Aby zrozumieć komórkowe i molekularne mechanizmy leżące u podstaw powstawania nowotworów i rozwoju zwężeń w zastawkach serca z inżynierii tkankowej, opracowano mysi model heterotopowego przeszczepu zastawki serca. Zastawkę płucną serca przeszczepiono biorcy przy użyciu techniki heterotopowego przeszczepiania serca.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przeszczepienie zastawki płucnej z wykorzystaniem mysiego modelu heterotopowego przeszczepienia serca
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zastawki serca wykonane techniką tkankową, zwłaszcza zastawki bezkomórkowe, zaczynają nabierać rozpędu w klinicznym zastosowaniu chirurgii rekonstrukcyjnej z mieszanymi wynikami. Jednak komórkowe i molekularne mechanizmy rozwoju tkanki nowotworowej, pogrubienia zastawki i rozwoju zwężenia nie są szeroko badane. Aby odpowiedzieć na powyższe pytania, opracowaliśmy mysi heterotopowy model przeszczepu zastawki serca. Zastawkę serca pobrano od myszy dawcy zastawki i przeszczepiono jej mysz-dawcę serca. Serce z nową zastawką przeszczepiono heterotopowo myszy biorcy. Przeszczepione serce wykazywało bicie własnego serca, niezależnie od bicia serca biorcy. Przepływ krwi określono ilościowo za pomocą systemu ultrasonograficznego o wysokiej częstotliwości z Dopplerem z falą pulsacyjną. Przepływ przez wszczepioną zastawkę płucną wykazywał przepływ do przodu z minimalną niedomykalnością, a przepływ szczytowy był bliski 100 mm/s. Ten mysi model przeszczepu zastawki serca jest bardzo wszechstronny, więc może być modyfikowany i dostosowywany w celu zapewnienia różnych środowisk hemodynamicznych i / lub może być stosowany z różnymi transgenicznymi myszami do badania rozwoju tkanki w zastawce serca zmodyfikowanej tkankowo.
Wprowadzenie
Wrodzone wady układu krążenia są jedną z głównych przyczyn śmiertelności niemowląt w świecie zachodnim1,2. Wśród nich często występującą formą są zwężenie zastawki płucnej i dwupłatkowe wady zastawki aortalnej3. Operacja wymiany zastawki serca jest rutynowym wyborem operacji rekonstrukcyjnych; jednak powikłania, w tym zwężenie i zwapnienie zastawki serca, a trwające całe życie uzależnienie od antykoagulantów jest znaczącym źródłem przewlekłych chorób i zgonów4-7. Co więcej, brak potencjału wzrostu wymaga operacji rewizyjnych, co dodatkowo zwiększa śmiertelność tych młodych pacjentów4,8,9.
W próbie opracowania funkcjonalnej zastępczej zastawki serca o potencjale wzrostu, Shinoka i in. umieścili autologiczne komórki na biodegradowalnej syntetycznej zastawce serca8. Syntetyczna zastawka przekształciła się w natywną strukturę podobną do zastawki serca o potencjale wzrostu. Wstępne badania na dużych zwierzętach wykazały możliwość zastosowania tej metodologii do stworzenia funkcjonalnej zastawki serca10. Jednak długoterminowe badania implantacji wykazały słabą trwałość z powodu postępującego pogrubienia tkanki zastawki, co prowadzi do zwężenia zastawki serca. W pracy Sodian i wsp. wykorzystano metodologię Shinoka, ale ostatecznie zastąpiono matrycę PGA biodegradowalnym elastomerem, który nadał właściwościom biomechanicznym konstrukcji zastawki inżynierii tkankowej bardziej fizjologiczny profil9,11,12. W badaniu in vivo, pomimo powodzenia implantacji, nie utworzyła się zlewająca się wyściółka komórek śródbłonka, co mogłoby ograniczyć długoterminowy sukces tego rusztowania12.
Aby racjonalnie zaprojektować ulepszoną syntetyczną zastawkę serca drugiej generacji, stworzono mysi model przeszczepu zastawki serca w celu zbadania komórkowych i molekularnych mechanizmów leżących u podstaw powstawania nowych tkanek, pogrubiania zastawki i rozwoju zwężeń. Modele mysie oferują szeroki wachlarz odczynników molekularnych, w tym transgenicznych, które nie są łatwo dostępne uinnych gatunków7. W tym modelu przeszczepu zastawki serca najpierw przeprowadzono syngeniczną wymianę zastawki płucnej ex vivo; A następnie serce z wszczepioną zastawką serca zostało wszczepione heterotopowo do syngenicznego gospodarza przy użyciu techniki mikrochirurgicznej. Model ten umożliwia wymianę zastawki serca bez konieczności stosowania krążenia pozaustrojowego.
W tym artykule opisano szczegółowe wyjaśnienie pobierania zastawek serca, preparatów serca dawcy, przeszczepu zastawki serca i heterotopowego przeszczepu serca. Wyniki wykazały ciągłe bicie serca dawcy, które było niezależne od bicia serca biorcy. Przepływ krwi przez wszczepioną zastawkę płucną mierzono za pomocą systemu ultrasonograficznego o wysokiej częstotliwości z dopplerem z falą pulsacyjną.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Uwaga: Wszystkie procedury dla zwierząt zostały zatwierdzone przez Ogólnokrajowy Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Szpitalu Dziecięcym.
1. Pobranie zastawki płucnej od myszy dawcy zastawki serca
- Autoklaw wszystkie narzędzia chirurgiczne przed zabiegiem: 1x cienkie nożyczki, 3x mikrokleszcze, 2x mikrozaciski naczyniowe, 1x zacisk do kleszczy, 1x uchwyt do mikroigieł, 1x nożyczki sprężynowe, 1x zwijacz .
- 6-8 tygodniowa samica myszy C57BL/6 jest używana jako dawca zastawki płucnej serca. Wyjmij mysz z klatki i zważ ją, a następnie poddaj eutanazji za pomocą koktajlu ketamina/ksylazyna (ketamina, 200 mg/kg i ksylazyna, 20 mg/kg, IP) w przypadku przedawkowania.
- Przypnij obszar klatki piersiowej i umieść mysz w grzbietowej pozycji leżącej na podkładce. Następnie wykonaj torakotomię. Odsłoń serce, wykonaj małe nacięcie na prawym przedsionku i przelej lewą komorę lodowatą solą fizjologiczną.
- Tępo wypreparuj tętnicę płucną (PA) z aorty wstępującej. Wyciąć zastawkę płucną (PV) wraz z 2 mm mankietem tętnicy płucnej. Pozbądź się pozostałej części serca.
- Przechowywać PV w zimnym roztworze heparyny i soli fizjologicznej (100 jednostek/ml). Uwaga: PV można przechowywać w roztworze przez dwie godziny przed przeszczepieniem do serca dawcy.
2. Przygotowanie serca dawcy
- 6-8 tygodniowa samica myszy C57BL/6 jest używana jako dawca serca. Wyjmij mysz z klatki i zważ ją, a następnie poddaj eutanazji za pomocą koktajlu ketamina/ksylazyna (ketamina, 200 mg/kg i ksylazyna, 20 mg/kg, IP) w przypadku przedawkowania. Jest to procedura terminalna.
- Przypnij obszar klatki piersiowej i umieść mysz w grzbietowej pozycji leżącej na podkładce. Następnie wykonaj torakotomię. Tępo oddziel serce, żyłę główną dolną (IVC), żyłę główną górną (SVC), aortę wstępującą, PA i żyłę płucną. Wykonaj fuzję IVC lodowatą sterylną solą fizjologiczną.
- Podwiązać IVC, SVC i żyłę płucną za pomocą jedwabnego szwu 6-0, a następnie przeciąć powyżej ligatur.
- Przetnij aortę i PA za pomocą mankietu 2 mm.
- Odetnij fotowoltaikę i wyrzuć ją.
3. Przeszczepienie zastawki serca do serca dawcy
- Natychmiast po kroku 2.5 umieść zastawkę serca z kroku 1.5 w sercu dawcy i ustaw zastawkę serca.
- Zabezpiecz PV ściegiem po prawej stronie zaworu za pomocą szwów monofilamentowych 10-0 na stożkowych igłach i zacznij szyć w sposób ciągły za pomocą 5-6 szwów z drugiej strony PV.
- Po zakończeniu przedniej strony obróć serce poziomo i zacznij zszywać tylną stronę PV na sercu dawcy.
- Przechowuj serce w zimnym, sterylnym roztworze heparyny/soli fizjologicznej. Uwaga: Serce dawcy może być trzymane w roztworze przez dwie godziny przed implantacją myszy biorcy.
4. Heterotopowy przeszczep serca na mysz biorcę
- Jako biorcę wykorzystano 6-8 tygodniową samicę myszy C57BL/6. Wyjmij mysz z klatki i zważ ją, a następnie znieczul koktajlem ketamina/ksylazyna (ketamina, 100 mg/kg i ksylazyna 10 mg/kg). Ketoprofen (5 mg/kg) jest stosowany jako środek przeciwbólowy przed znieczuleniem.
- Po sprawdzeniu poziomu sedacji poprzez szczypanie ogona, przytnij włosy na brzuchu i klatce piersiowej. Nasmaruj oczy sterylną maścią okulistyczną i umieść mysz w pozycji grzbietowej leżącej na podkładce. Zdezynfekuj brzuch betadyną i wacikami nasączonymi alkoholem. Następnie przykryj mysz sterylną serwetą i odsłoń tylko obszar nacięcia.
- Wykonaj nacięcie laparotomii w linii środkowej od dołu ksyloidalności do okolicy nadłonowej i włóż retraktor samozabezpieczający. Zawiń jelita w gazę zwilżoną solą fizjologiczną. Dosadnie zdefiniuj aortę podnerkową i żyłę główną.
- Umieść dwa jedwabne szwy 6-0 proksymalnie i dystalnie wokół aorty i IVC, aby ograniczyć krążenie krwi.
- Umieść serce dawcy po prawej stronie aorty brzusznej i przykryj je sterylną gazą. Nawilż go solą fizjologiczną.
- Wykonaj aortomię w aorcie brzusznej za pomocą igły 30 G i rozszerz otwór nożyczkami do rozmiaru aorty dawczej.
- Wykonać zespolenie z boku za pomocą sterylnych szwów monofilamentowych 10-0 na igłach stożkowych. Zabezpiecz aortę dawczą jednym szwem na bliższym końcu otworu w aorcie brzusznej i zacznij szyć w sposób ciągły 4-5 szwami od dystalnego końca aorty brzusznej.
- Odwróć serce na lewą stronę, przykryj je gazą z solą fizjologiczną i zacznij szyć w sposób ciągły 4-5 szwami od dystalnego końca aorty brzusznej.
- Wykonać janotomię w IVC za pomocą igły 30 G i rozszerzyć otwór do wielkości tętnicy płucnej dawcy.
- Wykonać zespolenie koniec z bok za pomocą sterylnych szwów monofilamentowych 10-0 na igłach stożkowych. Zabezpiecz PA dawcy jednym szwem na bliższym końcu otworu w IVC i zacznij szyć w sposób ciągły 4-5 szwami od dystalnego końca żyły głównej dolnej. Tym razem, ponieważ aorta przeszkadza, upewnij się, że szwy lewej ściany PA dawcy znajdują się po wewnętrznej stronie IVC.
- Przepłukać światło IVC heparyną i roztworem soli fizjologicznej (100 jednostek/ml). Zamknij prawą ścianę PA dawcy i biorcy IVC, zszywając je w sposób ciągły do dystalnego końca.
- Usuń dystalną ligaturę i zatamuj krwotok, stosując miejscowo wchłanialny sterylny środek hemostatowy. Gdy krwotok całkowicie ustaje, usuń szew proksymalny i zatamuj krwotok w ten sam sposób.
- Zwróć jelita i zamknij mięśnie brzucha i skórę w dwóch warstwach za pomocą czarnego nici poliamidowego 6-0.
- Wstrzyknąć podskórnie 0,5 ml soli fizjologicznej i umieścić mysz w klatce regeneracyjnej na podkładce rozgrzewającej, aż mysz będzie w pełni mobilna. Po powrocie do zdrowia umieść mysz z powrotem w nowej klatce z papierową ściółką. Podawaj leki przeciwbólowe (ibuprofen, 30 mg/kg, woda pitna) przez 48 godzin. Nie należy zwracać zwierzęcia, które przeszło operację, do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie wyzdrowieje.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rysunek 1 przedstawia schemat modelu transplantacji zastawki serca z wykorzystaniem heterotopowego przeszczepu serca. Zastawkę serca pobrano z serca dawcy i wszczepiono do serca drugiej myszy dawcy. Następnie serce z nową zastawką wszczepiono do jamy brzusznej myszy biorcy. Rysunek 2 przedstawia ilustrację wszczepionego serca w przestrzeni brzusznej (A), bezpośrednio po transplantacji serca (B) oraz 5 min po transplantacji. Po usunięciu szwów po obu stro...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Śmiertelność po tym zabiegu wynosi blisko 20%, co było spowodowane głównie krwotokiem w miejscu przeszczepienia PV i zespoleniem aorty dawcy z aortą brzuszną biorcy. W większości przypadków śmiertelność znacznie spada 48 godzin po operacji. Myszy, które przeżyły, wykazywały silne bicie serca i przepływ krwi przez wszczepiony PV. Cały proces trwa cztery godziny dla doświadczonego mikrochirurga. Potrzeba około 250 myszy, aby opanować tę technikę. Heterotopowy przeszczep serca jest stosunkowo prosty w porównaniu z implantac...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była częściowo wspierana przez grant z NIH (RO1 HL098228) dla CKB.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Mikroskop | Leica | M80 | |
| C57BL/6J (H-2b), Kobieta | Jackson Laboratories | 664 | 8-12 tygodni |
| Chlorowodorek ketaminy do wstrzykiwań | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| Sterylny roztwór ksylazyny | Akorn Inc. | NADA# 139-236 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-4396-01 | |
| Ibuprofen | PrecisionDose | NDC 68094-494-59 | |
| Heparyna Sodium | Sagent Pharmaceticals | NDC 25021-400 | |
| Roztwór soli fizjologicznej (sterylny 0,9% chlorek sodu) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| 0,9% Chlorek sodu do wstrzykiwań | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| Maść oftalmiczna z wazeliną | Dechra Produkty weterynaryjne | NDC 17033-211-38 | |
| Jodowe podkładki przygotowawcze | Triada jednorazowe, Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| Podkładki do przygotowywania alkoholu | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| Aplikatory z bawełnianą końcówką | Fisher Sientific | 23-400-118 | |
| Cienkie nożyczki | FST | 14028-10 | |
| Kleszczyk do mikrozębów | FST | 11018-12 | |
| Kleszcz do nakładania zacisków | FST | 00072-14 | |
| S& T Zacisk naczyniowy | FST | 00396-01 | |
| Nożyczki sprężynowe | FST | 15008-08 | |
| Zwijacze Colibri | FST | 17000-04 | |
| Dumont #5 Kleszcz | FST | 11251-20 | |
| Dumont #7 - Kleszcze drobne | FST | 11274-20 | |
| Dumont #5/45 Kleszcze | FST | 11251-35 | |
| Uchwyt na igły Tish/ Kleszcze | Micrins | MI1540 | |
| poliamidowy szew monofilamentowy, 10-0 | AROSurgical Instruments Corporation | TI638402 | Do szycia przeszczepu |
| poliamidowy szew monofilamentowy, 6-0 | AROSurgical Instruments | SN-1956 | Do muskulatury i zamykania skóry |
| Gąbki włókninowe | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Wchłanialny hemostat | Ethicon | 1961 | |
| ml Strzykawka | BD | 309659 | |
| 3 ml Strzykawka | BD | 309657 | |
| 10 ml Strzykawka | BD | 309604 | |
| 18 G 1 1/2 cala, Igła | BD | 305190 | |
| 25 G 1 in., Igła | BD | 305125 | |
| 30 G 1 in., Igła | BD | 305106 | |
| Recyrkulator ciepłej wody | Gaymar | TP-700 | |
| Podkładka rozgrzewająca | Gaymar | TP-22G | |
| Trymer | Wahl | 9854-500 | |
| VEVO2100 Ultradźwięki wysokiej częstotliwości | VisualSonics | http://www.visualsonics.com/vevo2100 | Numer katalogowy i cennik można uzyskać u przedstawicieli handlowych. |
| Żel do transmisji ultradźwięków | Parker Laboratories, INC. | 01-02 | |
| Stołowy laboratoryjny system znieczulenia zwierząt | VetEquip, INC. | ||
| Isoflurane | Baxter | 1001936060 |
Bibliografia
- Polito, A., et al. Increased morbidity and mortality in very preterm VLBW infants with congenital heart disease. Intens Care Med. 39, 1104-1112 (2013).
- Wren, C., Reinhardt, Z., Khawaja, K. Twenty year trends in diagnosis of life threatening neonatal cardiovascular malformations. Arch Dis Child Fetal. 93, F33-F35 (2008).
- Vacanti, J. P. Beyond transplantation Third annual Samuel Jason Mixter lecture. Archives of surgery. 123, Chicago Ill. 545-549 (1960).
- Tudorache, I., et al. Orthotopic replacement of aortic heart valves with tissue-engineered grafts. Tissue engineering Part A. 19, 1686-1694 (2013).
- van Geldorp, M. W., et al. Patient outcome after aortic valve replacement with a mechanical or biological prosthesis weighing lifetime anticoagulant related event risk against reoperation risk. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 137, 881-886 (2009).
- El Oakley, R., Kleine, P., Bach, D. S. Choice of prosthetic heart valve in today's practice. Circulation. 117, 253-256 (2008).
- Quinn, R. W. Animal Models for Bench to Bedside Translation of Regenerative Cardiac Constructs. Progress in Pediatric cardiology. 35, (2013).
- Shinoka, T., et al. Tissue engineering heart valves valve leaflet replacement study in a lamb model. The Annals of thoracic surgery. 60, S513-S516 (1995).
- Sodian, R., et al. Tissue engineering of heart valves in vitro experiences. The Annals of thoracic surgery. 70, 140-144 (2000).
- Shinoka, T., et al. Tissue engineered heart valves. Autologous valve leaflet replacement study in a lamb model. Circulation. 94, II164-II168 (1996).
- Sodian, R., et al. Evaluation of biodegradable three dimensional matrices for tissue engineering of heart valves. ASAIO journal (American Society for Artificial Internal Organs. 46, 107-110 (1992).
- Sodian, R., et al. Early in vivo experience with tissue-engineered trileaflet heart valves). Circulation. 102, III22-III29 (2000).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
