Skóra ssaków zawiera różnorodny wachlarz struktur - takich jak mieszki włosowe i zakończenia nerwowe - które wykazują charakterystyczne wzorce organizacji przestrzennej. Analiza skóry jako płaskiego mocowania wykorzystuje dwuwymiarową geometrię tej tkanki do tworzenia pełnowymiarowych obrazów struktur skóry o wysokiej rozdzielczości.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie skóry myszy metodą flat mount i jego zastosowanie do analizy wzorca mieszków włosowych i morfologii aksonów czuciowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Skóra jest bardzo niejednorodną tkanką. Struktury śródskórne obejmują mieszki włosowe, mięśnie arrector pili, specjalizacje naskórka (takie jak klastry komórek Merkla), gruczoły łojowe, nerwy i zakończenia nerwowe oraz naczynia włosowate. Przestrzenne rozmieszczenie tych struktur jest ściśle kontrolowane w skali mikroskopowej - co widać na przykład w uporządkowanym układzie typów komórek w obrębie pojedynczego mieszka włosowego - oraz w skali makroskopowej - co widać po prawie identycznej orientacji tysięcy mieszków włosowych w lokalnym obszarze skóry. Wizualizacja tych struktur bez fizycznego cięcia skóry jest możliwa dzięki dwuwymiarowej geometrii tego narządu. W tym protokole pokazujemy, że skóra myszy może być preparowana, utrwalana, przepuszczalna, barwiona i klarowana jako nienaruszony dwuwymiarowy obiekt, płaskie mocowanie. Protokół pozwala na łatwą wizualizację struktur skóry w całości poprzez pełną grubość dużych obszarów skóry poprzez przekrój optyczny i rekonstrukcję. Obrazy tych struktur mogą być również zintegrowane z informacjami o położeniu i orientacji względem osi ciała.
Wprowadzenie
Skóra jest jednym z największych organów w ciele, pełniącym ważne funkcje w somato-czuciu, izolacji/termoregulacji i obronie immunologicznej1. Zrozumienie molekularnych i komórkowych podstaw rozwoju i funkcji skóry jest przedmiotem zainteresowania od dawna ze względu na fundamentalne znaczenie skóry jako systemu biologicznego i jej znaczenie dla dermatologii. Skóra ssaków zawiera różnorodne struktury wielokomórkowe, w tym warstwowe warstwy keratynocytów, skórną tkankę łączną, kilka rodzajów mieszków włosowych, gruczoły łojowe, mięśnie arrector pili, naczynia krwionośne i co najmniej kilkanaście odrębnych klas aferentnych (czuciowych) i odprowadzających włók....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
To badanie zostało przeprowadzone w ścisłej zgodności z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych National Institutes of Health. Wszystkie zwierzęta były traktowane zgodnie z zatwierdzonym protokołem Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) MO11M29 Instytucji Medycznych Johns Hopkins. Zapoznaj się z wytycznymi lokalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystywania, aby uzyskać zatwierdzone metody eutanazji. Podczas pracy z utrwalaczami aldehydowymi lub rozpuszczalnikami organicznymi należy nosić rękawice, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne.
1. Przygotowanie materi....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Obrazowanie w jasnym polu preparatów skóry w układzie płaskim (flatmount) może być wykorzystane do obrazowania skórnych aferentów sensorycznych (Rysunek 3A10) oraz wzorców mieszków włosowych na podstawie pigmentacji melaninowej (Rysunek 4). Obrazowanie konfokalne preparatów skóry w układzie płaskim może służyć do określenia geometrii (1) skupisk komórek Merkla, wizualizowanych za pomocą przeciwciał anty-cytokeratyna-6 lub poprzez wychwyt barwnika AM (Rysunki 3I-L
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opanowanie opisanych powyżej metod preparacji wymaga jedynie cierpliwości, pewnej ręki i kilku dobrych narzędzi preparacyjnych. Rozwarstwienie skóry grzbietowej jest stosunkowo łatwe, ale rozwarstwienie skóry ogona i stopy – zwłaszcza we wczesnym wieku poporodowym – jest trudniejsze. We wczesnym wieku prenatalnym (np. przed E15) skóra jest trudna do usunięcia bez jej rozerwania. Dogodnie, w przypadku wielu badań nad wzrostem i wzorcem struktur skóry u myszy, interesujące zdarzenia zachodzą po urodzeniu, jak wida.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują dr Amirowi Rattnerowi za pomocne komentarze na temat manuskryptu. Wspierany przez Instytut Medyczny Howarda Hughesa.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Fosforan 5-bromo-4-chloro-indolylowy (BCIP) | Roche | 11383221001 | |
| AM1-43 | Biotium | 70024 | |
| AM4-65 | Biotium | 70039 | |
| Alkohol benzylowy | Sigma | 402834 | |
| Benzoesan benzylu | Sigma | B-6630 | |
| Mikroskop konfokalny | Zeiss | LSM700 | |
| Cy3-alfa przeciwciało aktynowe mięśni gładkich | Sigma | C6198 | 1:400 |
| Cytokeratyna-8 | Badania rozwojowe Hybridoma Bank | TROMA-I-c | 1:500 |
| Mikroskop | |||
| preparacyjny Narzędzia do sekcji | Nożyczki i kleszcze | narzędzi | |
| Elektryczna maszynka do | |||
| Fluoromount G | EM Sciences | 17984-25 | |
| Formalina | Sigma | HT501320 | |
| Naczynia szklane | Pyrex | Średnica 6 cm i 10 cm | |
| Talerze szklane | Amersham Biosciences | SE202P-10 | 10 cm x 8 cm x 1 mm |
| Depilator | Nair | ||
| Pozioma platforma obrotowa | Hoefer | PR250 Wytrząsarka | |
| Szpilki do owadów | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Ketamina/ksylazyna | Sigma | K113 | |
| Nitroniebieski tetrazolium (NBT) | Roche | ||
| Olej Czerwony O | Sigma | O0625 | |
| Paraformaldehyd | Sigma | P6148 | |
| Żyletki | VWR | 55411-055 | |
| Przeciwciała wtórne | Invitrogen | Alexa-dye sprzężony | |
| Sylgard-184 | Fisher Scientific | NC9020938 | |
| Plastikowe naczynia | tkankowych o średnicy 10 cm | ||
| Płytki do hodowli tkankowych 6 | - i 12-dołkowe |
Bibliografia
- Rook's Textbook of Dermatology. 8th ed. Burns, T., Breathnach, S., Cox, N., Griffiths, C. , Wiley Blackwell. (2010).
- Lee, J., Tumbar, T. Hairy tale of signaling in hair follicle development and cycling. Semin. Cell Dev. Biol. 23, 906-916 (2012).
- Masland, R. H.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
