofagów wykonano pojedyncze skany 1-krotnego zoomu elektronicznego na 10 polach na genotyp. Nienaruszone makrofagi zidentyfikowano na podstawie barwienia błony i jądra odpowiednio PKH26 i DAPI. Konidia zidentyfikowano na podstawie ekspresji FITC i obrazu w jasnym polu.

1. Przygotuj sterylne szkiełka nakrywkowe i płytki
   1. Pod Gabinetem Bezpieczeństwa Biologicznego namocz szkiełka nakrywkowe o wymiarach 22 x 22 mm w 70% etanolu przez 5-10 minut.
   2. Szkiełka nakrywkowe należy spłukać w sterylnym PBS.
   3. Za pomocą sterylnych kleszczyków delikatnie umieść pojedyncze szkiełko nakrywkowe na dnie każdego dołka sterylnej, pojedynczo zapakowanej płytki 6-dołkowej.
2. Nasiona ~ 1 x 10⁶ zebranych makrofagów pęcherzykowych oznaczonych PKH26 zawieszonych w 300 μl RPMI 1640, 10% FBS na każdym szkiełku nakrywkowym. Dokładna liczba może się różnić w zależności od plonów.
3. Pozwolić makrofagom przylegać przez inkubację w temperaturze 37 °C z 5% CO_{2 przez} noc.
4. Następnego ranka dodać ~1 x 10⁷ konidiów A. fumigatus wykazujących ekspresję GFP zawieszonych w 100 μl wstępnie podgrzanego (37 °C) RPMI 1640, 10% FBS.
5. Płytka powrotna do inkubatora o temperaturze 37 °C z 5% CO_{2 .}
6. Komórki należy utrwalać na co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Po 3, 7 i 14 godzinach napraw komórki, dodając równą objętość 2% formaldehydu do każdej studzienki (końcowe stężenie 1% formaldehydu). Umieść na noc płytki dla wczesnych punktów czasowych w temperaturze 4 °C. W ostatnim punkcie czasowym (14 godzin) utrwal komórki w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
7. Po utrwaleniu delikatnie usuń szkiełka nakrywkowe za pomocą kleszków i spłucz w DPBS.
8. Usuń nadmiar płynu, umieszczając krawędź szkiełka nakrywkowego na złożonym Kimwipe.
9. Nałóż 6 μl fluorescencyjnego medium montażowego z DAPI na szklane szkiełko mikroskopowe.
10. Połóż jedną krawędź szkiełka nakrywkowego na szkiełku podstawowym i delikatnie upuść je stroną z komórkami do dołu do podłoża montażowego. Podłoże montażowe rozprowadzi się i utworzy równą warstwę pod szkiełkiem nakrywkowym. Nie ma potrzeby naciskania na szkiełko nakrywkowe.
11. Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
12. Przygotowane preparaty należy przechowywać w pudełku na szkiełka (chronionym przed światłem) w temperaturze pokojowej do czasu, gdy będą gotowe do analizy za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Wyniki

Pozyskiwanie makrofagów pęcherzykowych poprzez BAL u myszy niepobudzonych pozwoli na uzyskanie populacji o czystości > 95% na podstawie cytologii. Punkty czasowe 3 i 7 h (Rysunek 2) poprzedzają etap strzępkowy wzrostu grzyba i umożliwiają porównanie wydajności fagocytozy konidiów pomiędzy genotypami. Punkt czasowy 14 h pozwala na porównanie genotypów pod kątem zdolności do hamowania przejścia fagocytowanych konidiów w tkankowo inwazyjny etap strzępkowy (Rysunek 3). Nieuszkodzone makro...

Dyskusja

Stosując to podejście do analizy ex vivo aktywności przeciwgrzybiczej makrofagów wraz z prowokacją grzybów in vivo , wcześniej wykazaliśmy, że oksydaza NADPH w makrofagach odgrywa ważną rolę w obronie przed A. fumigatus⁴. Zastosowanie izolowanych makrofagów pęcherzykowych pozwala nam skupić się na ich aktywności przeciwgrzybiczej przy braku innych komórek odpornościowych (np. rekrutowanych neutrofili), które bronią się przed Aspergillus in vivo.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
PKH26 Zestaw łączników komórek czerwonej fluorescencji do ogólnego etykietowania błony komórkowej	Sigma	PKH26GL-1KT
2,2,2 Tribromoetanol	Sigma	T48402	Używany do produkcji AvertinAnesthetic
2-metylo-2-butanol	Sigma	A-1685	Używany do produkcji AvertinAnesthetic
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (bez wapnia i magnezu)	Corning	21-031-CV
NH4Cl	Sigma	A0171	Służy do wytwarzania buforu do lizy czerwonych krwinek ACK
KHCO3	Sigma	P91444	Służy do wytwarzania buforu do lizy czerwonych krwinek ACK
EDTA	Sigma	E6758	Służy do wytwarzania buforu do lizy czerwonych krwinek ACK
22 G x 1,00 cala iv. cewnik	BD	381523	Insyte Autoguard Winged
Strzykawki insulinowe
6 ml Strzykawki 4-kierunkowy
	kran Fisher Scientific	50-700-077
Gwint
50 ml stożkowe probówki
gąbki z gazy (4 cale kwadratowe)
RPMI 1640 z L-glutaminą	Corning	10-040-CV
Płodowa surowica bydlęca	Hyklon	SH30396.03	inaktywowany termicznie
zestaw plam Hema 3	Fisher Scientific	22-122-911
Cytoseal 60	Thermo Scientific	8310-4
Sabouraud Agar do infuzji serca mózgu z chloramfenikolem i gentamycyną Skosy	BD	Szczep 297252
Aspergillus fumigatous z ekspresją białka			dostarczony przez dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Kanada
100 μ m Sitka do komórek	BD Falcon	64753-00
Nożyczki
Kleszcze
Szafa bezpieczeństwa biologicznego Klasa II
Sorval ST40 Wirówka z obrotowym wirnikiem kubełkowym
Mikroskop
Hemocytometr
Wirówka Cytospin 2	Thermo Scientific
Inkubator			37 ° C, 5%  CO2
>22 x 22 mm szkło z mikro pokrywą	VWR	48366-227	szklane szkiełka nakrywkowe
6-dołkowe płytki do hodowli komórkowych	Corning	3506
10% neutralna buforowana formalina	VWR	BDH0502-1LP
Podłoże montażowe Vectashield z DAPI	Vector Laboratories	H-1200
System Leica TCS SP2 z laserowym skanerem punktowym			Zamontowany na mikroskopie fluorescencyjnym DMIRE2

do szwówwirówkowe zielonej fluorescencji świetlny Leica DM1000 do hodowli komórkowych