Wysokoprzepustowy test na fenotyp Salmonella enterica Typhimurium asocjacji, inwazji i replikacji w makrofagach

Podsumowanie

Opracowano wysokoprzepustowy test in vitro fenotypu Salmonelli lub innych bakterii asocjacyjnych, inwazyjnych i replikacyjnych w komórkach fagocytarnych o wysokiej przepustowości. Metodę wykorzystano do oceny zmutowanych szczepów z nokautem genu Salmonelli pod kątem ich udziału w interakcjach gospodarz-patogen.

Streszczenie

Gatunki Salmonelli są patogenami odzwierzęcymi i głównymi przyczynami chorób przenoszonych przez żywność u ludzi i zwierząt gospodarskich¹. Zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw interakcji między Salmonellą a gospodarzem jest ważne dla wyjaśnienia molekularnej patogenezy zakażenia Salmonellą. Test ochrony gentamycyny przed fenotypem asocjacji, inwazji i replikacji Salmonelli w komórkach fagocytarnych został dostosowany, aby umożliwić wysokoprzepustowe badania przesiewowe w celu określenia ról mutantów delecyjnych serotypu Salmonella enterica Typhimurium w interakcjach z gospodarzem przy użyciu makrofagów myszy RAW 264.7. W ramach tego protokołu wariancja pomiarów jest znacznie zmniejszona w porównaniu ze standardowym protokołem, ponieważ szczepy typu dzikiego i wiele zmutowanych szczepów mogą być testowane w tym samym naczyniu hodowlanym i w tym samym czasie. Zastosowanie pipet wielokanałowych zwiększa przepustowość i precyzję. Ponadto zajęto się problemami związanymi z użyciem mniejszej liczby komórek gospodarza na studzienkę w 96-dołkowym naczyniu hodowlanym. W tym przypadku protokół zmodyfikowanego testu inwazji Salmonelli in vitro z wykorzystaniem komórek fagocytarnych został z powodzeniem zastosowany do fenotypu 38 indywidualnych mutantów delecji Salmonelli w celu asocjacji, inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej. Przedstawiono fenotypy in vitro, z których niektóre zostały następnie potwierdzone jako fenotypy in vivo w modelu zwierzęcym. W związku z tym zmodyfikowany, standaryzowany test na asocjację, inwazję i replikację fenotypu Salmonelli w makrofagach o wysokiej przepustowości może być szerzej wykorzystany do badania interakcji bakteria-gospodarz.

Wprowadzenie

Zmodyfikowany, standaryzowany test do fenotypowego kojarzenia, inwazji i replikacji Salmonelli w makrofagach o wysokiej przepustowości został opracowany w celu zbadania dużego zestawu genów prawdopodobnie angażujących się w interakcje Salmonella - gospodarz. Test ochrony gentamycyną został opracowany w 1973 r.² , ale po raz pierwszy został dokładnie opisany przez Elsinghorsta w 1994 r.^3,4. Obecnie stała się standardowym narzędziem do badania ex vivo wielu wewnątrzkomórkowych patogenów bakteryjnych, w tym Salmonelli^5,6. Zinternalizowane bakterie unikają zabicia przez niektóre antybiotyki, takie jak gentamycyna, które nie mogą przeniknąć do komórek eukariotycznych³. Wykorzystując to zjawisko, test ochrony gentamycyny mierzy przeżywalność i wzrost wewnątrzkomórkowych patogenów bakteryjnych. Trzy zdarzenia podczas infekcji, tj. związek z komórkami eukariotycznymi, inwazja i replikacja, można ocenić dla wewnątrzkomórkowych patogenów bakteryjnych na podstawie odstępu czasu między infekcją, leczeniem gentamycyną i dalszą inkubacją (ryc. 1). Eukariotyczne linie komórkowe zapewniają środowisko fizjologiczne, które jest mniej złożone niż odpowiednie modele zwierzęce do badań interakcji gospodarz-patogen.

Test ochrony gentamycyny jest odpowiednią platformą do badania interakcji STM-gospodarz, ale standardowy test w 24-dołkowym naczyniu hodowlanym ma niską przepustowość. Analiza obliczeniowa zestawów danych in vivo zidentyfikowała 149 produktów genu Salmonella, które według prognoz mogą wchodzić w interakcje z około 300 produktami genów gospodarza (dane niepublikowane). Standardowy test ochrony gentamycyny nie jest w stanie skutecznie fenotypować tej liczby mutantów.

Ponadto, test ochrony gentamycyny może teoretycznie wykryć inwazję nawet pojedynczej bakterii. Ze względu na tę nieodłączną wrażliwość, surowe dane są podatne na odchylenia techniczne, gdy powtarzają się w różnym czasie. Kontrole wewnętrzne i względna prezentacja danych po normalizacji są niezbędne do miarodajnej interpretacji wyników. Biorąc pod uwagę te czynniki, opracowano zmodyfikowany, znormalizowany test ochrony gentamycyny w celu zwiększenia możliwości testowania i precyzji.

Poniższy protokół jest szczegółowo opisany i zilustrowany, aby przeprowadzić zmodyfikowany test ochrony gentamycyny przy użyciu 96-dołkowych szalek hodowlanych i mysiej linii komórkowej makrofagów RAW264.7. W porównaniu ze standardowym protokołem w 24-dołkowych szalkach hodowlanych, zmodyfikowany protokół ma następujące zalety: 1) Użycie 96-dołkowych szalek hodowlanych pozwala na fenotypowanie do 10 różnych zmutowanych szczepów, w tym wewnętrznych kontroli pozytywnych i ujemnych o wystarczającej mocy statystycznej; 2) Zmienność wyników jest znacznie zmniejszona, ponieważ zmutowane szczepy są testowane w tym samym naczyniu hodowlanym i w tym samym czasie; 3) Zastosowanie pipet wielokanałowych zwiększa przepustowość przy jednoczesnym zmniejszeniu zmęczenia operatora. Wreszcie, w porównaniu z 24-dołkowymi szalkami hodowlanymi, problemy związane z mniejszą liczbą komórek gospodarza na basenie w 96-dołkowym naczyniu hodowlanym zostały rozwiązane poprzez optymalizację i standaryzację protokołu.

Podsumowując, zmodyfikowany, standaryzowany test in vitro fenotypu Salmonelli lub innego związku bakteryjnego, inwazji i replikacji w komórkach fagocytarnych zwiększa precyzję i osiąga wysoką przepustowość, jednocześnie zmniejszając zmęczenie operatora.

Protokół

1. Mysi makrofag RAW264.7 Hodowla komórkowa

1. Hoduj mysie komórki makrofagów o niskiej liczbie pasażów, RAW264.7 (numer ATCC^®, TIB-71) w nasadce filtra wentylowanego w kolbie do hodowli komórek T-75 w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 0,5% NaHCO₃ i 1% 100x aminokwasów endogennych (NEAA) w temperaturze 37°C, w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 .}
2. Gdy komórki osiągną 60-80% konfluencji w kolbie, użyj skrobaka do komórek, aby zebrać komórki, policz komórki w hemacytometrze i oblicz stężenie komórek.
3. Ponownie zawiesić komórki i rozcieńczyć stężenie komórek do 2,5 x 10⁵/ml w świeżej pożywce do hodowli komórkowych DMEM. Za pomocą pipet wielokanałowych umieścić 200 μl pożywki do hodowli komórkowych DMEM zawierającej 5 x 10⁴ komórek w każdym dołku 96-dołkowych płytek do hodowli komórkowych.
4. Umieść na płytce cztery dołki każdego szczepu Salmonelli. Ustaw trzy oddzielne płytki dla jednego zestawu testów inwazji komórek fagocytarnych i oznacz je odpowiednio słowami "asocjacja", "inwazja" i "replikacja".
5. Umieścić płytki w inkubatorze z 5% CO₂ w temperaturze 37 °C ON, aby umożliwić komórkom makrofagów przyczepienie się do dna studzienek.

2. Przygotowanie Salmonelli typu dzikiego i mutantów

1. Tego samego dnia, w którym przygotowywane są komórki makrofaga RAW264.7, należy pobrać pojedyncze kolonie serotypu dzikiego (WT) Salmonella enterica Typhimurium 14028s, mutanta DinvA, mutanta DphoP i pożądanych zmutowanych szczepów testowych i wyhodować je w bulionie Luria-Bertani (LB) uzupełnionym odpowiednio antybiotykami. Użyj każdego zestawu testów inwazji komórek fagocytarnych, aby przetestować do 10 zmutowanych szczepów (mutant DinvA i mutant DphoP są wadliwe odpowiednio w inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej).
2. Hodować bakterie przez 14 godzin w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 220 obr./min w 5 ml bulionu LB w luźno zakręconych 14 ml polipropylenu w probówce z okrągłym dnem. Rosół LB zawiera odpowiednie antybiotyki, w naszym przypadku większość zmutowanych szczepów jest oporna na Kanamycynę, 50 μg/ml
3. Następnego dnia subkulturuj każdą z kultur ON szczepów Salmonelli w zwykłych 5 ml bulionów LB w proporcji 1:50 przez dodatkowe 4 godziny z wytrząsaniem przy 220 obr./min.
4. Odczytaj wartości OD₆₀₀ każdej kultury bakteryjnej na spektrofotometrze, a każdy odczyt powinien mieścić się w zakresie 0,6-1,2, aby zoptymalizować ekspresję genu systemu wydzielania patekoli Salmonella typu III (SPI-1 TTSS) pod kątem inwazji.
5. Użyj wzoru 1 OD₆₀₀ = 7,5 x 10⁸ CFU/ml, aby oszacować stężenie bakterii, a następnie rozcieńczyć bakterie do stężenia 5 x 10⁶ CFU/ml w świeżej pożywce do hodowli komórkowych DMEM.

3. Test inwazji na 96-dołkowej płytce hodowlanej

1. Wyjąć trzy 96-dołkowe płytki do hodowli komórkowych z inkubatora CO₂ i przemyć każdą studzienkę raz 200 μl 1x buforu PBS.
2. Po umyciu i całkowitym usunięciu PBS, dodaj 200 μl bakterii w pożywce DMEM (patrz wyżej) do każdej studzienki. Daje to 1 x 10⁶ komórek Salmonelli w każdym dołku i wielokrotność infekcji (MOI) 20:1.
3. Odwirować płytki o sile 1 000 x g w szczelnie zamkniętym nośniku przez 10 minut, a następnie umieścić płytki (czas zero) w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO₂ na 30 minut. Dla każdego szczepu ustaw co najmniej cztery zduplikowane studzienki.
4. Po 30 minutach wyjąć płytki z inkubatora i przemyć je trzykrotnie 200 μl 1x PBS w celu usunięcia niezwiązanych bakterii.
5. Po umyciu należy zachować płytkę oznaczoną "skojarzeniem" do dalszej obróbki. Dodać 200 μl pożywki DMEM zawierającej 100 μg/ml gentamycyny do każdej studzienki z płytek oznaczonych słowami "inwazja" i "replikacja" w celu zabicia zewnątrzkomórkowej Salmonelli. Umieścić płytki z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ na dodatkową godzinę.
6. Zachowaj jedną studzienkę z każdego zakażonego szczepu do rejestracji liczby komórek makrofagów, resztę studzienek na płytce "asocjacyjnej" potraktuj 200 μl 1x PBS zawierającego 1% Triton X-100 przez 10 minut. Roztwór Triton spowoduje lizę komórek makrofagów i uwolnienie związanej z nimi Salmonelli.
7. Zbierz Salmonellę z każdej studzienki i umieść je w probówkach Eppendorf o pojemności 1,5 ml. Wykonaj trzy 10-krotne seryjne rozcieńczenia 900 μl 1x PBS na pobranych próbkach z każdej studzienki, między każdym rozcieńczeniem przeprowadza się wirowanie.
8. Trzecie rozcieńczenie, ^10-3, umieścić na płytkach LB (WT) lub LB Kan (mutanty). Oznacz płytki odpowiednią nazwą szczepu Salmonella, numerem rozcieńczenia, punktem czasowym i datą.
9. Po zawirowaniu trzeciej probówki z rozcieńczaczem, naniec 10 μl próbki na powierzchnię agaru i powtórz cztery razy, co daje w sumie 5 kropli. Upewnij się, że pięć kropli o pojemności 10 μl jest równomiernie rozmieszczonych na płytkach Petriego⁷.
10. Po zanurzeniu kropli w agarze odwróć płytki i inkubuj przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO_{2 .}
11. Studzienki zachowane do liczenia makrofagów należy traktować 150 μl 1xPBS zawierającego 0,25% trypsyny-EDTA przez 10 minut.
12. Po trypsynizacji umieść makrofagi w 1,5 ml probówkach Eppendorfa i potraktuj je 50 μl FBS w celu zneutralizowania roztworu trypsyny/EDTA, wybarwić komórki 0,4% błękitem trypanowym i ocenić je za pomocą hemytometru.
13. Po upływie jednej godziny inkubacji wyjąć płytki "inwazji" i "replikacji" z inkubatora CO₂ i umyć każdą z nich zgodnie z "Krokiem 3.4".
14. Zachowaj tabliczkę "inwazji" do dalszej obróbki jako "Krok 3.6-3.12".
15. Dodać 200 μl pożywki DMEM zawierającej 10 μg/ml gentamycyny do płytki "replikacyjnej" w celu utrzymania klirensu zewnątrzkomórkowej Salmonelli w pożywce. Umieść płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ na dodatkowe 22,5 godziny.
16. Następnego dnia wyjmij płytkę "replikacyjną" z inkubatora o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ i umyj każdą studzienkę jako "Krok 3.4" i potraktuj je jako "Krok 3.6-3.12".
17. Na koniec, po inkubacji przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C należy usunąć płytki agarowe i ocenić liczbę kolonii bakteryjnych.
18. Dobry rozkład kolonii powinien wynosić od 10 do 100 kolonii, każde miejsce zawiera w przybliżeniu od 2 do 20 kolonii, trudno byłoby zdobyć, gdyby w jednym miejscu było więcej niż 20 kolonii. Jeśli liczba jest zbyt niska lub zbyt wysoka, w razie potrzeby należy ponownie pokryć próbkę 10-krotnie wyższymi lub niższymi rozcieńczeniami.

4. Analiza danych

1. Obliczyć jtk (jednostki tworzenia kolonii na ml) każdej płytki na podstawie objętości posiewu i współczynnika rozcieńczenia.
2. Ustal liczbę Salmonelli na makrofagi za pomocą zarejestrowanej liczby komórek makrofagów z każdego szczepu.
3. Obliczyć średnie geometryczne CFU na makrofag z co najmniej trzech niezależnych eksperymentów odpowiednio dla asocjacji, inwazji lub replikacji komórek i znormalizować dalej do WT dla wartości względnej.
4. Przeanalizuj dane pod kątem asocjacji, inwazji i replikacji za pomocą testu t Studenta, porównując każdy szczep z WT i określ istotność statystyczną na podstawie wartości p.

Wyniki

Przedstawiono reprezentatywne wyniki (Rysunek 2>) po wykreśleniu danych na podstawie zmodyfikowanego testu inwazji komórek fagocytujących. Dane obejmują pięć różnych szczepów: WT, ΔinvA, ΔphoP, mutant A oraz mutant B. Szczepy ΔinvA, znany z defektów w inwazji, oraz ΔphoP, znany z defektów w replikacji⁸, posłużyły jako kontrole pozytywne w celu oceny poprawności eksperymentu. Rzeczywiście, w zmodyfikowanym teście inwazji mutant ΔinvA jest słabo inter...

Dyskusja

Test ochrony gentamycyną jest szeroko stosowany do badania inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowych patogenów bakteryjnych wewnątrz komórki gospodarza i jest szczególnie ważnym narzędziem biologicznym do badania patogenów, takich jak Salmonella, których inwazja jest warunkiem wstępnym do ustalenia infekcji¹. Standardowy test ochrony przed gentamycyną w społeczności badawczej zajmującej się salmonellą jest stosowany w 24-dołkowym naczyniu^{hodowlanym 5}. Chociaż zastosowanie 48-, a naw...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11965
Hyklon płodowej surowicy bydlęcej		SH30910.03
T-75 Kolba do hodowli komórkowych wentylowana nasadka filtra	Nest Biotechnology	708003
100x Aminokwasy endogenne	Life Technologies	11140
Skrobak do komórek	BD Falcon	353086
96-dołkowa płytka do hodowli komórkowej	Corning Incorporated	3595
Luria-Bertani (LB) bulion	MP Biomedicals	3002-075
14 ml Polipropylenowa probówka z okrągłym dnem	BD Falcon	352059
PBS pH 7,4 (1x)	Life Technologies	10010
Triton X-100	Sigma	T-8787
Kanamycyna roztwór	Sigma	K0254
Gentamycyna roztwór	Sigma	G1272
0,25% Trypsyna-EDTA	Life Technologies	25200
Trypan niebieski	Sigma	T8154