Korzystając z mikromacierzy białkowych zawierających prawie cały proteom S. cerevisiae, sonduje się szybkie, bezstronne badanie tysięcy równoległych interakcji białko-białko. Metoda ta może być stosowana do małych cząsteczek białek, modyfikacji potranslacyjnych i innych testów o wysokiej przepustowości.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Sondowanie funkcjonalnych mikromacierzy białkowych o dużej gęstości w celu wykrycia interakcji białko-białko
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mikromacierze funkcjonalnych białek o dużej gęstości zawierające ~4,200 rekombinowanych białek drożdży są badane pod kątem interakcji białko-białko kinazy kinazy za pomocą powinowactwa oczyszczonego białka fuzyjnego kinazy drożdżowej zawierającego znacznik V5-epitopu do odczytu. Oczyszczoną kinazę uzyskuje się poprzez hodowlę szczepu drożdży zoptymalizowanego pod kątem produkcji białek o wysokiej kopii zawierającego plazmid zawierający konstrukt fuzyjny kinazy-V5 pod indukowanym promotorem GAL. Drożdże są hodowane w restrykcyjnych pożywkach z neutralnym źródłem węgla przez 6 godzin, a następnie następuje indukcja z 2% galaktozą. Następnie zbiera się kulturę, a kinazę oczyszcza się przy użyciu standardowych technik chromatograficznych powinowactwa w celu uzyskania wysoce oczyszczonej kinazy białkowej do wykorzystania w teście. Oczyszczoną kinazę rozcieńcza się buforem kinazy do odpowiedniego zakresu dla testu, a mikromacierze białkowe są blokowane przed hybrydyzacją z mikromacierzą białkową. Po hybrydyzacji macierze są badane przeciwciałem monoklonalnym V5 w celu identyfikacji białek związanych przez białko kinazy-V5. Na koniec macierze są skanowane za pomocą standardowego skanera mikromacierzy, a dane są ekstrahowane do dalszej analizy informatycznej1,2 w celu określenia zestawu interakcji białkowych o wysokim poziomie ufności do dalszej walidacji in vivo.
Wprowadzenie
Potrzeba przeprowadzenia globalnych analiz biochemii białek i aktywności wiązania in vivo zaowocowała opracowaniem nowych metod profilowania interakcji białko-białko (PPI) i potranslacyjnych modyfikacji całych proteomów1,3-8. Mikromacierze białkowe są wytwarzane jako funkcjonalne mikromacierze białkowe przy użyciu pełnowymiarowych białek funkcjonalnych4-6,8,9 lub analitycznych mikromacierzy białkowych zawierających przeciwciała10,11. Zostały one zaprojektowane tak, aby zawierały białka o dużej gęstości ułożone na szkiełkach mikroskopowych o różnych składnikach chemicznych powierzchni, aby ułatwić różnorodne warunki eksperyment....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie sondy
- Hodowla i oczyszczanie sond kinazy fuzyjnej V5 używanych do badania interakcji z innymi białkami w następujący sposób:
- Użyj świeżo prążkowanego szczepu drożdży Y258 (MATa pep4-3, his4-580, ura3-53, leu2-3,112) zawierającego białko fuzyjne V5 (wyrażone z wektora GATEWAY pYES-DEST52). Użyj wyizolowanego białka jako sondy na mikromacierzach. Drożdże należy umieścić na syntetycznym kompletnym uracylu (Sc-Ura)/2% dekstrozie/agarze i hodować w temperaturze 30 °C przez 3 dni z zamrożonej kultury (-80 °C glicerolu).
- Zaszczepić kultury starterowe (5–20 ml) z pojedynczej kolonii i hodować przez noc w Sc-Ura/2% dekstrozie....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aktywność oddziaływań białko-białko obserwowano przy użyciu standardowego czytnika chipów w celu oceny konstruktu fuzyjnego kinazy białkowej Tda1-V5 jako białka przynęci w odniesieniu do funkcjonalnej mikromacierzy białek drożdżowych zawierającej około 4200 unikalnych białek fuzyjnych GST S. cerevisiae. Dalsza analiza z wykorzystaniem oprogramowania Genepix ujawniła liczne zdarzenia wiązania o różnym natężeniu. Powinowactwo oceniano na podstawie stopniowanego natężenia sygnału pochodzącego od przeciwciała monokl.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiony protokół został pierwotnie przeprowadzony przy użyciu 85 unikalnych białek fuzyjnych kinazy białkowej drożdży-V5 w celu porównania aktywności wiązania w różnych i pokrewnych rodzinach kinaz białkowych drożdży, co zaowocowało identyfikacją nowych sieci interakcji kinaz in vivo1. Jako nowa technologia profilowania proteomicznego, opracowanie wysokoprzepustowych (HTP) badań przesiewowych proteomów przy użyciu mikromacierzy białkowych opierało się na bibliotekach peptydów oraz eukariotycznyc.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez grant z NIH. Testy pokazane na rysunku 1 zostały przeprowadzone przez dr Josepha Fasolo. Dziękujemy dr Rui Chen za pomocne komentarze.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Szalki Petriego | VWR | NC-10747 | lub porównywalne |
| Ekstrakt z drożdży baktonowych | Difco | 0217-17 | |
| Pepton baktonowy | Difco | 0118-17 | |
| Agar baktonowy | Difco | 0140-01 | |
| Dekstroza | Sigma | D9434 | |
| rafinoza | Sigma | R0514 | |
| Galaktoza | Sigma | G0750 | |
| Sc-Ura Probówka odpadowa | MP Bio | 114410622 | |
| Małe probówki do hodowli VWR | /Fisher | ||
| Duża kolba Erlenmeyera | VWR/Fisher | ||
| Wirówka JA-10 z wirnikiem | |||
| Probówki wirówkowe (500 ml) | |||
| Probówka Falcon (50 ml) | VWR/Fisher | 21008-951 | |
| Tabletki PBS | Sigma | P4417 | |
| Probówki FastPrep (tubka z nakrętką 2 ml) | |||
| FastPrep Machine | MP Biomedicals | 116004500 | |
| Koraliki cyrkonowe | BioSpec | 11079105 | |
| Triton X100 | Sigma | P4417 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| Imidazol (pH = 7,4) | Sigma | I5513 | |
| PMSF | Sigma | 93482 | |
| Kompletny koktajl inhibitorów (bez EDTA) | Roche | 11873580001 | |
| Koktajl inhibitorów fosfatazy 1 | sigma | P2850 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| ATP | Sigma | A1852 | |
| Inkubator z wytrząsaniem (30 & C) | |||
| Niklowa żywica powinowactwa | Technologies | R901-01 | |
| G25 kolumna | GE nauki przyrodnicze | 27-5325-01 | |
| Nutator | VWR/Fisher | ||
| SDS-PAGE Żel (NuPage) | Life Technologies | ||
| Coomassie Blue Stain | Life Technologies | ||
| Przeciwciało monoklonalne V5 | Technologie życia | R960-25 | |
| Alexa647 Tagged Przeciwciało monoklonalne V5 | Technologie życia | 451098 | |
| Mikromacierze białkowe Kit | Life Technologies | PAH0525013 | |
| Genepix Scanner | Molecular Devices | ||
| Lifter Slips | Thomas Scientific | http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/ | |
| Bufor do lizy: 0,1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM imidazol (pH 7,4), Kompletny koktajl inhibitorów proteazy – Wolny od EDTA, Inhibitor fosfatazy Koktajl 1, 1 mM PMSF (dodać tuż przed użyciem) | Dodaj odczynniki do 1x PBS (0,01 M bufor fosforanowy, 0,0027 M chlorek potasu, 0,137 M chlorek sodu; pH 7,4), aby uzyskać pożądaną objętość roztworu do lizy | ||
| Bufor blokujący: 1% albumina surowicy bydlęcej (BSA), 0,1% Tween-20 | Dodaj odczynniki do 1x PBS, aby uzyskać żądaną objętość buforu | ||
| blokującegoBufor sondy: 2 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 0,05% Triton X-100, 50 mM NaCl, 500 μ M ATP (dla kinaz), 1% BSA | Dodaj odczynnik do 1x PBS, aby uzyskać żądaną objętość buforu sondy | ||
| Bufor do płukania: 0,1% Triton X-100, 500 mM NaCl, 0,5 mM DTT, 50 mM imidazol (pH 7,4), 2 mM MgCl2 | odczynnik do 1x PBS, aby uzyskać żądaną objętość bufora | ||
| sondyBufor elucyjny: 0,1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 – 500 mM imidazol (pH 7,4), Kompletny koktajl inhibitorów proteazy – Bez EDTA, inhibitor fosfatazy Koktajl 1, 1 mM PMSF (dodać tuż przed użyciem) | Zanim zaczniesz, ważne jest, aby zwrócić uwagę na gradient stężenia imidazolu (50 – 500 mM) i utworzyć osobne probówki dla każdego stężenia (zaleca się tworzenie przedziału w odstępach co 50 mM). Dodaj odczynnik do 1x PBS, aby uzyskać żądaną objętość buforu sondy | ||
| 3x YEP +6% galaktozy: Rozpuść 30 g ekstraktu drożdżowego i 60 g peptonu w 700 ml H2O i autoklaw. Dodać 300 ml filtra wysterylizowanego 20% galaktozy (wt/vol) | Galaktozy nie należy sterylizować w autoklawie |
Bibliografia
- Fasolo, J., et al. Diverse protein kinase interactions identified by protein microarrays reveal novel connections between cellular processes. Genes. 25, 767-778 (2011).
- Zhu, X., Gerstein, M., Snyder, M. ProCAT: a data analysis approac....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
