Różnicowa fluorymetria skaningowa jest powszechnie stosowaną metodą badania bibliotek małych cząsteczek pod kątem interakcji z białkami. W tym miejscu przedstawiamy prostą metodę rozszerzenia tych analiz w celu oszacowania stałej dysocjacji między małą cząsteczką a jej białkiem partnera.
Artykuł metodologiczny
Oznaczanie oddziaływań białko-ligand za pomocą różnicowej fluorymetrii skaningowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Obecnie dostępny jest szeroki zakres metod określania stałej dysocjacji między białkiem a oddziałującymi małymi cząsteczkami. Jednak większość z nich wymaga dostępu do specjalistycznego sprzętu i często wymaga pewnego stopnia wiedzy specjalistycznej, aby skutecznie przeprowadzać wiarygodne eksperymenty i analizować dane. Różnicowa fluorymetria skaningowa (DSF) jest coraz częściej stosowana jako solidna metoda wstępnych badań przesiewowych białek pod kątem oddziałujących małych cząsteczek, zarówno w celu identyfikacji fizjologicznych partnerów, jak i odkrywania trafień. Technika ta ma tę zaletę, że wymaga jedynie maszyny do PCR odpowiedniej do ilościowego PCR, a zatem odpowiednie oprzyrządowanie jest dostępne w większości instytucji; Dostępna jest już doskonała gama protokołów; W literaturze istnieją silne precedensy dotyczące wielorakich zastosowań tej metody. Wcześniejsze prace proponowały kilka sposobów obliczania stałych dysocjacji na podstawie danych DSF, ale są one matematycznie wymagające. W tym miejscu demonstrujemy metodę szacowania stałych dysocjacji na podstawie umiarkowanej ilości danych eksperymentalnych DSF. Dane te można zazwyczaj zebrać i przeanalizować w ciągu jednego dnia. Pokazujemy, jak różne modele mogą być używane do dopasowywania danych zebranych z prostych zdarzeń powiązania oraz gdzie występują kooperacyjne powiązania lub niezależne witryny powiązań. Na koniec przedstawiamy przykład analizy danych w przypadku, gdy standardowe modele nie mają zastosowania. Metody te są zilustrowane danymi zebranymi na temat dostępnych na rynku białek kontrolnych oraz dwóch białek z naszego programu badawczego. Ogólnie rzecz biorąc, nasza metoda zapewnia naukowcom prosty sposób na szybkie uzyskanie dalszych informacji na temat interakcji białko-ligand za pomocą DSF.
Wprowadzenie
Wszystkie białka będą się wiązać, z różnym powinowactwem, z różnorodnym zakresem innych cząsteczek, od prostych jonów po inne duże makrocząsteczki. W wielu przypadkach białka wiążą się z partnerami małocząsteczkowymi w ramach ich normalnej funkcji (np. kinaza wiąże się z ATP). Inne interakcje mogą być niezwiązane z funkcją, ale są eksperymentalnie przydatne jako narzędzia (np. małe cząsteczki, które stabilizują białka w celu poprawy sukcesu krystalizacji lub pomagają w utrzymaniu białek w roztworze); podczas gdy małe cząsteczki, które wiążą się z miejscami aktywnymi i miejscami allosterycznymi białek, mogą działać jako inhibitory, a tym samym modulować aktywność enzymów.
Istnieje szeroki zakres technik, które mogą być użyte do określenia powinowactwa białek do cząsteczek partnerskich. Kalorymetria miareczkowa izotermiczna 1 jest powszechnie postrzegana jako "złoty standard", ponieważ dostarcza bogatych informacji na temat reakcji, nie zawiera znaczników i ma ograniczone możliwości wykorzystania artefaktów eksperymentu. Jednak pomimo niedawnej poprawy czułości oprzyrządowania i automatyzacji konfiguracji eksperymentalnej, jest ona nadal stosunkowo droga pod względem zapotrzebowania na białko, ma w najlepszym razie niską lub średnią przepustowość i najlepiej nadaje się do interakcji o umiarkowanym lub wysokim powinowactwie (10 nM do 100 μM K d) 2. Inne metody bezznacznikowe, takie jak powierzchniowy rezonans plazmonowy lub interferometria dwuwarstwowa3, oferują wyższą przepustowość i osiągnęły czułość wykrywania mniejszych cząsteczek już od 100 Da. Instrumenty o wysokiej przepustowości dla tych metod są jednak stosunkowo drogie, są uzasadnione tylko tam, gdzie zapewniona będzie ciągła przepustowość odpowiednich projektów, a zatem prawdopodobnie będą niedostępne dla wielu laboratoriów akademickich.
Różnicowa fluorymetria skaningowa (DSF, lub termofluor) została po raz pierwszy opisana w 2001 4 roku jako metoda odkrywania leków. W tej metodzie białka są inkubowane z barwnikiem fluorescencyjnym (początkowo stosowano barwniki naftalenowo-sulfonowe), który zmienia swoją fluorescencję po związaniu się z hydrofobowymi regionami białek. Próbka barwnika białkowego jest następnie podgrzewana, a fluorescencja monitorowana jest wraz ze wzrostem ciepła. Rozwijanie się białka i ekspozycja hydrofobowych części białka powoduje powstanie charakterystycznego wzoru we fluorescencji w funkcji temperatury (ryc. 1A). Eksperyment można przeprowadzić w małych objętościach w dowolnym komercyjnym ilościowym urządzeniu do PCR, a więc w jednym eksperymencie można jednocześnie przetestować dużą liczbę próbek (zwykle 48, 96 lub 384 próbki, w zależności od modelu urządzenia). Eksperymenty można zwykle przeprowadzić w ciągu około godziny, co zapewnia możliwość wysokoprzepustowej analizy próbek 5.
Dalsze ulepszenia metodologii doprowadziły do przyjęcia barwników o lepszych właściwościach spektralnych 6,7, ogólnych narzędzi do analizy danych i sugerowanych protokołów do wstępnych badań przesiewowych 8,9. Rozszerzono zakres zastosowań metody, ze szczególnym naciskiem na stworzenie optymalnych warunków do przygotowania i przechowywania białek 10 oraz na identyfikację potencjalnych partnerów wiążących wspomagających krystalizację 11. Stosunkowo wysoka przepustowość metody, stosunkowo niski koszt białka (~2 μg na reakcję) oraz możliwość zastosowania do badania słabych cząsteczek wiążących sprawiły, że DSF jest cennym narzędziem do projektowania leków opartych na fragmentach, zwłaszcza w kontekście akademickim 12-14.
Pomimo szerokiego zastosowania DSF do badania oddziaływań białko-ligand, niewiele badań opisało wyznaczanie stałych dysocjacji z tych badań. Mają one jednak tendencję do tworzenia szczegółowych równań opisujących rozwój białka, z wieloma parametrami, które muszą być dopasowane do rzadkich danych lub w niektórych przypadkach oszacowane na 7,15-17. Metody te mają szczególne znaczenie w trudnych przypadkach, takich jak ściśle wiążące związki lub białka wykazujące nietypowe przejścia. Jednak dla wielu laboratoriów te szczegółowe analizy są zbyt uciążliwe do rutynowego stosowania. W związku z tym proponujemy alternatywne metody leczenia dla różnych scenariuszy i pokazujemy, w jaki sposób można je wykorzystać do dopasowania danych wynikających z różnych interakcji białko-ligand. Nasza metoda wykorzystuje instrument qPCR StepOne, dla którego dostępne jest oprogramowanie do analizy danych na zamówienie; Chociaż przyspiesza to analizę danych, wyniki z innych instrumentów mogą być przetwarzane przy użyciu wcześniej opublikowanych metod 9 i można przeprowadzić tę samą dalszą analizę.
Protokół
1. Określenie przybliżonej wartości stałej dysocjacji (tj. w granicach jednego rzędu wielkości)
- Przygotować mieszaninę wyszczególnioną w tabeli 1.
- Przygotować zapasy interesującego liganda o najwyższym dostępnym stężeniu, a następnie po sześciu dziesięciokrotnych rozcieńczeniach. W przypadku gdy przybliżona wartość Kd jest znana z wcześniejszych danych, należy dążyć do osiągnięcia co najmniej dwóch stężeń powyżej i poniżej Kd.
- Podwielokrotność 18 μl mieszaniny rozmieścić w ośmiu dołkach na płytce qPCR. Dodać 2 μl rozpuszczalnika do pierwszego dołka. Dodać po 2 μl każdego składnika serii rozcieńczania ligandów (etap 1.2) do jednego dołka z pozostałych siedmiu studzienek.
- Umieścić pieczęć qPCR na płytce. Aby uzyskać dobre uszczelnienie płytki, umieść aplikator ręczny (patrz tabele poszczególnych odczynników) na środku płytki. Wygładź uszczelkę z jednej strony, a następnie powtórz na drugiej połowie płytki.
- Odwirować płytkę o masie 500 x g przez dwie minuty, aby usunąć pęcherzyki powietrza.
- Umieścić płytkę w urządzeniu qPCR StepOne. Wybierz opcję "Krzywa topnienia", filtry ROX i wybierz szybką prędkość narastania (zapewnia to 2-minutową przerwę w temperaturze 25 °C, a następnie rampę do 99 °C w ciągu 40 minut, a następnie 2-minutową przerwę). Uruchom denaturację termiczną.
UWAGA: Pliki skryptów do wykonania przebiegu są dostępne online pod adresem http:// www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular. - Po zakończeniu uruchomienia instrumentu kliknij przycisk "Analizuj" na ekranie. Zapisz plik wynikowy.
- Otwórz oprogramowanie Protein Thermal Shift.
- Utwórz nowe badanie; w zakładce właściwości nadaj mu nazwę, a w zakładce Warunki wyszczególnij ligandy.
- Przejdź do zakładki Pliki eksperymentu i zaimportuj zapisany plik z wynikami (XXX.eds) i ustaw zawartość każdej studni (pliki szablonów są dostępne u autorów).
- Przejdź do zakładki Analiza i naciśnij przycisk "Analizuj".
UWAGA: Spowoduje to analizę wyników. Możliwe jest wyeksportowanie wyników do dalszego zbadania za pomocą programu Excel przy użyciu karty Eksportuj. Wyniki są eksportowane w formacie wyznaczonym przez karty. Najlepiej otworzyć wyeksportowany plik w programie Excel i od razu zapisać w formacie Excel.
- Sprawdzić, czy białko w obecności samego rozpuszczalnika daje wynik podobny do pokazanego na rysunku 1A. Następnie zbadaj temperatury topnienia zaobserwowane w wynikach w okienku "replikacja". Upewnij się, że pokazuje to wyraźny wzrost temperatury topnienia wraz ze wzrostem stężenia ligandów.
UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby zapewniło to wyraźną maksymalną temperaturę topnienia (zakładając, że białko jest w pełni związane ligandem) i przybliżoną Kd, w której temperatura topnienia znajduje się w połowie drogi między białkiem wolnym od ligandu a maksymalną.
2. Eksperymentalny zestaw do wyznaczania stałej dysocjacji
- Przygotować mieszaninę wyszczególnioną w tabeli 2 jako mieszankę główną.
- Przygotuj zapasy liganda w piętnastu różnych stężeniach, które zostaną dziesięciokrotnie rozcieńczone w końcowym doświadczeniu. Najlepiej uwzględnić stężenia co najmniej dwa rzędy wielkości powyżej i poniżej szacowanej Kd i wyśrodkować stężenia na szacowanym Kd. Skoncentruj się na siedmiu punktach w rzędzie wielkości szacowanego Kd, z kolejnymi czterema punktami po obu stronach; Jeśli istnieje wybór, dołącz więcej punktów do wartości, które są nasycone.
UWAGA: W razie potrzeby możliwa jest zmiana warunków doświadczalnych w taki sposób, aby zapasy ligandów były dwukrotnie większe niż stężenie doświadczalne, przy czym rozpuszczalność ligandów jest ograniczona. - Dodaj 120 μl mieszanki głównej do ośmiu dołków w 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery U, aby działała jako zbiornik do wygodnego dozowania mieszanki głównej. Za pomocą pipety 8-kanałowej dozuj 18 μl do jednej kolumny płytki PCR. Powtórz tę czynność dla kolejnych pięciu kolumn, aby uzyskać w sumie 48 wypełnionych studzienek w układzie 6 x 8 na płytce.
- Dodać 20 μl zapasów ligandów lub rozpuszczalnika do oddzielnych studzienek w 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery U. Za pomocą pipety 8-kanałowej odessać 2 μl ośmiu różnych ligandów (lub rozpuszczalnika). Dodaj je do jednej kolumny płytki PCR, która została wypełniona mieszanką wzorcową w kroku 2.3. Powtórzyć z tymi samymi ośmioma zapasami ligandów/rozpuszczalników dla dwóch kolejnych kolumn. Odessać 2 μl pozostałych ośmiu zapasów ligandów lub rozpuszczalników i dodać je do czwartej kolumny na płytce. Powtórz to dla dwóch kolejnych kolumn. W ten sposób otrzymamy trzy próbki dla wszystkich 16 próbek ligandów i rozpuszczalników.
- Umieścić pieczęć qPCR na płytce (patrz krok 1.4).
- Odwirować płytkę o masie 500 x g przez dwie minuty.
- Umieścić płytkę w aparacie qPCR. Uruchom denaturację termiczną, korzystając z parametrów określonych w kroku 1.6.
- Po zakończeniu uruchomienia instrumentu kliknij przycisk "Analizuj" na ekranie. Zapisz plik wynikowy.
- Otwórz oprogramowanie Protein Thermal Shift. Utwórz nowe badanie; na karcie właściwości nadaj temu nazwę, a na karcie Warunki wyszczególnij ligandy.
- Przejdź do zakładki Pliki eksperymentu i zaimportuj zapisany plik wyników (XXX.eds) i ustaw zawartość każdego dołka.
UWAGA: pliki szablonów są dostępne online pod adresem http:// www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular. - Przejdź do zakładki Analiza i naciśnij przycisk "Analizuj".
- Wybierz zakładkę "Replikacje" z menu po lewej stronie ekranu, aby wyświetlić wyniki w trzech egzemplarzach. Oceń wiarygodność danych na podstawie tego, jak ciasne są trójki. Jeśli potrójne egzemplarze wykazują słabą odtwarzalność, należy dokładnie przeanalizować surowe dane.
- Przeanalizuj dane przy użyciu zarówno metody Boltzmanna, jak i metody pochodnej, aby ocenić temperaturę topnienia. Wybierz zakładkę "Replikuj wyniki", a następnie w "Wykresie replikacji wyników" przełącz przycisk "Drukuj według:" pomiędzy "Tm – Boltzmann" i "Tm – Pochodna". Należy wybrać metodę, która zapewnia większą odtwarzalność próbki. Wyeksportuj wyniki do dalszego badania za pomocą programu Excel przy użyciu karty Eksportuj.
UWAGA: W przypadku próbek, które wykazują wiele przejść, prawie zawsze najlepiej jest użyć metody pochodnej w trybie wielokrotnego topnienia. Wyniki są eksportowane w formacie wyznaczonym przez karty. Najlepiej otworzyć wyeksportowany plik w programie Excel i od razu zapisać w formacie Excel. - Powtórzyć doświadczenie co najmniej dwa razy, w tym powtórzyć w innym dniu, aby zapewnić odtwarzalność wyników. Jeżeli analiza danych (patrz krok 3 poniżej) wykaże, że wartość Kd znacznie różni się od pierwotnego oszacowania, należy odpowiednio zmienić stężenia ligandów (patrz krok 2.2), aby zapewnić dobry zakres wartości wokół Kd.
3. Analiza danych w celu określenia stałej dysocjacji w warunkach denaturacji termicznej
- Utwórz tabelę w Excelu ze stężeniami ligandów i temperaturą topnienia.
- Otwórz oprogramowanie GraphPad Prism i utwórz tabelę XY. Wprowadź dane, używając kolumny X dla stężeń ligandów i kolumny Y dla wyników temperatury topnienia.
UWAGA: pokazany przykład to rysunek 1B. Skrypt z wstępnie załadowanymi równaniami oraz alternatywne instrukcje dotyczące korzystania z pakietu statystycznego SPSS są dostępne online pod adresem http:// www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular. - Na karcie Analiza wybierz opcję zmiany parametrów analizy (Ctrl+T). Aby wprowadzić właściwy model, wybierz "Nowy" i "Utwórz nowe równanie". Wprowadzić równanie wyszczególnione w tabeli 3 jako "Jednomiejscowe wiązanie liganda".
UWAGA: Przykład tych kroków pokazano na rysunku 1C. W przypadku korzystania ze skryptu z wstępnie załadowanymi równaniami, odpowiednie równanie można skierować wybrane z listy, a nie wprowadzić. Wyprowadzenie tego równania znajduje się w dodatku. - Zaznacz pole "Reguły dla wartości początkowych" i wprowadź reguły dla wartości początkowych zgodnie z opisem w tabeli 3.
- Ogranicz parametr P jako "Stała równa" i wprowadź końcowe stężenie białka (w tych samych jednostkach, w których podany jest ligand).
- Wybierz przycisk OK, aby przeprowadzić analizę.
UWAGA: Przykład tych kroków pokazano na rysunku 1D. Oprogramowanie do tworzenia wykresów tworzy rysunek przedstawiający dane i dopasowanie do modelu. Przykłady takich analiz przedstawiono w danych reprezentatywnych.
4. Dopasowywanie danych do modeli kooperatywnych
Aby dopasować dane do modelu kooperacyjnego, należy wybrać prosty model kooperacyjny lub model, w którym zdefiniowano dwie oddzielne stałe dysocjacji. Pierwsze podejście jest preferowane w przypadku negatywnej kooperatywności lub jako badanie wstępne. Jednak w zasadzie w przypadku dodatniej kooperatywności lepiej jest modelować dwie różne stałe dysocjacji 18. W takim przypadku modelowanie może przebiegać przy założeniu albo sekwencyjnego wiązania ligandów, albo niezależnego wiązania ligandów.
- Postępuj zgodnie z tymi samymi początkowymi krokami, co w protokole 3. Jednak w kroku 3.3 należy wstawić jedno z równań w tabeli 3 wymienionych jako "Prosty model kooperacyjny", "Sekwencyjne wiązanie dwóch ligandów" lub "Niezależne wiązanie dwóch ligandów" 18.
- W tabeli 3 należy wybrać odpowiednie reguły dla wartości początkowych skojarzonych z każdym z tych równań.
- Sprawdź dopasowanie modelu do danych. Jeśli dane są słabo dopasowane, rozważ inny model.
UWAGA: ważne jest również, aby dokładnie sprawdzić dopasowanie temperatury topnienia do danych za pomocą oprogramowania Protein Thermal Shift (krok 2.9): czasami konieczna jest tutaj zmiana parametrów, aby uzyskać najlepsze wyniki. Kolejną kwestią jest to, czy zakres punktów danych jest idealny i czy istnieją jakieś anomalne punkty: albo ograniczony zestaw danych po obu stronach Kd, albo pojedynczy anomalny punkt (zwłaszcza przy najwyższych stężeniach ligandów) może znacząco wpłynąć na wyniki. - Powtórzyć doświadczenie co najmniej dwa razy (patrz krok 2.12), aby zapewnić odtwarzalność.
5. Dopasowywanie danych do krzywych pokazujących binarne przesunięcia temperatury topnienia
Czasami, zamiast stopniowanej odpowiedzi na ligand, zaobserwowano, że białka przyjmują odpowiedź binarną, w której próbka związana jest wyraźnie oddzielona od próbki niezwiązanej. Przykład przedstawiono w reprezentatywnych wynikach (rysunek 4). W takim przypadku dopasowanie temperatur topnienia nie zapewni dobrego dopasowania do Kd.
- Eksportuj surowe dane wyjściowe z oprogramowania Protein Thermal Shift. Dla każdego punktu temperatury obliczyć średnią fluorescencję dla liganda zerowego i najwyższych stężeń ligandów. Tabelaryzuj wyniki z każdego punktu danych obok te.
UWAGA: Utworzony w tym miejscu błąd jest mniejszy niż błąd w dopasowanych temperaturach topnienia. - Otwórz pakiet statystyczny SPSS. Skopiuj temperatury, dwa średnie zestawy danych i dane dla każdego eksperymentu do okna danych w SPSS. Na karcie zmiennej ustaw średni zestaw danych dla braku liganda jako "niski", a średni zestaw danych dla najwyższego stężenia liganda jako "wysoki".
- Pobierz plik składni dostępny online pod adresem http:// www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular. Wybierz "Uruchom → Uruchom wszystko".
- Skopiuj wyniki powiązane z proporcjami do nowego skoroszytu programu Excel z odpowiednimi stężeniami ligandów.
- Otwórz oprogramowanie Graphpad i utwórz tabelę XY. Wprowadź dane, używając kolumny X dla stężeń ligandów i kolumny Y dla wyników temperatury topnienia. W zakładce analiza wybierz opcję "zmień parametry analizy". Aby wprowadzić właściwy model, wybierz "Nowy" i "Utwórz nowe równanie". Wprowadź równanie podane w tabeli 3, wymienione jako "Analiza binarnych zmian temperatury topnienia".
- Zaznacz pole "Reguły dla wartości początkowych" i wprowadź reguły dla wartości początkowych wyszczególnionych w tabeli 3. Ogranicz parametr P jako "Stała równa" i wprowadź końcowe stężenie białka (w tych samych jednostkach, w których podany jest ligand).
UWAGA: przykłady wypełniania tych rubryk dla protokołu w sekcji 3 pokazano na rysunku 1C, D. - Jeśli istnieje dobre dopasowanie, wyniki można poprawić, ekstrapolując na oczekiwany wynik przy nieskończonym stężeniu ligandów. Na podstawie modelu proporcji związanej przy każdym stężeniu liganda zbadaj wartość dla najwyższej wartości stężenia liganda. Jeśli wartość ta wynosi 0,99 lub więcej, dalsza analiza prawdopodobnie nie poprawi wyników.
- Jeżeli proporcja jest mniejsza niż 0,99, wymagany jest dodatkowy krok w celu skorygowania wpływu niezwiązanego białka w próbce o najwyższym stężeniu liganda. W kroku 5.2 zapisz proporcję liganda związanego w najwyższym punkcie stężenia liganda (z kroku 5.7) do komórki R2 (można użyć innej komórki, a R2 odpowiednio zastąpić w równaniu w tabeli 3). Utwórz dodatkową kolumnę po średniej wyników najwyższego stężenia liganda. W pierwszej komórce skopiuj równanie wymienione w tabeli 3 jako "Ekstrapolacja do nieskończonego stężenia liganda". Skopiuj tę formułę do pozostałych komórek w tej kolumnie.
UWAGA: To obliczenie usuwa wpływ niezwiązanego białka w najwyższym stężeniu liganda. Różnicę między białkiem wolnym od ligandów a najwyższym stężeniem liganda mnoży się przez odwrotność proporcji związanej przy najwyższym stężeniu liganda, aby uzyskać oczekiwaną różnicę między stanami białka w pełni związanego i niezwiązanego w każdym punkcie temperatury. Różnica ta jest dodawana lub odejmowana od stanu niezwiązanego, aby uzyskać oczekiwaną fluorescencję dla białka w pełni związanego z ligandem. - Zastąp kolumnę maksymalnego stężenia ligandów w arkuszu danych SPSS tą nową kolumną i powtórz dopasowanie danych.
UWAGA: kroki 5.7 - 5.9 mogą wymagać powtórzenia, jeśli model sugeruje dalszą znaczącą zmianę proporcji związanej przy maksymalnym stężeniu liganda (jeśli tak jest, prawdopodobnie idealnym rozwiązaniem byłoby powtórzenie eksperymentu z uwzględnieniem wyższego punktu stężenia ligandów). - W przypadkach, gdy białko wykazuje przesunięcie binarne i wykazuje zachowanie kooperacyjne, równanie sugerowane w kroku 5.5 powinno zostać zastąpione równaniem z kroku 4.1. Parametry "Góra" i "Dół" należy zastąpić odpowiednio wartościami 1 i 0.
- Powtórzyć doświadczenie co najmniej dwa razy (patrz krok 2.12), aby zapewnić odtwarzalność.
Wyniki
Doskonałym substratem testowym dla tej metody jest heksokinaza. Ma ona tę zaletę, że jest łatwo dostępna w handlu, a jej dwa substraty znajdują się w większości laboratoriów i zapewniają wyraźne, powtarzalne wyniki w analizie. Wstępne badanie stężeń (Protokół 1), z wykorzystaniem heksokinazy i glukozy (Rysunek 2A), sugeruje, że prawdopodobna wartość Kd będzie mieścić się w zakresie od 0,2 do 1,7 mM. W związku z tym przeprowadzono szersze badanie (Protokół 2), stosując stężenia przedstawione w Tabeli 4. Wyniki (Rysunek 2B) wykazują dobre dopasowanie do równania wiązania liganda w jednym miejscu (Protokół sekcja 3.3) [9] i pozwoliły wyznaczyć wartość Kd wynoszącą 1,2 ± 0,1 mM.
Domniemana heptozoguanylotransferaza WcbM 19,20 wykazuje silny przesunięcie termiczne po związaniu z GTP (Rycina 3A). Wstępny screening zasugerował, że Kd mieściłby się w zakresie około 100 µM. W związku z tym przeprowadzono pełny screening, stosując stężenia przedstawione w Tabeli 5. Dopasowanie wyników do równania 3.3 wykazało zadowalającą zgodność (R2 wynoszące 0,981; Rycina 3B). Istnieje jednak wyraźna różnica między danymi a modelem, co sugeruje konieczność zastosowania innego równania. Przeszukiwanie bazy Protein Databank 21 z wykorzystaniem sekwencji WcbM wykazało, że najbliżsi homologowie, dla których określono struktury, tworzą dimery. Dane przeanalizowano zatem przy użyciu trzech równań dla kooperatywnego, sekwencyjnego i niezależnego wiązania dwóch ligandów (Protokół 4). Statystyki dopasowania dla modelu kooperatywnego dały wartość R2 równą 0,998 i odchylenie standardowe reszt (Sy.x) wynoszące 0,215, podczas gdy modele wiązania sekwencyjnego i niezależnego dały wartości R2 wynoszące 0,992 oraz Sy.x odpowiednio 0,480 i 0,461. Sugeruje to, że modelem dającym najlepsze dopasowanie do danych był model kooperatywny: zaobserwowano w nim K½ wynoszące 230 ± 10 µM przy wartości n równej 0,52 ± 0,02 (Rycina 3C). Wskazuje to na negatywną kooperatywność wiązania. Należy zauważyć, że w tym przypadku zastosowano K½ zamiast Kd, ponieważ jednostkami dla Kd byłyby mało satysfakcjonujące µM0.52.
Domniemana GDP-6-deoksy-β-d-manno-heptopiranoza 2-O-acetylaza, WcbI 22, wykazuje dość nietypowy wynik w różnicowej fluorymetrii skanowania. Wobec braku ligandów obserwuje się wyraźną i prostą denaturację (Rysunek 4A). Za pomocą DSF zidentyfikowano koenzym A (CoA) jako ligand tego białka, a powinowactwo białka do tego partnera zbadano zgodnie z opisem w protokole. W obecności wysokich stężeń CoA obserwuje się silne przesunięcie w stronę wyższej temperatury, ze zmianą temperatury topnienia o 15 °C. Jednakże przy stężeniach pośrednich, zamiast przesunięcia do monofazowego topnienia w pośredniej temperaturze topnienia, WcbI wykazywało topnienie bifazowe, w którym białko zdawało się topić albo w temperaturze bez ligandu, albo w temperaturze topnienia pełnego kompleksu (Rysunek 4A). Proporcje tych dwóch form zmieniały się w sposób zależny od dawki, przy czym wzrost stężeń substratu zwiększał proporcję frakcji topiącej się w wyższej temperaturze (Rysunek 4B). Bezpośrednia analiza tych danych była trudna: dopasowanie do równania Boltzmanna dawało bardzo słabe wyniki, natomiast metody pochodnych wskazywały na występowanie dwóch zdarzeń topnienia, ale nie pomagały w wykazaniu zmian wraz ze wzrostem stężenia ligandu.
Zastosowano zatem mniej konwencjonalne podejście do analizy tych danych (Protokół 5). Wyniki pochodnej fluorescencji bez liganda oraz przy najwyższym stężeniu liganda przyjęto jako reprezentujące w zasadzie całe białko w stanie o niższej temperaturze topnienia lub wyższej temperaturze topnienia. Pozostałe dane pochodnej dopasowano w każdym punkcie jako sumę proporcji każdego z tych dwóch stanów, przy czym suma proporcji wynosiła jeden (Rysunek 4C). Uzyskane dane dopasowano następnie w ten sam sposób co wcześniej, aby otrzymać pozorną wartość Kd, stosując te same równania. Wykazało to, że w punkcie „wysokiego” stężenia liganda prawdopodobnie tylko 95% liganda jest związane. Następnie dokonano ekstrapolacji danych w celu przewidzenia wyniku dla białka związanego w 100%, a dopasowanie danych powtórzono, co dało pozorną wartość Kd wynoszącą 58 ± 2 µM. Zapewniło to doskonałe dopasowanie wyników eksperymentalnych do modelu wiązania (Rysunek 4D).
Rycina 1. Przykłady konfiguracji eksperymentu i analizy. (A) Przykład oczekiwanego kształtu profilu denaturacji termicznej (na podstawie danych dla heksokinazy drożdżowej). Charakterystyczny kształt surowych danych wykazuje stopniowy wzrost fluorescencji do maksimum, a następnie łagodny spadek (omówione szczegółowo w 9). Towarzyszy temu pojedynczy pik w pierwszej pochodnej fluorescencji. (B) Przykład wprowadzania danych do programu Graphpad. Stężenie ligandu znajduje się na osi X, a obserwowane temperatury topnienia na osi Y. (C) Przykład definiowania równania w programie Graphpad. (D) Przykłady prawidłowego ustawiania wartości początkowych zmiennych orazB ustalania stężenia białka w celu umożliwienia poprawnego wyznaczenia stałej dysocjacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2. Oddziaływanie heksokinazy z glukozą mierzone za pomocą różnicowej fluorymetrii skanowania termicznego. (A) Wstępny eksperyment testujący szeroki zakres stężeń glukozy sugeruje, że Kd prawdopodobnie mieści się w zakresie 0,2 - 1,7 mM. (B) Szczegółowy eksperyment, w którym przetestowano 16 stężeń glukozy, pozwala na wyznaczenie pozornego Kd wynoszącego 1,12 ± 0,05 mM. Dane bardzo dobrze pasują do modelu pojedynczego zdarzenia wiązania (przy czym dolna temperatura (T1) i górna temperatura (T2) wynoszą odpowiednio 35,4 ± 0,2 ºC oraz 49,3 ± 0,5 ºC). Należy zauważyć, że dane te zostały zebrane w obecności 10 mM MgCl2. Obrazy zostały przygotowane przy użyciu programu GraphPad. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3. Oddziaływanie WcbM z GTP ujawnia antykooperatywne wiązanie. (A) Wstępny eksperyment badający szeroki zakres stężeń GTP sugeruje, że Kd prawdopodobnie mieści się w zakresie 200 - 500 µM. (B) Szczegółowy eksperyment, obejmujący 16 stężeń GTP, sugeruje wartość pozornego Kd wynoszącą 120 ± 20 µM. Jednakże przy zastosowaniu skali logarytmicznej dla osi x występuje znacząca rozbieżność między modelem a danymi. (C) Analiza tych samych danych przy użyciu modelu kooperatywnego wykazuje doskonałe dopasowanie do danych w przypadku zastosowania prostego modelu kooperatywnego. Wyznaczono tutaj wartość K½ równą 230 ± 20 µM, przy współczynniku kooperatywności n = 0,52 ± 0,02 (przy czym dolna (T1) i górna (T2) temperatura dopasowały się odpowiednio do 69,63 ± 0,06 ºC oraz 79,9 ± 0,1 ºC). Ponieważ WcbM wydaje się być dimerem, sugeruje to, że enzym wykazuje pełną antykooperatywność w wiązaniu GTP. Obrazy zostały przygotowane przy użyciu programu GraphPad. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 4. WcbI wykazuje dwufazowy wzór topnienia w obecności swojego ligandu koenzymu A (CoA). (A) WcbI wykazuje prosty monofazowy wzór topnienia w nieobecności ligandu (linia niebieska). Podobny wzór obserwuje się przy wysokich stężeniach ligandu (1 mM; linia zielona). Jednakże przy pośrednich stężeniach ligandu (60 µM; linia czerwona) obserwuje się dwa wyraźne piki topnienia, odpowiadające stanom wolnym od ligandu oraz związanym z ligandem. (B) Przejście między dwoma zestawami pików jest zależne od dawki w całym zakresie stężeń. (C) Modelowanie dwufazowego topnienia jako sumy proporcji stanu wolnego od ligandu i stanu przy wysokim stężeniu ligandu daje dobre dopasowanie do danych (przerywana linia fioletowa w porównaniu z linią czerwoną). Dopasowanie to ulega poprawie poprzez ekstrapolację wyniku uzyskanego dla wysokiego stężenia ligandu (gdzie model sugeruje ~95% obsadzenia) do pełnego obsadzenia (przerywana linia niebieska). (D) Dane uzyskane dla proporcji WcbI związanego z CoA wykazują doskonałe dopasowanie do prostego modelu wiązania z Kd wynoszącym 58 ± 2 µM (dane te reprezentują pomiary zebrane w dwa oddzielne dni, przy czym dla drugiego dnia wybrano nieco inne stężenia ligandu na podstawie pierwszego zestawu wyników). Panele (A - C) zostały przygotowane w programie Excel, a panel (D) w programie Graphpad. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Tabela 1. Receptura dla eksperymentów wstępnych.
| Odczynnik | Objętość w mieszaninie (µl) |
| Białko | do końcowego stężenia 0,11 mg/ml |
| 5000X SYPRO Orange | 0.3 |
| 0,5 M HEPES pH 7,0 | 3.7 |
| 5 M NaCl | 5.6 |
| Woda | Do 180 µl |
Opisano tutaj „master mix” białka, odczynnika detekcyjnego i buforu do wstępnego eksperymentu rozpoznawczego w celu oszacowania Kd, zgodnie z opisem w sekcji 1 protokołu. Ta mieszanina buforowa jest odpowiednia dla białek generycznych. W przypadkach, gdy wcześniejsze wyniki sugerują użycie innych buforów, należy zastosować odpowiednie zamienniki. Jeśli roztwór zapasowy białka ma niskie stężenie (t.j. mniej niż 0.3 mg/ml), może być konieczne zmniejszenie ilości dodanego buforu, aby skompensować bufor już obecny w próbce białka.
Tabela 2. Przepis do oznaczenia Kd.
| Odczynnik | Objętość w mieszaninie (µl) |
| Białko | do stężenia końcowego 0,11 mg/ml |
| 5 000X SYPRO Orange | 1.78 |
| 0,5 M HEPES pH 7,0 | 22.2 |
| 5 M NaCl | 33.3 |
| Woda | Do 180 µl |
Opisano tutaj „master mix” białka, odczynnika detekcyjnego i buforu do pełnego oznaczenia Kd dla próbki białka, zgodnie z opisem w sekcji 2 protokołu. Ta mieszanina buforowa jest odpowiednia dla białek generycznych. W przypadku, gdy wcześniejsze wyniki sugerują zastosowanie innych buforów, należy je wprowadzić zamiennie. Jeśli stężenie roztworu gęstego białka jest niskie (t.j. mniej niż 0.3 mg/ml), może być konieczne zmniejszenie ilości dodawanego buforu, aby skompensować bufor obecny już w próbce białka.
Tabela 3. Równania i parametry do analizy danych.
| Krok w protokole eksperymentalnym | Wymagane równanie | Wymagane parametry | Opis zmiennych i parametrów |
| 3.3 | |||
| Wiązanie ligandu w jednym centrum | Y=Bottom + ((Top-Bottom)*(1-((P-Kd-X+sqrt(((P+X+Kd)^2)-(4*P*X)))/(2*P)))) | P: stężenie białka. Kd: stała dysocjacji. P oraz Kd są podane w tych samych jednostkach, których użyto dla stężeń liganda. Top, Bottom: temperatury topnienia odpowiednio przy nieskończonym stężeniu liganda oraz przy braku stężenia liganda. | |
| 3.4 | Dół = *YMIN | YMIN: Wartość minimalna Y (w tym przypadku najniższa eksperymentalna Tm białka) | |
| Górna granica = *YMAX | YMAX: wartość maksymalna Y (najwyższa eksperymentalna temperatura topnienia białka Tm) | ||
| Kd = *X w YMID | YMID: wartość Y odpowiadająca średniej z YMIN i YMAX. X to odpowiadająca jej wartość X (w tym przypadku odpowiednie stężenie ligandu) | ||
| P = (Wartość początkowa, do dopasowania) | |||
| 4.1 | |||
| Prosty model kooperatywny | Y=Bottom+((Top-Bottom)*(((X/Kd)^n)/(1+((X/Kd)^n)))) | n: współczynnik Hilla. Opisuje on kooperatywność lub inne właściwości biochemiczne białka i nie musi być szacunkiem liczby miejsc wiązania ligandu w białku. Współczynnik Hilla równy jeden oznacza brak kooperatywności; wartości mniejsze od jeden wskazują na kooperatywność ujemną, a wartości większe od jeden na kooperatywność dodatnią. | |
| Dół = *YMIN | |||
| Góra = *YMAX | |||
| Kd = *X w YMID | |||
| P = (Wartość początkowa, do dopasowania) | |||
| n = (Wartość początkowa, do dopasowania) | |||
| Sekwencyjne wiązanie dwóch ligandów | Y=Bottom+((Top-Bottom)*((X^2)/(Kd*K2))/(1+(X/Kd)+((X^2)/(Kd*K2)))) | K2: stała dysocjacji dla drugiego zdarzenia wiązania. | |
| Dół = *YMIN | |||
| Góra = *YMAX | |||
| Kd = *X w YMID | |||
| K2 = *X w YMID | |||
| P = (Wartość początkowa, do dopasowania) | |||
| Niezależne wiązanie dwóch ligandów | Y=Bottom+((Top-Bottom)*((X^2)/(Kd*K2))/(1+(2*X/Kd)+((X^2)/(Kd*K2)))) | ||
| Dół = *YMIN | |||
| Górna granica = *YMAX | |||
| Kd = *X w YMID | |||
| K2 = *X przy YMID | |||
| P = (Wartość początkowa, do dopasowania) | |||
| 5.5 | |||
| Analiza przesunięć binarnych temperatury topnienia | Y=1-((P-Kd-X+sqrt(((P+X+Kd)^2)-(4*P*X)))/(2*P)) | ||
| Dół = *YMIN | |||
| Górna granica = *YMAX | |||
| Kd = *X w YMID | |||
| P = (Wartość początkowa, do dopasowania) | |||
| 5.8 | |||
| Ekstrapolacja do nieskończonego stężenia ligandu | (C2-((1-$R$2)*B2))/$R$2 | B2: komórka zawierająca wynik bez liganda. C2: komórka zawierająca wynik z maksymalną ilością liganda. $R$2: komórka zawierająca proporcję związania przy maksymalnym stężeniu liganda. |
Kroki 3, 4 i 5 wymagają wprowadzenia szczegółowych równań do oprogramowania analitycznego oraz precyzyjnego zdefiniowania parametrów początkowych dla analizy danych. Przedstawiono równania dla każdego odpowiedniego kroku wraz z poprawnym wyborem parametrów. Dla odniesienia zamieszczono wyjaśnienie znaczenia zmiennych i parametrów.
Tabela 4. Stężenia do przesiewania interakcji heksokinazy z glukozą.
| Punkt poboru próbek | Stężenie ligandu (glukozy) (mM) |
| 1 | 0 |
| 2 | 0.001 |
| 3 | 0.005 |
| 4 | 0.01 |
| 5 | 0.03 |
| 6 | 0.1 |
| 7 | 0.3 |
| 8 | 0.4 |
| 9 | 0.7 |
| 10 | 1.1 |
| 11 | 2.1 |
| 12 | 3.7 |
| 13 | 5.3 |
| 14 | 7 |
| 15 | 9 |
| 16 | 11 |
Heksokinazę z drożdży piekarskich Saccharomyces cerevisiae dodano do mieszaniny głównej (master mix) zgodnie z opisem w protokole, uzupełniając ją o 10 mM MgCl2 , ponieważ magnez jest znanym kofaktorem. Wstępna szacunkowa wartość Kd mieściła się w przedziale od 0,5 do 2 mM. Doświadczenia zaplanowano tak, aby uzyskać wskazane stężenia końcowe glukozy.
Tabela 5. Stężenia do przesiewania interakcji WcbM z GDP.
| Punkt poboru próbek | Stężenie ligandu (GTP) (μM) |
| 1 | 0 |
| 2 | 0.5 |
| 3 | 1 |
| 4 | 5 |
| 5 | 10 |
| 6 | 25 |
| 7 | 50 |
| 8 | 100 |
| 9 | 250 |
| 10 | 500 |
| 11 | 1,000 |
| 12 | 2,500 |
| 13 | 5,000 |
| 14 | 7,500 |
| 15 | 10,000 |
| 16 | 20,000 |
Białko WcbM z Burkholderia pseudomallei dodano do mieszaniny głównej zgodnie z opisem w protokole. Wstępna wartość Kd została oszacowana na około 100 µM. Doświadczenia zaplanowano tak, aby uzyskać wskazane stężenia końcowe GTP, dążąc do objęcia zakresu co najmniej dwóch rzędów wielkości powyżej i poniżej wartości Kd.
Dyskusja
Różnicowa fluorymetria skanowania (Differential scanning fluorimetry) udowodniła swoją skuteczność jako solidna i wszechstronna metoda charakteryzacji białek oraz identyfikacji potencjalnych ligandów białkowych. Dobrze udokumentowane sukcesy w przyspieszaniu stabilizacji białek, odkrywaniu leków (szczególnie w laboratoriach z mniejszym finansowaniem) oraz krystalizacji 10,23-25 uczyniły ją atrakcyjną metodą wstępnego przesiewu związków. Związki dodane do białek wykazują wyraźny, zależny od dawki wzrost pozornej temperatury topnienia 7,9. Dotychczas jednak podejmowano niewiele prób wykorzystania wyników tych eksperymentów do wyznaczania pozornych stałych wiązania, co pomogłoby w rankingu związków pod kątem ich powinowactwa. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę systematycznego wyznaczania pozornej stałej dysocjacji dla białek w obecności ligandu.
Przedstawione tutaj wyniki wykazują, że metoda DSF pozwala na szybkie i wiarygodne oszacowanie stałej dysocjacji dla kompleksu białko-ligand. Uzyskane dane można analizować przy użyciu dostępnych komercyjnie narzędzi w celu szybkiego wyznaczenia Kd, bez konieczności przyjmowania założeń dotyczących prawdopodobnych wartości parametrów. Metoda ta wykazuje znaczącą przewagę nad niektórymi porównywalnymi metodami pod względem oszczędności białka oraz czasu. Opisany tutaj eksperyment zużyje 0,13 mg białka na jedno badanie (około 0,4 mg w przypadku eksperymentów powtórzonych w trzech powtórzeniach). Wynik ten wypada korzystnie w porównaniu z izotermiczną kalorymetrią miareczkową (ITC), gdzie pojedynczy eksperyment z białkiem o średniej masie 40 kDa zużyje podobną ilość. Pełny zestaw eksperymentów wymaganych w tym protokole zajmie około 4 hr, wliczając przygotowanie, dla jednej serii badań. Ponownie, jest to prawdopodobnie znacznie szybciej niż w przypadku metod takich jak ITC czy powierzchniowy rezonans plazmonowy, które mimo swojej skuteczności często wymagają znacznej optymalizacji w celu uzyskania najlepszych danych.
Nasze wyniki wykazują, że nadal istnieje potrzeba dokładnego zbadania surowych danych, dopasowania tych danych w celu wyznaczenia temperatury topnienia oraz dopasowania danych temperatury topnienia w celu wyznaczenia stałej dysocjacji. Pierwszym wyzwaniem jest kształt surowych danych uzyskanych podczas topnienia białka. W niektórych przypadkach kształt ten może nie przypominać tego przedstawionego na Ryc. 1A. Do częstych problemów należą niewielkie przesunięcia temperatury po związaniu ligandu, wysoka fluorescencja tła oraz nietypowe, wielokrotne przejścia temperaturowe. Niewielkie przesunięcia temperatury obserwuje się przy wiązaniu wielu ligandów. W tej metodzie najbardziej krytycznym parametrem jest błąd pomiaru Tm w porównaniu do przesunięcia temperatury. Dane zazwyczaj można dopasować w sposób zadowalający, gdy odchylenie standardowe z pomiarów w trzech powtórzeniach nie przekracza 10% przesunięcia temperatury topnienia między białkiem niezwiązanym a całkowicie związanym. Nasze doświadczenie wskazuje, że w sytuacjach, gdy takie przesunięcia temperatury wynoszą zaledwie 2 °C, może to być wystarczające do dopasowania danych, pod warunkiem że poszczególne punkty danych są bardzo dokładne. Drugim problemem są krzywe o nietypowym kształcie. Często różnią się one między wolnym białkiem a formami związanymi z ligandem, ponieważ wiązanie ligandu wpływa na tryby rozfałdowania białka. W takich przypadkach użytkownik musi rozważyć, czy dane mogą zostać wykorzystane przy odpowiednim doborze modeli służących do wyznaczania temperatury topnienia i stałej dysocjacji. Kolejnym powszechnym problemem jest konieczność dodania kofaktora do białka (np. MgCl2 w naszym przykładzie z heksokinazą), aby uzyskać najbardziej wiarygodne dane. Nasze doświadczenie pokazuje, że staranne rozważenie wszystkich prawdopodobnych czynników w eksperymencie na etapie wykonywania wstępnych odczytów jest niezbędne do uzyskania najlepszych wyników. Co więcej, alternatywne analizy teoretyczne mogą ujawnić dodatkowe cechy tych danych 15,17. Na koniec, w przypadku niektórych białek zawierających natywnie odsłonięte regiony hydrofobowe, nie jest rzadkością występowanie wysokiej fluorescencji tła. Istnieje szereg rozwiązań tych problemów, które zostały szczegółowo omówione w innych publikacjach6,9.
W szczególności użytkownik musi rozważyć, czy zastosować model Boltzmanna czy model pochodnych (np. Rycina 4), a w przypadku zastosowania pochodnych – czy należy modelować wiele procesów topnienia. Dwie metody modelowania rozfałdowania termicznego różnią się tym, że metoda Boltzmanna dopasowuje dane eksperymentalne do równania Boltzmanna, zakładając regularny kształt sigmoidalny krzywej rozfałdowania. Z kolei metoda pochodnych wyznacza pierwszą pochodną danych eksperymentalnych w każdym punkcie (dolny panel na Rycina 1A) i uznaje temperaturę topnienia za punkt najwyższej wartości pierwszej pochodnej. Metoda pochodnych zazwyczaj daje wyższą temperaturę topnienia o około 2 - 3 °C. Większość białek wykaże bardziej spójny wynik (tj. błąd standardowy temperatury topnienia dla eksperymentów w trzech powtórzeniach będzie niższy) dla jednej z tych dwóch metod. Jest to zazwyczaj ściśle powiązane z dokładnym kształtem krzywej rozfałdowania białka i konieczne jest empiryczne określenie najlepszej metody w każdym przypadku. W sytuacjach, gdy stosowany jest model pochodnych, ważne jest również uwzględnienie wielu zdarzeń topnienia. Niektóre dane wyraźnie wskazują na występowanie wielu przejść i w takich przypadkach wyniki będą prawdopodobnie łatwiejsze do interpretacji, jeśli te wielokrotne zdarzenia topnienia zostaną wymodelowane. W kontekście niniejszego protokołu często zdarza się, że dodanie ligandu może spowodować przejście białka z wielu przejść topnienia do pojedynczego przejścia (np. poprzez stabilizację najbardziej wrażliwej termicznie subdomeny) lub i odwrotnie. Zalecamy zatem wspólne przeanalizowanie surowych danych przed rozważeniem, które podejście będzie najlepsze do zastosowania.
Po wymodelowaniu indywidualnych temperatur topnienia mogą pojawić się kolejne problemy podczas dopasowywania ich do modeli przedstawionych w sekcji protokołu. Niezbędne jest dokładne zbadanie dopasowania do równania stałej dysocjacji z wykorzystaniem skali logarytmicznej, ponieważ analiza ta często uwypukla rozbieżności między danymi obserwowanymi a modelem (enp. Rysunek 3). Chociaż uzyskane wyniki są zazwyczaj wiarygodne, staranność w ich interpretacji daje możliwość wyciągnięcia lepszych wniosków oraz nadania danym głębszego znaczenia.
Szczególnym problemem wynikającym z tych danych jest interpretacja białek, które wykazują kooperatywność lub wielokrotne zdarzenia wiązania w metodzie DSF. Do tej pory zjawisko to zaobserwowaliśmy jedynie w białkach, w których spodziewano się wystąpienia wielu swoistych zdarzeń wiązania (np. WcbM, białko, którego najbliższy homolog jest multimerem 26 i które zachowuje się jak multimer w chromatografii wykluczania cząsteczek [dane nie pokazane]). Nie jest wcale jasne, czy zaobserwowana w denaturacji DSF kooperatywność ujemna wskazuje na to, że enzym ostatecznie wykaże kooperatywność ujemną; może to raczej być sygnał wystąpienia złożonego wiązania, które należy dokładniej zbadać przy użyciu szerszego zakresu metod. Sugeruje nam to jednak, że bardziej szczegółowe badania takich białek prawdopodobnie pozwolą zidentyfikować interesujące efekty.
Wartości stałej dysocjacji wyznaczone za pomocą tej metody są zazwyczaj tego samego rzędu co wartości uzyskane innymi metodami, takimi jak izotermiczna kalorymetria miareczkowania oraz powierzchniowy rezonans plazmonowy. Jednakże obserwowane wartości bezwzględne są często wyższe niż te uzyskane za pomocą wspomnianych metod. Jest to co najmniej częściowo konsekwencją faktu, że stała dysocjacji jest obserwowana w temperaturze topnienia białka z ligandem. Ta wartość Kd jest zazwyczaj wyższa niż w temperaturach fizjologicznych. Stała dysocjacji jest powiązana z temperaturą reakcji następującymi równaniami:
[1]
[2]
(gdzie cθ to standardowe stężenie odniesienia, ΔrG to zmiana energii swobodnej Gibbsa reakcji, R to uniwersalna stała gazowa, ΔH to zmiana entalpii reakcji, a ΔS to zmiana entropii reakcji.)
Reakcje o stałych dysocjacji mieszczących się w zakresie pomiarowym tej metody będą zazwyczaj charakteryzować się ujemną wartością ΔrG, zatem efektem wzrostu temperatury w równaniu [1] będzie zwiększenie stałej dysocjacji. Zarówno składniki ΔH, jak i ΔS, które składają się na energię swobodną Gibbsa (równanie [2]), są zależne od temperatury27, a wpływ na stałą dysocjacji będzie zależał od wielkości i znaku tych zależności temperaturowych i nieuchronnie będzie zależał od rodzaju oddziaływania. W związku z tym nie jest zaskakujące, że stałe dysocjacji wyznaczone tą metodą są czasami większe niż te wyznaczone metodami działającymi w RT. Zależność od temperatury jest oczywiście ograniczeniem wielu innych metod, które mają tendencję do podawania stałej dysocjacji w temperaturach niższych niż temperatura fizjologiczna.
Kolejnym zastrzeżeniem dotyczącym metody DSF jest to, że, w przeciwieństwie do ITC, jest to metoda z użyciem znacznika. Stosowany znacznik fluorescencyjny (SYPRO Orange) jest hydrofobowy, przez co w niektórych przypadkach może konkurować z wiązaniem hydrofobowych ligandów z białkami. W konsekwencji prawdopodobne jest, że w niektórych sytuacjach uzyskana stała dysocjacji zostanie sztucznie zawyżona z powodu konkurencji ze znacznikiem. Jednak w przypadku porównywania różnorodnych ligandów (co jest głównym zastosowaniem DSF), różnice te prawdopodobnie nie będą na tyle istotne, aby wpłynąć na ranking związków pod względem powinowactwa.
Potencjalną wadą tej metody jest możliwy do osiągnięcia poziom detekcji. W zasadzie nie powinno być możliwe dokładne zmierzenie wartości Kd niższej niż 50% stężenia białka, a nawet wartości w tym zakresie mogą cechować się wątpliwą dokładnością. Chociaż granicę detekcji w tym zakresie można nieco przesunąć poprzez zmniejszenie stężeń białka i barwnika, czułość instrumentu uniemożliwi dalszą redukcję stężenia białka. Analogicznie, górna granica czułości będzie zdeterminowana przez rozpuszczalność ligandu. Aby uzyskać matematycznie wiarygodną szacunkową wartość Kd, najważniejsze jest pozyskanie danych, w których 90% białka znajduje się w formie związanej z ligandem, co wymaga stężeń ligandu wynoszących około dziesięciokrotność Kd (przy założeniu braku kooperatywności). Zatem granica detekcji będzie koniecznie stanowić jedną dziesiątą rozpuszczalności ligandu w odpowiednim buforze. Oznacza to, że granice detekcji tej metody będą typowo mieścić się w zakresie od 1 µM do wartości między 1 a 100 mM, w zależności od białka i ligandu.
Podsumowując, różnicowa fluorymetria skanująca jest wszechstronną techniką, którą można zastosować do szerokiego zakresu białek. Stosując przedstawione tutaj metody, możliwe jest szybkie i niedrogie określenie powinowactwa białka do różnych ligandów. Ma to ogromny potencjał zastosowania w oczyszczaniu i stabilizacji białek, wyjaśnianiu funkcji lub specyficzności enzymów z metagenomów, a także w odkrywaniu leków, szczególnie w małych laboratoriach.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana z grantu BBSRC (numer grantu BB/H019685/1 i BB/E527663/1) dla Uniwersytetu w Exeter.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Instrument do PCR w czasie rzeczywistym StepOne | Life Technologies | 4376357 | DSF można wykonywać za pomocą wielu innych urządzeń. Instrument StepOne posiada bardzo wygodne oprogramowanie do analizy danych. |
| Oprogramowanie do przesunięcia termicznego białek v1.0 | Life Technologies | 4466037 | |
| MicroAmp Szybkie płytki optyczne 48-dołkowe | Life Technologies | 4375816 | |
| Taśma uszczelniająca optyczna | Life Technologies | 4375323 | Bio-rad nr części 223-9444 jest alternatywnym dostawcą |
| Płytki 96-dołkowe z dnem w kształcie litery U | Fisher | 11521943 | |
| SYPRO Orange | Life Technologies | S6650 | W przypadku dostawcy o mniejszej objętości należy użyć Sigma nr części S5692 |
| SPSS statistics wersja 20 | IBM | Inne pakiety statystyczne będą zapewniać podobną funkcjonalność | |
| GraphPad Prism 6.02 | GraphPad | Inne pakiety statystyczne będą zapewniać podobną funkcjonalność | |
| Aplikator ręczny (PA1) | 3M | 75-3454-4264-6 | |
| Heksokinaza z Saccharomyces cerevisiae | Sigma-Aldrich | H5000 | |
| Glukoza | Fisher 10141520 |
Bibliografia
- Freyer, M. W., Lewis, E. A. Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Methods Cell Biol. 84, 79-113 (2008).
- Ladbury, J. E. Calorimetry as a tool for understanding biomolecular interactions and an aid to drug design. Biochem Soc Trans. 38, 888-893 (2010).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal Biochem. 377, 209-217 (2008).
- Pantoliano, M. W., et al. High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery. J Biomol Screen. 6, 429-440 (2001).
- Senisterra, G., Chau, I., Vedadi, M. Thermal denaturation assays in chemical biology. Assay Drug Dev Technol. 10, 128-136 (2012).
- Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., Detitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Anal Biochem. 357, 289-298 (2006).
- Lo, M. C., et al. Evaluation of fluorescence-based thermal shift assays for hit identification in drug discovery. Anal Biochem. 332, 153-159 (2004).
- Nettleship, J. E., Brown, J., Groves, M. R., Geerlof, A. Methods for protein characterization by mass spectrometry, thermal shift (ThermoFluor) assay, and multiangle or static light scattering. Methods Mol Biol. 426, 299-318 (2008).
- Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).
- Geders, T. W., Gustafson, K., Finzel, B. C. Use of differential scanning fluorimetry to optimize the purification and crystallization of PLP-dependent enzymes. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 68, 596-600 (2012).
- Vedadi, M., et al. Chemical screening methods to identify ligands that promote protein stability, protein crystallization, and structure determination. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15835-15840 (2006).
- Davis, B. J., Erlanson, D. A. Learning from our mistakes: the 'unknown knowns' in fragment screening. Bioorg Med Chem Lett. 23, 2844-2852 (2013).
- Larsson, A., Jansson, A., Aberg, A., Nordlund, P. Efficiency of hit generation and structural characterization in fragment-based ligand discovery. Curr Opin Chem Biol. 15, 482-488 (2011).
- Scott, D. E., et al. Using a fragment-based approach to target protein-protein interactions. Chembiochem. 14, 332-342 (2013).
- Cimmperman, P., et al. A quantitative model of thermal stabilization and destabilization of proteins by ligands. Biophys. J. 95, 3222-3231 (2008).
- Matulis, D., Kranz, J. K., Salemme, F. R., Todd, M. J. Thermodynamic stability of carbonic anhydrase: measurements of binding affinity and stoichiometry using ThermoFluor. Biochemistry. 44, 5258-5266 (2005).
- Zubriene, A., et al. Measurement of nanomolar dissociation constants by titration calorimetry and thermal shift assay - radicicol binding to Hsp90 and ethoxzolamide binding to CAII. Int J Mol Sci. 10, 2662-2680 (2009).
- Weiss, J. N. The Hill equation revisited: uses and misuses. FASEB J. 11, 835-841 (1997).
- Cuccui, J., et al. Characterization of the Burkholderia pseudomallei K96243 capsular polysaccharide I coding region. Infect Immun. 80, 1209-1221 (2012).
- DeShazer, D., Waag, D. M., Fritz, D. L., Woods, D. E. Identification of a Burkholderia mallei polysaccharide gene cluster by subtractive hybridization and demonstration that the encoded capsule is an essential virulence determinant. Microb Pathog. 30, 253-269 (2001).
- Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. Announcing the worldwide Protein Data Bank. Nat Struct Biol. 10, 980(2003).
- Vivoli, M., Ayres, E., Beaumont, E., Isupov, M., Harmer, N. Structural insights into WcbI, a novel polysaccharide biosynthesis enzyme. IUCr Journal. 1 (1), 28-38 (2014).
- Sorrell, F. J., Greenwood, G. K., Birchall, K., Chen, B. Development of a differential scanning fluorimetry based high throughput screening assay for the discovery of affinity binders against an anthrax protein. J Pharm Biomed Anal. 52, 802-808 (2010).
- Uniewicz, K. A., et al. Differential scanning fluorimetry measurement of protein stability changes upon binding to glycosaminoglycans: a screening test for binding specificity. Anal Chem. 82, 3796-3802 (2010).
- Wan, K. F., et al. Differential scanning fluorimetry as secondary screening platform for small molecule inhibitors of Bcl-XL. Cell Cycle. 8, 3943-3952 (2009).
- Koropatkin, N. M., Holden, H. M. Molecular structure of alpha-D-glucose-1-phosphate cytidylyltransferase from Salmonella typhi. J Biol Chem. 279, 44023-44029 (2004).
- Paleskava, A., Konevega, A. L., Rodnina, M. V. Thermodynamics of the GTP-GDP-operated conformational switch of selenocysteine-specific translation factor SelB. J Biol Chem. 287, 27906-27912 (2012).
Przedruki i uprawnienia
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie