Artykuł metodologiczny

Tworzenie ogniska: test komórkowy w celu określenia potencjału onkogennego genu

DOI:

10.3791/51742

⸱

31 grudnia 2014

 ,  , 
1Department of Pharmacology, University of California, Davis

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test Focus Formation dostarcza prostej metody oceny potencjału transformacyjnego kandydującego onkogenu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Złośliwa transformacja komórek zazwyczaj wiąże się ze zwiększoną proliferacją, utratą hamowania kontaktu, nabyciem niezależnego od zakotwiczenia potencjału wzrostu i zdolnością do tworzenia nowotworów u zwierząt doświadczalnych1. W komórkach NIH 3T3 wiadomo, że szlak transdukcji sygnału Ras wyzwala wiele z tych zdarzeń, co jest znane jako transformacja Ras. Wprowadzenie nadekspresji genu w komórkach NIH 3T3 może sprzyjać transformacji morfologicznej i utracie hamowania kontaktu, co może pomóc w określeniu potencjału onkogennego tego genu będącego przedmiotem zainteresowania. Testem, który zapewnia prostą metodę oceny jednego z aspektów potencjału transformacyjnego onkogenu, jest test formacji ostrości (FFA)2. Kiedy komórki NIH 3T3 dzielą się normalnie w hodowli, robią to, dopóki nie osiągną zlewającej się monowarstwy. Jednak w obecności nadekspresji onkogenu komórki te mogą zacząć rosnąć w gęstych, wielowarstwowych ogniskach1, które można uwidocznić i określić ilościowo za pomocą barwienia fioletem krystalicznym lub Hema 3. W tym artykule opisujemy protokół FFA z transdukcją retrowirusową interesującego genu do komórek NIH 3T3 oraz sposób ilościowego określania liczby ognisk poprzez barwienie. Transdukcja retrowirusowa oferuje bardziej wydajną metodę dostarczania genów niż transfekcja, a zastosowanie ekotropowego mysiego retrowirusa zapewnia kontrolę bezpieczeństwa biologicznego podczas pracy z potencjalnymi ludzkimi onkogenami.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki nowotworowe można odróżnić od swoich normalnych odpowiedników za pomocą szerokiego zakresu zmian, od wzorców ekspresji genów, przez epigenomikę, po zmiany morfologiczne i proliferacyjne. Wśród tych ostatnich, zmniejszona zależność od surowicy, zahamowanie utraty kontaktu (gęstości), nabycie proliferacji niezależnej od zakotwiczenia i ostatecznie zdolność do tworzenia guzów po wstrzyknięciu zwierzętom są przydatnymi, mierzalnymi wskaźnikami transformacji złośliwej3. Opracowano kilka testów in vitro i in vivo do transformacji komórkowej. Testy in vitro mają na celu identyfikację i pomiar zmian w morfologii kultur (test tworzenia ognisk), dynamice hodowli (szybkość wzrostu, gęstość nasycenia) i wymaganiach dotyczących czynnika wzrostu (wzrost w zmniejszonej surowicy) lub zakotwiczenia (wzrost w miękkim agarze). Złotym standardem w określaniu złośliwej natury typu komórki pozostaje tworzenie nowotworów (ksenoprzeszczepy) u zwierząt doświadczalnych. Jednak koszt i czas trwania badań in vivo nie zawsze sprawiają, że są one uzasadnione jako pierwszy etap walidacji lub badania przesiewowego potencjalnych onkogenów. Chociaż żaden test in vitro nie zapewnia ostatecznej oceny potencjału onkogennego genu, dostarcza on wglądu w potencjał onkogenny, który może zawęzić przyszłe badania in vivo. Jednym z najczęściej stosowanych systemów oceny potencjału onkogennego in vitro jest Focus Formation Assay2. Podejście to opiera się na wykorzystaniu mysiego fibroblastu NIH 3T3, nieprzekształconej linii komórkowej, która wykazuje silne hamowanie kontaktowe. Nadekspresja onkogenu powoduje utratę wzrostu zależnego od gęstości; Przekształcone komórki mogą następnie rosnąć w wielu warstwach, tworząc "ogniska", które można łatwo zwizualizować na tle monowarstwy nieprzekształconych komórek. Test tworzenia ostrości mierzy zatem zdolność kandydującego onkogenu do indukowania złośliwej transformacji, czego dowodem jest utrata hamowania kontaktu jako mierzalny fenotyp. FFA został wykorzystany do oceny transformacji przez nadekspresję m.in. kinaz białkowych (np. Src4, BRAF5), czynników transkrypcyjnych (np. N-myc6), receptorów sprzężonych z białkiem G (np. P2RY87) i GTPaz (np. Ras1). Względna łatwość tego testu sprawia, że jest to dobry wybór, który zapewni szybką i wizualnie jasną odpowiedź na pytanie, czy nadekspresja genu jest wystarczająca do transformacji mysich komórek fibroblastów NIH 3T3 in vitro.

FFA opisany w tym protokole wykorzystuje linię komórkową8 Plat-E, która dostarcza białka do pakowania wirusów, oraz wektor retrowirusowy pBABEpuro9 (plazmid Addgene 1764) do produkcji retrowirusa. Po transfekcji konstruktem pBABEpuro zawierającym interesujący gen, linia komórkowa Plat-E wytworzy ekotropowego retrowirusa, który może być wykorzystany do zakażenia komórek NIH 3T3. Ta wirusowa metoda dostarczania genów jest bardziej wydajna niż tradycyjne metody transfekcji chemicznej i oferuje sposób na trwałą ekspresję genu10. Po włączeniu do genomu komórek NIH 3T3 nadekspresja interesującego genu jest napędzana przez promotor wirusowych długich powtórzeń końcowych (LTR)11. To stałe wyrażenie można wykorzystać do określenia, czy gen będący przedmiotem zainteresowania ma aktywność onkogenną, mierzoną tworzeniem ognisk, na komórkach NIH 3T3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Tworzenie wektorów wirusowych

Sekwencje kodujące dla interesującego genu, jak również kontrole pozytywne i negatywne, są wprowadzane do pBABEpuro za pomocą tradycyjnych metod klonowania (amplifikacja PCR, trawienie restrykcyjne i ligacja). Na wektorze znajdują się cztery miejsca restrykcyjne, w których można wprowadzić DNA: BamHI, SnaBI, EcoRI i SalI.

  1. Przygotuj plazmidowe DNA klasy transfekcyjnej z kompetentnych komórek za pomocą zestawu QIAGEN plasmid midi.
  2. Zmierz stężenie DNA za pomocą spektrofotometru NanoDrop2000.

2. Produkcja retrowirusów

Linia komórkowa Plat-E zostanie wykorzystana do produkcji ekotropowego retrowirusa, który dostarczy interesujące cDNA do komórek NIH 3T3.

  1. Zakładanie kultur Plat-E z zamrożonych komórek
    1. Szybko rozmrozić komórki Plat-E w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Powoli dodawać 9 ml pożywki Plat-E (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% Płodowej Surowicy Bydlęcej (FBS) + Penicylina i Streptomycyna).
    2. Odwirować probówkę o stężeniu 180 x g przez 5 minut i wyrzucić supernatant.
    3. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki Plat-E i przenieść do naczynia hodowlanego o średnicy 10 cm.
    4. Inkubować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 do momentu, aż osiągną 80-90% zlewu (około 2 dni).
  2. Dzielenie komórek
    1. Odessać pożywkę i raz przemyć komórki PBS.
    2. Dodać 2 ml 0,05% trypsyny-EDTA i inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
    3. Oderwać komórki przez stukanie palcem, dodać 10 ml pożywki Plat-E i przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml.
    4. Odwirować probówkę o stężeniu 180 x g przez 5 minut i wyrzucić supernatant.
    5. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki Plat-E i wysiać je w nowych szalkach w rozcieńczeniach 1:4-1:6.
  3. Siewnik i transfekcja Plat-E
    1. Wysiew 2 x 106 komórek na 10 cm naczynie hodowlane przy użyciu pożywki Plat-E bez żadnych antybiotyków.
    2. Inkubować komórki O/N w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    3. Następnego dnia przenieś 300 μl Opti-MEM do 1,5 ml probówki do mikrofuge.
    4. Dodać 27 μl polietylenininy (PEI), ekonomicznego odczynnika do transfekcji12, do przygotowanej probówki z Opti-MEM. Delikatnie wymieszać, stukając palcem i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Dodać 9 μg plazmidowego DNA klasy transfekcyjnej do probówki Opti-MEM/PEI, delikatnie wymieszać przez wirowanie i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Dodawać kompleks DNA/PEI kroplami do szalki Plat-E i inkubować O/N w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    7. Następnego dnia odessać pożywkę zawierającą odczynnik do transfekcji i dodać 10 ml świeżej pożywki Plat-E (bez antybiotyków).
    8. Umieść komórki z powrotem w inkubatorze.

3. Komórki NIH 3T3 i infekcja

  1. Ustanawianie kultur NIH 3T3 i wysiew
    1. Szybko rozmrozić komórki NIH 3T3 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i przenieść do probówki o pojemności 15 ml. Powoli dodawać 9 ml pożywki NIH 3T3 (DMEM + 10% FBS).
    2. Odwirować probówkę o stężeniu 180 x g przez 5 minut i wyrzucić supernatant.
    3. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki NIH 3T3 i przenieść do naczynia hodowlanego o średnicy 10 cm.
    4. Inkubować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Bardzo ważne jest, aby komórki NIH 3T3 były zawsze utrzymywane w niedostatecznym zlewaniu (50-60%), ponieważ częstotliwość spontanicznej transformacji (a tym samym podstawowy poziom tworzenia ognisk) wzrasta, gdy hodowla osiągnie zbieg.
    5. Wysiewaj 3 x 105 komórek na 10 cm naczynie i inkubuj O/N do infekcji następnego dnia.
  2. Zakażać
    1. Zbierz retrowirusowy supernatant z szalki Plat-E za pomocą jednorazowej strzykawki o pojemności 10 ml, przefiltruj go przez nylonowy filtr membranowy o wielkości porów 0,45 μm i przenieś do probówki o pojemności 15 ml.
    2. Dodać 10 ml świeżej pożywki Plat-E do komórek (bez antybiotyków) i umieścić je z powrotem w inkubatorze.
    3. Odessać pożywkę z naczynia na komórki NIH 3T3, która ma być zakażona, i dodać 5 ml zwykłej pożywki NIH 3T3 i 5 ml przefiltrowanego supernatantu zawierającego wirusa.
    4. Do naczynia dodać polibren w stężeniu 6 μg/ml.
    5. Inkubować komórki O/N w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    6. Następnego dnia powtórz kroki 3.2.1 – 3.2.5 dla drugiej rundy infekcji.
    7. Zastąp pożywkę zawierającą wirusa zwykłą pożywką NIH 3T3.
    8. Pozwól komórkom NIH 3T3 rosnąć przez 2-3 tygodnie, w razie potrzeby wymieniając pożywkę. Sprawdź ekspresję interesującego białka za pomocą konwencjonalnej elektroforezy białek i immunoblot na lizatach całych komórek z płytek replik
      9. .

4. Barwienie i kwantyfikacja

  1. Barwienie kryształowym fioletem
    1. Odessać pożywkę NIH 3T3 i umieścić naczynia na lodzie.
    2. Umyj naczynia dwukrotnie lodowatym PBS.
    3. Namocuj komórki lodowatym metanolem przez 10 minut.
    4. Wyjmij naczynia z lodu, odessaj metanol i dodaj 3 ml 0,5% roztworu fioletu krystalicznego wykonanego z 25% metanolu (RT).
    5. Inkubuj naczynia przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Odessać roztwór fioletu krystalicznego i ostrożnie wypłukać naczynie preparatem Milli-QH2O, aż z płukanki nie zniknie żaden kolor.
    7. Pozostaw naczynia do wyschnięcia O/N na blacie (bez przykrycia).
  2. Kwantyfikacja ognisk
    1. Gdy naczynia wyschną, użyj linijki, aby zmierzyć ciemne zbiory komórek na talerzu. Licz tylko te, które mają średnicę większą niż 5 mm jako "ogniska". Zapisz liczbę ognisk i oblicz średnie oraz istotność w porównaniu z kontrolami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MXD3 to podstawowy czynnik transkrypcyjny helisa-pętla-helisa leucyny (bHLHZ), który jest członkiem sieci MYC/MAX/MAD. Jest to nietypowy członek rodziny MAD13-15 i doniesiono, że bierze udział w kancerogenezie16,17. W porównaniu z pBABEpuro (kontrola ujemna) i MYC (kontrola pozytywna), szalki NIH 3T3, w których MXD3 był nadmiernie eksprymowany, miały znacznie mniej ognisk (Figura 1A). Dane na rysunku 1B zostały zebrane z wielu eksperymentów w celu określenia istotno...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FFA zapewnia szybką i łatwą metodę oceny przemiany złośliwej in vitro. Jest podatny na badania przesiewowe stosunkowo dużej liczby genów kandydujących, a jego skromne wymagania techniczne sprawiają, że jest opłacalny. Co więcej, dwa lub więcej genów może być współeksprymowanych (czasami określanych jako test "współpracy") w celu oceny potencjału rakotwórczego kombinacji. Zalety tego testu polegają na jego prostej technice, łatwości oznaczania ilościowego i stosunkowo krótkim czasie realizacji. Należy jednak podk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta grantem z NIH Director's New Innovator Award Program (E.D.). A. A. była częściowo wspierana przez nagrody licencjackie od National Cancer Institute i National Science Foundation.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
pBABE-puro wektorAddgenePlasmid 1764wektor klonowania
Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, EcotropicCell Biolabs, Inc.RV-101do produkcji wirusów
Linia komórkowa NIH 3T3 mysiaSigma-Aldrich93061524do testu tworzenia ognisk
10 ml strzykawka z końcówką BD Luer-LokBD Biosciences309604odczynnik do produkcji wirusa
0,45 i mu; m Filtr strzykawkowy Puradisc Whatman6750-2504odczynnik do produkcji wirusów
Polietyleniminę (PEI)Polysciences, Inc.23966-2odczynnik do transfekcji komórek
Odczynnik do infekcji / transfekcji polibrenuEMD MilliporeTR-1003-Godczynnik do transfekcji komórek
Crystal VioletFisher ScientificC581-25
Plasmid Plus Midi KitQIAGEN12945oczyszczanie plazmidu
BD Falcon Naczynia do hodowli tkankowychBD Biosciences353003Materiały do hodowli komórkowych
Zmodyfikowana pożywka Dulbecco's Eagle Medium (DMEM)Gibco11995-065pożywka do hodowli komórkowych
0,05% Trypsyna-EDTAGibco25300-054dostarcza hodowlę komórkową
Opti-MEM I Zredukowana pożywka surowicyGibco31985-062Pożywka do hodowli bydła
płodowego (FBS)Pożywka do hodowli komórkowychGibco16000-044
Linia komórkowa linia komórkowa

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Clark, G. J., Cox, A. D., Graham, S. M., Der, C. J. Biological assays for Ras transformation. Methods in enzymology. , 255-395 (1995).
  2. Celis, J. E. Cell biology : a laboratory handbook. , 3rd edn, Elsevier Academic. 345-352 (2006).
  3. Raptis, L., Vultur, A. Neoplastic transformation assays. Methods in molecular biology. 165, 151-164 (2001).
  4. Johnson, P. J., Coussens, P. M., Danko, A. V., Shalloway, D. Overexpressed pp60c-src can induce focus formation without complete transformation of NIH 3T3 cells. Molecular and cellular biology. 5, 1073-1083 (1985).
  5. Bonner, T. I., Kerby, S. B., Sutrave, P., Gunnell, M. A., Mark, G., Rapp, U. R. Structure and biological activity of human homologs of the raf/mil oncogene. IMolecular and cellular biology. 5, 71400-71407 (1985).
  6. Yancopoulos, G. D., et al. N-myc can cooperate with ras to transform normal cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, 5455-5459 (1985).
  7. Fujiwara, S., et al. Transforming activity of purinergic receptor P2Y, G protein coupled, 8 revealed by retroviral expression screening. Leukemia & lymphoma. 48, 978-986 (2007).
  8. Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene. 7, 1063-1066 (2000).
  9. Morgenstern, J. P., Land, H. Advanced mammalian gene transfer: high titre retroviral vectors with multiple drug selection markers and a complementary helper-free packaging cell line. Nucleic acids research. 18, 3587-3596 (1990).
  10. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and bioanalytical chemistry. 397, 3173-3178 (2010).
  11. Klaver, B., Berkhout, B. Comparison of 5' and 3' long terminal repeat promoter function in human immunodeficiency virus. Journal of virology. 68, 3830-3840 (1994).
  12. Fukumoto, Y., et al. Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine. Cytotechnology. 62, 73-82 (2010).
  13. Fox, E. J., Wright, S. C. S-phase-specific expression of the Mad3 gene in proliferating and differentiating cells. The Biochemical journal. 359, 361-367 (2001).
  14. Yun, J. S., Rust, J. M., Ishimaru, T., Diaz, E. A novel role of the Mad family member Mad3 in cerebellar granule neuron precursor proliferation. Molecular and cellular biology. 27, 8178-8189 (2007).
  15. Gore, Y., Lantner, F., Hart, G., Shachar, I. Mad3 negatively regulates B cell differentiation in the spleen by inducing Id2 expression. Molecular biology of the cell. 21, 1864-1871 (2010).
  16. Barisone, G. A., Yun, J. S., Diaz, E. From cerebellar proliferation to tumorigenesis: new insights into the role of Mad3. Cell cycle. 7, 423-427 (2008).
  17. Barisone, G. A., et al. Role of MXD3 in proliferation of DAOY human medulloblastoma cells. PloS One. 7, e38508(2012).
  18. Nair, S. K., Burley, S. K. X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors. Cell. 112, 193-205 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Test formowania ognisktransdukcja retrowirusowakom rki NIH 3T3barwienie fioletem krystalicznymkom rki pakuj ce Pla Enadekspresja genuutrata hamowania kontaktowegokwantyfikacja ognisktransformacja kom rkowa

Powiązane artykuły