Oznaczanie oddziaływań białko-ligand za pomocą różnicowej fluorymetrii skaningowej

Podsumowanie

Różnicowa fluorymetria skaningowa jest powszechnie stosowaną metodą badania bibliotek małych cząsteczek pod kątem interakcji z białkami. W tym miejscu przedstawiamy prostą metodę rozszerzenia tych analiz w celu oszacowania stałej dysocjacji między małą cząsteczką a jej białkiem partnera.

Streszczenie

Obecnie dostępny jest szeroki zakres metod określania stałej dysocjacji między białkiem a oddziałującymi małymi cząsteczkami. Jednak większość z nich wymaga dostępu do specjalistycznego sprzętu i często wymaga pewnego stopnia wiedzy specjalistycznej, aby skutecznie przeprowadzać wiarygodne eksperymenty i analizować dane. Różnicowa fluorymetria skaningowa (DSF) jest coraz częściej stosowana jako solidna metoda wstępnych badań przesiewowych białek pod kątem oddziałujących małych cząsteczek, zarówno w celu identyfikacji fizjologicznych partnerów, jak i odkrywania trafień. Technika ta ma tę zaletę, że wymaga jedynie maszyny do PCR odpowiedniej do ilościowego PCR, a zatem odpowiednie oprzyrządowanie jest dostępne w większości instytucji; Dostępna jest już doskonała gama protokołów; W literaturze istnieją silne precedensy dotyczące wielorakich zastosowań tej metody. Wcześniejsze prace proponowały kilka sposobów obliczania stałych dysocjacji na podstawie danych DSF, ale są one matematycznie wymagające. W tym miejscu demonstrujemy metodę szacowania stałych dysocjacji na podstawie umiarkowanej ilości danych eksperymentalnych DSF. Dane te można zazwyczaj zebrać i przeanalizować w ciągu jednego dnia. Pokazujemy, jak różne modele mogą być używane do dopasowywania danych zebranych z prostych zdarzeń powiązania oraz gdzie występują kooperacyjne powiązania lub niezależne witryny powiązań. Na koniec przedstawiamy przykład analizy danych w przypadku, gdy standardowe modele nie mają zastosowania. Metody te są zilustrowane danymi zebranymi na temat dostępnych na rynku białek kontrolnych oraz dwóch białek z naszego programu badawczego. Ogólnie rzecz biorąc, nasza metoda zapewnia naukowcom prosty sposób na szybkie uzyskanie dalszych informacji na temat interakcji białko-ligand za pomocą DSF.

Wprowadzenie

Wszystkie białka będą się wiązać, z różnym powinowactwem, z różnorodnym zakresem innych cząsteczek, od prostych jonów po inne duże makrocząsteczki. W wielu przypadkach białka wiążą się z partnerami małocząsteczkowymi w ramach ich normalnej funkcji (np. kinaza wiąże się z ATP). Inne interakcje mogą być niezwiązane z funkcją, ale są eksperymentalnie przydatne jako narzędzia (np. małe cząsteczki, które stabilizują białka w celu poprawy sukcesu krystalizacji lub pomagają w utrzymaniu białek w roztworze); podczas gdy małe cząsteczki, które wiążą się z miejscami aktywnymi i miejscami allosterycznymi białek, mogą działać jako inhibitory, a tym samym modulować aktywność enzymów.

Istnieje szeroki zakres technik, które mogą być użyte do określenia powinowactwa białek do cząsteczek partnerskich. Kalorymetria miareczkowa ^{izotermiczna 1} jest powszechnie postrzegana jako "złoty standard", ponieważ dostarcza bogatych informacji na temat reakcji, nie zawiera znaczników i ma ograniczone możliwości wykorzystania artefaktów eksperymentu. Jednak pomimo niedawnej poprawy czułości oprzyrządowania i automatyzacji konfiguracji eksperymentalnej, jest ona nadal stosunkowo droga pod względem zapotrzebowania na białko, ma w najlepszym razie niską lub średnią przepustowość i najlepiej nadaje się do interakcji o umiarkowanym lub wysokim powinowactwie (10 nM do 100 μM _{K d}) ². Inne metody bezznacznikowe, takie jak powierzchniowy rezonans plazmonowy lub interferometria ^{dwuwarstwowa3}, oferują wyższą przepustowość i osiągnęły czułość wykrywania mniejszych cząsteczek już od 100 Da. Instrumenty o wysokiej przepustowości dla tych metod są jednak stosunkowo drogie, są uzasadnione tylko tam, gdzie zapewniona będzie ciągła przepustowość odpowiednich projektów, a zatem prawdopodobnie będą niedostępne dla wielu laboratoriów akademickich.

Różnicowa fluorymetria skaningowa (DSF, lub termofluor) została po raz pierwszy opisana w 2001 ⁴ roku jako metoda odkrywania leków. W tej metodzie białka są inkubowane z barwnikiem fluorescencyjnym (początkowo stosowano barwniki naftalenowo-sulfonowe), który zmienia swoją fluorescencję po związaniu się z hydrofobowymi regionami białek. Próbka barwnika białkowego jest następnie podgrzewana, a fluorescencja monitorowana jest wraz ze wzrostem ciepła. Rozwijanie się białka i ekspozycja hydrofobowych części białka powoduje powstanie charakterystycznego wzoru we fluorescencji w funkcji temperatury (ryc. 1A). Eksperyment można przeprowadzić w małych objętościach w dowolnym komercyjnym ilościowym urządzeniu do PCR, a więc w jednym eksperymencie można jednocześnie przetestować dużą liczbę próbek (zwykle 48, 96 lub 384 próbki, w zależności od modelu urządzenia). Eksperymenty można zwykle przeprowadzić w ciągu około godziny, co zapewnia możliwość wysokoprzepustowej analizy próbek ⁵.

Dalsze ulepszenia metodologii doprowadziły do przyjęcia barwników o lepszych właściwościach spektralnych ^6,7, ogólnych narzędzi do analizy danych i sugerowanych protokołów do wstępnych badań przesiewowych ^8,9. Rozszerzono zakres zastosowań metody, ze szczególnym naciskiem na stworzenie optymalnych warunków do przygotowania i przechowywania białek ¹⁰ oraz na identyfikację potencjalnych partnerów wiążących wspomagających krystalizację ¹¹. Stosunkowo wysoka przepustowość metody, stosunkowo niski koszt białka (~2 μg na reakcję) oraz możliwość zastosowania do badania słabych cząsteczek wiążących sprawiły, że DSF jest cennym narzędziem do projektowania leków opartych na fragmentach, zwłaszcza w kontekście akademickim ^12-14.

Pomimo szerokiego zastosowania DSF do badania oddziaływań białko-ligand, niewiele badań opisało wyznaczanie stałych dysocjacji z tych badań. Mają one jednak tendencję do tworzenia szczegółowych równań opisujących rozwój białka, z wieloma parametrami, które muszą być dopasowane do rzadkich danych lub w niektórych przypadkach oszacowane ^{na 7,15-17}. Metody te mają szczególne znaczenie w trudnych przypadkach, takich jak ściśle wiążące związki lub białka wykazujące nietypowe przejścia. Jednak dla wielu laboratoriów te szczegółowe analizy są zbyt uciążliwe do rutynowego stosowania. W związku z tym proponujemy alternatywne metody leczenia dla różnych scenariuszy i pokazujemy, w jaki sposób można je wykorzystać do dopasowania danych wynikających z różnych interakcji białko-ligand. Nasza metoda wykorzystuje instrument qPCR StepOne, dla którego dostępne jest oprogramowanie do analizy danych na zamówienie; Chociaż przyspiesza to analizę danych, wyniki z innych instrumentów mogą być przetwarzane przy użyciu wcześniej opublikowanych metod ⁹ i można przeprowadzić tę samą dalszą analizę.

Protokół

1. Określenie przybliżonej wartości stałej dysocjacji (tj. w granicach jednego rzędu wielkości)

1. Przygotować mieszaninę wyszczególnioną w tabeli 1.
2. Przygotować zapasy interesującego liganda o najwyższym dostępnym stężeniu, a następnie po sześciu dziesięciokrotnych rozcieńczeniach. W przypadku gdy przybliżona wartość K_d jest znana z wcześniejszych danych, należy dążyć do osiągnięcia co najmniej dwóch stężeń powyżej i poniżej K_d.
3. Podwielokrotność 18 μl mieszaniny rozmieścić w ośmiu dołkach na płytce qPCR. Dodać 2 μl rozpuszczalnika do pierwszego dołka. Dodać po 2 μl każdego składnika serii rozcieńczania ligandów (etap 1.2) do jednego dołka z pozostałych siedmiu studzienek.
4. Umieścić pieczęć qPCR na płytce. Aby uzyskać dobre uszczelnienie płytki, umieść aplikator ręczny (patrz tabele poszczególnych odczynników) na środku płytki. Wygładź uszczelkę z jednej strony, a następnie powtórz na drugiej połowie płytki.
5. Odwirować płytkę o masie 500 x g przez dwie minuty, aby usunąć pęcherzyki powietrza.
6. Umieścić płytkę w urządzeniu qPCR StepOne. Wybierz opcję "Krzywa topnienia", filtry ROX i wybierz szybką prędkość narastania (zapewnia to 2-minutową przerwę w temperaturze 25 °C, a następnie rampę do 99 °C w ciągu 40 minut, a następnie 2-minutową przerwę). Uruchom denaturację termiczną.
   UWAGA: Pliki skryptów do wykonania przebiegu są dostępne online pod adresem http:// www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.
7. Po zakończeniu uruchomienia instrumentu kliknij przycisk "Analizuj" na ekranie. Zapisz plik wynikowy.
8. Otwórz oprogramowanie Protein Thermal Shift.
   1. Utwórz nowe badanie; w zakładce właściwości nadaj mu nazwę, a w zakładce Warunki wyszczególnij ligandy.
   2. Przejdź do zakładki Pliki eksperymentu i zaimportuj zapisany plik z wynikami (XXX.eds) i ustaw zawartość każdej studni (pliki szablonów są dostępne u autorów).
   3. Przejdź do zakładki Analiza i naciśnij przycisk "Analizuj".
      UWAGA: Spowoduje to analizę wyników. Możliwe jest wyeksportowanie wyników do dalszego zbadania za pomocą programu Excel przy użyciu karty Eksportuj. Wyniki są eksportowane w formacie wyznaczonym przez karty. Najlepiej otworzyć wyeksportowany plik w programie Excel i od razu zapisać w formacie Excel.
9. Sprawdzić, czy białko w obecności samego rozpuszczalnika daje wynik podobny do pokazanego na rysunku 1A. Następnie zbadaj temperatury topnienia zaobserwowane w wynikach w okienku "replikacja". Upewnij się, że pokazuje to wyraźny wzrost temperatury topnienia wraz ze wzrostem stężenia ligandów.
   UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby zapewniło to wyraźną maksymalną temperaturę topnienia (zakładając, że białko jest w pełni związane ligandem) i przybliżoną K_d, w której temperatura topnienia znajduje się w połowie drogi między białkiem wolnym od ligandu a maksymalną.

2. Eksperymentalny zestaw do wyznaczania stałej dysocjacji

1. Przygotować mieszaninę wyszczególnioną w tabeli 2 jako mieszankę główną.
2. Przygotuj zapasy liganda w piętnastu różnych stężeniach, które zostaną dziesięciokrotnie rozcieńczone w końcowym doświadczeniu. Najlepiej uwzględnić stężenia co najmniej dwa rzędy wielkości powyżej i poniżej szacowanej K_d i wyśrodkować stężenia na szacowanym K_d. Skoncentruj się na siedmiu punktach w rzędzie wielkości szacowanego K_d, z kolejnymi czterema punktami po obu stronach; Jeśli istnieje wybór, dołącz więcej punktów do wartości, które są nasycone.
   UWAGA: W razie potrzeby możliwa jest zmiana warunków doświadczalnych w taki sposób, aby zapasy ligandów były dwukrotnie większe niż stężenie doświadczalne, przy czym rozpuszczalność ligandów jest ograniczona.
3. Dodaj 120 μl mieszanki głównej do ośmiu dołków w 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery U, aby działała jako zbiornik do wygodnego dozowania mieszanki głównej. Za pomocą pipety 8-kanałowej dozuj 18 μl do jednej kolumny płytki PCR. Powtórz tę czynność dla kolejnych pięciu kolumn, aby uzyskać w sumie 48 wypełnionych studzienek w układzie 6 x 8 na płytce.
4. Dodać 20 μl zapasów ligandów lub rozpuszczalnika do oddzielnych studzienek w 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery U. Za pomocą pipety 8-kanałowej odessać 2 μl ośmiu różnych ligandów (lub rozpuszczalnika). Dodaj je do jednej kolumny płytki PCR, która została wypełniona mieszanką wzorcową w kroku 2.3. Powtórzyć z tymi samymi ośmioma zapasami ligandów/rozpuszczalników dla dwóch kolejnych kolumn. Odessać 2 μl pozostałych ośmiu zapasów ligandów lub rozpuszczalników i dodać je do czwartej kolumny na płytce. Powtórz to dla dwóch kolejnych kolumn. W ten sposób otrzymamy trzy próbki dla wszystkich 16 próbek ligandów i rozpuszczalników.
5. Umieścić pieczęć qPCR na płytce (patrz krok 1.4).
6. Odwirować płytkę o masie 500 x g przez dwie minuty.
7. Umieścić płytkę w aparacie qPCR. Uruchom denaturację termiczną, korzystając z parametrów określonych w kroku 1.6.
8. Po zakończeniu uruchomienia instrumentu kliknij przycisk "Analizuj" na ekranie. Zapisz plik wynikowy.
9. Otwórz oprogramowanie Protein Thermal Shift. Utwórz nowe badanie; na karcie właściwości nadaj temu nazwę, a na karcie Warunki wyszczególnij ligandy.
10. Przejdź do zakładki Pliki eksperymentu i zaimportuj zapisany plik wyników (XXX.eds) i ustaw zawartość każdego dołka.
    UWAGA: pliki szablonów są dostępne online pod adresem http:// www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.
11. Przejdź do zakładki Analiza i naciśnij przycisk "Analizuj".
    1. Wybierz zakładkę "Replikacje" z menu po lewej stronie ekranu, aby wyświetlić wyniki w trzech egzemplarzach. Oceń wiarygodność danych na podstawie tego, jak ciasne są trójki. Jeśli potrójne egzemplarze wykazują słabą odtwarzalność, należy dokładnie przeanalizować surowe dane.
    2. Przeanalizuj dane przy użyciu zarówno metody Boltzmanna, jak i metody pochodnej, aby ocenić temperaturę topnienia. Wybierz zakładkę "Replikuj wyniki", a następnie w "Wykresie replikacji wyników" przełącz przycisk "Drukuj według:" pomiędzy "Tm – Boltzmann" i "Tm – Pochodna". Należy wybrać metodę, która zapewnia większą odtwarzalność próbki. Wyeksportuj wyniki do dalszego badania za pomocą programu Excel przy użyciu karty Eksportuj.
       UWAGA: W przypadku próbek, które wykazują wiele przejść, prawie zawsze najlepiej jest użyć metody pochodnej w trybie wielokrotnego topnienia. Wyniki są eksportowane w formacie wyznaczonym przez karty. Najlepiej otworzyć wyeksportowany plik w programie Excel i od razu zapisać w formacie Excel.
    3. Powtórzyć doświadczenie co najmniej dwa razy, w tym powtórzyć w innym dniu, aby zapewnić odtwarzalność wyników. Jeżeli analiza danych (patrz krok 3 poniżej) wykaże, że wartość K_d znacznie różni się od pierwotnego oszacowania, należy odpowiednio zmienić stężenia ligandów (patrz krok 2.2), aby zapewnić dobry zakres wartości wokół K_d.

3. Analiza danych w celu określenia stałej dysocjacji w warunkach denaturacji termicznej

1. Utwórz tabelę w Excelu ze stężeniami ligandów i temperaturą topnienia.
2. Otwórz oprogramowanie GraphPad Prism i utwórz tabelę XY. Wprowadź dane, używając kolumny X dla stężeń ligandów i kolumny Y dla wyników temperatury topnienia.
   UWAGA: pokazany przykład to rysunek 1B. Skrypt z wstępnie załadowanymi równaniami oraz alternatywne instrukcje dotyczące korzystania z pakietu statystycznego SPSS są dostępne online pod adresem http:// www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.
3. Na karcie Analiza wybierz opcję zmiany parametrów analizy (Ctrl+T). Aby wprowadzić właściwy model, wybierz "Nowy" i "Utwórz nowe równanie". Wprowadzić równanie wyszczególnione w tabeli 3 jako "Jednomiejscowe wiązanie liganda".
   UWAGA: Przykład tych kroków pokazano na rysunku 1C. W przypadku korzystania ze skryptu z wstępnie załadowanymi równaniami, odpowiednie równanie można skierować wybrane z listy, a nie wprowadzić. Wyprowadzenie tego równania znajduje się w dodatku.
4. Zaznacz pole "Reguły dla wartości początkowych" i wprowadź reguły dla wartości początkowych zgodnie z opisem w tabeli 3.
5. Ogranicz parametr P jako "Stała równa" i wprowadź końcowe stężenie białka (w tych samych jednostkach, w których podany jest ligand).
6. Wybierz przycisk OK, aby przeprowadzić analizę.
   UWAGA: Przykład tych kroków pokazano na rysunku 1D. Oprogramowanie do tworzenia wykresów tworzy rysunek przedstawiający dane i dopasowanie do modelu. Przykłady takich analiz przedstawiono w danych reprezentatywnych.

4. Dopasowywanie danych do modeli kooperatywnych

Aby dopasować dane do modelu kooperacyjnego, należy wybrać prosty model kooperacyjny lub model, w którym zdefiniowano dwie oddzielne stałe dysocjacji. Pierwsze podejście jest preferowane w przypadku negatywnej kooperatywności lub jako badanie wstępne. Jednak w zasadzie w przypadku dodatniej kooperatywności lepiej jest modelować dwie różne stałe dysocjacji ¹⁸. W takim przypadku modelowanie może przebiegać przy założeniu albo sekwencyjnego wiązania ligandów, albo niezależnego wiązania ligandów.

1. Postępuj zgodnie z tymi samymi początkowymi krokami, co w protokole 3. Jednak w kroku 3.3 należy wstawić jedno z równań w tabeli 3 wymienionych jako "Prosty model kooperacyjny", "Sekwencyjne wiązanie dwóch ligandów" lub "Niezależne wiązanie dwóch ligandów" ¹⁸.
2. W tabeli 3 należy wybrać odpowiednie reguły dla wartości początkowych skojarzonych z każdym z tych równań.
3. Sprawdź dopasowanie modelu do danych. Jeśli dane są słabo dopasowane, rozważ inny model.
   UWAGA: ważne jest również, aby dokładnie sprawdzić dopasowanie temperatury topnienia do danych za pomocą oprogramowania Protein Thermal Shift (krok 2.9): czasami konieczna jest tutaj zmiana parametrów, aby uzyskać najlepsze wyniki. Kolejną kwestią jest to, czy zakres punktów danych jest idealny i czy istnieją jakieś anomalne punkty: albo ograniczony zestaw danych po obu stronach K_d, albo pojedynczy anomalny punkt (zwłaszcza przy najwyższych stężeniach ligandów) może znacząco wpłynąć na wyniki.
4. Powtórzyć doświadczenie co najmniej dwa razy (patrz krok 2.12), aby zapewnić odtwarzalność.

5. Dopasowywanie danych do krzywych pokazujących binarne przesunięcia temperatury topnienia

Czasami, zamiast stopniowanej odpowiedzi na ligand, zaobserwowano, że białka przyjmują odpowiedź binarną, w której próbka związana jest wyraźnie oddzielona od próbki niezwiązanej. Przykład przedstawiono w reprezentatywnych wynikach (rysunek 4). W takim przypadku dopasowanie temperatur topnienia nie zapewni dobrego dopasowania do K_d.

1. Eksportuj surowe dane wyjściowe z oprogramowania Protein Thermal Shift. Dla każdego punktu temperatury obliczyć średnią fluorescencję dla liganda zerowego i najwyższych stężeń ligandów. Tabelaryzuj wyniki z każdego punktu danych obok te.
   UWAGA: Utworzony w tym miejscu błąd jest mniejszy niż błąd w dopasowanych temperaturach topnienia.
2. Otwórz pakiet statystyczny SPSS. Skopiuj temperatury, dwa średnie zestawy danych i dane dla każdego eksperymentu do okna danych w SPSS. Na karcie zmiennej ustaw średni zestaw danych dla braku liganda jako "niski", a średni zestaw danych dla najwyższego stężenia liganda jako "wysoki".
3. Pobierz plik składni dostępny online pod adresem http:// www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular. Wybierz "Uruchom → Uruchom wszystko".
4. Skopiuj wyniki powiązane z proporcjami do nowego skoroszytu programu Excel z odpowiednimi stężeniami ligandów.
5. Otwórz oprogramowanie Graphpad i utwórz tabelę XY. Wprowadź dane, używając kolumny X dla stężeń ligandów i kolumny Y dla wyników temperatury topnienia. W zakładce analiza wybierz opcję "zmień parametry analizy". Aby wprowadzić właściwy model, wybierz "Nowy" i "Utwórz nowe równanie". Wprowadź równanie podane w tabeli 3, wymienione jako "Analiza binarnych zmian temperatury topnienia".
6. Zaznacz pole "Reguły dla wartości początkowych" i wprowadź reguły dla wartości początkowych wyszczególnionych w tabeli 3. Ogranicz parametr P jako "Stała równa" i wprowadź końcowe stężenie białka (w tych samych jednostkach, w których podany jest ligand).
   UWAGA: przykłady wypełniania tych rubryk dla protokołu w sekcji 3 pokazano na rysunku 1C, D.
7. Jeśli istnieje dobre dopasowanie, wyniki można poprawić, ekstrapolując na oczekiwany wynik przy nieskończonym stężeniu ligandów. Na podstawie modelu proporcji związanej przy każdym stężeniu liganda zbadaj wartość dla najwyższej wartości stężenia liganda. Jeśli wartość ta wynosi 0,99 lub więcej, dalsza analiza prawdopodobnie nie poprawi wyników.
8. Jeżeli proporcja jest mniejsza niż 0,99, wymagany jest dodatkowy krok w celu skorygowania wpływu niezwiązanego białka w próbce o najwyższym stężeniu liganda. W kroku 5.2 zapisz proporcję liganda związanego w najwyższym punkcie stężenia liganda (z kroku 5.7) do komórki R2 (można użyć innej komórki, a R2 odpowiednio zastąpić w równaniu w tabeli 3). Utwórz dodatkową kolumnę po średniej wyników najwyższego stężenia liganda. W pierwszej komórce skopiuj równanie wymienione w tabeli 3 jako "Ekstrapolacja do nieskończonego stężenia liganda". Skopiuj tę formułę do pozostałych komórek w tej kolumnie.
   UWAGA: To obliczenie usuwa wpływ niezwiązanego białka w najwyższym stężeniu liganda. Różnicę między białkiem wolnym od ligandów a najwyższym stężeniem liganda mnoży się przez odwrotność proporcji związanej przy najwyższym stężeniu liganda, aby uzyskać oczekiwaną różnicę między stanami białka w pełni związanego i niezwiązanego w każdym punkcie temperatury. Różnica ta jest dodawana lub odejmowana od stanu niezwiązanego, aby uzyskać oczekiwaną fluorescencję dla białka w pełni związanego z ligandem.
9. Zastąp kolumnę maksymalnego stężenia ligandów w arkuszu danych SPSS tą nową kolumną i powtórz dopasowanie danych.
   UWAGA: kroki 5.7 - 5.9 mogą wymagać powtórzenia, jeśli model sugeruje dalszą znaczącą zmianę proporcji związanej przy maksymalnym stężeniu liganda (jeśli tak jest, prawdopodobnie idealnym rozwiązaniem byłoby powtórzenie eksperymentu z uwzględnieniem wyższego punktu stężenia ligandów).
10. W przypadkach, gdy białko wykazuje przesunięcie binarne i wykazuje zachowanie kooperacyjne, równanie sugerowane w kroku 5.5 powinno zostać zastąpione równaniem z kroku 4.1. Parametry "Góra" i "Dół" należy zastąpić odpowiednio wartościami 1 i 0.
11. Powtórzyć doświadczenie co najmniej dwa razy (patrz krok 2.12), aby zapewnić odtwarzalność.

Wyniki

Doskonałym substratem testowym dla tej metody jest heksokinaza. Ma to tę zaletę, że jest łatwo dostępne na rynku i posiada dwa substraty, które można znaleźć w większości laboratoriów i które zapewniają jasne, powtarzalne wyniki w teście. Wstępne badanie przesiewowe stężenia (Protokół 1) przy użyciu heksokinazy i glukozy (Figura 2A) sugeruje, że prawdopodobne K_d będzie mieścić się w zakresie od 0,2 do 1,7 mM. W związku z tym przeprowadzono większe badanie przesiewowe (Protokół 2), wykorzystując stężenia przedstawione w Tabeli 4. Wyniki (Rysunek 2B) wykazują dobre dopasowanie do równania wiązania liganda w jednym miejscu (sekcja 3.3 protokołu) [9] i dały K_d 1,2 ± 0,1 mM.

Przypuszczalna transferaza heptozo-guanylowa WcbM ^19,20 wykazuje silne przesunięcie termiczne przy wiązaniu z GTP (Rysunek 3A). Wstępne badanie przesiewowe sugerowało, że K_d będzie mieścił się w zakresie około 100 μM. W związku z tym stworzono pełny ekran, wykorzystując stężenia przedstawione w tabeli 5. Dopasowanie wyników do równania 3.3 wykazało rozsądne dopasowanie (R² z 0,981; Rysunek 3B). Istnieje jednak wyraźna różnica między danymi a modelem, co sugeruje, że potrzebne jest inne równanie. Przeszukanie Protein Databank ²¹ z sekwencją WcbM wykazało, że najbliższe homologi, dla których wyznaczono struktury, tworzą dimery. W związku z tym dane przeanalizowano przy użyciu trzech równań kooperatywnego, sekwencyjnego i niezależnego wiązania dwóch ligandów (Protokół 4). Statystyki dopasowania dla modelu kooperatywnego dały wartość R² równą 0,998 i odchylenie standardowe reszt (Sy.x) równe 0,215, podczas gdy zarówno sekwencyjne, jak i niezależne modele wiązania dały wartość R² równą 0,992 i Sy.x wynoszącą odpowiednio 0,480 i 0,461. Sugeruje to, że modelem najlepiej pasującym do danych był model kooperatywny: tutaj zaobserwowano K_1/2 wynoszące 230 ± 10 μM, z wartością n 0,52 ± 0,02 (rysunek 3C). Wskazywało to na negatywną kooperatywność z wiązaniem. Należy zauważyć, że w tym przypadku użyto K_1/2, a nie K_d, ponieważ jednostkami dla K_d byłby raczej niezadowalający μM^0,52.

Przypuszczalna 2-O-acetylaza GDP-6-deoksy-β-d-manno-heptopyranozy, WcbI ²², wykazuje dość nietypowy wynik w różnicowej fluorymetrii skaningowej. W przypadku braku jakichkolwiek ligandów wykazuje wyraźną i prostą denaturację (ryc. 4A). Koenzym A (CoA) został zidentyfikowany jako ligand tego białka za pomocą DSF, a powinowactwo białka do tego partnera zbadano zgodnie z opisem w protokole. W obecności wysokich stężeń CoA obserwuje się silne przejście do wyższej temperatury, ze zmianą temperatury topnienia o 15 °C. Jednak przy stężeniach pośrednich, zamiast przejścia do topnienia jednofazowego w pośredniej temperaturze topnienia, WcbI wykazało topnienie dwufazowe, przy czym białko wydaje się topić w temperaturze bez ligandu lub w temperaturze topnienia w pełni związanego (Rysunek 4A). Proporcje obu gatunków zmieniały się w sposób zależny od dawki, przy czym rosnące stężenia substratów zwiększały proporcję, która topiła się w wyższej temperaturze (ryc. 4B). Bezpośrednia analiza tych danych była wyzwaniem: dopasowanie do równania Boltzmanna dawało bardzo słabe dopasowania, podczas gdy metody pochodne podkreślały, że zachodzą dwa zdarzenia topnienia, ale nie pomagały w wykazaniu zmiany wraz ze wzrostem stężenia ligandów.

Dlatego przyjęto mniej konwencjonalne podejście do analizy tych danych (Protokół 5). Przyjęto, że wyniki pochodnej fluorescencji bez liganda i przy najwyższym stężeniu liganda reprezentują zasadniczo całe białko w niższej temperaturze topnienia lub wyższej temperaturze topnienia. Pozostałe dane pochodne zostały dopasowane w każdym punkcie jako suma proporcji każdego z tych dwóch stanów, z proporcją zsumowaną do jedności (rysunek 4C). Uzyskane dane zostały następnie dopasowane jak poprzednio, aby uzyskać pozorne K_d, przy użyciu tych samych równań, co poprzednio. Podkreśliło to, że "wysoki" punkt liganda prawdopodobnie będzie związany tylko w 95% z ligandem. Dane zostały następnie ekstrapolowane na przewidywanie wyniku dla białka związanego w 100%, a dopasowanie danych powtórzono, aby uzyskać pozorne K_d wynoszące 58 ± 2 μM. Zapewniło to doskonałe dopasowanie wyników eksperymentalnych do modelu wiązania (rysunek 4D).

Rysunek 1. Przykłady konfiguracji i analizy eksperymentu. (A) Przykład oczekiwanego kształtu termicznego profilu denaturacji (zaczerpnięty z danych dotyczących heksokinazy drożdży). Charakterystyczny kształt surowych danych wskazuje na postępujący wzrost fluorescencji do maksimum, po którym następuje płytki spadek (omówiony bardziej szczegółowo w ⁹). Towarzyszy temu pojedynczy pik w pierwszej pochodnej fluorescencji. (B) Przykład wprowadzania danych do Graphpad. Stężenie liganda jest podane na osi X, a obserwowane temperatury topnienia na osi Y. (C) Przykład definicji równania w Graphpad. (D) Przykłady prawidłowego ustawiania początkowych wartości zmiennych oraz ustalania stężenia białka, aby umożliwić prawidłowe wyznaczenie stałej dysocjacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 2. Interakcja heksokinazy z glukozą mierzona za pomocą różnicowej fluorymetrii skaningowej. (A) Wstępny eksperyment testujący szeroki zakres stężeń glukozy sugeruje, że K_d może mieścić się w zakresie 0,2 - 1,7 mM. (B) Szczegółowy eksperyment, badający 16 stężeń glukozy, pozwala na określenie pozornego K_d jako 1,12 ± 0,05 mM. Dane bardzo dobrze pasują do modelu dla pojedynczego zdarzenia wiążącego (z temperaturami dolną (T1) i górną (T2) pasującą odpowiednio do 35,4 ± 0,2 ºC i 49,3 ± 0,5 ºC). Należy zauważyć, że dane te zostały zebrane w obecności 10 mM MgCl₂. Obrazy te zostały przygotowane przy użyciu programu GraphPad. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Interakcja WcbM z GTP ujawnia wiązanie antykooperatywne. (A) Wstępny eksperyment testujący szeroki zakres stężeń GTP sugeruje, że K_d prawdopodobnie mieści się w zakresie 200 - 500 μM. (B) Szczegółowy eksperyment, testujący 16 stężeń GTP, sugeruje wartość pozornego K_d wynoszącą 120 ± 20 μM. Jednak gdy dla osi x używana jest skala logarytmiczna, występuje znaczna rozbieżność między modelem a danymi. (C) Analiza tych samych danych z modelem kooperacyjnym wykazuje doskonałe dopasowanie do danych, w których stosowany jest prosty model kooperacyjny. Tutaj wyznaczono K_1/2 230 ± 20 μM, ze współczynnikiem kooperatywności n = 0,52 ± 0,02 (przy temperaturach dolnej (T1) i górnej (T2) mieszczących się odpowiednio w 69,63 ± 0,06 ºC i 79,9 ± 0,1 ºC). Ponieważ WcbM wydaje się być dimeryczne, oznacza to, że enzym jest doskonale antykooperatywny w wiązaniu z GTP. Obrazy te zostały przygotowane przy użyciu programu GraphPad. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. WcbI pokazuje dwufazowy wzór topnienia w obecności swojego liganda koenzymu A (CoA). (A) WcbI, przy braku liganda (niebieski), wykazuje prosty monofazowy wzór topnienia. Przy wysokich stężeniach ligandów (1 mM; zielona linia) obserwuje się podobny wzór. Jednak przy pośrednich stężeniach ligandów (60 μM; czerwona linia) obserwuje się dwa wyraźne piki topnienia, odpowiadające stanom wolnym od ligandów i związanym ligandem. (B) Przejście między tymi dwoma zestawami pików jest zależne od dawki w całym zakresie stężeń. (C) Modelowanie topnienia dwufazowego jako sumy proporcji wyników wolnych od ligandów i wyników z wysokimi ligandami daje dobre dopasowanie do danych (przerywana fioletowa linia w porównaniu z czerwoną linią). To dopasowanie poprawia się poprzez ekstrapolację wyniku zaobserwowanego dla wysokiego stężenia ligandów (gdzie model sugeruje ~95% obłożenia) do pełnego obłożenia (przerywana niebieska linia). (D) Dane uzyskane dla proporcji WcbI związanej z CoA wykazują doskonałe dopasowanie do prostego modelu wiązania, z K_d wynoszącym 58 ± 2 μM (dane te reprezentują dane zebrane w dwóch oddzielnych dniach, z nieznacznie różnymi stężeniami ligandów wybranymi na drugi dzień na podstawie pierwszego zestawu wyników). Panele (A - C) zostały przygotowane przy użyciu Excela, a panel (D) za pomocą Graphpada. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1. Przepis na wstępne eksperymenty.

Odczynnik	Objętość w mieszance (μl)
Białko	Do końcowego stężenia 0,11 mg/ml
5000X SYPRO Pomarańczowy	0.3
0,5 M HEPES pH 7,0	3.7
5 mln NaCl	5.6
Woda	do 180 μl

To opisuje "główną mieszankę" białka, odczynnika detekcyjnego i buforu do wstępnego eksperymentu zwiadowczego, aby zapewnić oszacowanie K_d, jak opisano w sekcji 1 protokołu. Ta mieszanina buforowa jest odpowiednia dla białek generycznych. W przypadku gdy poprzednie wyniki sugerują, że należy zastosować inne, należy je zastąpić. Jeżeli podstawowe stężenie białka jest niskie (tj. mniejsze niż 0,3 mg/ml), może być konieczne zmniejszenie ilości dodawanego dodatkowego buforu w celu skompensowania buforu już obecnego w próbce białka.

Tabela 2. Przepis na oznaczanie K_d.

Odczynnik	Objętość w mieszance (μl)
Białko	Do końcowego stężenia 0,11 mg/ml
5,000X SYPRO Pomarańczowy	1.78
0.5 M HEPES pH 7.0	22.2
5 mln NaCl	33.3
Woda	do 180 μl

To opisuje "główną mieszankę" białka, odczynnika detekcji i buforu do pełnego określenia K_d dla próbki białka, jak opisano w sekcji 2 protokołu. Ta mieszanina buforowa jest odpowiednia dla białek generycznych. W przypadku gdy poprzednie wyniki sugerują, że należy zastosować inne, należy je zastąpić. Jeżeli podstawowe stężenie białka jest niskie (tj. mniejsze niż 0,3 mg/ml), może być konieczne zmniejszenie ilości dodawanego dodatkowego buforu w celu skompensowania buforu już obecnego w próbce białka.

Tabela 3. Równania i parametry do analizy danych.

Krok w protokole eksperymentalnym	Wymagane równanie	Wymagane parametry	Opis zmiennych i parametrów
3.3
Jednostronne wiązanie ligandów	Y=Dół + ((Góra-Dół)*(1-((P-Kd-X+sqrt(((P+X+Kd)^2)-(4*P*X)))/(2*P))))		P: stężenie białka. Kd: stała dysocjacji. P i Kd są podawane w tych samych jednostkach, które zostały użyte do stężeń ligandów. Góra, dół: temperatury topnienia odpowiednio przy nieskończonym stężeniu ligandów i braku stężenia ligandów.
3.4		Dół = *YMIN	YMIN: Minimalna wartość Y (w tym przypadku najniższe białko eksperymentalne Tm)
		Góra = *YMAX	YMAX: Maksymalna wartość Y (najwyższe eksperymentalne białko Tm)
		Kd = *X w YMID	YMID: wartość Y, która odpowiada średniej z YMIN i YMAX. X jest odpowiednią wartością X (w tym przypadku odpowiednie stężenie liganda)
		P = (wartość początkowa, do dopasowania)
4.1
Prosty model współpracy	Y=Dół+((Góra-Dół)*(((X/Kd)^n)/(1+((X/Kd)^n))))		n: Współczynnik wzgórza. Opisuje to kooperatywność lub inne właściwości biochemiczne białka i niekoniecznie jest oszacowaniem liczby miejsc wiązania ligandów w białku. Współczynnik Hilla równy jeden oznacza brak kooperatywności; Wartości mniejsze niż jeden wskazują ujemną kooperatywność, a wartości większe niż jedna dodatnia kooperatywność.
		Dół = *YMIN
		Góra = *YMAX
		Kd = *X w YMID
		P = (wartość początkowa, do dopasowania)
		n = (wartość początkowa, do dopasowania)
Sekwencyjne wiązanie dwóch ligandów	Y=Dół+((Góra-Dół)*((X^2)/(Kd*K2))/(1+(X/Kd)+((X^2)/(Kd*K2))))		K2: stała dysocjacji dla drugiego zdarzenia wiązania.
		Dół = *YMIN
		Góra = *YMAX
		Kd = *X w YMID
		K2 = *X w YMID
		P = (wartość początkowa, do dopasowania)
Niezależne wiązanie dwóch ligandów	Y=Bottom+((Góra-Dół)*((X^2)/(Kd*K2))/(1+(2*X/Kd)+((X^2)/(Kd*K2))))
		Dół = *YMIN
		Góra = *YMAX
		Kd = *X w YMID
		K2 = *X w YMID
		P = (wartość początkowa, do dopasowania)
5.5
Analiza binarnych zmian temperatury topnienia	Y=1-((P-Kd-X+sqrt(((P+X+Kd)^2)-(4*P*X)))/(2*P))
		Dół = *YMIN
		Góra = *YMAX
		Kd = *X w YMID
		P = (wartość początkowa, do dopasowania)
5.8
Ekstrapolacja do nieskończonego stężenia ligandów	(C2-((1-$R$2)*B2))/$R$2		B2: komórka zawierająca wynik bez ligandu. C2: komórka zawierająca wynik z maksymalną ilością ligandu. $R$2: komórka zawierająca proporcję związaną przy maksymalnym stężeniu liganda.

Kroki 3, 4 i 5 wymagają dodania szczegółowych równań do oprogramowania analitycznego oraz precyzyjnego zdefiniowania parametrów początkowych do analizy danych. Pokazane są równania dla każdego odpowiedniego kroku z prawidłowym wyborem parametrów. Wyjaśnienie znaczenia zmiennych i parametrów ma charakter poglądowy.

Tabela 4. Stężenia do badania przesiewowego interakcji heksokinazy z glukozą.

Punkt próbkowania	Stężenie ligandu (glukozy) (mM)
1	0
2	0.001
3	0.005
4	0.01
5	0.03
6	0.1
7	0.3
8	0.4
9	0.7
10	1.1
11	2.1
12	3.7
13	5.3
14	7
15	9
16	11

Heksokinaza z pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae została dodana do głównej mieszanki zgodnie z opisem w protokole, uzupełniona 10 mM MgCl₂ jako magnez jest znanym kofaktorem. Wstępne oszacowanie K_d wynosiło od 0,5 do 2 mM. Eksperymenty zostały przeprowadzone w celu uzyskania wskazanych końcowych stężeń glukozy.

Tabela 5. Stężenia do badań przesiewowych interakcji WcbM z GDP

.

Punkt próbkowania	stężenie ligandu (GTP) (μM)
1	0
2	0.5
3	1
4	5
5	10
6	25
7	50
8	100
9	250
10	500
11	1,000
12	2,500
13	5,000
14	7,500
15	10,000
16	20,000

WcbM z Burkholderia pseudomallei został dodany do głównego miksu zgodnie z opisem w protokole. Początkowe oszacowanie K_d wynosiło około 100 μM. Eksperymenty zostały przeprowadzone w celu uzyskania wskazanych końcowych stężeń GTP, mając na celu pokrycie co najmniej dwóch rzędów wielkości powyżej i poniżej K_d.

Dyskusja

Różnicowa fluorymetria skaningowa dowiodła swojej mocy jako solidna i wszechstronna metoda charakteryzowania białek i identyfikacji potencjalnych ligandów białkowych. Dobrze udokumentowane sukcesy w przyspieszeniu stabilizacji białek, odkrywania leków (zwłaszcza w słabiej finansowanych laboratoriach) i krystalizacji ^10,23-25 sprawiły, że jest to atrakcyjna metoda wstępnych badań przesiewowych związków. Związki dodawane do białek wykazują wyraźny zależny od dawki wzrost pozornej temperatury topnienia ^7,9. Było jednak kilka prób wykorzystania wyników tych eksperymentów do określenia pozornych stałych wiązania, aby pomóc w klasyfikowaniu związków pod kątem ich powinowactwa. W tym miejscu przedstawiamy metodę systematycznego wyznaczania pozornej stałej dysocjacji dla białek w obecności liganda.

Przedstawione tutaj wyniki pokazują, że DSF może szybko i solidnie dostarczyć oszacowań stałej dysocjacji dla kombinacji białko-ligand. Obserwowane dane mogą być manipulowane za pomocą dostępnych na rynku narzędzi w celu zapewnienia szybkiego wyznaczenia K_d, bez konieczności przyjmowania założeń dotyczących prawdopodobnej wartości parametrów. Metoda ta ma znaczną przewagę nad niektórymi porównywalnymi metodami, ponieważ jest oszczędna zarówno pod względem białka, jak i wymaganego czasu. Opisany tutaj eksperyment zużywa 0,13 mg białka na eksperyment (około 0,4 mg w przypadku eksperymentów powtórzonych w trzech egzemplarzach). Wypada to korzystnie w porównaniu z izotermiczną kalorymetrią miareczkową (ITC), gdzie pojedynczy eksperyment ze średnim białkiem 40 kDa zużyje podobną ilość. Pełny zestaw eksperymentów wymaganych dla tego protokołu pochłonąłby około 4 godzin, łącznie z przygotowaniem, dla pojedynczego zestawu eksperymentów. Ponownie, prawdopodobnie będzie to znacznie szybsze niż metody takie jak ITC lub powierzchniowy rezonans plazmonowy, które, choć potężne, często wymagają znacznej optymalizacji w celu uzyskania najlepszych danych.

Nasze wyniki pokazują, że nadal istnieje wymóg dokładnego zbadania surowych danych, dopasowania tych danych do określenia temperatury topnienia oraz dopasowania danych dotyczących temperatury topnienia w celu określenia stałej dysocjacji. Pierwszym wyzwaniem jest kształt surowych danych powstających podczas topienia białek. W niektórych przypadkach kształt może nie być zbliżony do kształtu zaobserwowanego na rysunku 1A. Typowe problemy obejmują niskie zmiany temperatury wiązania ligandów, wysoką fluorescencję tła i niezwykłe wielokrotne przejścia temperatury. Niskie zmiany temperatury są widoczne przy wiązaniu wielu ligandów. W przypadku tej metody najbardziej krytycznym parametrem jest błąd w pomiarze T_m w porównaniu ze zmianą temperatury. Dane można zwykle dość dobrze dopasować, gdy odchylenie standardowe potrójnych pomiarów nie przekracza 10% zmiany temperatury topnienia między białkiem niezwiązanym a w pełni związanym. Z naszego doświadczenia wynika, że tam, gdzie takie zmiany temperatury wynoszą tylko 2 °C, może to wystarczyć do dopasowania danych, jeśli poszczególne punkty danych są bardzo dokładne. Drugą kwestią są krzywe o nietypowych kształtach. Często różnią się one między wolnymi białkami a formami związanymi z ligandem, ponieważ wiązanie liganda wpływa na tryby rozwijania białka. W takich przypadkach użytkownik musi rozważyć, czy dane mogą być wykorzystane z odpowiednim uwzględnieniem modeli, które mają być użyte do określenia temperatury topnienia i stałej dysocjacji. Innym częstym problemem jest to, że dodanie kofaktora do białka (np. MgCl₂ w naszym przykładzie z heksokinazą) jest wymagane w celu uzyskania najbardziej wiarygodnych danych. Z naszego doświadczenia wynika, że staranne rozważenie wszystkich prawdopodobnych czynników w eksperymencie na etapie dokonywania wstępnych odczytów jest niezbędne do uzyskania najlepszych wyników. Co więcej, alternatywne terapie teoretyczne mogą ujawnić cechy tych danych ^15,17. Wreszcie, nierzadko zdarza się, że niektóre białka, które zawierają natywnie odsłonięte regiony hydrofobowe, wykazują wysoką fluorescencję tła. Istnieje szereg rozwiązań tych problemów, które zostały szeroko omówione w innym miejscu^6,9.

W szczególności użytkownik musi rozważyć, czy użyć modelu Boltzmanna, czy modelu pochodnego (np. rysunek 4), a w przypadku użycia pochodnych, czy należy modelować wiele stopów. Obie metody modelowania rozwijania termicznego różnią się tym, że metoda Boltzmanna dopasowuje dane eksperymentalne do równania Boltzmanna, przyjmując regularny kształt sigmoidalny do krzywej rozwijania. W przeciwieństwie do tego, metoda pochodna przyjmuje pierwszą pochodną danych doświadczalnych w każdym punkcie (dolny panel na rysunku 1A) i traktuje temperaturę topnienia jako punkt najwyższej pierwszej pochodnej. Metoda pochodna zazwyczaj zwraca wyższą temperaturę topnienia o około 2 - 3 °C. Większość białek zwróci bardziej spójny wynik (tj. błąd standardowy temperatury topnienia dla eksperymentów potrójnych jest niższy) dla jednej z dwóch metod. Jest to zwykle ściśle związane z dokładnym kształtem krzywej rozwijania białka i konieczne jest empiryczne określenie najlepszej metody w każdym przypadku. W przypadku stosowania modelu pochodnego ważne jest również uwzględnienie wielu zdarzeń topnienia. Niektóre dane wyraźnie wskazują na wielokrotne przejścia, a w takich przypadkach wyniki będą prawdopodobnie łatwiejsze do interpretacji, jeśli te wielokrotne topnienie zostaną zamodelowane. W kontekście tego protokołu często zdarza się, że dodanie liganda może spowodować przejście białka z wielu przejść topnienia do pojedynczego przejścia (np . poprzez stabilizację najbardziej wrażliwej termicznie subdomeny) lub odwrotnie. W związku z tym zalecamy, aby surowe dane zostały przeanalizowane razem przed rozważeniem, które podejście będzie najlepsze do zastosowania.

Po modelowaniu poszczególnych temperatur topnienia mogą pojawić się dalsze problemy z dopasowaniem ich do modeli przedstawionych w sekcji protokołu. Konieczne jest dokładne zbadanie dopasowania do równania stałej dysocjacji przy użyciu skali logarytmicznej, ponieważ analiza ta często podkreśla rozbieżności między obserwowanymi danymi a modelem (np. Rysunek 3). Podczas gdy uzyskane wyniki są na ogół solidne, staranność w interpretacji daje możliwość wydobycia z danych lepszych wyników i najbardziej znaczącego.

Szczególną kwestią poruszoną przez te dane jest interpretacja, jaką należy umieścić w białkach, które wykazują kooperatywność lub wielokrotne zdarzenia wiązania w DSF. Do tej pory zaobserwowaliśmy to zjawisko tylko w białkach, co do których oczekuje się, że będą miały wiele specyficznych zdarzeń wiązania (np. WcbM, białko, którego najlepszym homologiem jest multimer ²⁶ i które działa jako multimer w chromatografii wykluczania wielkości [dane nie pokazane]). Wcale nie jest jasne, czy ujemna kooperatywność obserwowana w denaturacji DSF wskazuje, że enzym ostatecznie wykaże ujemną kooperatywność: może to raczej wskazywać na złożone wiązanie, które należy dokładniej zbadać przy użyciu szerszego zakresu metod. Sugeruje nam to jednak, że bardziej obszerne badania takich białek mogą zidentyfikować interesujące efekty.

Wartości podane dla stałej dysocjacji przy użyciu tej metody są na ogół tego samego rzędu, co wartości podane przez inne metody, takie jak izotermiczna kalorymetria miareczkowa i powierzchniowy rezonans plazmonowy. Jednak obserwowane wartości bezwzględne są często wyższe niż obserwowane przy użyciu tych metod. Jest to przynajmniej częściowo konsekwencja faktu, że stała dysocjacji jest obserwowana w temperaturze topnienia białka z ligandem. To K_d jest na ogół wyższe niż w temperaturach fizjologicznych. Stała dysocjacji jest związana z temperaturą reakcji za pomocą równań:

[1]

[2]

(gdzie c^θ jest wzorcowym stężeniem odniesienia, Δ_rG jest zmianą energii swobodnej Gibbsa reakcji, R jest stałą molową gazu, ΔH jest zmianą entalpii w reakcji, a ΔS jest zmianą entropii w reakcji).

Reakcje ze stałymi dysocjacji w mierzalnym zakresie tej metody będą na ogół miały ujemne Δ_rG, a zatem efektem wzrostu temperatury na równanie [1] będzie zwiększenie stałej dysocjacji. Zarówno człony ΔH , jak i ΔS , które składają się na energię swobodną Gibbsa (równanie [2]) są zależne od temperatury²⁷, a wpływ na stałą dysocjacji będzie zależał od wielkości i znaku tych zależności temperaturowych i będzie koniecznie zależny od oddziaływania. W związku z tym nie jest zaskakujące, że stałe dysocjacji wyznaczone tą metodą są czasami większe niż te wyznaczone metodami działającymi przy RT. Zależność od temperatury jest oczywiście również zastrzeżeniem wielu innych metod, które mają tendencję do zapewniania stałej dysocjacji w temperaturach niższych niż temperatura fizjologiczna.

Innym zastrzeżeniem metody DSF jest to, że jest to metoda oznakowana, w przeciwieństwie do ITC. Zastosowana etykieta fluorescencyjna (SYPRO Orange) jest hydrofobowa, a więc w niektórych przypadkach może konkurować z wiązaniem hydrofobowych ligandów z białkami. W związku z tym jest prawdopodobne, że w niektórych przypadkach uzyskana stała dysocjacji zostanie sztucznie podniesiona z powodu konkurencji z etykietą. Jednak w przypadku porównania różnych ligandów (główne zastosowanie DSF) jest mało prawdopodobne, aby różnice były wystarczająco znaczące, aby wpłynąć na klasyfikację związków według powinowactwa.

Potencjalną wadą tej metody jest granica wykrywalności, którą można osiągnąć. Zasadniczo nie powinno być możliwe dokładne zmierzenie wartości K_d niższej niż 50% stężenia białka, a nawet wartości w tym zakresie mogą mieć wątpliwą dokładność. Podczas gdy granica wykrywalności na tym końcu zakresu może być nieco rozszerzona poprzez zmniejszenie stężenia białka i barwnika, czułość przyrządu zapobiegnie dalszemu spadkowi stężenia białka. Podobnie, górna granica czułości zostanie określona przez rozpuszczalność liganda. Aby uzyskać matematycznie solidne oszacowanie K_d, najważniejsze jest uzyskanie danych z 90% białka obecnego w formie związanej z ligandem, co wymaga, aby stężenia ligandów były około dziesięć razy K_d (przy założeniu braku kooperatywności). Granica wykrywalności będzie zatem musiała wynosić jedną dziesiątą rozpuszczalności liganda w odpowiednim buforze. Oznacza to, że granice wykrywalności metody będą zwykle wahać się od 1 μM do od 1 do 100 mM, w zależności od białka i liganda.

Podsumowując, różnicowa fluorymetria skaningowa jest wszechstronną techniką mającą zastosowanie do szerokiej gamy białek. Korzystając z przedstawionych tutaj metod, możliwe jest szybkie i niedrogie określenie powinowactwa białka do różnych ligandów. Ma to ogromny potencjał do zastosowania w oczyszczaniu i stabilizacji białek, wyjaśnianiu funkcji lub swoistości enzymów z metagenomów oraz w odkrywaniu leków, zwłaszcza w małych laboratoriach.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Instrument do PCR w czasie rzeczywistym StepOne	Life Technologies	4376357	DSF można wykonywać za pomocą wielu innych urządzeń. Instrument StepOne posiada bardzo wygodne oprogramowanie do analizy danych.
Oprogramowanie do przesunięcia termicznego białek v1.0	Life Technologies	4466037
MicroAmp Szybkie płytki optyczne 48-dołkowe	Life Technologies	4375816
Taśma uszczelniająca optyczna	Life Technologies	4375323	Bio-rad nr części 223-9444 jest alternatywnym dostawcą
Płytki 96-dołkowe z dnem w kształcie litery U	Fisher	11521943
SYPRO Orange	Life Technologies	S6650	W przypadku dostawcy o mniejszej objętości należy użyć Sigma nr części S5692
SPSS statistics wersja 20	IBM		Inne pakiety statystyczne będą zapewniać podobną funkcjonalność
GraphPad Prism 6.02	GraphPad		Inne pakiety statystyczne będą zapewniać podobną funkcjonalność
Aplikator ręczny (PA1)	3M	75-3454-4264-6
Heksokinaza z Saccharomyces cerevisiae	Sigma-Aldrich	H5000
Glukoza	Fisher 10141520