Śródmózgowe wstrzyknięcie wirusa do mózgu nowonarodzonego myszy w celu trwałej i rozległej transdukcji neuronalnej

Podsumowanie

Tutaj demonstrujemy technikę rozległej transdukcji neuronalnej poprzez dokomorowe wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem do mózgu noworodka myszy. Metoda ta zapewnia szybki i łatwy sposób na osiągnięcie trwającej całe życie ekspresji transgenów dostarczanych przez wirusa.

Streszczenie

Wraz z szybkim wzrostem postępu naukowego, potrzebne są nowe metody dla eksperymentalnej neuronauki, aby szybko i łatwo manipulować ekspresją genów w mózgu myszy. Tutaj opisujemy technikę wprowadzoną po raz pierwszy przez Passiniego i Wolfe'a do bezpośredniego wewnątrzczaszkowego dostarczania transgenów kodowanych wirusowo do mózgu noworodka myszy. W najbardziej podstawowej formie procedura wymaga jedynie wiadra z lodem i strzykawki o pojemności mikrolitrów. Jednak protokół może być również dostosowany do użytku z ramkami stereotaktycznymi, aby poprawić spójność dla badaczy nowych w tej technice. Metoda opiera się na zdolności wirusa związanego z adenowirusem (AAV) do swobodnego przemieszczania się z komór mózgowych do miąższu mózgu, podczas gdy wyściółka wyściółki jest jeszcze niedojrzała w ciągu pierwszych 12-24 godzin po urodzeniu. Dokomorowe wstrzyknięcie AAV w tym wieku powoduje rozległą transdukcję neuronów w mózgu. Odciąganie rozpoczyna się w ciągu kilku dni po wstrzyknięciu i utrzymuje się przez całe życie zwierzęcia. Miano wirusa można dostosować w celu kontrolowania gęstości transdukowanych neuronów, podczas gdy koekspresja białka fluorescencyjnego zapewnia istotną etykietę transdukowanych komórek. Wraz z rosnącą dostępnością urządzeń do rdzeni wirusowych, które zapewniają zarówno gotowe, wstępnie zapakowane odczynniki, jak i niestandardowe preparaty wirusowe, podejście to oferuje szybką metodę manipulowania ekspresją genów w mózgu myszy, która jest szybka, łatwa i znacznie tańsza niż tradycyjna inżynieria linii zarodkowej.

Wprowadzenie

Tradycyjne metody modyfikacji ekspresji genów neuronalnych wymagają czasochłonnych i kosztownych manipulacji linią zarodkową. Alternatywne metody de novo, takie jak elektroporacja in utero lub stereotaktyczne wstrzyknięcie lentiwirusa, dają szybsze wyniki i są mniej kosztowne, ale mają tę wadę, że wymagają złożonej interwencji chirurgicznej^1-3. Co więcej, ekspresja transgenu ma ograniczony zakres przestrzenny w przypadku tych metod. W niniejszym artykule opisujemy szybką, łatwą i ekonomiczną metodę powszechnej manipulacji neuronami poprzez dokomorowe wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem (AAV) do mózgu noworodka myszy. Metoda została po raz pierwszy opisana przez Johna Wolfe'a i Marco Passiniego w 2001 roku, gdzie zasugerowali, że mały rozmiar cząstek AAV pozwala mu dyfundować w płynie mózgowo-rdzeniowym, gdy przechodzi z komór bocznych przez niedojrzałą barierę wyściordzą i do miąższu mózgu^4,5. Dokomorowe wstrzyknięcie AAV w ciągu pierwszych 24 godzin po urodzeniu powoduje rozległą transdukcję wirusa w podzbiorach nerwowych obejmujących każdy obszar mózgu, od opuszki węchowej do pnia mózgu^6,7. Transgeny dostarczane przez wirusa ulegają ekspresji i są aktywne w ciągu kilku dni od wstrzyknięcia i utrzymują się do roku po transdukcji. Tak więc ta wszechstronna manipulacja umożliwia badania od wczesnego rozwoju mózgu po starzenie się i degenerację u dorosłych.

Dostosowując technikę do naszych specyficznych potrzeb eksperymentalnych, skupiliśmy się przede wszystkim na serotypie AAV8, ponieważ jest on najbardziej efektywny w transdukcji neuronów⁶. Pokazujemy, że miano wirusa można rozcieńczyć w celu kontrolowania gęstości transdukowanych neuronów w eksperymentach testujących wewnętrzne konsekwencje manipulacji genetycznej dla komórek. Ponadto wykazaliśmy, że dwa wirusy mogą być wstrzykiwane jednocześnie w celu wytworzenia wzorców ekspresji, które są stronnicze w kierunku odrębnych lub nakładających się zestawów neuronów, w zależności od serotypów wybranych do pakowania wirusa. Nasza praca rozszerza wszechstronność tej techniki do zastosowania w szerokim zakresie eksperymentalnych warunków neuronauki.

Protokół

Wykonuj wszystkie procedury i protokoły z udziałem zwierząt zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Opisane tutaj procedury zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Baylor College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee.

Niekompetentne wektory wirusa adenologicznego (AAV) do dostarczania transgenu do mózgu gryzoni są zatwierdzone do użytku na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 1. Na stronie CDC można znaleźć publikację rządu USA "Biosafety in Microbiology and Biomedical Laboratories (BMBL)", która zawiera szczegółowe wymagania dotyczące właściwej ochrony i procedur postępowania z wirusami. Skontaktuj się z lokalnymi pracownikami weterynarii i bezpieczeństwa środowiskowego, aby dowiedzieć się, jakie są specyficzne wymagania instytucjonalne dotyczące procedur z wykorzystaniem wirusów. Przepisy dotyczące sal zabiegowych, kwarantanny i identyfikacji klatek stanowiących zagrożenie biologiczne różnią się w zależności od instytucji.

1. Przygotuj szczenięta P0 i matki zastępcze

1. Zapewnij wysokotłuszczową karmę dla wszystkich kobiet w ciąży i karmiących, aby zaspokoić zapotrzebowanie energetyczne w okresie rozrodu i laktacji.
2. Wieczorem ustaw klatkę hodowlaną, dodając jedną lub dwie zdrowe samice do klatki jednego osiadłego samca. Następnego ranka sprawdź, czy samice nie mają korka pasującego i oddziel samice od samców, jeśli jest obecna zatyczka.
   1. Wykorzystaj matki zastępcze do wychowywania młodych z tła genetycznego o słabych cechach matczynych (na przykład C57BL/6 lub C3HeJ). Matki zastępcze przyjmują młode z innego miotu, jeśli przeniesione młode urodziły się w ciągu czterech dni od miotu matki zastępczej.
   2. Ustaw oddzielną klatkę kryciową, używając samic ICR lub FVB wraz z hodowcami doświadczalnymi, tak aby dwie grupy samic rodziły mniej więcej w tym samym czasie.
3. Samice rodzą w ciągu 19 ±1 dni od daty założenia wtyczki, w zależności od szczepu tła. Trzy dni przed porodem (16 dni po dacie zatyczki) umieść ciężarną samicę w czystej klatce ze świeżym materiałem gniazdowym i zadaszonym schronieniem.
4. Sprawdzaj, czy nie ma nowonarodzonych szczeniąt dwa razy dziennie, zaczynając 2 dni przed przewidywaną datą porodu (17 dni po dacie podłączenia do piersi). Zbadaj klatkę przy minimalnym stresie dla matek, zaglądając przez dno pod kątem obecności różowych noworodków. Myszy zazwyczaj rodzą młode rano, ale w rzadkich przypadkach rodzą po południu.
5. Zaplanuj wykonanie zastrzyków, gdy tylko młode zaczną karmić piersią (co będzie widoczne po widocznych plamach mlecznych) lub w ciągu 6 godzin od urodzenia, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej.

2. Przygotuj sprzęt do iniekcji

1. Przygotować strzykawkę o pojemności 10 μl z igłą 32 G dla noworodków z ogólną liczbą P0. W przypadku wstrzykiwania stereotaktycznego należy zamontować strzykawkę na ramieniu manipulatora.
2. W przypadku stosowania ramy stereotaktycznej do wstrzykiwań, należy schłodzić stadium noworodkowe do temperatury 4-8 °C, dodając 100% etanolu i suchego lodu do zbiornika na przednim końcu bloku. Utrzymuj temperaturę powyżej 1 °C, aby uniknąć odmrożeń szczeniąt.

3. Przygotuj rozcieńczenia wirusa do wstrzykiwań

1. Przygotuj 1% roztwór niebieskiego barwnika trypanowego (20x bulion).
2. Przygotować 5-25 μl podwielokrotności zapasu wirusa związanego z adenowirusem (AAV) w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy 2. Umieścić te podwielokrotności w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości. Unikaj dodatkowych cykli zamrażania i rozmrażania, ponieważ powoduje to utratę skuteczności transdukcji wirusa.
3. Wyjąć porcję AAV z zamrażarki o temperaturze -80 °C i umieścić na lodzie do rozmrożenia.
4. Przygotować roztwór wirusa do wstrzykiwań, rozcieńczając wirusa w lodowato zimnym 1x buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (PBS). Zacznij od dziesięciokrotnego seryjnego rozcieńczenia (10¹⁰ do 10⁸ cząstek wirusa/półkulę) w celu wstępnej optymalizacji wzorca transdukcji.
5. Dodaj 20x błękit trypanowy do roztworu AAV do końcowego stężenia 0,05%.

4. Przygotowanie nowonarodzonych szczeniąt do wstrzyknięcia

1. Umieść mały aluminiowy talerz na lodzie, aby ostygł. Umieść suchą chusteczkę na wierzchu talerza, aby chronić skórę szczeniaka przed zimnym metalem. Służy to jako płaska, zimna powierzchnia do znieczulania i wstrzykiwania szczeniąt.
2. Przygotuj podkładkę rozgrzewającą odpowiednią do utrzymywania ciepła u nowonarodzonych myszy przed i po wstrzyknięciu.
3. Gdy nowonarodzone szczenięta zaczną ssać, wyjmij około połowy z nich z klatki, a drugą połowę zostaw z matką. Umieść zebrane młode na podkładce rozgrzewającej w oczekiwaniu na wstrzyknięcie.
   UWAGA: Jeśli biologiczna matka nie opiekuje się młodymi, należy natychmiast usunąć cały miot z klatki i umieścić młode na podkładce rozgrzewającej, aby czekały na wstrzyknięcie. Taka sytuacja może mieć miejsce w przypadku pierwszego miotu urodzonego przez samice C57BL/6 lub w przypadku innych szczepów wsobnych, które mają słabe cechy hodowlane. W takiej sytuacji plamy mleczne nie będą widoczne u nowonarodzonych szczeniąt.
4. Przenieś jedno szczenię z podkładki rozgrzewającej na zimną metalową płytkę, aby wywołać znieczulenie hipotermią. Odczekaj 2-3 minuty, aż szczenię zostanie w pełni znieczulone. Potwierdź znieczulenie, bardzo delikatnie ściskając łapę i monitoruj brak ruchu lub oddychania.

5. Wstrzyknięcie AAV noworodkom myszy

1. Wstrzyknięcie wewnątrzczaszkowe AAV z wolnej ręki noworodkom myszy:
   1. Do strzykawki iniekcyjnej załadować 5 μl rozcieńczonego AAV z 0,05% błękitem trypanowym.
   2. Delikatnie przetrzyj głowę znieczulonego szczeniaka wacikiem nasączonym 70% etanolem.
   3. Zidentyfikować miejsca wstrzyknięć w odległości 2/5 odległości od szwu lambda do każdego oka. Alternatywne miejsce wstrzyknięcia znajduje się około 0,8-1 mm z boku szwu strzałkowego, w połowie drogi między lambdą a bregmą. Te punkty orientacyjne są widoczne przez skórę w punkcie P0.
   4. Oznaczyć miejsce wstrzyknięcia nietoksycznym pisakiem laboratoryjnym.
   5. Trzymać strzykawkę z widoczną skalą do monitorowania objętości dozowanego roztworu.
   6. Upewnij się, że kciuk może sięgać górnej części tłoka. Następnie zdjąć kciuk z tłoka, jednocześnie ustawiając igłę, aby uniknąć przypadkowego dozowania wirusa.
   7. Znajdź wygodną pozycję do podparcia ramienia do wstrzyknięcia, kładąc łokieć na ławce i opierając rękę o wiadro z lodem.
   8. Połóż szczeniaka na boku z głową bezpośrednio pod strzykawką. Obróć głowę szczeniaka tak, aby zaznaczone miejsce wstrzyknięcia było skierowane do góry i delikatnie, ale stanowczo przytrzymaj tę pozycję otwartą dłonią.
   9. Trzymać strzykawkę prostopadle do powierzchni czaszki i wprowadzić igłę w zaznaczone miejsce wstrzyknięcia na głębokość około 3 mm. Wstrzykiwać igłę do momentu, gdy opór nieznacznie się zmniejszy, co oznacza, że igła wniknęła do komory bocznej. Jeśli potrzebne jest odniesienie, zaznacz 3 mm od końcówki igły nietoksycznym maszynką. Dostosuj głębokość iniekcji do wielkości i szczepu potomstwa w oparciu o ukierunkowanie barwnika na komory.
   10. Trzymać strzykawkę sztywno, tak aby można było wcisnąć tłok bez wsuwania igły głębiej w mózg. Jeśli wstrzyknięcie zostanie przemieszczone do wzgórza, rozprzestrzenianie się wirusa będzie poważnie ograniczone.
   11. Rozpocząć powolne wstrzykiwanie wirusa, monitorując objętość dozowaną ze strzykawki. Do każdej komory należy podać maksymalną objętość 2 μl. Jeśli igła znajduje się we właściwej pozycji, barwnik rozprzestrzeni się, wypełniając komorę.
   12. Powoli wyjmować igłę.
   13. Poczekaj, aż pierwsze miejsce wstrzyknięcia zamknie się przed wstrzyknięciem drugiej półkuli.
       UWAGA: Nie należy wstrzykiwać tego samego miejsca więcej niż raz. Ponowne włożenie igły zmusza do wycieku wirusa, który został już wstrzyknięty, i powoduje obrażenia lub śmierć szczeniaka.
   14. Wstrzyknąć do przeciwległej komory, stosując tę samą procedurę.
2. Stereotaktyczne wstrzyknięcie AAV noworodkom myszy:
   1. Załadować 5 μl rozcieńczonego AAV z 0,05% błękitem trypanowym do strzykawki iniekcyjnej trzymanej przez manipulator stereotaktyczny.
   2. Delikatnie umieść głowę szczeniaka między nausznikami ramy noworodka. Upewnij się, że głowica jest wypoziomowana w osi Y (od przodu do tyłu), sprawdzając, czy linia między lambdą a bregmą jest równoległa do stage. Upewnij się, że głowa jest wypoziomowana w osi X (z boku na bok), sprawdzając, czy wyobrażona linia między uszami lub linia między oczami jest równoległa do sceny.
   3. Delikatnie przetrzyj głowę znieczulonego szczeniaka bawełnianym wacikiem nasączonym 70% etanolem.
   4. Użyj manipulatora stereotaktycznego, aby ustawić strzykawkę powyżej lambda, a następnie wyzeruj współrzędne X i Y. Przesuń ramiona stereotaktyczne na (X, Y) = (0,8, 1,5) mm dla standardowych P0 pups.
      UWAGA: Wielkość szczeniaka i współrzędne stereotaktyczne mogą się różnić w zależności od odmiany i wieku. Dostosuj współrzędne na podstawie wstrzyknięć barwnika w razie potrzeby, aby celować w komory boczne.
   5. Powoli opuścić igłę w miejscu wstrzyknięcia. Powierzchnia czaszki wgnieci się, a następnie zwolni, gdy igła wbije się w skórę. Wycofać igłę, aż czaszka odzyska swój normalny wklęsły kształt, ale należy utrzymać skos igły pod skórą. Wyzeruj współrzędną Z w tym punkcie.
   6. Włożyć igłę do Z = -1,7 mm, a następnie wycofać do -1,5 mm.
   7. Powoli wstrzyknij wirusa. Każda półkula może przyjąć do 2 μl roztworu.
   8. Trzymać strzykawkę na miejscu przez 30-60 sekund po zakończeniu wstrzyknięcia, a następnie powoli wycofywać igłę przez 1-2 minuty.
   9. Powtórzyć te czynności dla przeciwległej półkuli, używając ujemnych współrzędnych w osi X dla miejsca wstrzyknięcia.
      UWAGA: Alternatywne współrzędne dla iniekcji to (X, Y, Z) = (0,8, 2,0, -1,5) mm i (1,2, 1,0, -1,5) mm. Pierwsze wstrzyknięcie należy wykonać przy (0,8, 2,0), następnie przejść do (0,8, -2,0), (1,2, 1,0) i na końcu (1,2, -1,0). Wstrzyknąć 1 μl roztworu w każde miejsce, w sumie 2 μl na półkulę. Szybko przechodź między wstrzyknięciami, aby zakończyć zabieg w czasie krótszym niż 10 minut.

6. Opieka po wstrzyknięciu

1. Po zakończeniu wstrzykiwań do obu półkul, umieść szczenię z powrotem na podkładce rozgrzewającej, aż temperatura jego ciała i kolor skóry powrócą do normy, a szczenię zacznie się poruszać.
2. Jeśli używasz biologicznej matki do karmienia noworodków, którym wstrzyknięto, zwróć wstrzyknięte młode do biologicznej matki po tym, jak odzyskają normalne ruchy. Umieść pozostałe niewstrzyknięte szczenięta na podkładce rozgrzewającej. Powtarzaj procedurę, aż wszystkie myszy zostaną wstrzyknięte.
3. Jeśli korzystasz z usług matki zastępczej do karmienia noworodków, którym wstrzyknięto, przenieś wszystkie wstrzyknięte szczenięta do matki zastępczej w celu opieki po powrocie do normalnego ruchu.
   1. Usunąć z klatki większość lub wszystkie szczenięta należące do matki zastępczej, aby zapewnić powodzenie zwierzętom, którym wstrzyknięto
   implant.
   2. Jeśli szczenięta matki zastępczej i szczenięta, którym wstrzyknięto zastrzyk, mają ten sam kolor oczu i skóry, oznacz szczenięta matki zastępczej długopisem laboratoryjnym, aby można je było później odróżnić.
   3. Umieść szczenięta matki zastępczej i część ich ściółki razem z wstrzykniętymi szczeniętami. Upewnij się, że wstrzyknięte szczenięta nabiorą zapachu swojego biologicznego potomstwa, aby poprawić akceptację nowych szczeniąt.
   4. Umieść tylko młode, którym wstrzyknięto się z powrotem w klatce matki zastępczej. Usuń wszystkie pozostałe szczenięta od przybranej matki.
4. Upewnij się, że matka opiekuje się i karmi młode, którym wstrzyknięto zastrzyk, w ciągu 10 minut od umieszczenia ich w klatce. Jeśli matka nie odbierze szczeniąt w tym czasie, przenieś je do innej matki zastępczej.
5. Oznacz klatkę kartą zagrożenia biologicznego, aby pokazać, że zawiera zwierzęta, którym wstrzyknięto wirusa. Umieść klatkę w zatwierdzonym miejscu przez 72 godziny.
6. Po 72-godzinnym okresie kwarantanny przenieś matkę i młode (ale bez ściółki lub innych przedmiotów z klatki) do czystej klatki. Wykonaj ten transfer w komorze bezpieczeństwa biologicznego poziomu 2, aby uniknąć narażenia na jakąkolwiek ściółkę skażoną wirusem. Zwróć czystą klatkę z wstrzykniętymi zwierzętami do zwykłego obiektu dla myszy.
7. Umieść brudną klatkę w torbie na wypadek zagrożenia biologicznego, wysterylizuj w autoklawie, a następnie zwróć klatkę do wiwarium.

7. Sprzątanie

1. Umieścić pozostały roztwór wirusa w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości. Wirus zachowuje zdolność transdukcji przez co najmniej 2 miesiące, gdy jest przechowywany w temperaturze 4 °C⁸.
2. Zdezynfekować igłę i strzykawkę 2% wybielaczem, a następnie kilkakrotnie spłukać w wodzie dejonizowanej.
3. Oczyść obszar roboczy 2% wybielaczem, a następnie 70% etanolem.
4. Zbierz wszystkie jednorazowe przedmioty, w tym końcówki do pipet, probówki, maskę i rękawiczki, w plastikowej torbie na wypadek zagrożenia biologicznego. Materiały odpadowe należy utylizować zgodnie z lokalnymi przepisami i politykami instytucjonalnymi (np. autoklawować lub spalać).

8. Przygotowanie mózgów myszy do obrazowania

1. Umieść wstrzykniętą mysz w komorze eutanazji dwutlenku węgla po 3-4 tygodniach od wstrzyknięcia. Postępuj zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi prawidłowych procedur eutanazji. Nie należy perfuzjować zwierząt paraformaldehydem, ponieważ spowoduje to wygaszenie etykiety fluorescencyjnej.
2. Usunąć cały mózg z czaszki i utrwalić na 3-12 godzin w 4% paraformaldehydzie w PBS w temperaturze 4 °C.
3. Przenieś unieruchomiony mózg do 30% sacharozy w celu krioprotekcji. Inkubować w temperaturze 4 °C, aż mózg opadnie na dno.
4. Zbierz wiadro drobno pokruszonego suchego lodu. Przetnij mózg na pół wzdłuż linii środkowej. Zakop połówki mózgu w suchym lodzie, aby zamarzły.
5. Schłodzić etap mikrotomu, dodając suchy lód i 100% etanol.
6. Przymocuj mózg do sceny linią środkową w dół za pomocą PBS i pozostaw do zamrożenia.
7. Przekrój przez mózg o grubości 30-45 μm za pomocą mikrotomu zamrażająco-przesuwnego.
8. Umieścić skrawki w 24-dołkowych płytkach zawierających roztwór przeciw zamarzaniu (250 ml glicerolu, 300 ml glikolu etylenowego, 500 ml 0,1 M buforu fosforanowego, pH 7,4). Przykryj płyty folią aluminiową i przechowuj w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości.
9. Zbierz skrawki z 1-4 dołków i umyj 3x w PBS.
10. Zamontuj sekcje na szkiełkach mikroskopowych i szkiełku nakrywkowym. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia w ciemnym miejscu.
11. Obraz jest przesuwany przy użyciu odpowiednich filtrów dla natywnego YFP lub tdTomato, aby sprawdzić wzorzec transdukcji wirusa.

Wyniki

Skuteczna dostraszczylna iniekcja wirusowa zapewnia rozległą i silną ekspresję neuronalną. W niniejszej pracy oceniliśmy transdukcję wirusową przy użyciu fluorescencyjnych genów YFP lub tdTomato pod kontrolą promotora kurzej beta-aktyny (promotor CBA). Konstrukty te zostały zapakowane do AAV8 i wstrzyknięte do komór bocznych noworodków myszy ICR (P0). Wysokie miana wirusa (10¹⁰ cząsteczek na półkulę) doprowadziły do gęstego znakowania cebulki węchowej, prążkowia, kory mózgowej, hipokampa i móżdżku (Rys...

Dyskusja

Opisaliśmy wszechstronną procedurę manipulowania ekspresją genów neuronalnych przy użyciu AAV jako nośnika do powszechnego dostarczania do mózgu noworodków myszy. W porównaniu z innymi metodami transgenezy neuronalnej, takimi jak elektroporacja in^utero1 lub stereotaktyczne wstrzyknięcie wewnątrzczaszkowe^2,3, iniekcja wirusa u noworodków jest stosunkowo łatwa i prosta. Podstawową procedurę można wykonać w ciągu kilku minut za pomocą tylko wiadra z lodem i strzykawki o pojemności mikrolitrów. Optymaln...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Myszy niekrewniacze ICR	Harlan	Hsd:ICR (CD-1)	Ten szczep jest również znany jako
myszy wsobne CD-1 FVB	The Jackson Laboratory	1800	w wieku 5-6 tygodni
Nestlets	Lab Supply	NESTLETS
Shepherd shacks	Lab Supply	SS-mouse
Wysokotłuszczowa karma dla gryzoni	Purina Mills	PicoLab Mouse diet 20, #5058	To jest nasza standardowa karma hodowlana
Wysokotłuszczowa karma dla gryzoni (alternatywa)	Harlan Laboratories	Teklad Global 19% białkowa dieta dla gryzoni #2019S	Jeśli niski poziom fitoestrogenów, potrzebna jest dieta autoklawowalna
Strzykawka do wstrzykiwań	Hamilton	7653-01	Strzykawka 10 ml
Igły iniekcyjne	Hamilton	7803-04, RN 6PK PT4, 0,375"	32 G, do standardowych iniekcji P0
Metalowa płytka do krioanezjozyjność	McMaster Carr	8975K439	Surowa płyta aluminiowa, 6 "x 12", 0,25 cala, będzie musiała zostać pocięta na 3 równe części, a krawędzie przeszlifowane przez lokalny warsztat mechaniczny
Urządzenie stereotaktyczne dla małych zwierząt z cyfrowym odczytem	David Kopf Instruments	Model 940
Uniwersalny uchwyt na strzykawkę ze stopką podporową	igły David Kopf Instruments	Model 1772-F1
Rama dla noworodków	Stoelting	51625	Oficjalnie nazywana adaptacją myszy i noworodka szczura
Worki na utylizację zagrożeń biologicznych ze sterylnym wskaźnikiem	VWR	14220-030	Ważne! – Skontaktuj się z lokalnymi weterynarzami i personelem ds. bezpieczeństwa środowiska, aby dowiedzieć się więcej o swoim instytucie" Protokół usuwania odpadów stwarzających zagrożenie biologiczne