Cytozolowe pomiary wapnia w komórkach nabłonka nerek za pomocą cytometrii przepływowej

Podsumowanie

Wapń bierze udział w licznych fizjologicznych i patofizjologicznych szlakach sygnałowych. Obrazowanie żywych komórek wymaga specjalistycznego sprzętu i może być czasochłonne. Zoptymalizowano szybką, prostą metodę wykorzystującą cytometr przepływowy do określenia względnych zmian wapnia cytozolowego w przylegających komórkach nabłonka wprowadzonych do zawiesiny.

Streszczenie

Różnorodne procesy komórkowe, zarówno fizjologiczne, jak i patofizjologiczne, wymagają lub są regulowane przez wapń, w tym egzocytoza, funkcja mitochondriów, śmierć komórki, metabolizm komórkowy i migracja komórek, by wymienić tylko kilka. Wapń cytozolowy jest zwykle utrzymywany w niskich stężeniach nanomolowych; Występuje raczej w wysokich stężeniach mikromolowych do milimolowych w retikulum endoplazmatycznym, macierzy mitochondrialnej i przedziale zewnątrzkomórkowym. Po stymulacji przejściowy wzrost cytozolowego wapnia służy do sygnalizowania dalszych zdarzeń. Wykrywanie zmian w cytozolowym wapniu jest zwykle wykonywane przy użyciu obrazowania żywych komórek z barwnikami wiążącymi wapń, które wykazują albo wzrost intensywności fluorescencji, albo przesunięcie długości fali emisji po związaniu wapnia. Jednak zestaw do obrazowania żywych komórek nie jest swobodnie dostępny dla wszystkich badaczy. Alternatywne metody wykrywania zostały zoptymalizowane dla komórek immunologicznych z cytometrią przepływową oraz dla nieimmunologicznych komórek adherentnych z czytnikiem mikropłytek fluorescencyjnych. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną, prostą metodę wykrywania zmian w komórkach nabłonka za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu barwnika wiążącego wapń o pojedynczej długości fali. Przylegające komórki nabłonka kanalików proksymalnych nerek, które zwykle są trudne do obciążenia barwnikami, obciążono barwnikiem wiążącym wapń przepuszczalnym dla komórek fluorescencyjnych w obecności probenecydu, wprowadzono do zawiesiny, a sygnały wapniowe monitorowano przed i po dodaniu thapsigarginy, tunikamycyny i jonomycyny.

Wprowadzenie

Wapń jest ważnym drugim przekaźnikiem odpowiedzialnym za przekazywanie komórkowych sygnałów fizjologicznych i patofizjologicznych¹. Stężenia wapnia cytozolowego są utrzymywane na niskim poziomie dzięki aktywności pomp wapniowych i wymienników wapniowych. ATPaza wapniowa retikulum sarkoplazmatycznego/endoplazmatycznego (SERCA) uzupełnia zapas wapnia w retikulum endoplazmatycznym (ER) w ramach systemu "nieszczelności pompy", podczas gdy ATPaza wapniowa błony komórkowej (PMCA) wytłacza wapń do przedziału zewnątrzkomórkowego, w obu przypadkach w sposób zależny od ATP². Przekaźniki fizjologiczne, takie jak hormony lub neuroprzekaźniki, przekazują swoje sygnały przez receptory sprzężone z białkiem G, aktywację fosfolipazy C, która hydrolizuje 4,5-bisfosforan fosfatydyloinozytolu (PIP2) w błonie komórkowej w celu wytworzenia diacyloglicerolu i trifosforanu inozytolu (IP3)³. Podczas gdy diacyloglicerol pozostaje w błonie komórkowej, IP3 dyfunduje do cytozolu i wiąże się z receptorami IP3 (IP3Rs), które są kanałami wapniowymi aktywowanymi ligandami, znajdującymi się w błonie ER, a wapń jest uwalniany z magazynu światła ER, co prowadzi do wzrostu stężenia wapnia w cytozolu⁴. Alternatywną drogą dotarcia wapnia do cytozolu są kanały wapniowe i wymienniki obecne w błonie komórkowej. Opisano wzajemne oddziaływanie między tymi dwoma przedziałami: uwalnianie wapnia indukowane wapniem (CICR), w którym zewnątrzkomórkowy wapń indukuje uwalnianie wapnia z magazynów ER⁵, oraz wejście wapnia obsługiwane przez magazyn (SOCE), w którym opróżnianie zapasów ER jest wykrywane przez STIM i powoduje otwarcie kanałów wapniowych Orai w błonie komórkowej w celu ułatwienia ponownego wypełnienia zapasów ER⁶.

W warunkach patofizjologicznych komórkowa odpowiedź wapniowa jest rozregulowana, a cytozolowy wapń wzrasta przy braku stymulatorów fizjologicznych¹. Odpowiedź wapniowa może być zaburzona na wiele sposobów: przedłużony sygnał wapniowy, opóźnione usuwanie wapnia z cytozolu, wyczerpanie zapasów wapnia lub miejscowe zmiany wapnia. Ponadto mitochondria odgrywają kluczową rolę w buforowaniu i uwalnianiu wapnia⁷. Długotrwały i/lub supramaksymalny wzrost cytozolowego wapnia prowadzi do śmierci komórki. W rzeczywistości wapń jest najczęściej zaangażowany w komórkową odpowiedź patofizjologiczną i jest kluczowym zdarzeniem w szerokim zakresie chorób, takich jak choroby neurodegeneracyjne, choroby serca, nowotwory, choroby kości i choroby nerek, które są głównie związane ze śmiercią komórek i utratą lub zmianą funkcji narządów lub tkanek^8-10. Co więcej, zaburzenia sygnałów wapniowych są powiązane z adaptacją komórkową oraz zmianami w funkcjach i reakcjach komórkowych.

Tradycyjnie, sygnały wapniowe są mierzone za pomocą ujemnie naładowanego fluorescencyjnego wskaźnika wapniowego, który jest ładowany do komórek w postaci przepuszczalnego dla komórek estru acetoksymetylowego (AM). Po rozszczepieniu przez esterazy komórkowe wskaźniki fluorescencyjne pozostają w przedziale wewnątrzkomórkowym i zwiększają intensywność fluorescencji, gdy wapń jest związany. Najbardziej znanym i stosowanym wskaźnikiem wapnia jest ratiometryczny Fura-2 opracowany przez Rogera Tsiena i współpracowników¹¹. Wskaźniki wapnia o różnym powinowactwie do wapnia pozwalają na monitorowanie różnych pul wapnia. Metody wykrywania obejmują obrazowanie żywych komórek, czytnik mikropłytek fluorescencyjnych i cytometrię przepływową. Stosunkowo szybka kinetyka sygnałów wapniowych (zwykle w ciągu kilku sekund do minut) sprawia, że obrazowanie żywych komórek jest najlepszą metodą uzyskania jak największej ilości informacji o charakterystyce sygnału wapniowego. Oprócz szybkiej kinetyki sygnałów wapniowych (w ciągu milisekund), obrazowanie żywych komórek jest lepszą metodą badania kompartmentalizacji komórkowej sygnalizacji wapniowej w pojedynczej komórce ¹². Bezwzględne stężenia wapnia można obliczyć, określając minimalną i maksymalną fluorescencję wskaźnika wapnia poprzez dodanie odpowiednio chelatora wapnia i przepuszczalnie komórek, jak opisali Grynkiewicz i wsp. ^{Rozdział 11}.

Wykorzystanie cytometrii przepływowej do pomiaru sygnałów wapniowych zostało po raz pierwszy opracowane w latach 80. w komórkach immunologicznych, gdzie możliwość pomiaru wielu parametrów, takich jak integralność błony i separacja populacji komórek, oraz wymóg komórek w zawieszeniu w połączeniu z rozwojem wskaźników wapnia o pojedynczej długości fali sprawiły, że cytometria przepływowa stała się idealną i wygodną metodą wykrywania^13-15. W komórkach przylegających obrazowanie żywych komórek dostarcza najwięcej informacji o sygnalizacji wapniowej, a przede wszystkim o kinetyce, ale wymaga skomplikowanej konfiguracji obejmującej mikroskop fluorescencyjny, system perfuzyjny, utrzymanie środowiska komórkowego, takiego jak temperatura, oraz specjalistyczne oprogramowanie mikroskopowe do pozyskiwania i analizowania danych. Alternatywne metody, takie jak czytnik mikropłytek fluorescencyjnych lub środki farmakologiczne z wykorzystaniem chelatatorów wapnia, są nieporównywalne pod względem uzyskanych informacji. Cytometria przepływowa staje się coraz szerzej stosowana do monitorowania cytozolowego wapnia w przylegających komórkach, chociaż w większości badań wykonuje się tylko pomiary punktu końcowego. Stosując metodę pierwotnie opracowaną przez Gergely'ego i wsp. w immunologicznych komórkach B¹⁶, zmiany stężenia wolnego wapnia w cytozolach za pomocą cytometrii przepływowej z kinetyką w czasie rzeczywistym i monitorowaniem intensywności fluorescencji w poszczególnych komórkach z populacji próbki zostały z powodzeniem zmierzone w komórkach nabłonka raka i hybrydach rakowych komórek macierzystych¹⁷. Metoda ta została następnie zaadaptowana do stosowania w przylegających komórkach nabłonka, które są trudne do obciążenia wskaźnikami wapnia ¹⁸.

Tutaj, używając unieśmiertelnionej przylegającej linii komórek nabłonkowych pochodzących z segmentu S1 kanalika proksymalnego nerki szczura (WKPT-0293 Cl.2)¹⁹, opisujemy zoptymalizowaną uproszczoną metodę pomiaru zmian stężenia wapnia w cytozolu za pomocą cytometrii przepływowej. Ponieważ wiele komórek nabłonkowych posiada szereg organicznych transporterów związków anionowych, obciążenie komórek wskaźnikiem wapnia może okazać się wyzwaniem. Aby zapobiec wypływowi wskaźników wapnia, probenecyd, prototypowy inhibitor transporterów anionów organicznych, pierwotnie opracowany w celu zmniejszenia wydalania penicyliny²⁰ przez nerki, jest stosowany jednocześnie w pożywce inkubacyjnej. Komórki są utrzymywane w monowarstwach w celu obciążenia wskaźnikiem wapnia, wprowadzane do zawiesiny, a sygnały wapniowe mogą być wykrywane natychmiast po dodaniu związku.

Protokół

1. Przygotowanie odczynników i roztworów

1. Przygotować zmodyfikowany zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS) (w mM: 136,9 NaCl, 5,37 KCl, 0,34 Na₂HPO₄, 0,44 KH₂PO₄, 4,17 NaHCO₃, pH 7,2, bez czerwieni fenolowej). Przechowywać w temperaturze 4 °C.
2. Przygotować 1,5 M roztwory podstawowe kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) (pH 7,2) 1,5 M CaCl 2 i 2 M w wodzie destylowanej.
3. Przygotować 250 mM roztwór podstawowy probenecydu. W przypadku postaci wolnego kwasu (często określanej jako nierozpuszczalna w wodzie) rozpuścić probenecyd w proszku w 1 N NaOH, napełnić do trzech czwartych końcowej objętości wodą destylowaną i powoli miareczkować do pH 7,4 za pomocą 1 N HCl. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
4. Rozpuścić przepuszczalny dla membrany fluorescencyjnej barwnik wiążący wapń w bezwodnym dimetylosulfotlenku (DMSO) do stężenia podstawowego 1 mM. Przechowywać w temperaturze -20 °C w ciemności.
5. Przed każdym eksperymentem należy świeżo przygotować bufor topnika HBSS (PHF) zawierający probenecyd, łącząc zmodyfikowany HBSS z (w końcowych stężeniach) 1,5 mM CaCl₂, 10 mM HEPES, pH 7,2, 5% płodową surowicą bydlęcą, 2 mM probenecydem i 5,55 mM glukozy. Ogrzać do 37 °C.

2. Hodowla komórkowa

1. Płytka 2,5 x 10⁵ komórek kanalików proksymalnych nerki (WKPT-0293 Cl.2) na studzienkę 6-dołkowej płytki lub szalki 35 mm w standardowej pożywce hodowlanej i rosną przez 2 dni, osiągając zbieżność około 70%.

3. Ładowanie barwnika wapniowego

1. Dla każdej studzienki lub naczynia wymieszać 1 ml pożywki hodowlanej zawierającej 5% płodowej surowicy bydlęcej, 4 μM przepuszczalny dla komórek barwnik wiążący wapń i 2 mM probenecyd.
2. Zastąpić pożywkę hodowlaną 1 ml mieszaniny barwników do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut w wilgotnym inkubatorze z 5% CO₂ . Przykryj płytkę folią aluminiową, aby zapobiec wybielaniu wskaźnika fluorescencyjnego.

4. Przygotowanie komórek do cytometrii przepływowej

1. Ogrzać 0,05% roztwór kwasu trypsynowo-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) do temperatury 37 °C.
2. Odessać roztwór barwnika obciążającego wapń z każdej studzienki i dodać 1 ml trypsyny wzdłuż ściany studzienki.
3. Inkubować w temperaturze 37 °C aż do odłączenia wszystkich komórek.
4. Przenieść komórki do probówki o pojemności 1,5 ml i osadu, odwirowując w mikrowirówce o masie 10 000 g przez 1 minutę.
5. Ostrożnie zassać supernatant, nie naruszając osadu.
6. Przemyć komórki, dodając 1 ml buforu PHF i zawiesić ponownie, pipetując w górę i w dół.
7. Granulki przez odwirowanie z prędkością 10 000 g przez 1 min.
8. Powtórz kroki 4.6 i 4.7 jeszcze dwa razy.
9. Ponownie zawiesić komórki w końcowej objętości 500 μl buforu PHF i użyć komórek do eksperymentów w ciągu 1 godziny.
10. Opcjonalnie: policz komórki, aby określić stężenie komórek i użyj 5 x 10⁴ – 1 x 10⁵ komórek na pomiar.

5. Konfiguracja cytometru przepływowego

1. Uruchom cytometr przepływowy, otwórz szufladę fluidyki i przestaw przełącznik zaworu odpowietrzającego, aby zwiększyć ciśnienie powietrza w zbiorniku płynu osłonowego.
2. "Zalać" przyrząd, aby usunąć potencjalne pęcherzyki powietrza z wnętrza rurek wewnętrznych i komory przepływowej.
3. W oprogramowaniu do cytometrii przepływowej otwórz dwa okna z wykresem punktowym.
   1. Pierwszy wykres punktowy wymaga światła rozproszonego do przodu (FSC) dla parametru X i światła rozproszonego z boku (SSC) dla parametru Y w celu kontroli jakości komórek w próbce odpowiednio poprzez ich rozmiar i ziarnistość.
   2. Drugi wykres punktowy mierzy intensywność fluorescencji barwnika związanego z wapniem. Wybierz odpowiedni kanał detekcji fluorescencji dla parametru Y za pomocą skali logarytmicznej i czasu w sekundach dla parametru X na skali liniowej.
4. Ustaw natężenie przepływu na "wysokie".

6. Pomiar cytometrii przepływowej

1. Wykonaj pomiary w RT. Do probówki z próbką cytometrii przepływowej (11,5 x 75 mm) dodać 480 μl buforu PHF.
2. Dodaj 20 μl zawiesiny komórkowej i krótko zmieszaj, aby wymieszać.
3. Przesuń ramię podtrzymujące probówkę na bok i umieść probówkę z próbką nad rurką do wstrzykiwania próbki, aż powstanie szczelne uszczelnienie. Przywróć ramię nośne rury do pierwotnej pozycji wyśrodkowanej.
4. Zoptymalizuj pomiar, dostosowując kanał fluorescencji tak, aby średnia intensywność fluorescencji próbki wynosiła około 10² na osi y. Zapisz i wykorzystaj do kolejnych eksperymentów.
5. Aby rozpocząć eksperyment, powtórz kroki od 6.1 do 6.3.
6. Rejestruj fluorescencję wyjściową przez 50 sekund.
7. Wstrzymać pomiar, wyjąć probówkę z próbką, dodać interesujący związek, krótko przetrząsnąć i powrócić do probówki do wstrzykiwania próbki. Ten krok nie powinien zająć więcej niż 15 sekund.
8. Wznów pomiar i kontynuuj przez łącznie 204,8 sek.
9. Do kontroli dodatnich i ujemnych należy użyć jonoforu wapniowego, takiego jak jonomycyna (10 μM), oraz chelatora wapnia, takiego jak kwas tetraoctowy glikolu etylenowego (EGTA), MnCl₂ lub CoCl₂ (2 mM).

7. Analiza danych

1. Analizuj dane za pomocą dedykowanego oprogramowania do cytometrii przepływowej do analizy offline, takiego jak WinMDI (Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry), bezpłatny pakiet oprogramowania opracowany przez Joe Trottera w The Scripps Institute, Flow Cytometry Core Facility.
2. Otwórz wykres punktowy z parametrami SSC i FSC.
3. Wybierz region komórek do analizy za pomocą narzędzia "Regiony" (kliknij obraz prawym przyciskiem myszy), aby wykluczyć martwe komórki lub resztki komórek znajdujące się w lewym dolnym rogu z analizy danych (Rysunek 1).
4. Analiza kwadrantowa (rysunek 2)
   1. Otwórz wykres gęstości z czasem na osi x i intensywnością fluorescencji na osi y. Korzystaj ze wszystkich zdarzeń.
   2. Użyj tego samego regionu bramkowania, co w 7.3.
   3. Określ ilościowo dane za pomocą narzędzia "Kwadrant".
   4. Wyreguluj separatory kwadrantowe tak, aby linia pionowa była umieszczona w momencie dodawania związku, a linia pozioma była umieszczona w środku fluorescencji linii podstawowej w kontrolkach. Upewnij się, że położenie separatorów kwadrantowych jest równe we wszystkich próbkach.
   5. Procent komórek w każdym kwadrancie jest wyświetlany w każdym rogu (Rysunek 2). Porównaj prawy górny kwadrant (UR) między próbkami.
5. Analiza histogramu (rysunek 3)
   1. Otwórz dane kontrolne w oknie histogramu z intensywnością fluorescencji na osi x i zdarzeniami na osi y. Korzystaj ze wszystkich zdarzeń.
   2. Aby uzyskać przegląd obrazowy, dodaj dane testowe, które mają zostać porównane z wykresem kontrolnym, jako wykresy nakładkowe (przejdź do pozycji Plik → Otwórz plik → Wybierz plik → Nakładka).
   3. Do analizy ilościowej należy stosować pojedyncze okna histogramu. Bramka populacji komórek przy użyciu regionu R1 z kroku 7.3.
   4. W kontroli niepoddanej działaniu substancji należy użyć funkcji markera ("Markery") do oznaczenia obszaru do analizy, zaczynając od punktu środkowego między minimalną a maksymalną fluorescencją piku kontrolnego, a kończąc na maksymalnej intensywności fluorescencji. Obliczany jest procent komórek w tym obszarze.
   5. Pobieranie danych z okna statystyk. Powtórz te czynności dla pozostałych plików danych, używając tego samego zaznaczonego obszaru do analizy.
6. Analiza intensywności fluorescencji (ryc. 4)
   1. Otwórz wykres punktowy z czasem na osi x i intensywnością fluorescencji na osi y. Korzystaj ze wszystkich zdarzeń.
   2. Włącz "Tryb kinetyczny" i "Linia kinetyki nakładki". Na wykresie kropkowym pojawi się niebieska linia reprezentująca średnią intensywność fluorescencji.
   3. Określ ilościowo względny napływ wapnia, tworząc wiele prostokątnych obszarów. Każdy region powinien mieć szerokość około "50", co odpowiada "10 sekundom". Zdefiniuj maksymalnie 15 prostokątnych regionów.
   4. Pobierz kwantyfikację z okna statystyk i skopiuj ją do arkusza kalkulacyjnego.
   5. Do analizy należy użyć danych średniej y. Obliczyć średnią od R2 do R6, która odpowiada 20 do 50 sekundom. Jest to wartość bazowa.
   6. Wybierz odpowiedni przedział czasowy do analizy napływu wapnia (w zależności od początku, czasu trwania i intensywności).
   7. Oblicz sygnały wapnia z każdego regionu w tym przedziale czasu w stosunku do średniej wartości podstawowej, czyli sygnału fluorescencji przed dodaniem związku, który jest ustawiony na 100%. Określ średnią i odchylenie standardowe regionów po dodaniu związku; Jest to średni sygnał wapniowy wywoływany przez związek.

Wyniki

Aby zwiększyć stężenie wapnia w cytozolu, do komórek kanalików proksymalnych nerek (WKPT-0293 Cl.2) obciążonych przenikalnym przez błony komórkowe barwnikiem wiążącym wapń, Fluo-3-AM, zastosowano dwa związki farmakologiczne. Nieleczone próbki kontrolne obciążono barwnikiem wiążącym wapń w obecności probenecydu i wymieszano, lecz bez dodawania jakichkolwiek związków. Tapsygargin (TG) jest klasycznym inhibitorem pompy SERCA, co prowadzi do wycieku wapnia z ER i w konsekwencji do wzrostu stężenia wapnia w cytozolu. Tunicamy...

Dyskusja

Wapń jest kluczowym wydarzeniem w wielu procesach komórkowych, działając jako druga cząsteczka sygnałowa przekaźnika, a także jako środek komunikacji między ER a mitochondriami. Możliwość pomiaru zmian w stężeniach wolnego cytozolowego wapnia jest przydatną techniką, która może mieć zastosowanie we wszystkich obszarach biologii komórki. Istnieją różne metody wykrywania cytozolowych sygnałów wapniowych. Klasycznie sygnały z ratiometrycznego wskaźnika wapnia, takiego jak Fura-2, są monitorowane w żywych komórkach za pomocą...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Fluo-3, AM	Invitrogen	F-1241	Przepuszczalność komórek
Probenecyd	Sigma-Aldrich	P-8761	Nierozpuszczalny w wodzie, rozpuszcza się w 1 N NaOH
0,05% Trypsyna-EDTA (1X)	Invitrogen	25300-062
Jonomycyna	Sigma-Aldrich	I9657
Thapsigargin	Tocris Bioscience	1138
Tunicamycin	Sigma-Aldrich	T7765
Cytometr przepływowy FACSCalibur + Oprogramowanie CELLQuest	Becton Dickinson
Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI)	Joe Trotter, The Scripps Institute		Należy pamiętać, że jest to starsza aplikacja 16-bitowa, która odczytuje pliki zgodne z FCS 2.0, ale nie rozpoznaje danych cyfrowych FCS 3.0.
WKPT-0293 Linia komórkowa kanalików proksymalnych nerki szczura Cl.2			Biofizyka, Case Western Reserve University, Cleveland, OH)

Udostępnione przez dr Ulricha Hopfera (Zakład Fizjologii i