Artykuł metodologiczny

Obrazowanie skóry myszy metodą flat mount i jego zastosowanie do analizy wzorca mieszków włosowych i morfologii aksonów czuciowych

21.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51749

⸱

25 czerwca 2014

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology and Genetics, Howard Hughes Medical Institute, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Neuroscience, Howard Hughes Medical Institute, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Ophthalmology, Howard Hughes Medical Institute, Johns Hopkins University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Skóra ssaków zawiera różnorodny wachlarz struktur - takich jak mieszki włosowe i zakończenia nerwowe - które wykazują charakterystyczne wzorce organizacji przestrzennej. Analiza skóry jako płaskiego mocowania wykorzystuje dwuwymiarową geometrię tej tkanki do tworzenia pełnowymiarowych obrazów struktur skóry o wysokiej rozdzielczości.

Streszczenie

Skóra jest bardzo niejednorodną tkanką. Struktury śródskórne obejmują mieszki włosowe, mięśnie arrector pili, specjalizacje naskórka (takie jak klastry komórek Merkla), gruczoły łojowe, nerwy i zakończenia nerwowe oraz naczynia włosowate. Przestrzenne rozmieszczenie tych struktur jest ściśle kontrolowane w skali mikroskopowej - co widać na przykład w uporządkowanym układzie typów komórek w obrębie pojedynczego mieszka włosowego - oraz w skali makroskopowej - co widać po prawie identycznej orientacji tysięcy mieszków włosowych w lokalnym obszarze skóry. Wizualizacja tych struktur bez fizycznego cięcia skóry jest możliwa dzięki dwuwymiarowej geometrii tego narządu. W tym protokole pokazujemy, że skóra myszy może być preparowana, utrwalana, przepuszczalna, barwiona i klarowana jako nienaruszony dwuwymiarowy obiekt, płaskie mocowanie. Protokół pozwala na łatwą wizualizację struktur skóry w całości poprzez pełną grubość dużych obszarów skóry poprzez przekrój optyczny i rekonstrukcję. Obrazy tych struktur mogą być również zintegrowane z informacjami o położeniu i orientacji względem osi ciała.

Wprowadzenie

Skóra jest jednym z największych organów w ciele, pełniącym ważne funkcje w somato-czuciu, izolacji/termoregulacji i obronie immunologicznej1. Zrozumienie molekularnych i komórkowych podstaw rozwoju i funkcji skóry jest przedmiotem zainteresowania od dawna ze względu na fundamentalne znaczenie skóry jako systemu biologicznego i jej znaczenie dla dermatologii. Skóra ssaków zawiera różnorodne struktury wielokomórkowe, w tym warstwowe warstwy keratynocytów, skórną tkankę łączną, kilka rodzajów mieszków włosowych, gruczoły łojowe, mięśnie arrector pili, naczynia krwionośne i co najmniej kilkanaście odrębnych klas aferentnych (czuciowych) i odprowadzających włókien nerwowych (ryc. 1). Różne obszary ciała są związane z charakterystycznymi różnymi typami skóry. U większości ssaków prawie cała powierzchnia ciała pokryta jest skórą, która jest gęsto upakowana mieszkami włosowymi. [Ludzie i nagie kretoszczury stanowią wyjątki od tego wzorca.] Na powierzchniach dłoniowych dłoni i stóp brakuje włosów, które są również związane ze specjalistycznymi wzorami naskórkowymi (dermatoglifami), gruczołami zewnątrzwydzielniczymi i zakończeniami nerwów czuciowych. Zdarzenia komórkowe i molekularne, które kontrolują wzrost, różnicowanie i przestrzenne rozmieszczenie komórek w mieszku włosowym, są szczególnie interesujące, ponieważ każdy mieszek włosowy wykazuje, w miniaturze, wiele centralnych cech organogenezy2. Cechy te obejmują istnienie komórek macierzystych i niszy komórek macierzystych, precyzyjnie choreografię migracji komórek oraz składanie struktur wielokomórkowych z embriologicznie odrębnych komponentów.

Ten artykuł opisuje metody preparowania, utrwalania, oznaczania i obrazowania skóry myszy jako nienaruszonego dwuwymiarowego arkusza, określanego jako przygotowanie "całego montażu" lub "płaskiego montażu". Ponieważ skóra myszy jest stosunkowo cienka, możliwe jest obrazowanie przez całą grubość spłaszczonej skóry za pomocą konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej. Płaskie podejście do obrazowania skóry ssaków jest technicznie korzystne, ponieważ omija potrzebę fizycznego cięcia, umożliwiając w ten sposób rekonstrukcję struktur w całości za pomocą sekcji optycznej. Ponieważ prawie cała skóra jest przetwarzana jako pojedynczy obiekt, podejście flat mount ułatwia również obrazowanie wielu obszarów powierzchni ciała, zachowując jednocześnie informacje o położeniu i orientacji względem osi ciała. Wreszcie, struktury w skórze są zazwyczaj obecne we wzorach, które powtarzają się w regularnych odstępach czasu, ułatwiając w ten sposób zbieranie obrazów od wielu przedstawicieli danej struktury. Cechy te są znane neurobiologom zajmującym się siatkówką, dwuwymiarową częścią ośrodkowego układu nerwowego, która cieszy się analogicznymi korzyściami w badaniach morfologii neuronów3.

Opisane tutaj podejście flat mount jest szczególnie użyteczne do badania struktur, które wykazują organizację przestrzenną na stosunkowo dużą skalę w dwuwymiarowej płaszczyźnie skóry. Jednym z przykładów organizacji przestrzennej na dużą skalę jest skoordynowana biegunowość mieszków włosowych i struktur związanych z mieszkami włosowymi - klastrów komórek Merkla, mięśni arrector pili, gruczołów łojowych i zakończeń nerwowych4. Mieszki włosowe są zorientowane pod kątem w stosunku do płaszczyzny skóry, a składnik wektora mieszków włosowych, który leży w 2-wymiarowej płaszczyźnie skóry, na ogół wykazuje orientację w stosunku do osi ciała, która jest precyzyjnie określona dla każdej pozycji na ciele. Na przykład mieszki włosowe z tyłu znajdują się od rostralnego do ogonowego, a włosy na grzbietowej powierzchni stóp wskazują od proksymalnego do dystalnego. Orientacja mieszków włosowych jest kontrolowana przez płaską sygnalizację polaryzacji komórek (PCP; zwaną również polaryzacją tkankową5). Ten system sygnalizacji został odkryty u Drosophila, gdzie stwierdzono, że niewielki zestaw podstawowych genów PCP kontroluje orientację włosków łusek i szczeciny. Trzy ortologie ssaków podstawowych genów PCP - frzzled homolog 6 (Fzd6, określany również jako Fz6), kadheryna EGF LAG siedmioprzebiegowy receptor G-type 1 (Celsr1) i vang-like 2 (Vangl2) - odgrywają analogiczne role w skórze ssaków, koordynując orientację mieszków włosowych z osiami ciała. Badania myszy z nokautem Fz6 (Fzd6tm1Nat, dalej określane jako Fz6-/-) pokazują, że pierwotną wadą przy braku sygnalizacji PCP jest początkowa randomizacja lub dezorganizacja orientacji mieszków włosowych, bez wpływu na wewnętrzną strukturę mieszków włosowych6-8. Drugi system inny niż PCP działa później, promując lokalne wyrównanie pobliskich mieszków włosowych, co prowadzi do wytwarzania wzorów włosów na dużą skalę, takich jak okółki i kępki.

Drugi przykład dużej organizacji przestrzennej w skórze jest widoczny w morfologiach czuciowych altanek aksonowych. Neurony czuciowe, które unerwiają skórę, mają swoje ciała komórkowe w korzeniu grzbietowym i zwojach nerwu trójdzielnego. Neurony te wykrywają temperaturę, ból, swędzenie i różnego rodzaju deformacje mechaniczne uderzające w skórę i włosy9. Można je podzielić na podtypy w oparciu o średnicę aksonu i prędkość przewodzenia, strukturę zakończenia nerwu końcowego oraz wzorce ekspresji receptorów, kanałów i innych cząsteczek. Ze względu na dużą gęstość unerwienia w skórze, analizy, które obejmują wizualizację wszystkich aksonów (np. barwienie immunologiczne anty-neurofilamentów), a nawet wszystkich aksonów jednej klasy (co obserwujemy, gdy pojedynczy typ komórki jest oznaczony ekspresją fluorescencyjnego reportera) na ogół ujawniają gęstą superpozycję aksonów, która uniemożliwia określenie morfologii pojedynczego drzewa. Aby obejść ten problem, zastosowaliśmy niezwykle rzadkie etykietowanie genetyczne do wytworzenia próbek skóry grzbietowej, w których pojedyncze, dobrze izolowane altany aksonów są wizualizowane przez ekspresję histochemicznego reportera, ludzkiej fosfatazy alkalicznejłożyska 10. Takie podejście pozwala na jednoznaczną wizualizację morfologii poszczególnych trzpieni aksonów i zdefiniowanie typów neuronów somatosensorycznych na podstawie kryteriów morfologicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

To badanie zostało przeprowadzone w ścisłej zgodności z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych National Institutes of Health. Wszystkie zwierzęta były traktowane zgodnie z zatwierdzonym protokołem Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) MO11M29 Instytucji Medycznych Johns Hopkins. Zapoznaj się z wytycznymi lokalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystywania, aby uzyskać zatwierdzone metody eutanazji. Podczas pracy z utrwalaczami aldehydowymi lub rozpuszczalnikami organicznymi należy nosić rękawice, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne.

1. Przygotowanie materiałów

  1. Wylewanie talerzy Sylgard
    1. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, wymieszaj utwardzacz z bazą i wymieszaj plastikowym prętem.
    2. Pipeta ~35 ml płynu Sylgard na naczynie do hodowli tkankowych o średnicy 10 cm. Naczynia do hodowli tkankowych są głębsze niż standardowe naczynia bakteryjne; Zapewnia to pionowy prześwit dla szpilek przeciw owadom.
    3. Umieść naczynia na poziomej powierzchni w temperaturze pokojowej przez noc. Znikną pęcherzyki powstałe podczas mieszania.
    4. Po polimeryzacji płytki Sylgard należy przechowywać w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Płytki Sylgard mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej przez lata i wielokrotnie używane, aż do momentu odłączenia się Sylgard od płytki.
  2. Rozwiązania
    1. Benzoesan benzylu i alkohol benzylowy (BBBA). Wymieszaj 2 objętości benzoesanu benzylu i 1 objętość alkoholu benzylowego. Przechowywać w ciemności w szklanej butelce ze szklanym korkiem lub teflonową nakrętką.
      UWAGA: Zużyty BBBA należy odpowiednio traktować jako odpad rozpuszczalnika organicznego. Nie pozwól, aby BBBA stykał się z plastikiem.
    2. Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS). Dodać 4 g PFA do 80 ml wody, dodać 0,1 ml 1 N NaOH, mieszać na gorącej płycie w temperaturze ~70 °C przez ~5 minut, aż PFA całkowicie się rozpuści, a następnie dodać 10 ml 10x PBS i doprowadzić objętość do 100 ml wodą.
      UWAGA: Wdychanie oparów formaldehydu/PFA i BBBA należy zminimalizować poprzez przechowywanie tych roztworów w zakrytych pojemnikach. Formaldehyd/PFA jest czynnikiem rakotwórczym.
    3. Olej czerwony O. Przygotuj 0,5% zapasu izopropanolu. Bezpośrednio przed użyciem rozcieńczyć wodą do końcowego stężenia 0,3% Oil Red O, a następnie przefiltrować przez filtr 0,2 μm.

2. Sekcja skóry, utrwalenie i oczyszczanie

  1. Skóra grzbietowa do barwienia immunologicznego i obrazowania melaniny
    1. W przypadku bardzo młodych myszy (np. płodów i młodych (P)0-P3 w dniu poporodowym) należy poddać myszy eutanazji przez inhalację izofluranu. Poddaj eutanazji starsze myszy poprzez inhalację izofluranu lub wstrzyknięcie ketaminy/ksylazyny, a następnie zwichnięcie szyjki macicy.
    2. Usuń włosy za pomocą elektrycznej maszynki do golenia i żelu do depilacji. W przypadku myszy młodszych niż P8 ten krok można pominąć.
    3. Użyj żyletki, aby wykonać poziome cięcie od podstawy ogona wzdłuż każdego boku, przechodząc po grzbietowej stronie podstawy każdej kończyny, przechodząc bocznie do uszu i kończąc na nosie.
    4. Delikatnie oderwij skórę od leżącej pod nią tkanki, przechodząc od tyłu do przodu, trzymając skórę między palcami w rękawiczkach, aby nie została ściśnięta kleszczami. Podczas obierania skóry na poziomie uszu najpierw odetnij uszy nożyczkami i postępuj szczególnie powoli, ponieważ skóra może się rozerwać w tym miejscu.
    5. Od tego momentu ustaw skórę tak, aby była skierowana do góry. Przypnij skórę do Sylgarda za pomocą ~20 szpilek na owady równomiernie rozmieszczonych na obwodzie; nie rozciągaj nadmiernie skóry (Rysunek 2B). Przykryj skórę 10-20 ml PBS.
    6. Wypreparuj tłuszcz i tkankę łączną związaną ze skórą za pomocą kątowych lub zakrzywionych kleszczy ze spiczastym końcem kleszczy skierowanym poziomo, aby zminimalizować ryzyko, że kleszcze przebiją skórę. Wyciśnij wszelkie pęcherzyki powietrza, które zostały uwięzione pod skórą, delikatnie przesuwając aplikator z bawełnianą końcówką po powierzchni skóry.
      UWAGA: Jeśli skóra ma być używana do barwienia immunologicznego płaskiego lub histochemii, usuń jak najwięcej tkanki łącznej; Jeśli skóra ma być używana do wizualizacji mieszków włosowych na podstawie pigmentacji melaniny, mniej całkowite usunięcie tkanki łącznej jest zadowalające. Skóra prenatalna wymaga minimalnego "oczyszczenia" przylegającej tkanki łącznej.
    7. Utrwalić przypiętą skórę, dodając 20 ml świeżo przygotowanej 4% PFA/PBS lub 10% buforowanej formaliny na 10 cm płytkę Sylgarda (jeśli skóra będzie używana do obrazowania melaniny lub histochemii fosfatazy alkalicznej (AP)) lub 20 ml świeżo przygotowanej 2% PFA/PBS (jeśli skóra będzie używana do barwienia immunologicznego lub wizualizacji transgenicznej keratyny (Krt)17-GFP11), i delikatnie obróć przez noc w chłodnym pomieszczeniu. Następnego dnia prać w PBS przez >10 min.
      UWAGA: Standardowa formalina składa się w 37% z formaldehydu; Dlatego "10% formalina" to 3,7% formaldehydu.
    8. W przypadku barwienia AP i barwienia immunologicznego należy kontynuować w sekcji 3. W przypadku obrazowania melaniny należy odwodnić skórę za pomocą serii stopniowanych etanoli (70%, 95%, 100%), jeden dzień na każdy etap, z delikatnym obrotem poziomym w temperaturze pokojowej. Usuń resztki tkanki łącznej.
    9. Mając skórę w 100% etanolu, usuń szpilki owadów i, jeśli to konieczne, przytnij skórę nożyczkami, aby usunąć najbardziej obwodowe 1-2 mm skóry z otworami na szpilki.
    10. Przenieś skórę do szklanego naczynia o średnicy 10 cm, umieść na skórze dwa szklane szkiełka mikroskopowe, aby zapobiec jej zwijaniu się, i dodaj 20 ml BBBA. BBBA szybko twardnieje tkankę, dlatego ważne jest, aby skóra była spłaszczona pod ciężarem szkiełek przed dodaniem BBBA.
    11. W ciągu następnych kilku godzin zdejmij szkiełka ze skóry na kilka sekund, aby BBBA mógł zmyć skórę.
      UWAGA: Podczas pracy z BBBA należy nosić rękawice. W zależności od wieku i umiejscowienia skóry może wystąpić nawet 30% skurcz BBBA.
  2. Skóra stopy do analizy wzorca mieszków włosowych
    UWAGA: Zazwyczaj badany zakres wieku to P1-P8.
    1. Po eutanazji odetnij stopy powyżej stawu skokowego i wykonaj pojedyncze proste cięcie wzdłuż powierzchni brzusznej przez podeszwy stóp.
    2. Delikatnie oderwij skórę od leżącej pod nią tkanki, postępując w kierunku proksymalnym do dystalnego.
    3. Wytnij palce, aby zwolnić skórę i przypnij ją do Sylgarda wewnętrzną powierzchnią skierowaną do góry (Rysunek 2C). Na skórze stopy znajduje się minimalna ilość tkanki łącznej.
    4. Transgeniczna skóra Krt17-GFP jest teraz gotowa do obrazowania. W przypadku obrazowania melaniny należy przeprowadzić utrwalenie, odwodnienie i usunięcie BBBA, jak opisano w punkcie 2.1.
  3. Skóra stóp do wizualizacji gruczołów łojowych
    1. Po eutanazji usuń włosy, wcierając żel do depilacji w powierzchnię skóry palcem i kciukiem w rękawiczce; odczekaj 10 min.
      UWAGA: Nie używaj elektrycznej maszynki do golenia, która uszkodzi delikatną skórę stóp.
    2. Przemyć powierzchnię skóry wodą z kranu, przeprowadzić sekcję i przypiąć skórę do produktu Sylgard zgodnie z opisem w punkcie 2.2.
    3. Utrwal z 1% PFA/PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie umyj w PBS.
      UWAGA: Do wizualizacji gruczołów łojowych na stopach, które rozwijają się po pierwszym tygodniu po porodzie, optymalnym wiekiem do analizy za pomocą Oil Red O jest P21, ponieważ oznacza to nadir pigmentacji włosów podczas pierwszego cyklu włosa12, a zatem gruczoły łojowe można łatwiej zobaczyć. W przypadku myszy albinosów analizę tę można przeprowadzić w każdym wieku. Aby uzyskać potomstwo albinosów pigmentowane krzyżowo zmutowane myszy z linią mutantów tyrozynazy, taką jak C57BL / 6J-Tyrc-2J .
  4. Przygotowanie skóry ogona do analizy rozmieszczenia melaniny, orientacji mieszków włosowych i wizualizacji gruczołów łojowych
    1. Po eutanazji wykonaj okrągłe nacięcie wokół podstawy ogona, a następnie podłużną szczelinę, która biegnie wzdłuż ogona wzdłuż jego brzusznej powierzchni.
    2. Zdejmij skórę ogona, zaczynając od końca, mocno chwytając czubek kości ogonowej i/lub tkanki łącznej jedną parą kleszczy, a skórę drugą parą kleszczy. Przypnij skórę ogona do Sylgarda.
    3. W celu analizy rozmieszczenia melaniny i orientacji mieszków włosowych należy utrwalić i przetworzyć skórę zgodnie z opisem w punkcie 2.1. W celu analizy gruczołów łojowych należy przeciąć skórę ogona na szereg segmentów o długości ~0,5 do 1 cm przed utrwaleniem i inkubować kawałki skóry w PBS/5 mM EDTA przez noc w temperaturze 37 °C, aby osłabić przyleganie skóry właściwej i naskórka13.
    4. Delikatnie oderwij naskórek od skóry właściwej, przypnij naskórek do Sylgarda (wewnętrzną stroną do góry) i utrwal go w 4% PFA/PBS na 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyć PBS i zabarwić czerwonym olejem O, jak opisano poniżej.
      UWAGA: Elektryczna maszynka do golenia i/lub żel do depilacji mogą być użyte przed wypreparowaniem starszej skóry ogona (np. P21), ale ten zabieg jest opcjonalny, ponieważ włosy na ogonie nie są tak gęste, jak w innych miejscach na ciele.

3. Reakcje barwienia

  1. Histochemia ludzkiej fosfatazy alkalicznej łożyska (AP) w celu wizualizacji genetycznie znakowanych altanek aksonów10,14,15 (ryc. 3A,B)
    1. Po utrwaleniu PFA na Sylgardzie, umieścić utrwalone skórki w szklanym naczyniu o średnicy 10 cm i zanurzyć pod PBS/1 mM MgCl2. Delikatnie obracaj naczynie w łaźni wodnej w temperaturze 70 °C przez 90 minut, aby zniszczyć endogenną aktywność fosfatazy.
    2. Wizualizuj aktywność reporterową AP histochemicznie za pomocą 4-48 godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej w 0,1 M Tris, pH 9,5, 0,1 M NaCl, 50 mM MgCl2, 0,34 μg / ml NBT i 0,175 μg / ml BCIP, zwykle przy użyciu 10-15 ml roztworu barwiącego na skórę grzbietową P21. Monitorować reakcję pod mikroskopem preparacyjnym, uważając, aby nie przekroczyła optymalnego czasu, zgodnie z oględzinami intensywności barwienia aksonów w stosunku do niespecyficznego osadzania NBT.
    3. Zatrzymaj reakcję, przemywając trzykrotnie pzmianami PBS/0,1% Tween-20 w ciągu 1 godziny, ponownie przypnij skórki do Sylgard, odwodnij skórki za pomocą serii etanolu, a następnie przenieś skórki do 10 cm naczynia z BBBA.
      UWAGA: BBBA powoli rozpuszcza osad NBT. W ciągu pierwszych kilku godzin w BBBA rozpuści się drobne tło wytrąconego NBT; w rezultacie roztwór BBBA ciemnieje, a skóra rozjaśnia się. Po kilku godzinach zmień BBBA na świeże.
    4. Po zobrazowaniu skóry zabarwionej AP przenieś ją do etanolu na >1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie przechowuj w świeżym etanolu w temperaturze -20 °C. Skóry zabarwione AP mogą być przechowywane w ten sposób przez wiele miesięcy bez utraty sygnału.
  2. Barwienie czerwienią olejową O w celu uwidocznienia gruczołów łojowych4 (ryc. 3C-F)
    1. Usunąć szpilki owadów i przenieść lekko przymocowane skóry stóp lub ogonów z płytki Sylgarda do studzienek 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej, z maksymalnie dwiema próbkami skóry na studzienkę. Myć izopropanolem w proporcji 60:40 przez 5 min w temperaturze pokojowej.
    2. Zabarwieć w 2 ml 0,3% czerwieni olejowej O w proporcji 60:40 izopropanol:woda (patrz sekcja 1.2) w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
    3. Myć izopropanolem w proporcji 60:40 przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć wodą. Ostrożnie odetnij krawędzie skóry, w tym otwory na szpilki, cienkimi nożyczkami, aby powierzchnia skóry mogła być jak najbardziej płaska.
    4. Umieść skórę na szkiełku zewnętrzną powierzchnią skierowaną do góry, dodaj kilka kropli wody lub wodnego podłoża mocującego, przykryj skórę szkiełkiem nakrywkowym, a następnie delikatnie przyklej szkiełko nakrywkowe do szkiełka, aby jeszcze bardziej spłaszczyć skórę.
  3. Barwienie immunologiczne do montażu płaskiego4,16,17 (rysunki 3G,H)
    1. Wytnij prostokąt z utrwalonej skóry PFA (np. 1 cm x 0,5 cm), zaznaczając jego orientację asymetrycznym cięciem (np. przytnij prawy przedni róg). Wykonaj etapy inkubacji i mycia z delikatnym obracaniem na obracającej się poziomej platformie. W studzienkach 6- lub 12-dołkowej płytki do hodowli tkankowej przemyć kilkakrotnie PBS w celu usunięcia pozostałości PFA, przemyć ~10 zmianami PBS 0,3% Triton X-100 (0,3% PBST) przez 5-8 godzin w temperaturze pokojowej, aby przeniknąć przez skórę.
    2. Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym w 0,3% PBST z 5% surowicą kozią i 20% DMSO przez pięć dni w temperaturze pokojowej. Przykryj wgłębienia płyty przezroczystą taśmą lub samoprzylepnym tworzywem sztucznym, aby wyeliminować straty parowania.
    3. Przemyć 10-15 zmianami 0,3% PBST przez 5-8 godzin i inkubować z przeciwciałem drugorzędowym w 0,3% PBST z 5% surowicą kozią i 20% DMSO przez 3 dni w temperaturze pokojowej.
    4. Myć 10-15 wymianami 0,3% PBST w ciągu 5-8 godzin.
    5. Odwodnić w 25%, 50% i 75% metanolu przez 5 minut, a następnie 3x w 100% metanolu przez 20 minut każdy.
    6. Klarowny w BBBA przez noc w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Barwienie immunologiczne skóry młodszej niż ~P1 metodą flat mount można przeprowadzić zgodnie z powyższym opisem, ale z krótszym czasem inkubacji i mycia. Na przykład skóra P1 może być wybarwiona immunologicznie przez noc w przeciwciałie pierwotnym i kilkugodzinną inkubacją w przeciwciałie drugorzędowym, a także z przerywanymi płukaniami trwającymi tylko 2-3 godziny w 0,3% PBST. Jak wspomniano powyżej, młodsze skóry są również na tyle cienkie, że można je obrazować bez czyszczenia BBBA.
  4. Wizualizacja klastrów komórek Merkla z fluorescencyjnym wychwytem barwnika na zakończeniach nerwowych (ryc. 3I-L)
    AMI-43 (zielony) i AM4-65 (czerwony) to utrwalalne barwniki fluorescencyjne, które dostają się do komórek przez nieselektywny kanał kationowy18. W żywej skórze barwniki te są selektywnie wychwytywane i skoncentrowane w komórkach Merkla.
    1. Rozpuścić 1 mg AM1-43 lub AM4-65 w 2 ml PBS i przechowywać w porcjach w temperaturze -80 °C.
    2. Nowonarodzone szczenięta należy wstrzyknąć podskórnie za pomocą igły o masie 29 g w ilości 2-10 μg barwnika na gram masy ciała.
    3. Dzień później poddaj myszy eutanazji i przeprowadź sekcję skóry grzbietowej.
    4. Utrwalić skórki w 4% PFA/PBS w temperaturze 4 °C przez noc, przemyć PBS i zamontować skórę zgodnie z opisem w punkcie 3.2.

4. Obrazowanie i analiza obrazu

  1. Obrazowanie orientacji mieszków włosowych (ryc. 4)
    1. Użyj mikroskopu preparacyjnego, aby zobrazować skórę grzbietu, stopy lub ogona, która jest zanurzona w BBBA, spłaszczona pod szklanym szkiełkiem i nadal w szklanym naczyniu - takie podejście minimalizuje zanieczyszczenie mikroskopu BBBA.
    2. Oświetl naczynie od dołu. Aby zminimalizować przestrzenne różnice w natężeniu światła w całym polu widzenia, podnieś szklaną miskę na wysokość ~10 cm ponad standardową powierzchnię roboczą mikroskopu preparacyjnego i umieść dyfuzyjną plastikową lub szklaną płytkę nad źródłem światła.
    3. Przywrócić skórę do 100% etanolu do długotrwałego przechowywania w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Pozostawienie skóry w BBBA na dłużej niż jeden dzień powoduje rozpad granulek melaniny. Po poddaniu się zabiegowi BBBA skóra stwardnieje i pozostanie płaska od tego momentu. Różne skórki mogą być oznaczone szeregiem nacięć na ich przednich i/lub tylnych końcach, dzięki czemu można je przechowywać razem, aby zaoszczędzić miejsce w zamrażarce.
  2. Obrazowanie i śledzenie trzpieni aksonów (rysunki 3A,B)
    1. Umieścić wybarwioną skórę AP (sekcja 3.1.3) między dwiema szklanymi płytkami, typu używanego do małych żeli białkowych. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza między płytki a skórę, a następnie ostrożnie usuń nadmiar BBBA ręcznikiem papierowym. Umieść kanapkę z płytką-skórą-płytką na stoliku mikroskopowym (Rysunek 2D).
    2. Używaj oświetlenia jasnego pola lub DIC z obiektywem 10X i krokiem Z 2 μm lub 5 μm. Użyj zmechanizowanego stolika XY, aby uchwycić montaż obrazów X-Y, które są zszywane w celu utworzenia jednego trójwymiarowego zestawu danych w skali szarości.
      UWAGA: W przypadku pojedynczej dużej altany aksonowej ten zestaw danych może mieć rozmiar nawet 5 GB.
    3. Wykonuj ręczne, automatyczne lub półautomatyczne śledzenie trzpieni aksonów za pomocą dowolnego z różnych pakietów oprogramowania.
      UWAGA: Oprogramowanie takie jak Neuromantic (http://www.reading.ac.uk/neuromantic/) jest darmowym narzędziem do rekonstrukcji neuronów, które działa w środowisku PC i jest stosunkowo łatwe do opanowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Obrazowanie w jasnym polu preparatów skóry w układzie płaskim (flatmount) może być wykorzystane do obrazowania skórnych aferentów sensorycznych (Rysunek 3A10) oraz wzorców mieszków włosowych na podstawie pigmentacji melaninowej (Rysunek 4). Obrazowanie konfokalne preparatów skóry w układzie płaskim może służyć do określenia geometrii (1) skupisk komórek Merkla, wizualizowanych za pomocą przeciwciał anty-cytokeratyna-6 lub poprzez wychwyt barwnika AM (Rysunki 3I-L

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opanowanie opisanych powyżej metod preparacji wymaga jedynie cierpliwości, pewnej ręki i kilku dobrych narzędzi preparacyjnych. Rozwarstwienie skóry grzbietowej jest stosunkowo łatwe, ale rozwarstwienie skóry ogona i stopy – zwłaszcza we wczesnym wieku poporodowym – jest trudniejsze. We wczesnym wieku prenatalnym (np. przed E15) skóra jest trudna do usunięcia bez jej rozerwania. Dogodnie, w przypadku wielu badań nad wzrostem i wzorcem struktur skóry u myszy, interesujące zdarzenia zachodzą po urodzeniu, jak wida...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują dr Amirowi Rattnerowi za pomocne komentarze na temat manuskryptu. Wspierany przez Instytut Medyczny Howarda Hughesa.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Fosforan 5-bromo-4-chloro-indolylowy (BCIP)Roche11383221001
AM1-43Biotium70024
AM4-65Biotium70039
Alkohol benzylowySigma402834
Benzoesan benzyluSigma B-6630
Mikroskop konfokalnyZeissLSM700
Cy3-alfa przeciwciało aktynowe mięśni gładkichSigma C61981:400
Cytokeratyna-8 Badania rozwojowe Hybridoma BankTROMA-I-c1:500
Mikroskop
preparacyjny Narzędzia do sekcji Nożyczki i kleszczenarzędzi
Elektryczna maszynka do
Fluoromount GEM Sciences17984-25
FormalinaSigmaHT501320
Naczynia szklanePyrex Średnica 6 cm i 10 cm
Talerze szklaneAmersham BiosciencesSE202P-1010 cm x 8 cm x 1 mm
Depilator Nair
Pozioma platforma obrotowa HoeferPR250 Wytrząsarka
Szpilki do owadówFine Science Tools 26002-20
Ketamina/ksylazynaSigmaK113
Nitroniebieski tetrazolium (NBT)Roche 
Olej Czerwony OSigmaO0625
ParaformaldehydSigma P6148
ŻyletkiVWR55411-055
Przeciwciała wtórne InvitrogenAlexa-dye sprzężony 
Sylgard-184Fisher ScientificNC9020938
Plastikowe naczyniatkankowych o średnicy 10 cm
Płytki do hodowli tkankowych 6- i 12-dołkowe 
do do naukigoleniaorbitalna11383213001 do hodowli

Bibliografia

  1. Rook's Textbook of Dermatology. 8th ed. Burns, T., Breathnach, S., Cox, N., Griffiths, C. , Wiley Blackwell. (2010).
  2. Lee, J., Tumbar, T. Hairy tale of signaling in hair follicle development and cycling. Semin. Cell Dev. Biol. 23, 906-916 (2012).
  3. Masland, R. H. The neuronal organization of the retina. Neuron. 76, 266-280 (2012).
  4. Chang, H., Nathans, J. Responses of hair follicle-associated structures to loss of planar cell polarity signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, (2013).
  5. Wallingford, J. B. Planar cell polarity and the developmental control of cell behavior in vertebrate embryos. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 28, 627-653 (2012).
  6. Guo, N., Hawkins, C., Nathans, J. Frizzled6 controls hair patterning in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 9277-9281 (2004).
  7. Wang, Y., Badea, T., Nathans, J. Order from disorder: Self-organization in mammalian hair patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 19800-19805 (2006).
  8. Wang, Y., Chang, H., Nathans, J. When whorls collide: the development of hair patterns in frizzled 6 mutant mice. Development. 137, 4091-4099 (2010).
  9. Lumpkin, E. A., Caterina, M. J. Mechanisms of sensory transduction in the skin. Nature. 445, 858-865 (2007).
  10. Wu, H., Williams, J., Nathans, J. Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling. Elife. 1, (2012).
  11. Bianchi, N., Depianto, D., McGowan, K., Gu, C., Coulombe, P. A. Exploiting the keratin 17 gene promoter to visualize live cells in epithelial appendages of mice. Mol. Cell. Biol. 25, 7249-7259 (2005).
  12. Alonso, L., Fuchs, E. The hair cycle. J. Cell Sci. 119, 391-393 (2006).
  13. Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 30, 5241-5255 (2003).
  14. Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J. Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
  15. Rotolo, T., Smallwood, P. M., Williams, J., Nathans, J. Genetically-directed, cell type-specific sparse labeling for the analysis of neuronal morphology. PLoS One. 3, (2008).
  16. Devenport, D., Fuchs, E. Planar polarization in embryonic epidermis orchestrates global asymmetric morphogenesis of hair follicles. Nat. Cell Biol. 10, 1257-1268 (2008).
  17. Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147, 1615-1627 (2011).
  18. Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. J. Neurosci. 23, 4054-4065 (2003).
  19. Fujiwara, H., et al. The basement membrane of hair follicle stem cells is a muscle cell niche. Cell. 144, 577-589 (2011).
  20. Orsini, M. W. Technique of preparation, study and photography of benzyl-benzoate cleared material for embryological studies. J. Reprod. Fertil. 3, 283-287 (1962).
  21. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
  22. Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
  23. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
  24. Aal Ertürk,, et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
  25. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat. Methods. 10, 508-513 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Disekcja sk rybarwienie immunologicznemikroskopia konfokalnaalkohol benzoilo benzoesanowyspecjalizacje nask rkapolaryzacja kom rek podeszwowych

Powiązane artykuły