Modelowanie udaru u myszy: trwała koagulacja dalszej tętnicy środkowej mózgu

Podsumowanie

Różne mysie modele zamknięcia tętnicy środkowej mózgu (MCAO) są szeroko stosowane w eksperymentalnych badaniach mózgu. W tym miejscu demonstrujemy model przezczaszkowego stałego dystalnego MCAO, który powoduje konsekwentny zawał kory mózgowej o wielkości odpowiadającej uszkodzeniom spowodowanym przez większość udarów niedokrwiennych u ludzi.

Streszczenie

Udar mózgu jest trzecią najczęstszą przyczyną zgonów i główną przyczyną nabytej niepełnosprawności dorosłych w krajach rozwiniętych. Tylko bardzo ograniczone opcje terapeutyczne są dostępne dla niewielkiej części pacjentów z udarem mózgu w ostrej fazie. Obecne badania intensywnie poszukują nowych strategii terapeutycznych i coraz częściej koncentrują się na fazie podostrej i przewlekłej po udarze, ponieważ więcej pacjentów może kwalifikować się do interwencji terapeutycznych w dłuższym oknie czasowym. Te opóźnione mechanizmy obejmują ważne szlaki patofizjologiczne, takie jak zapalenie po udarze, angiogeneza, plastyczność neuronów i regeneracja. Aby przeanalizować te mechanizmy, a następnie ocenić nowe cele leków, poszukuje się eksperymentalnych modeli udaru o znaczeniu klinicznym, niskiej śmiertelności i wysokiej odtwarzalności. Co więcej, myszy są najmniejszymi ssakami, u których można wywołać ogniskową zmianę udaru mózgu i dla których dostępne jest szerokie spektrum modeli transgenicznych. Dlatego opisujemy tutaj mysi model przezczaszkowego, trwałego krzepnięcia tętnicy środkowej mózgu poprzez elektrokoagulację dystalną tętnic soczewkowo-triataliowych, tzw. "model krzepnięcia". Powstały zawał w tym modelu zlokalizowany jest głównie w korze; Względna objętość zawału w stosunku do wielkości mózgu odpowiada większości udarów u ludzi. Ponadto model spełnia wyżej wymienione kryteria odtwarzalności i niskiej śmiertelności. W tym filmie demonstrujemy chirurgiczne metody indukcji udaru mózgu w "modelu krzepnięcia" oraz przedstawiamy narzędzia do analizy histologicznej i funkcjonalnej.

Wprowadzenie

Udar mózgu jest trzecią najczęstszą przyczyną zgonów i jedną z głównych przyczyn nabytej niepełnosprawności dorosłych^{w krajach} rozwiniętych. 1. Około 80% tej ostrej choroby neurologicznej jest spowodowane niedokrwieniem mózgu wynikającym z niedrożności przepływu krwi w mózgu, podczas gdy około 15% jest spowodowanych krwotokiem śródmózgowym². Pomimo trwających badań, dożylne podawanie tkankowego aktywatora plazminogenu jest jak dotąd jedynym zatwierdzonym leczeniem farmakologicznym udaru niedokrwiennego i dostępnym tylko dla mniejszości pacjentów z udarem ze względu na krótkie, zatwierdzone okno czasowe wynoszące 4,5 godziny po wystąpieniu udaru^3,4. Ponieważ nie ma modeli in vitro, które mogłyby prawidłowo modelować złożone interakcje między mózgiem, naczyniami krwionośnymi i ogólnoustrojowymi mechanizmami patofizjologicznymi podczas udaru, modele zwierzęce są niezbędne w przedklinicznych badaniach nad udarem.

Dlatego też opracowano kilka modeli udaru niedokrwiennego u różnych gatunków. Jednym z najczęściej stosowanych modeli udaru jest "model włóknisty", w którym włókno szwu jest przejściowo wprowadzane do tętnicy szyjnej wewnętrznej i przekazywane do momentu, gdy końcówka zasłania początek tętnicy środkowej mózgu (MCA), co powoduje zatrzymanie przepływu krwi, a następnie zawał mózgu w obszarach podkorowych, a w przypadku przedłużonej okluzji również w korze mózgowej^5,6. W fotozakrzepowych modelach udaru niedokrwiennego uzyskuje się fotochemiczną okluzję napromieniowanego naczynia korowego po wstrzyknięciu fotouczulacza, w wyniku czego powstają małe, miejscowo opisane zmiany⁷. Trwałe zamknięcie MCA dystalnej tętnic soczewkowo-strzechowych można osiągnąć przez podwiązanie tętnicy, jej przejściowe ściśnięcie lub przez trwałe krzepnięcie^8,9. Powstały zawał w tym modelu dotyczy głównie kory nowej¹⁰, ponieważ okluzja MCA w tym modelu jest dystalna do tętnic soczewkowo-trójstronnych, które zaopatrują zwoje podstawy.

Ponieważ większość zmian po udarze mózgu u ludzi znajduje się na terytorium tętnicy środkowej mózgu, wszystkie typowe modele udaru przypominają okluzje MCA lub jednej z jego gałęzi¹¹. MCA jest jedną z głównych tętnic, która zapewnia dopływ krwi do mózgu; Powstaje z tętnicy szyjnej wewnętrznej, biegnie wzdłuż bruzdy bocznej, gdzie następnie rozgałęzia się i wystaje do zwojów podstawy i bocznych powierzchni płatów czołowych, ciemieniowych i skroniowych, w tym pierwotnej kory ruchowej i czuciowej. Prawy i lewy MCA są połączone z przednimi tętnicami mózgowymi i tylnymi tętnicami komunikacyjnymi, które łączą się z tylnymi tętnicami mózgowymi, tworząc koło Willisa (ryc. 1).

Jak wcześniej zgłaszali Carmichael et al.¹¹, zawały modelowane przez model dystalnej niedrożności tętnicy środkowej mózgu (MCAO) u myszy obejmują około 10-15% półkuli, naśladując w ten sposób większość zmian po udarze mózgu, które znajdują się na korowym terytorium MCA^11,12. W 1981 roku Tamura i wsp. opisali stały, przezczaszkowy model krzepnięcia MCAO u szczurów ⁸. Jednak model opisany przez Tamurę obejmował proksymalne zamknięcie MCA w celu obejścia bardziej dystalnego rozwidlenia tętnicy. Tak więc oryginalny "model Tamura" indukuje nie tylko zmiany korowe, ale także prążkowiowe, podobne do zmian uzyskanych przez "model włóknisty"⁶. W tym miejscu opisujemy stały dystalny model MCAO za pomocą elektrokoagulacji przezczaszkowej u myszy. Ponadto przedstawiamy powiązane metody histologiczne i funkcjonalne do analizy wyniku udaru w tym modelu. Wszystkie metody oparte są na standardowych procedurach operacyjnych opracowanych i stosowanych w naszych laboratoriach.

Protokół

Oświadczenie etyczne

Eksperymenty opisane w tym filmie zostały przeprowadzone zgodnie z krajowymi wytycznymi dotyczącymi wykorzystania zwierząt doświadczalnych, a protokoły zostały zatwierdzone przez niemieckie komitety rządowe (Regierung von Oberbayern, Monachium, Niemcy). W tym badaniu wykorzystano 10-tygodniowe, męskie myszy C57Bl/6J. Zwierzęta trzymano w kontrolowanej temperaturze (22 ± 2 °C), z 12-godzinnym cyklem światła i ciemności oraz dostępem do granulowanego pokarmu i wody ad libitum. Protokoły analgezji i sedacji są opisane jako zatwierdzone przez lokalną komisję rządową, ale mogą różnić się od protokołów stosowanych w innych laboratoriach.

1. Przygotowanie materiałów i instrumentów

1. Podłącz koc grzewczy, aby utrzymać ciepło w miejscu operacji i utrzymać temperaturę ciała myszy podczas znieczulenia (37 °C).
2. Przygotuj autoklawowane nożyczki, kleszcze i bawełnę, maść do oczu z dekspantenolu i materiał do szycia. Przygotować strzykawkę z roztworem soli fizjologicznej (bez igły), aby utrzymać nawodnienie miejsca operacji. Przygotuj gaz znieczulający (70%_N2O+ 30%_O2 + izofluran).
3. Leki przeciwbólowe wstrzykiwać dootrzewnowo: Metamizol 200 mg/kg, karprofen 4 mg/kg i buprenorfina 0,1 mg/kg.
4. Umieść mysz w komorze indukcyjnej o natężeniu przepływu izofluranu 4%, aby znieczulić ją do momentu ustania spontanicznych ruchów ciała i wibrysów.
5. Przenieś mysz w pozycji bocznej z nosem do maski anestezjologicznej i utrzymuj stężenie izofluranu na poziomie 4% przez około kolejną minutę, a następnie zmniejsz i wynosi około 1,5%, aby utrzymać odpowiednie znieczulenie.
6. Nałóż maść do oczu z dekspantenolem na oba oczy.

2. Dystalny model MCAO

1. Wykonaj 1 cm nacięcie skóry między uchem a okiem za pomocą małych nożyczek operacyjnych po aseptycznym przygotowaniu pola operacyjnego przy użyciu środka dezynfekującego skórę.
2. Oddziel skórę i zlokalizuj mięsień skroniowy.
3. Wybierz w generatorze wysokiej częstotliwości funkcję krzepnięcia, tryb bipolarny, wybierz 12 W i połącz kleszczyki do elektrokoagulacji z.
4. Dodaj kroplę soli fizjologicznej i użyj kleszczy, aby odłączyć mięsień skroniowy od czaszki w jej wierzchołkowej i grzbietowej części, tworząc w ten sposób płat mięśniowy bez całkowitego usuwania mięśnia.
5. Zidentyfikuj MCA poniżej przezroczystej czaszki, w rostralnej części obszaru skroniowego, grzbietowo do zatoki zadoczodołowej (ryc. 2A). Jeśli rozwidlenie MCA nie jest widoczne (ze względu na anatomiczną normalną zmianę), zidentyfikuj naczynie najbardziej rostralne.
6. Dodaj trochę soli fizjologicznej na czaszkę i rozcieńcz kość wiertłem tuż nad gałęzią MCA, aż uzyska cienką i półprzezroczystą teksturę (ryc. 2B).
7. Ostrożnie wycofaj kość powyżej tętnicy za pomocą bardzo cienkich kleszczy.
8. Wybierz tryb bipolarny w generatorze wysokiej częstotliwości o mocy 7 W. Skoaguluj tętnicę za pomocą kleszczy elektrokoagulacyjnych proksymalnych i dystalnych do rozwidlenia (rysunek 2C). Gdy rozwidlenie nie jest widoczne ze względu na wariant anatomiczny, należy skoagulować prawidłowo zidentyfikowaną gałąź MCA (patrz wyżej) w dwóch miejscach w odległości ok. 1 mm. Nie jest konieczne chwytanie tętnicy kleszczami w celu koagulacji, wystarczy ostrożne dotykanie tętnicy kleszczami po obu stronach od góry i powoduje mniejsze uszkodzenia mechaniczne.
9. Odczekaj 30 sekund i delikatnie dotknij tętnicy kleszczami, aby sprawdzić, czy nie ma przepływu krwi z powodu spontanicznej rekanalizacji. W przypadku rekanalizacji należy powtórzyć elektrokoagulację jeden raz.
10. Przenieś mięsień skroniowy do jego pozycji, zakrywając otwór w zadziorach.
11. Zszyć ranę i umieścić zwierzę w pudełku do karmienia w temperaturze 32 °C, aby wyzdrowiało ze znieczulenia i wróciło do klatki. Ogólnie rzecz biorąc, zwierzę potrzebuje 5-10 minut, aby dojść do siebie po znieczuleniu.
12. Wstrzyknąć znieczulenie pooperacyjne (i.p.) po 24 godzinach, a następnie codziennie do piątego dnia po operacji: karprofen 4 mg/kg.

3. Fikcyjna operacja

Wykonaj wszystkie procedury identycznie jak w operacji opisanej powyżej - włączając w to ścieńczenie czaszki i jej usunięcie - z wyjątkiem niekoagulacji odsłoniętej tętnicy.

4. Test cylindra¹³

1. Umieść zwierzę w przezroczystym cylindrze ze szkła akrylowego (średnica: 8 cm; wysokość: 25 cm) przed dwoma lustrami i taśmą wideo na 5 minut. Ustaw kamerę centralnie przed dwoma lustrami i cylindrem, aby uzyskać optymalny obraz (Rysunek 3A).
2. W celu oceny niezależnego użycia kończyn przednich należy ocenić (1) kontakt ścianki cylindra z jedną kończyną przednią podczas pełnego tylnego ruchu oraz (2) lądowanie z tylko jedną kończyną przednią na podłodze po pełnym tylnym ustawieniu. Policz co najmniej 20 kontaktów na jedną kończynę przednią, korzystając z funkcji zwolnionego tempa lub klatka po klatce darmowego oprogramowania Video Lan Client (VLC) (http://www.videolan.org/vlc).
3. W przypadku analizy wyjściowej przed zabiegiem chirurgicznym: wykonaj test dwa razy na mysz, z 1-godzinną przerwą między próbami. Używanie kończyn przednich jest wyrażone jako stosunek prawo- i lewostronnego, niezależnego używania kończyn przednich.
4. Po koagulacji MCA: wykonaj test ponownie dwa razy na mysz, z 1-godzinną przerwą między próbami, jak wskazano powyżej.

5. Perfuzja

1. Znieczulić zwierzęta (np. odpowiednio ketaminą i ksylazyną w dawce 120/16 mg/kg masy ciała).
2. Ułóż zwierzę w pozycji leżącej na plecach i otwórz jamę brzuszną za pomocą środkowego cięcia. Usuń rozdarcia i mostek. Wykonaj małe nacięcie w prawym przedsionku. Wprowadzić kaniulę perfuzyjną do lewej komory i powoli perfuzjonować 20 ml soli fizjologicznej.
3. Odetnij głowę zwierzęciu, otwórz kalwarię i delikatnie oderwij mózg od podstawy czaszki.
4. Zamrozić mózgi w temperaturze -40 °C zimnego izopentanu na 10 minut, a następnie wyjąć mózgi z izopentanu i przechowywać do dalszej analizy w temperaturze -80 °C.

6. Wolumetria zawału

1. Kriosekcja: Wycinaj mózgi seryjnie na kriostacie do odcinków o grubości 20 μm co 400 μm na szkiełkach i przechowuj szkiełka w temperaturze -20 °C.
2. Barwienie fioletem krezylowym (CV):
   1. Przygotować roztwór barwiący: Wymieszać 0,5 g octanu CV w 500 ml H₂O. Wymieszać i podgrzewać (60 °C) aż do rozpuszczenia kryształów. Pozostaw roztwór do ostygnięcia i przechowuj w ciemnej butelce. Podgrzej do 60 °C i przefiltruj przed każdym użyciem.
   2. Suszyć szkiełka w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie umieść je w 95% etanolu na 15 minut, a następnie w 70% etanolu na 1 minutę, a następnie w 50% etanolu na 1 minutę.
   3. Umieścić szkiełka w wodzie destylowanej na 2 minuty, odświeżyć wodę destylowaną i umieścić je w niej na 1 minutę. Następnie umieścić szkiełka w roztworze barwiącym (60 °C) na 10 minut i umyć je dwukrotnie w wodzie destylowanej przez 1 minutę.
   4. Umieść szkiełka w 95% etanolu na 2 minuty. Następnie umieść je w 100% etanolu na 5 minut, odśwież 100% etanol i umieść je na 2 minuty. Następnie przykryj szkiełka medium montażowym.
   5. Analiza:
      Zeskanuj szkiełka i przeanalizuj objętość pośredniego zawału metodą^{Swansona 14}, aby skorygować obrzęk:
      (Obszar niedokrwienny) = (Obszar kory po stronie przeciwnej) - (Obszar kory niedokrwiennej po stronie ipsilateralnej) (Rysunek 4A).

Wyniki

Ze względu na krótki czas znieczulenia i umiarkowany stopień uszkodzenia mózgu, około 10 min po przeniesieniu do klatek wszystkie zwierzęta były przytomne, poruszały się swobodnie i wchodziły w interakcje z towarzyszami z jednej grupy. Śmiertelność podczas operacji MCAO wynosiła poniżej 5%, głównie w wyniku przypadkowego krwawienia podpajęczynówkowego lub nieprawidłowego znieczulenia. Śmiertelność w ciągu 7-dniowego okresu obserwacji po indukcji udaru występuje bardzo rzadko, u około 1-2% zwierząt. W serii operacyjnej 10 zwierząt do niniejszego raportu wszystkie osobniki przeżyły operację oraz 7-dniowy okres obserwacji, a żadne z nich nie musiało zostać wykluczone ze względu na kryteria wyłączenia.

Deficyty behawioralne po koagulacji MCA oceniono za pomocą testu cylindra¹³, analizując asymetrię w wykorzystaniu przednich łap. W teście tym stosunek niezależnego użycia lewej i prawej przedniej łapy mierzono w określonych punktach czasowych po indukcji udaru i porównywano z wartościami wyjściowymi uzyskanymi 24 h przed MCAO (Ryc. 3B). U zwierząt zaobserwowano istotną zmianę asymetrii w użyciu kończyn podczas wspólnej eksploracji ścian w teście cylindra 24 h (1,72 ± 0,326; p < 0,05) oraz 3 dni (1,36 ± 0,17; p < 0,05) po MCAO. Mimo że stosunek ten uległ poprawie w ciągu tygodnia obserwacji, asymetria motoryczna była nadal istotna 7 dni po MCAO (1,35 ± 0,29; p < 0,05) w porównaniu z wartościami wyjściowymi.

Wykonano wolumetrię obszaru zawału przy użyciu seryjnych coronalnych przekrojów mózgu barwionych fioletem krezylowym 7 dni po indukcji udaru (Rysunek 4B). Średnia objętość zawału wynosiła 15,4 mm³, co stanowiło 12% jednej półkuli mózgu (Rysunek 4C). Zmienność tego modelu udaru jest wyjątkowo niska, z odchyleniem standardowym wynoszącym około 10%. Obszar uszkodzenia obejmuje korę somatosensoryczną i motoryczną, przy jedynie niewielkim zajęciu struktur podkorowych. Ponadto lokalizacja obszaru zawału jest wysoce przewidywalna, z minimalną zmiennością, co przedstawiono na schematycznym diagramie rozmieszczenia (Rysunek 4D).

Rysunek 1. Schematyczne przedstawienie koła Willisa. Tętniczy krąg Willisa jest utworzony przez tętnice mózgu środkowe (MCA) i tętnice mózgu przednie (ACA), które odgałęziają się od tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA), a także przez tętnice mózgu tylne (PCA) i tętnice łączące tylne (PComA). MCA biegnie w stronę bruzdy bocznej, gdzie rozgałęzia się na korę mózgową. Dominująca gałąź MCA, zaopatrująca główną część kory ruchowej i część kory somatosensorycznej, jest trwale zamknięta w zaprezentowanym modelu (AcomA = tętnica łącząca przednia; BA = tętnica podstawna; SuCA = górna tętnica móżdżkowa).

Rycina 2. Widok przezczaszkowy po usunięciu mięśnia skroniowego i schematyczna prezentacja okluzji MCA. (A) Po usunięciu mięśnia skroniowego tętnice korowe są widoczne przez częściowo półprzezroczystą czaszkę myszy (u myszy w wieku 8–12 tygodni). Dominującą gałąź MCA można zidentyfikować w przedniej części widoku skroniowego, a także kolejne tętnice korowe odgałęziające się od MCA oraz PCA w części tylnej. (B) Schematyczny widok na dominującą gałąź MCA w jej najczęstszym wariancie z rozwidleniem na bocznej korze skroniowej po wywierceniu otworu trepanacyjnego i usunięciu fragmentu czaszki. (C) Czarne kwadraty reprezentują miejsca koagulacji MCA po stronie proksymalnej i dystalnej rozwidlenia.

Rysunek 3. Analiza deficytów behawioralnych. (A) Układ testu cylindra: mysz jest umieszczana w pionowym cylindrze, a za nim ustawia się lustra w celu rejestracji wszystkich ruchów za pomocą kamery wideo. (B) Asymetrię wykorzystania przednich kończyn analizowano za pomocą testu cylindra. Stosunki lewej/prawej kończyny w zakresie niezależnego wykorzystania przednich kończyn obliczano 24 hr przed MCAO oraz w indicated punktach czasowych po indukcji udaru. N = 10, *p < 0.05 pomiędzy wskazanym punktem czasowym a wartością bazową (kontrolną).

Rycina 4. Wolumetryczna analiza zawału i wynik zawału po dystalnej MCAO. (A) Reprezentatywny obraz koronalnego przekroju mózgu barwionego fioletem krezylowym 7 dni po MCAO. Żółta linia wskazuje wybór kory przeciwległej (prawej), a czerwona linia wybiera niezawałowaną (zabarwioną) korę mózgu jednostronnej. Blady obszar w lewej półkuli przedstawia obszar tkanki zawałowej. (B) Analiza objętości zawału w 10 mózgach (każda kropka reprezentuje jeden osobniczy mózg) 24 h, 3 dni i 7 dni po dystalnej koagulacji MCA. Pozioma czerwona linia reprezentuje średnią, słupki błędów wskazują odchylenie standardowe. (C) Reprezentatywne koronalne przekroje mózgu barwione fioletem krezylowym co 400 µm w 7. dniu po koagulacji MCA. (D) Schematyczny rozkład zawałowej tkanki mózgowej 7 dni po MCAO. Każdy slajd przedstawia skumulowane informacje o rozkładzie zawału (zakodowane kolorystycznie zgodnie z oznaczeniem) w danym przekroju w odniesieniu do bregma (obraz zmodyfikowany z: Liesz A et al., Brain, 2011; za zgodą Oxford University Press). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Niniejszy protokół opisuje eksperymentalny model udarowy dystalnego, trwałego MCAO metodą elektrokoagulacji przezczaszkowej – tzw. "model krzepnięcia". W międzyczasie model ten stał się jednym z najczęściej wykorzystywanych modeli zwierzęcych w eksperymentalnych badaniach nad udarem^{mózgu 12}. W porównaniu z innymi modelami ogniskowego niedokrwienia mózgu, model krzepnięcia przedstawiony w tym filmie ma tę zaletę, że zapewnia bardzo krótki czas operacji, wynoszący około 10 minut, gdy jest wykonywany przez wyszkolonego naukowca. W związku z tym w tym modelu można osiągnąć krótkie czasy znieczulenia, co jest korzystną cechą eksperymentalnego modelu udaru, ponieważ wpływ środków znieczulających na neuroprotekcję i wynik udaru jest dobrze znany¹⁵. Ponadto, jak wcześniej opisali Carmichael i wsp. ¹¹, potwierdzamy, że wynikająca objętość i lokalizacja zawału po dystalnej trwałej koagulacji MCA odpowiada niedokrwiennym zmianom mózgu w większości udarów u ludzi proporcjonalnie do wielkości mózgu. Udar mózgu u ludzi jest głównie niewielkich rozmiarów ze zmianami obejmującymi około 5-15% półkuli, na podstawie wcześniejszych badań populacyjnych i klinicznych badań obrazowych^16-18, w przeciwieństwie do rozległych zmian udarowych z kompresyjnym obrzękiem mózgu, które występują w mniej niż 10% udarów klinicznych¹⁹. W związku z tym zmiany udarowe na obszarze MCA około 12% półkuli osiągnięte przez prezentowany model można uznać za istotną translacyjnie objętość wyrzutową. Należy jednak wziąć pod uwagę, że różne szczepy myszy lub stosowane protokoły znieczulenia mogą wpływać na powstałą objętość zmiany²⁰.

Śmiertelność w okresie obserwacji po indukcji udaru mózgu w tym modelu jest praktycznie nieobecna. Na ogólną śmiertelność poniżej 5% składają się głównie zgony podczas operacji z powodu powikłań anestezjologicznych lub poświęcenia z powodu spełnienia kryteriów wykluczenia. Aby zagwarantować niską zmienność tego modelu i jego doskonałą odtwarzalność, sugerujemy następujące kryteria wykluczenia: 1) Jakikolwiek krwotok podpajęczynówkowy podczas operacji. 2) Czas operacji dłuższy niż 15 min. 3) Rekanalizacja MCA po dwóch próbach elektrokoagulacji tylko z przejściowym MCAO. Co więcej, zwierzęta muszą być badane codziennie po MCAO (podstawowe zachowania fizjologiczne, wygląd futra i masa ciała) w celu kontrolowania bólu, dyskomfortu lub zachowań chorobowych.

Do analizy wyników udaru można zastosować kilka środków, takich jak pomiar plamek laserowych, rezonans magnetyczny, testy behawioralne lub analiza histologiczna. W tym protokole udostępniamy przykładowe metody analizy zachowania i analizy objętości zawału. Opracowano kilka testów do analizy behawioralnej po ogniskowym niedokrwieniu mózgu i wykorzystano je w eksperymentalnych badaniach nad udarem. Odpowiednimi testami na dysfunkcję sensomotoryczną wcześniej stosowaną przez naszą grupę w tym modelu skoku^21,22 były test Rotarod²³, test lepkiej etykiety²⁴, test narożny²⁵ i test cylindryczny¹³, który jest pokazany w tym filmie. Test cylindryczny konsekwentnie obrazuje asymetrię motoryczną w ostrej fazie po dystalnym stałym MCAO, a także wykrywa kolejne odzyskiwanie funkcji motorycznej.

Pomimo oczywistych zalet, należy wziąć pod uwagę pewne ograniczenia tego modelu skoku. Po pierwsze, trepanacja czaszki jest potrzebna w celu koagulacji tętnicy, wytwarzając w ten sposób potencjalny dostęp do okołooperacyjnych infekcji mózgu, chociaż infekcje bakteryjne rany operacyjnej, mięśnia skroniowego lub samego mózgu nigdy nie zostały wykryte przez nas samych ani udokumentowane przez innych korzystających z tego modelu. Ponadto nie można wykluczyć mechanicznego uszkodzenia kory mózgowej podczas preparacji i krzepnięcia, ale można je ograniczyć poprzez staranne wiercenie i usuwanie czaszki, stałe nawilżanie miejsca operowanego i minimalną niezbędną elektrokoagulację (patrz kryteria wyłączenia). Chociaż przebieg MCA, jak pokazano na rysunku 2 , występuje u większości myszy C57Bl/6, w protokole opisujemy, jak postępować przy normalnych zmianach kursu statku, aby zminimalizować zmienność modelu. Ponadto sugerujemy stosowanie wielu (3 w przypadku bifurkacji; 2 bez bifurkacji MCA) miejsc okluzji, aby zminimalizować ryzyko częściowej rekanalizacji MCA, co z naszego doświadczenia jest ważnym czynnikiem wpływającym na zmienność tego modelu.

Jeśli chodzi o testy behawioralne, w wyżej wymienionych testach behawioralnych można wykryć tylko niewielkie deficyty behawioralne, a regenerację funkcjonalną można zaobserwować w ciągu pierwszego tygodnia po udarze. W związku z tym bardziej zaawansowane systemy testowe o wyższej czułości i jakościowych parametrach testowych, takie jak test wykwalifikowanego docierania²⁷ , mogą być bardziej odpowiednie do wykrywania długoterminowych wyników funkcjonalnych w tym modelu.

Wreszcie, ze względu na trwałą koagulację MCA nie można uzyskać reperfuzji, co jest cechą obserwowaną u znacznego odsetka pacjentów z udarem mózgu z powodu spontanicznej lizy skrzepów lub terapii²⁸. Jednak wcześniej opisany model udaru zakrzepowo-zatorowego²⁶ przewiduje opcję uzupełniającego modelu udaru z reperfuzją korowego niedokrwienia mózgu. Podsumowując, wysoka odtwarzalność, możliwa długoterminowa obserwacja ze względu na minimalną śmiertelność oraz porównywalna względna objętość i lokalizacja zawału w odniesieniu do udaru u człowieka wyróżniają "model krzepnięcia" jako cenny model dla podstawowych i translacyjnych badań nad udarem.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Aparat Canon Eos 500D	Canon		: 18-55 mm; 30 kl./s; 640 x 480 funkcja wideo
Lustro	Kristallform	2677089	30 x 30 cm
Cylinder ze szkła akrylowego	przezroczysty H& S Kunststofftechnik		Średnica: 8 cm,  wysokość: 25 cm
Koc grzewczy	FHC DC Regulator
Drobne nożyczki	FST	15000-00
Nożyczki Mayo	FST	1410-15
Kleszcze	FST	11616-15
Bawełna	NOBA Verbondmitel Danz	974116
Roztwór soli Braun		131321
Bepanthen pommade	Bayer
Isoflurane	Abbot	B506
System anestezjologiczny do izofluranu	Dräger
Stereomikroskop	Zeiss	Stemi DV4
Urządzenie elektrochirurgiczne	ERBETOM ICC 80/50 HF-Chirurgiegerä t
Wiertło	Proxxon	D-34343
Ketamina	Inresa Arzneimittel GmbH
Xylacine	Albrecht
5ml Strzykawka	Braun
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem PH: 7,4	Apotheke Innestadt Uni München	P32799
Isopentane	Fluka	59070
Prowadnice Cryostat	Thermo Scientific CryoStarNX70
Superfrost Plus Thermo	Scientific	J1800AMNZ
Fiolet kresylowy	Sigma Life Science	C5042-10G
Kwas octowy	Sigma Life Science	695092
Etanol 70%	CLN Chemikalien Laborbedorf	521005
Etanol 96%	CLN Chemikalien Laborbedorf	522078
Etanol 99%	CLN Chemikalien Laborbedorf	ETO-5000-99-1
Podłoże montażowe Roti-Histokit	Roth	6638.1
Myszy C57Bl/6J Charles	River	000664