Method Article

Testy agregacji kulek w celu scharakteryzowania przypuszczalnych cząsteczek adhezyjnych komórek

DOI:

10.3791/51762

⸱

October 17th, 2014

 , 
1Department of Neuroscience, Ohio State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy prostą, szybką metodę charakteryzowania wewnętrznych właściwości adhezyjnych domniemanych cząsteczek adhezyjnych komórek. Wydzielana, znakowana epitopem ektodomena cząsteczki adhezyjnej komórki jest wychwytywana z pożywki hodowlanej na małych, jednorodnych funkcjonalizowanych kulkach. Kulki te można następnie natychmiast wykorzystać w prostych testach agregacji kulek.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adhezja komórka-komórka jest fundamentalna dla życia wielokomórkowego i jest pośredniczona przez różnorodny wachlarz białek na powierzchni komórki. Jednak interakcje adhezyjne dla wielu z tych białek są słabo poznane. W tym miejscu przedstawiamy prostą, szybką metodę charakteryzowania właściwości adhezyjnych domniemanych homofilnych cząsteczek adhezyjnych komórek. Hodowane komórki HEK293 są transfekowane plazmidem DNA kodującym wydzielaną, znakowaną epitopem ektodomenę białka powierzchniowego komórki. Za pomocą funkcjonalizowanych kulek specyficznych dla znacznika epitopu, rozpuszczalne, wydzielane białko fuzyjne jest wychwytywane z pożywki hodowlanej. Powlekane kulki mogą być następnie używane bezpośrednio w testach agregacji kulek lub w testach sortowania kulek fluorescencyjnych w celu zbadania adhezji homofilowej. W razie potrzeby mutageneza może być następnie wykorzystana do wyjaśnienia określonych aminokwasów lub domen wymaganych do adhezji. Test ten wymaga tylko niewielkich ilości wyrażonego białka, nie wymaga produkcji stabilnych linii komórkowych i można go wykonać w ciągu 4 dni.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adhezja komórka-komórka jest niezbędna dla rozwoju i integralności organizmów wielokomórkowych i jest pośredniczona przez różnorodny układ cząsteczek na powierzchni komórki. Wiele z tych cząsteczek adhezyjnych zostało zidentyfikowanych i scharakteryzowanych, choć wiele z nich pozostaje do odkrycia. Do badania właściwości cząsteczek adhezyjnych komórek (CAM) stosuje się kilka metod, w tym testy sortowania komórek, testy agregacji komórek1-8 oraz metody biofizyczne, takie jak mikroskopia sił atomowych i spektroskopia sił powierzchniowych9-12.

Złożoność nawet uproszczonych systemów in vitro wykorzystujących linie komórkowe utrudnia określenie właściwości adhezyjnych domniemanego CAM. Zazwyczaj cząsteczka jest uważana za CAM, jeśli indukuje agregację komórek po transfekcji do nieadhezyjnej linii komórkowej. Oczywiste jest jednak, że nie jest to bezpośredni dowód na aktywność adhezyjną. Na przykład, ułatwienie dostarczania na powierzchnię komórki lub stabilności CAM również skutkowałoby zwiększoną agregacją komórek1,13. Co więcej, prawdziwy CAM może nie pośredniczyć w agregacji komórek, jeśli linia komórkowa nie ma innych kofaktorów wymaganych do dostarczania lub stabilizacji powierzchni komórki.

Aby uniknąć tych komplikujących czynników, można zastosować bardziej bezpośrednie testy, które opierają się na idei, że interakcje adhezyjne powinny być wewnętrzną właściwością biochemiczną domeny zewnątrzkomórkowej. Podczas gdy kulki były początkowo używane do charakteryzowania Ng-CAM2, testy te zostały rozszerzone w celu zbadania adhezji za pośrednictwem kadheryny12,14,15. Wykorzystując fuzję fuzji ektodomeny C-kadheryny-Fc, laboratorium Gumbiner wykazało, że wielokrotne powtórzenia kadheryny przyczyniają się do interakcji homofilnych14. Korzystając z porównywalnych testów agregacji kulek, scharakteryzowano również adhezję E-kadheryny i N-kadheryny12,15, podobnie jak szereg protokadheryn1,15-18 i izoform Dscam z Drosophila19. Tutaj opisujemy stosunkowo prosty i szybki test do scharakteryzowania aktywności adhezyjnej wydzielanych, znakowanych epitopami ektodomen domniemanych homofilnych CAM (Figura 1). Użyliśmy tego testu przede wszystkim do scharakteryzowania członków nadrodziny kadheryny.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie komórek (Dzień -2 do 0)

  1. Podziel komórki HEK293 1:5 przy użyciu 0,05% roztworu trypsyny-EDTA i inkubuj w pożywce wzrostowej w temperaturze 37 °C z 5% CO2 aż do 60 - 80% zlewu (2 - 3 dni). Dla każdego warunku hoduj komórki w szalkach 2 x 100 mm.

2. Transfekcja komórek (Dzień 1)

  1. Transfekcja komórek HEK293 z plazmidem kodującym fuzję Fc przy użyciu odczynnika do transfekcji, takiego jak Lipofectamina. Można również stosować metody alternatywne, które prowadzą do porównywalnej skuteczności transfekcji.
  2. Z powrotem transfekowane komórki należy umieścić w inkubatorze na 24 godziny.

3. Propagacja komórek (Dzień 2)

  1. Podgrzej pożywkę wzrostową bez płodowej surowicy bydlęcej (-FBS) do 37 °C.
  2. Opłucz naczynia 2x 10 ml pożywki wzrostowej -FBS i włóż naczynia do inkubatora o temperaturze 37 °C na 1 godzinę.
  3. Opłucz naczynia z kulturami jeszcze raz za pomocą 10 ml Growth Media -FBS, w sumie 3 mycia.
  4. Inkubować transfekowane komórki HEK293 w temperaturze 37 °C przez kolejne 48 godzin bez FBS przed pobraniem pożywki.

4. Agregacja koralików (Dzień 4)

  1. Aby zebrać pożywkę z szalek hodowlanych, przenieś pożywkę z każdej pary szalek do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i wiruj z prędkością 500 x g przez 5 minut, aby osadzać resztki komórkowe.
  2. Przefiltrować media z probówki stożkowej o pojemności 50 ml do filtra odśrodkowego za pomocą strzykawki o pojemności 30 ml i filtra strzykawkowego 0,45 μm.
  3. Filtry odśrodkowe należy obracać przy 4 000 x g i temperaturze 4 °C, aż objętość skoncentrowanej pożywki hodowlanej osiągnie około 500 μl (około 15 min). Powtarzaj, aż wszystkie podłoża hodowlane zostaną dodane i zagęszczone.
  4. Dodać 1,5 μl kulek magnetycznych białka G do 1 ml lodowatego buforu wiążącego w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml dla każdej próbki, umieścić na magnesie i usunąć bufor. Natychmiast dodaj skoncentrowaną pożywkę hodowlaną do kulek magnetycznych białka G.
  5. Obracaj probówki w temperaturze 4 °C przez 2 godziny.
  6. Umieść probówki na magnesie i wyjmij media. Szybko umyj koraliki dwukrotnie lodowatym 1 ml buforu wiążącego, a następnie ponownie zawieś kulki w 300 μl buforu wiążącego.
  7. Podziel zawieszone kulki na 2 probówki, 150 μl do każdej probówki, a następnie dodaj 1,5 μl 200 mM CaCl2 lub 200 mM EDTA odpowiednio dla warunków "wapń" i "brak wapnia".
  8. Przenieść 100 μl z każdego warunku do szkiełka studzienkowego wgłębienia i zebrać mikrofotografie za pomocą mikroskopu światła przechodzącego (ryc. 2). Zbierz obrazy z 5 pól widzenia dla każdego eksperymentu w każdym żądanym punkcie czasowym.

5. Analiza danych

  1. Korzystając z oprogramowania ImageJ lub porównywalnego oprogramowania do analizy obrazów, otwórz jeden z pięciu zestawów danych obrazów za pomocą opcji Importuj/Sekwencja obrazów... z menu rozwijanego Plik. Zostaną one otwarte jako stos obrazów.
  2. W oknie dialogowym Obraz/Właściwości... zmień jednostki obrazu na piksele i ustaw Szerokość pikseli i Wysokość pikseli na 1,0.
  3. Przekonwertuj obrazy na binarne za pomocą polecenia Dostosuj/Próg... w menu rozwijanym Obraz. Ustaw próg tak, aby uwzględniał piksele, które przyczyniają się do tworzenia ściegów lub agregacji ściegów, ale nie uwzględniają tła i małych cząstek. Zastosuj do wszystkich obrazów w stosie.
  4. W oknie dialogowym Ustawianie miar zaznacz pola Obszar i Położenie stosu
    5. .
  5. Uruchom polecenie Analizuj cząstki... w menu rozwijanym Analizuj. Spowoduje to wygenerowanie listy zidentyfikowanych cząstek, w tym ich rozmiaru (obszaru) i obrazu, na którym zostały zidentyfikowane.
  6. Powtórz ten proces dla którego eksperymentu i warunku eksperymentalnego.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przykładowy eksperyment jest przedstawiony na rysunku 2, który pokazuje zależne od wapnia agregacje kulek przez ektodomenę N-kadheryny połączonej z Fc (NcadEC-Fc). Przy braku wapnia kulki wykazują niewielką lub żadną tendencję do agregacji i nie ma wzrostu wielkości agregatu w czasie (ryc. 1A,C). W obecności wapnia kulki pokryte NcadEC-Fc wykazują silną agregację, przy czym wielkość agregatu rośnie w czasie (rysunek 1B,C). Eksperyment ten powtórzono trzy razy, przy czym ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adhezja komórek jest istotną cechą życia wielokomórkowego i jest pośredniczona przez szeroki wachlarz białek powierzchniowych komórek. Spośród nich szczegółowe właściwości adhezyjne są znane tylko dla stosunkowo niewielkiej części. Tutaj opisaliśmy prosty, szybki protokół badania homofilnej zdolności adhezyjnej wydzielanych ektodomen połączonych z wygodnym znacznikiem epitopu. Takie podejście ma szereg ważnych zalet. Po pierwsze, stabilne linie komórkowe nie są wymagane14,20, ponieważ wystarczające ilości biał...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta nagrodą NSF/ARRA (IOS 0920357) oraz nagrodą od NIH (5R21MH098463).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
pFc-N1 plazmidAddgeneDo złożenia
HEK293 komórkiAmerican Type Culture CollectionCRL-1573
DMEMMediatech - Corning10-013-CV
Płodowa surowica bydlęca (FBS)SigmaF2442
100x Pen-Strep (10,000 U/ml)Life Technologies15140-122
0,05% Trypsyna-EDTALife Technologies25300054
Lipofectamine 2000Life Technologies11668030
Dynabeads – Białko GLife Technologies10003D
Albumina surowicy bydlęcejSigmaA3294
Szkiełka depresyjneMikroskopia elektronowa Nauki71878-06
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-15 z membraną Ultracel-10MilliporeUFC901024
0,45 mm filtr strzykawkowySarstedt83.1826
Dynamag-2 MagnetLife Technologies12321D
Fiji (ImageJ) Oprogramowanie do analizy obrazuhttp://fiji.sc/Fiji
Tabela/roztworów
Pożywka wzrostowaDMEM + 10% FBS + filtr Pen-Strepsterylizować i przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Podłoża wzrostowe – FBSDMEM + Pen-StrepFilter sterylizować i przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Bufor wiążący50 mM Tris, pH 7,4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0,2% BSAVortex aż do rozpuszczenia, przechowywać na lodzie.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chen, X., Gumbiner, B. M. Paraxial protocadherin mediates cell sorting and tissue morphogenesis by regulating C-cadherin adhesion activity. J. Cell Biol. 174 (2), 301-313 (2006).
  2. Grumet, M., Friedlander, D. R., Edelman, G. M. Evidence for the binding of Ng-CAM to laminin. Cell Adhes. Commun. 1 (2), 177-190 (1993).
  3. Hatta, K., Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. Cloning and expression of cDNA encoding a neural calcium-dependent cell adhesion molecule: its identity in the cadherin gene family. J. Cell Biol. 106 (3), 873-881 (1988).
  4. Hirano, S., Nose, A., Hatta, K., Kawakami, A., Takeichi, M. Calcium-dependent cell-cell adhesion molecules (cadherins): subclass specificities and possible involvement of actin bundles. J. Cell Biol. 105 (6 Pt 1), 2501-2510 (1987).
  5. Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. Expressed recombinant cadherins mediate cell sorting in model systems. Cell. 54 (7), 993-1001 (1988).
  6. Nose, A., Takeichi, M. A novel cadherin cell adhesion molecule: its expression patterns associated with implantation and organogenesis of mouse embryos. J. Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2649-2658 (1986).
  7. Schreiner, D., Weiner, J. A. Combinatorial homophilic interaction between gamma-protocadherin multimers greatly expands the molecular diversity of cell adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (33), 14893-14898 (2010).
  8. Takeichi, M. Functional correlation between cell adhesive properties and some cell surface proteins. J. Cell Biol. 75, 464-474 (1977).
  9. Sivasankar, S., Brieher, W., Lavrik, N., Gumbiner, B., Leckband, D. Direct molecular force measurements of multiple adhesive interactions between cadherin ectodomains. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 (21), 11820-11824 (1999).
  10. Sivasankar, S., Gumbiner, B., Leckband, D. Direct measurements of multiple adhesive alignments and unbinding trajectories between cadherin extracellular domains. Biophys. J. 80, 1758-1768 (2001).
  11. Sivasankar, S., Zhang, Y., Nelson, W. J., Chu, S. Characterizing the initial encounter complex in cadherin adhesion. Structure. 17 (8), 1075-1081 (2009).
  12. Zhang, Y., Sivasankar, S., Nelson, W. J., Chu, S. Resolving cadherin interactions and binding cooperativity at the single-molecule level. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (1), 109-114 (2009).
  13. Yasuda, S., et al. Activity-induced protocadherin arcadlin regulates dendritic spine number by triggering N-cadherin endocytosis via TAO2beta and p38 MAP kinases. Neuron. 56 (3), 456-471 (2007).
  14. Chappuis-Flament, S., Wong, E., Hicks, L. D., Kay, C. M., Gumbiner, B. M. Multiple cadherin extracellular repeats mediate homophilic binding and adhesion. J. Cell Biol. 154 (1), 231-243 (2001).
  15. Emond, M. R., Biswas, S., Blevins, C. J., Jontes, J. D. A complex of Protocadherin-19 and N-cadherin mediates a novel mechanism of cell adhesion. J. Cell Biol. 195 (7), 1115-1121 (2011).
  16. Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. The clustered protocadherins Pcdhalpha and Pcdhgamma form a heteromeric complex in zebrafish. Neuroscience. 219, 280-289 (2012).
  17. Blevins, C. J., Emond, M. R., Biswas, S., Jontes, J. D. Differential expression, alternative splicing, and adhesive properties of the zebrafish delta1-protocadherins. Neuroscience. 199, 523-534 (2011).
  18. Morishita, H., et al. Structure of the cadherin-related neuronal receptor/protocadherin-alpha first extracellular cadherin domain reveals diversity across cadherin families. J. Biol. Chem. 281, 33650-33663 (1074).
  19. Wojtowicz, W. M., Flanagan, J. J., Millard, S. S., Zipursky, S. L., Clemens, J. C. Alternative splicing of Drosophila Dscam generates axon guidance receptors that exhibit isoform-specific homophilic binding. Cell. 118 (5), 619-633 (2004).
  20. Drees, F., Reilein, A., Nelson, W. J. Cell-adhesion assays: fabrication of an E-cadherin substratum and isolation of lateral and Basal membrane patches. Methods Mol. Biol. 294, 303-320 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bead Aggregation AssayCell Adhesion MoleculesHEK293 CellsProtein G Magnetic BeadsHomophilic AdhesionCalcium Dependent AdhesionImage AnalysisTransmitted Light MicroscopyEpitope tagged EctodomainFunctionalized Beads

Related Articles