Artykuł metodologiczny

Sondowanie funkcjonalnych mikromacierzy białkowych o dużej gęstości w celu wykrycia interakcji białko-białko

7.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51872

⸱

2 sierpnia 2015

 ,  , 
1Department of Genetics, Stanford University, 2Stanford Center for Genomics and Personalized Medicine, Stanford University

W tym artykule

Podsumowanie

Korzystając z mikromacierzy białkowych zawierających prawie cały proteom S. cerevisiae, sonduje się szybkie, bezstronne badanie tysięcy równoległych interakcji białko-białko. Metoda ta może być stosowana do małych cząsteczek białek, modyfikacji potranslacyjnych i innych testów o wysokiej przepustowości.

Streszczenie

Mikromacierze funkcjonalnych białek o dużej gęstości zawierające ~4,200 rekombinowanych białek drożdży są badane pod kątem interakcji białko-białko kinazy kinazy za pomocą powinowactwa oczyszczonego białka fuzyjnego kinazy drożdżowej zawierającego znacznik V5-epitopu do odczytu. Oczyszczoną kinazę uzyskuje się poprzez hodowlę szczepu drożdży zoptymalizowanego pod kątem produkcji białek o wysokiej kopii zawierającego plazmid zawierający konstrukt fuzyjny kinazy-V5 pod indukowanym promotorem GAL. Drożdże są hodowane w restrykcyjnych pożywkach z neutralnym źródłem węgla przez 6 godzin, a następnie następuje indukcja z 2% galaktozą. Następnie zbiera się kulturę, a kinazę oczyszcza się przy użyciu standardowych technik chromatograficznych powinowactwa w celu uzyskania wysoce oczyszczonej kinazy białkowej do wykorzystania w teście. Oczyszczoną kinazę rozcieńcza się buforem kinazy do odpowiedniego zakresu dla testu, a mikromacierze białkowe są blokowane przed hybrydyzacją z mikromacierzą białkową. Po hybrydyzacji macierze są badane przeciwciałem monoklonalnym V5 w celu identyfikacji białek związanych przez białko kinazy-V5. Na koniec macierze są skanowane za pomocą standardowego skanera mikromacierzy, a dane są ekstrahowane do dalszej analizy informatycznej1,2 w celu określenia zestawu interakcji białkowych o wysokim poziomie ufności do dalszej walidacji in vivo.

Wprowadzenie

Potrzeba przeprowadzenia globalnych analiz biochemii białek i aktywności wiązania in vivo zaowocowała opracowaniem nowych metod profilowania interakcji białko-białko (PPI) i potranslacyjnych modyfikacji całych proteomów1,3-8. Mikromacierze białkowe są wytwarzane jako funkcjonalne mikromacierze białkowe przy użyciu pełnowymiarowych białek funkcjonalnych4-6,8,9 lub analitycznych mikromacierzy białkowych zawierających przeciwciała10,11. Zostały one zaprojektowane tak, aby zawierały białka o dużej gęstości ułożone na szkiełkach mikroskopowych o różnych składnikach chemicznych powierzchni, aby ułatwić różnorodne warunki eksperymentalne wymagane do przeprowadzania szeroko zakrojonych analiz biochemicznych12. Chemia powierzchni nitrocelulozy i aldehydu do przyłączania chemicznego za pomocą metod przyłączania lizyny lub powinowactwa, takich jak szkiełka chelatowane niklem do przyłączania białek znakowanych Hisem i glutation do przyłączania powinowactwa między innymi13.

Użycie funkcjonalnych mikromacierzy białkowych do wykrywania interakcji białko-białko wymaga dostępu do wysokiej jakości biblioteki funkcjonalnych białek14. S. cerevisiae jest podatny na stworzenie takiej biblioteki poprzez połączenie konstruktów białkowych znakowanych o wysokim powinowactwie z wysokoprzepustowymi technikami oczyszczania chromatograficznego. Zdecydowana większość genomu drożdży została zsekwencjonowana i prawie cały proteom może być wyrażony z plazmidu o wysokiej kopii w celu oczyszczania i analiz biochemicznych12. Po uzyskaniu białek i ułożeniu ich w formacie 384-dołkowym, są one drukowane na szkiełku mikroskopowym, co pozwala na szybką równoległą wieloparametryczną analizę biochemiczną i badanie bioinformatyczne8,14-16. Mikromacierze białkowe są wykorzystywane między innymi do testów enzymatycznych i interakcji z białkami, lipidami, małymi cząsteczkami i kwasami nukleinowymi. Dostępność białek na powierzchni macierzy proteomu sprawia, że są one podatne na różne rodzaje detekcji analitycznej, w tym powinowactwo immunologiczne, powierzchniowy rezonans plazmonowy, fluorescencję i wiele innych technik. Co więcej, pozwala na precyzyjną kontrolę warunków eksperymentalnych, w których może to być trudne do wykonania in vivo.

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie właściwego wykorzystania funkcjonalnych mikromacierzy białkowych do wykrywania interakcji białko-białko. Aplikacja ta umożliwia wysokoprzepustową, równoległą analizę biochemiczną aktywności wiązania białek przy użyciu wysoce oczyszczonego analitu (białka) będącego przedmiotem zainteresowania. Białko przynęty V5-fuzyjnej oznaczone C-końcem (karboksylowo-końcowym) jest wytwarzane z plazmidu o wysokiej kopii w szczepie drożdży zoptymalizowanym pod kątem oczyszczania białka. Znakowanie C-końca zapewnia, że białko o pełnej długości zostało przetranslowane. Białkiem użytym w tym badaniu jest kinaza białka fuzyjnego Tda1-V5, która jest oczyszczana przy użyciu żywicy o powinowactwie do niklu za pomocą znacznika His6X. Konstrukt fuzyjny Tda1-V5 jest oczyszczany przez seryjną elucję przy użyciu gradientu imidazolu w celu wymycia najbardziej wzbogaconej frakcji do zastosowania w teście.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie sondy

  1. Hodowla i oczyszczanie sond kinazy fuzyjnej V5 używanych do badania interakcji z innymi białkami w następujący sposób:
    1. Użyj świeżo prążkowanego szczepu drożdży Y258 (MATa pep4-3, his4-580, ura3-53, leu2-3,112) zawierającego białko fuzyjne V5 (wyrażone z wektora GATEWAY pYES-DEST52). Użyj wyizolowanego białka jako sondy na mikromacierzach. Drożdże należy umieścić na syntetycznym kompletnym uracylu (Sc-Ura)/2% dekstrozie/agarze i hodować w temperaturze 30 °C przez 3 dni z zamrożonej kultury (-80 °C glicerolu).
    2. Zaszczepić kultury starterowe (5–20 ml) z pojedynczej kolonii i hodować przez noc w Sc-Ura/2% dekstrozie na platformie otrząsającej (220-250 obr./min) lub na kole w temperaturze 30 °C.
    3. Następnego ranka zaszczepić 400 ml kultury rafinozy Sc-Ura/2% z wystarczającą ilością kultury starterowej do końcowego OD600 0,1.
    4. Hodować inokulum do OD600 0,6, a następnie indukować galaktozę ekspresji konstruktu fuzyjnego kinazy V5 poprzez dodanie roztworu 3x ekstraktu drożdżowego / peptonu (YEP) uzupełnionego 6% galaktozą, dodając tyle, aby rozcieńczyć pożywkę indukcyjną przez współczynnik 3, tak aby końcowe stężenie galaktozy wynosiło 2%.
    5. Indukować komórki w temperaturze 30 °C przez 6 godzin na platformie wstrząsającej. Użyj kolby Erlenmeyera o pojemności 2 litrów, aby zapewnić odpowiednie napowietrzenie.
    6. Zbierać komórki za pomocą rotora JA-10 (lub podobnego), obracając 400 ml zawiesiny komórek o sile 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    7. Przemyć komórki raz 50 ml lodowatego buforu PBS i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Ponownie umyć osad w lodowatym buforze PBS (bez detergentów lub innych dodatków) używanym do lizy i przenieść do probówek zatrzaskowych o pojemności 2 ml w celu lizy.
    8. Wirować komórki w temperaturze 20 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C do postaci osadu i odpipetować bufor.
    9. Umieść probówki na lodzie i kontynuuj etap lizy.
    10. Poddać komórki lizie (250-350 μl osadu) za pomocą kulek cyrkonu o średnicy 0,5 mm w objętości 1:1:1 osadu komórkowego, kulek i buforu do lizy z buforem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i wirować mieszaninę za pomocą platformy mieszającej 3 razy w odstępach 2-minutowych w temperaturze 4 °C.
    11. Odwirować lizat w sile 20 000 x g w stołowym mikrofugowaniu przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    12. Odpipetować supernatant do wysokoobrotowej probówki wirówkowej z poliwęglanu i sklarować przez odwirowanie przez 30 minut przy 150 000 x g w temperaturze 4 °C.
    13. Przenieść oczyszczony lizat do probówki zawierającej wstępnie przemytą żywicę powinowactwa do Ni2+ (~100 μl) i inkubować na nutatorze przez 2 godziny w temperaturze 4 °C w celu wychwycenia białka fuzyjnego V5 znakowanego histydyną(His)6X.
    14. Płukać żywicę trzy razy przez 10 minut w temperaturze 4 °C za pomocą buforu do mycia. Granulować żywicę za pomocą wirówki stołowej przez 5 minut w temperaturze 1 000 x g w temperaturze 4 °C i zassać supernatant. Dodaj świeży bufor do płukania do każdego prania i zwróć rurkę do nutatora w celu wymieszania podczas prania.
    15. Po zakończeniu etapów mycia nałóż umytą żywicę na świeżą kolumnę G-25 w celu elucji.
    16. Stopniowo nanosić 25 μl buforu elucyjnego, zaczynając od 100 mM imidazolu do 500 mM imidazolu w odstępach co 50 mM, co daje łącznie 9 frakcji.
    17. Oznaczyć zebrane frakcje za pomocą żelu poliakryloamidowego z dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) i barwienia coomassie w celu zidentyfikowania najbardziej wzbogaconej frakcji (frakcji) do użycia w teście, a następnie dodać glicerol do 30% i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu wykorzystania w teście.

2. Sondowanie tablic

UWAGA: Proszę zapoznać się z krokiem 2.6 tej sekcji, aby przygotować roztwór przeciwciała przed rozpoczęciem testu.

  1. Aby wykryć interakcje, rozcieńczyć przeciwciało sprzężone z V5-fluoroforem (tj. AlexaFluor 647 ) do 260 ng/ml w buforze sondy i dokładnie wymieszać przez wytrząsanie.
    UWAGA: Przygotuj ten roztwór przeciwciała 30 minut przed użyciem i umieść probówkę na nutatorze lub pokole, aby zapewnić całkowite wymieszanie i jednorodną zawiesinę przeciwciała.
  2. Rozcieńczyć sondę białkową V5-fuzyjną w zakresie stężeń 5–500 μg/ml.
    UWAGA: Zoptymalizowany dla każdego testu interakcji białko-białko, przy użyciu bufora sondy. Optymalizacja polega na dodaniu większej ilości sond do bufora sondy. Zazwyczaj jako punkt wyjścia przyjmuje się 10 μg/ml i odpowiednio dostosowuje się w zależności od siły sygnału.
  3. Wyjmij mikromacierze białkowe z zamrażarki (−20 °C) i doprowadź do 4 °C w lodówce tuż przed użyciem.
  4. Dodaj bufor blokujący bezpośrednio do uchwytu szkiełka zawierającego mikoracje białek i przykryj górę parafilmem, aby zapobiec wyciekom. Zablokować tablice w buforze blokującym na 1 godzinę przez wytrząsanie z prędkością 50 obr./min na stoliku w temperaturze 4 °C.
  5. Po zablokowaniu przenieś matryce do nawilżonej komory schłodzonej do temperatury 4 °C i dodaj 90 μl rozcieńczonej sondy bezpośrednio na powierzchnię matrycy. Nałożyć matryce na podniesiony ślizg podnośnika i inkubować statycznie (bez wstrząsów) w wilgotnej komorze w temperaturze 4 °C przez 1,5 godziny.
  6. Przemyć matryce 3 razy po 1 minutę w buforze sondy w trzech stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. Dodaj szkiełko do stożkowych probówek zawierających wystarczającą ilość wstępnie schłodzonego buforu sondy, aby całkowicie pokryć szkiełko. Pozwól, aby podnośnik delikatnie zsunął się z mikromacierzy białkowej (nie należy jej zdejmować na siłę, ponieważ może to spowodować uszkodzenie powierzchni matrycy).
  7. Nałóż roztwór przeciwciała bezpośrednio na matrycę natychmiast po zakończeniu mycia (krok 2.5) i pokryj podniesionym ślizgiem podnośnika, tak jak poprzednio. Inkubować matryce przez 30 minut w temperaturze 4 °C w wilgotnej komorze.
  8. Wykonaj ten sam etap mycia, co poprzednio (3 razy po 1 minutę w buforze sondy) i wiruj w stożkowej probówce o pojemności 50 ml przy 800 x g w wirówce stołowej przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Wysuszyć matryce na powietrzu w uchwycie szkiełkowym w ciemności przez 30 minut przed skanowaniem matrycy przy długości fali 647 nm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aktywność oddziaływań białko-białko obserwowano przy użyciu standardowego czytnika chipów w celu oceny konstruktu fuzyjnego kinazy białkowej Tda1-V5 jako białka przynęci w odniesieniu do funkcjonalnej mikromacierzy białek drożdżowych zawierającej około 4200 unikalnych białek fuzyjnych GST S. cerevisiae. Dalsza analiza z wykorzystaniem oprogramowania Genepix ujawniła liczne zdarzenia wiązania o różnym natężeniu. Powinowactwo oceniano na podstawie stopniowanego natężenia sygnału pochodzącego od przeciwciała monokl...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiony protokół został pierwotnie przeprowadzony przy użyciu 85 unikalnych białek fuzyjnych kinazy białkowej drożdży-V5 w celu porównania aktywności wiązania w różnych i pokrewnych rodzinach kinaz białkowych drożdży, co zaowocowało identyfikacją nowych sieci interakcji kinaz in vivo1. Jako nowa technologia profilowania proteomicznego, opracowanie wysokoprzepustowych (HTP) badań przesiewowych proteomów przy użyciu mikromacierzy białkowych opierało się na bibliotekach peptydów oraz eukariotycznyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez grant z NIH. Testy pokazane na rysunku 1 zostały przeprowadzone przez dr Josepha Fasolo. Dziękujemy dr Rui Chen za pomocne komentarze.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szalki PetriegoVWRNC-10747lub porównywalne
Ekstrakt z drożdży baktonowychDifco0217-17
Pepton baktonowyDifco0118-17
Agar baktonowyDifco0140-01
DekstrozaSigmaD9434
rafinozaSigmaR0514
GalaktozaSigmaG0750
Sc-Ura Probówka odpadowaMP Bio114410622
Małe probówki do hodowli VWR/Fisher
Duża kolba ErlenmeyeraVWR/Fisher
Wirówka JA-10 z wirnikiem
Probówki wirówkowe (500 ml)
Probówka Falcon (50 ml)VWR/Fisher21008-951
Tabletki PBSSigmaP4417
Probówki FastPrep (tubka z nakrętką 2 ml)
FastPrep MachineMP Biomedicals116004500
Koraliki cyrkonoweBioSpec11079105
Triton X100SigmaP4417
DTTSigmaD9779
MgCl2SigmaM8266 
NaClSigmaS3014 
Imidazol (pH = 7,4)SigmaI5513 
PMSFSigma93482
Kompletny koktajl inhibitorów (bez EDTA)Roche11873580001
Koktajl inhibitorów fosfatazy 1sigmaP2850
BSASigmaA2153 
Tween-20SigmaP1379 
ATPSigmaA1852 
Inkubator z wytrząsaniem (30 & C)
Niklowa żywica powinowactwaTechnologiesR901-01
G25 kolumnaGE nauki przyrodnicze27-5325-01 
NutatorVWR/Fisher
SDS-PAGE Żel (NuPage)Life Technologies
Coomassie Blue StainLife Technologies
Przeciwciało monoklonalne V5Technologie życiaR960-25
Alexa647 Tagged Przeciwciało monoklonalne V5Technologie życia451098
Mikromacierze białkowe KitLife TechnologiesPAH0525013
Genepix ScannerMolecular Devices
Lifter SlipsThomas Scientifichttp://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/
Bufor do lizy: 0,1% Triton X-100, 0,5 mM DTT,
2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM imidazol (pH 7,4), Kompletny koktajl inhibitorów proteazy – Wolny od EDTA, Inhibitor fosfatazy Koktajl 1, 1 mM PMSF  (dodać tuż przed użyciem)		Dodaj odczynniki do 1x PBS (0,01 M bufor fosforanowy, 0,0027 M chlorek potasu, 0,137 M chlorek sodu; pH 7,4), aby uzyskać pożądaną objętość roztworu do lizy
Bufor blokujący: 1% albumina surowicy bydlęcej (BSA), 0,1% Tween-20Dodaj odczynniki do 1x PBS, aby uzyskać żądaną objętość buforu
blokującegoBufor sondy: 2 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 0,05% Triton X-100, 50 mM NaCl, 500 μ M ATP (dla kinaz), 1% BSADodaj odczynnik do 1x PBS, aby uzyskać żądaną objętość buforu sondy
Bufor do płukania: 0,1% Triton X-100, 500 mM NaCl, 0,5 mM DTT, 50 mM imidazol (pH 7,4), 2 mM MgCl2odczynnik do 1x PBS, aby uzyskać żądaną objętość bufora
sondyBufor elucyjny: 0,1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 – 500 mM imidazol (pH 7,4), Kompletny koktajl inhibitorów proteazy – Bez EDTA, inhibitor fosfatazy Koktajl 1, 1 mM PMSF (dodać tuż przed użyciem)Zanim zaczniesz, ważne jest, aby zwrócić uwagę na gradient stężenia imidazolu (50 – 500 mM) i utworzyć osobne probówki dla każdego stężenia (zaleca się tworzenie przedziału w odstępach co 50 mM). Dodaj odczynnik do 1x PBS, aby uzyskać żądaną objętość buforu sondy
3x YEP +6% galaktozy: Rozpuść 30 g ekstraktu drożdżowego i  60 g peptonu w 700 ml H2O i autoklaw. Dodać 300 ml filtra wysterylizowanego 20% galaktozy (wt/vol)  Galaktozy nie należy sterylizować w autoklawie
Wirówka Life Dodaj

Bibliografia

  1. Fasolo, J., et al. Diverse protein kinase interactions identified by protein microarrays reveal novel connections between cellular processes. Genes. 25, 767-778 (2011).
  2. Zhu, X., Gerstein, M., Snyder, M. ProCAT: a data analysis approach for protein microarrays. Genome biology. 7, R110(2006).
  3. Breitkreutz, A., et al. A global protein kinase and phosphatase interaction network in yeast. Science. 328, 1043-1046 (2010).
  4. Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415, 141-147 (2002).
  5. Jeong, J. S., et al. Rapid identification of monospecific monoclonal antibodies using a human proteome microarray. Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).
  6. Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
  7. Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 4730-4735 (2007).
  8. Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293, 2101-2105 (2001).
  9. Ptacek, J., et al. Global analysis of protein phosphorylation in yeast. Nature. 438, 679-684 (2005).
  10. Haab, B. B. Antibody arrays in cancer research. Molecular & cellular proteomics. Mol Cell Proteomics. 4 (4), 377-383 (2005).
  11. Kopf, E., Zharhary, D. Antibody arrays--an emerging tool in cancer proteomics. The international journal of biochemistry & cell biology. 39, 1305-1317 (2007).
  12. Berrade, L., Garcia, A. E., Camarero, J. A. Protein microarrays: novel developments and applications. Pharmaceutical research. 28, 1480-1499 (2011).
  13. Balboni, I., Limb, C., Tenenbaum, J. D., Utz, P. J. Evaluation of microarray surfaces and arraying parameters for autoantibody profiling. Proteomics. 8, 3443-3449 (2008).
  14. Gelperin, D. M., et al. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes & development. 19, 2816-2826 (2005).
  15. Fasolo, J., Snyder, M. Protein microarrays. Methods Mol. Biol. 548, 209-222 (2009).
  16. Im, H., Snyder, M., et al. Preparation of recombinant protein spotted arrays for proteome-wide identification of kinase targets. Current protocols in protein science. Coligan, J. E. 27, Unit 27 24(2013).
  17. MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikromacierz bia kowakinaza dro d owaoczyszczanie powinowactwemznacznik epitopowy V5skaner mikromacierzydetekcja fluorescencyjnaanaliza bioinformatycznaekspresja bia ekhodowla dro d y

Powiązane artykuły