Przepływ pracy dla wysokiej zawartości, indywidualnej kwantyfikacji komórek markerów fluorescencyjnych na podstawie danych z mikroskopu uniwersalnego, wspierany przez oprogramowanie Open Source

Summary

Presented to elastyczny przepływ pracy w informatyce, umożliwiający multipleksowaną analizę obrazów fluorescencyjnie znakowanych komórek. Przepływ pracy określa ilościowo markery jądrowe i cytoplazmatyczne oraz oblicza translokację markerów między tymi przedziałami. Przedstawiono procedury perturbacji komórek z wykorzystaniem siRNA oraz wiarygodną metodologię wykrywania markerów za pomocą immunofluorescencji pośredniej w formatach 96-dołkowych.

Abstract

Postępy w zrozumieniu mechanizmów kontrolnych rządzących zachowaniem komórek w przylegających do siebie modelach hodowli tkanek ssaków stają się coraz bardziej zależne od sposobów analizy pojedynczych komórek. Metody, które dostarczają złożonych danych odzwierciedlających średnie wartości biomarkerów z populacji komórek, grożą utratą dynamiki subpopulacji, która odzwierciedla heterogeniczność badanego systemu biologicznego. W związku z tym tradycyjne podejścia są zastępowane lub wspierane przez bardziej wyrafinowane formy testów komórkowych opracowane w celu umożliwienia oceny za pomocą mikroskopii o wysokiej zawartości. Testy te potencjalnie generują dużą liczbę obrazów biomarkerów fluorescencyjnych, co jest możliwe dzięki dołączonym zastrzeżonym pakietom oprogramowania, co pozwala na wieloparametryczne pomiary na komórkę. Jednak stosunkowo wysokie koszty kapitałowe i nadmierna specjalizacja wielu z tych urządzeń uniemożliwiły ich dostęp do wielu badaczy.

Opisany tutaj jest uniwersalny proces pracy do ilościowego oznaczania intensywności wielu markerów fluorescencyjnych z określonych subkomórkowych regionów pojedynczych komórek, odpowiedni do użycia z obrazami z większości mikroskopów fluorescencyjnych. Kluczem do tego przepływu pracy jest implementacja ogólnodostępnego oprogramowania Cell Profiler¹ w celu rozróżnienia poszczególnych komórek na tych obrazach, podzielenia ich na zdefiniowane regiony subkomórkowe i dostarczenia wartości intensywności markerów fluorescencji specyficznych dla tych regionów. Ekstrakcja indywidualnych wartości intensywności komórek z danych obrazowych jest głównym celem tego przepływu pracy i zostanie zilustrowana analizą danych kontrolnych z ekranu siRNA dla regulatorów punktów kontrolnych G1 w przylegających komórkach ludzkich. Jednak przedstawiony tutaj przepływ pracy może być zastosowany do analizy danych z innych środków perturbacji komórek (np. złożonych badań przesiewowych) i innych form markerów komórkowych opartych na fluorescencji, a zatem powinien być przydatny dla szerokiego zakresu laboratoriów.

Introduction

Praca przedstawiona tutaj opisuje użycie darmowego oprogramowania Cell Profiler do przeprowadzenia sterowanego algorytmem podziału obrazów mikroskopowych fluorescencyjnych przylegających komórek w celu identyfikacji pojedynczych komórek i zdefiniowanych regionów subkomórkowych. Podejście to, określane jako segmentacja obrazu, umożliwia późniejszą wieloparametryczną analizę obrazowanych komórek poprzez ilościowe oznaczanie markerów znakowanych fluorescencyjnie zlokalizowanych w każdej komórce lub regionie subkomórkowym (określanych jako obiekty segmentowane). Ten przepływ pracy stanowi podstawę do umożliwienia analizy o wysokiej zawartości i ma służyć jako narzędzie, które może być dalej rozwijane i modyfikowane w celu dopasowania do wieloparametrycznych, indywidualnych analiz komórek w laboratoriach bez dostępu do specjalistycznych instrumentów o wysokiej zawartości lub zastrzeżonego oprogramowania. Pliki dostarczone z tym manuskryptem zawierają zestaw testowy odpowiednich surowych danych obrazu, ustawień algorytmu i skryptów pomocniczych do wygenerowania opisanej analizy. Podane ustawienia algorytmu dla narzędzia Cell Profiler są zoptymalizowane pod kątem przykładowego zestawu danych, a sekcja Dyskusja zawiera szczegółowe informacje o tym, jakie korekty mogą być konieczne, aby umożliwić korzystanie z danych obrazowych z innych badań.

Po wyodrębnieniu danych ilościowych za pomocą Cell Profiler, różne laboratoria mogą mieć różne wymagania co do sposobu wykorzystania informacji prezentowanych przez poszczególne wartości komórek w surowych danych; tutaj pokazano jedno podejście, za pomocą którego do surowych danych stosuje się bramki dla każdego testu. Za pomocą tych bramek dane są przekształcane w binarne warunki odpowiedzi, co pozwala na wizualizację trendów łączących różne terapie z subpopulacjami komórek poddawanych odpowiedzi zdefiniowanej przez bramki. Bramki ustala się na podstawie obserwacji rozkładów danych uzyskanych dla odpowiednich kontroli ujemnych i dodatnich dla każdego istotnego pomiaru. Wykorzystanie bramek to tylko jeden z przykładów zarządzania surowymi pomiarami opartymi na komórkach. Pokazano tu również wykorzystanie pomiarów intensywności jądrowego DNA w ich surowej postaci jako ciągłego zakresu wartości w połączeniu z bramkowanymi danymi. Należy rozważyć inne podejścia do zarządzania danymi analizy obrazu, w zależności od charakteru badania; Opisano statystyczne alternatywy dla stosowania bramek do przypisywania komórek do subpopulacji² oraz systematyczne porównania strategii podsumowywania danych o wysokiej zawartości w dużej liczbie parametrów³.

Analizy danych obrazowych o wysokiej zawartości znalazły zastosowanie w badaniach komórkowych nad reakcją na leki, genetyką odwróconą i sygnalizacją stresu środowiskowego ^4-6. Zaleta analizy o wysokiej zawartości wynika z faktu, że algorytmiczna analiza danych z mikroskopii fluorescencyjnej pozwala na jednoczesne uwzględnianie parametrów ilościowych i przestrzennych w poszczególnych komórkach⁷. W ten sposób można porównywać wyniki komórkowe dla wielu testów, śledzić zróżnicowane zachowanie subpopulacji komórek zdefiniowanych w teście w warunkach eksperymentalnych, a testy mogą obejmować uwzględnienie zmiennych morfologicznych. Omówione tutaj strategie i przepływ pracy analizy, podobnie jak w przypadku innych podejść o wysokiej zawartości, są w stanie dostarczyć multipleksowane dane, które są powiązane z poszczególnymi komórkami. Metody o wysokiej zawartości pasują do badań, które generują obrazy z mikroskopu fluorescencyjnego i mają zastosowanie do analizy danych, począwszy od dziesiątek obrazów wytwarzanych w konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej o niskiej przepustowości, a skończywszy na tysiącach obrazów wytwarzanych przy użyciu zautomatyzowanych platform przesiewowych o wysokiej zawartości.

Przepływ pracy jest tutaj zilustrowany przykładowymi danymi, z których mierzone są oddzielne testy, odpowiednio pod względem intensywności markerów fluorescencyjnych lub translokacji jądrowej/cytoplazmatycznej białka reporterowego fluorescencyjnego. Przepływ pracy jest elastyczny, ponieważ testy te mogą być rozpatrywane osobno lub w połączeniu, w zależności od każdego pytania badawczego przez różnych badaczy. Przykładowe dane są tworzone w ramach eksperymentu z interferencją RNA (RNAi) (rysunek 1). Małe interferujące oligonukleotydy RNA (siRNA) są używane do niszczenia określonych białek w ludzkich komórkach raka jelita grubego HCT116, co powoduje zmiany dla dwóch fluorescencyjnych reporterów aktywności kinazy zależnej od cyklin (CDK). Zależną od CDK6 fosforylację białka siatkówki jądrowej w serynie 780 (P-S780 RB1) ocenia się za pomocą barwienia przeciwciałami. W tych samych komórkach reporter aktywności CDK2 znakowany zielonym białkiem fluorescencyjnym (reporter GFP-CDK2) jest oceniany na podstawie jego stosunku jądrowego do cytoplazmatycznego, gdzie przy braku aktywności CDK2 reporter znajduje się w jądrze, a po aktywacji CDK2 przemieszcza się do cytoplazmy⁸. Dodatkowo, jądrowe DNA każdej komórki jest barwione przy użyciu barwnika interkalującego DNA, bisbenzimidu, który służy jako środek do identyfikacji komórek i definiowania granic jąder na obrazach, a także jako miara obfitości DNA dostarczająca informacji o pozycji komórki w cyklu komórkowym (ryc. 2).

Aktywności CDK6 i CDK2 są wykrywalne jako komórki przechodzące z fazy G1 do S cyklu komórkowego⁵ i następują po sobie^9,10 i w związku z tym oczekuje się ścisłej zgodności między dwoma reporterami w poszczególnych komórkach. Zastosowany tutaj zestaw danych demonstracyjnych analizuje jako przykład wpływ siRNA na CDK6, białko siatkówczaka (RB1) i nieukierunkowaną kontrolę negatywną (Tabela 1). Knockdown CDK6 powinien wywołać zarówno zmniejszenie epitopu RB1 P-S780, jak i akumulację komórek w fazie G1 cyklu komórkowego. Nokaut RB1 służy jako odczynnik kontrolny dla specyficzności przeciwciała fosfo-S780. Obrazy z mikroskopu fluorescencyjnego z utrwalonych^{formaliną, 11}, fluorescencyjnie barwionych komórek hodowli tkankowej HCT116 są wykorzystywane do algorytmicznej analizy obrazu. Uzyskane w ten sposób dane liczbowe są następnie wykorzystywane do porównywania osób zgłaszających i mierzenia wpływu różnych stanów powalających.

Potencjalny rozmiar danych generowanych przez ten rodzaj analizy może stanowić wyzwanie dla normalnych narzędzi analizy. Na przykład dane poszczególnych komórek mogą być większe niż może pomieścić niektóre programy do arkuszy kalkulacyjnych. Dołączone są skrypty Perla, które wykonują proste, wysoce powtarzalne, nadzorowane przetwarzanie danych, aby pomóc w analizie dużych zbiorów danych. Skrypty Perla są pisane specjalnie dla plików wyjściowych tworzonych przez program Cell Profiler podczas przetwarzania plików obrazów z określoną konwencją nazewnictwa plików (Rysunek 3) i pozwalają na użycie w analizie zmiennej liczby pól na studzienkę. Często ważne jest, aby bramkować dane testowe poszczególnych komórek w celu śledzenia trendów w subpopulacjach komórek⁵, a tutaj pokazano użycie skryptu Perla do oznaczania każdej komórki na podstawie ustawionej bramki wstępnie określonej dla każdego typu testu. Dołączone są również opcjonalne skrypty Perla, które podsumowują wyniki danych dla poszczególnych dołków (lub warunków), dostarczając: procentu komórek w ustawionej bramce i średnich wartości surowych wyników testu. Drugi, bardziej jednorodny sposób przeglądania danych, jest prawidłowy tam, gdzie odpowiedzi wpływają na wszystkie lub większość komórek w studni. Jak omówiono powyżej, taka ocena jest mniej przydatna niż ta, którą zapewnia bramkowanie danych z poszczególnych komórek, w których odpowiedź jest ograniczona do podzbioru komórek w populacji.

Użyteczność opisanego przepływu pracy nie ogranicza się do perturbacji przez siRNA lub opisane testy markerów. W badaniach wykorzystano to podejście do oznaczania odpowiedzi w eksperymentach z hodowlą tkankową z wykorzystaniem kombinacji siRNA, inhibitorów chemicznych i radioterapii oraz do oceny markerów innych niż aktywność CDK6 i CDK2⁵.

Koncepcyjnie, eksperymentalna strategia pozwala na automatyczne rejestrowanie różnych biologicznie użytecznych regionów subkomórkowych w pojedynczych komórkach obecnych na obrazach z mikroskopu fluorescencyjnego. W związku z tym podejście to może dostarczyć ilościowych, multipleksowanych danych ujawniających informacje biologiczne, które mogą zostać pominięte przez techniki koncentrujące się na populacjach, a nie na pojedynczych komórkach. Przy niewielkich modyfikacjach opisane podejście i proces analizy mogą dostarczyć ilościowych, indywidualnych danych komórkowych dla dowolnych wyników testów opartych na fluorescencji i odpowiedzi biologicznych komórki, w których interesująca jest ilościowa ocena zawartości DNA, kwantyfikacja fluorescencji jądrowej lub cytoplazmatycznej lub przenoszenie markerów między tymi dwoma przedziałami, indywidualnie lub w sposób multipleksowany. Ponieważ wymagania dotyczące publikowania coraz częściej skłaniają się ku przesyłaniu publicznie dostępnych danych surowych, dostęp do bezpłatnych narzędzi do analizy obrazów mikroskopowych, takich jak te opisane tutaj, oraz znajomość tych narzędzi będą również bezpośrednio interesujące dla laboratoriów, które chcą ponownie przeanalizować opublikowane dane.

Protocol

1. Eksperymentalne zaburzenia i znakowanie komórek dla markerów odpowiedzi (badanie siRNA z odwróconą transfekcją)

1. W sterylnej pipecie kapturowej do hodowli tkanek 70 μl siRNA 200 nM w buforze 1x siRNA w studzienkach sterylnej, gładkiej płytki 96-dołkowej. Rozcieńczyć lipid transfekcyjny w 40 objętościach pożywki DMEM bez surowicy i dozować 105 μl do każdej studzienki zawierającej siRNA.
   UWAGA: Rozcieńczenie 262,5 μl lipidu w 10,5 ml DMEM bez surowicy daje mieszankę wzorcową odpowiednią dla całej 96-dołkowej płytki siRNA, dostarczając 2,6 μl lipidu na dołek. Zastosowanie początkowego stężenia siRNA 200 nM na tym etapie zapewni stężenie robocze 20 nM w kroku 1.3, ale procedury będą działać w przypadku stężeń roboczych do 5 nM, przy odpowiednim dostosowaniu stężenia początkowego (tj. 50 nM). Niższe stężenie robocze może zmniejszyć liczbę wyników fałszywie dodatnich poza celem, chociaż może zmniejszyć wielkość odpowiedzi na cel, prowadząc do wzrostu odsetka wyników fałszywie ujemnych na celu.
2. Mieszaj płytkę delikatnymi wibracjami przez dziesięć minut w temperaturze pokojowej. Otrzymane 175 μl należy podzielić na trzy powtórzenia po 50 μl na cel na nieprzezroczystą, 96-dołkową płytkę z przezroczystą podstawą poddaną działaniu kultury tkankowej.
3. Odwrotny transfekt poprzez dozowanie 8 000 komórek na studzienkę w 150 μl DMEM zawierającym 10% surowicy bezpośrednio do 50 μl kompleksów lipidowo-siRNA. Ludzkie komórki jelita grubego HCT116 stabilnie eksprymują marker znakowany GFP, raportujący aktywność CDK2^5,8. Nie jest konieczne dalsze mieszanie. Uszczelnij płytkę sterylną, samoprzylepną, oddychającą membraną, aby kontrolować wilgotność i zapobiec "efektom krawędziowym" płytki, a następnie umieść płytkę w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ na 48 godzin.
4. Zassać pożywkę tak, aby niewielka pozostała ilość pożywki w studzienkach. Utrwal komórki, dodając 100 μl 4% buforowanego formaldehydu do każdej studzienki i inkubuj w dygestorium przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
5. Usunąć roztwór utrwalający, zasysając płytkę. W tym momencie albo należy przerwać eksperyment, przemywając płytkę trzykrotnie 100 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), a następnie przechowywać szczelnie zapieczętowane, poniżej 100 μl PBS w ciemności w temperaturze 4 °C przez okres do tygodnia, albo przystąpić do przepuszczalności komórek.
   UWAGA: Zalecamy obróbkę płytek tak szybko, jak to możliwe po utrwaleniu i generalnie preferujemy przechowywanie w pełni przetworzonych płyt. Biobójcze środki konserwujące, takie jak tiomersal, azydek sodu lub komercyjne alternatywy, mogą być dodawane w celu zapobiegania rozwojowi micoroganizmu. Dodanie inhibitorów fosfatazy pomaga w zachowaniu fosfoepitopów, a inne sposoby zachowania stanów modyfikacji białek mogą być przydatne w odpowiednich kontekstach testowych
6. Usunąć PBS z płytki i przepuszczalność komórek, dodając 100 μl roztworu do przepuszczalności. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej bez wstrząsania. Odessać roztwór przepuszczalny za pomocą pipety wielokanałowej. Powtórz ten krok trzy razy.
7. Zablokuj komórki, dodając 100 μl roztworu blokowego na studzienkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć roztwór blokowy, zasysając płytkę, a następnie sondować 50 μl przeciwciała anty P-S780 RB1 rozcieńczonego 500-krotnie w roztworze blokowym przez 2 godziny w ciemności w temperaturze pokojowej.
8. Umyj płytkę trzykrotnie 100 μl roztworu do przemywania płytek, pozostawiając roztwór na płytce na 5 minut za każdym razem. Sondować płytkę przez noc w ciemności w temperaturze 4 °C z 50 μl fluorescencyjnie znakowanego przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego 1000-krotnie w roztworze blokowym uzupełnionym 2 μM specyficznego dla chromatyny barwnika DNA bisbenzimidu. Umyć płytkę trzy razy, tak jak poprzednio, i przechowywać szczelnie zamkniętą, w temperaturze poniżej 100 μl PBS, w ciemności w temperaturze 4 °C. Zobrazować płytkę w ciągu dwóch tygodni.

2. Obrazowanie i segmentacja obrazu

1. Użyj konfokalnego lub wirującego mikroskopu fluorescencyjnego z obiektywem 20X, aby wykonać oddzielne 16-bitowe obrazy TIFF w skali szarości w trzech kanałach odpowiadających barwnikowi DNA, GFP i fluoroforom barwiącym immuno. Przechwyć wiele nienakładających się na siebie zestawów obrazów, nazywanych tutaj ramkami, aby zobrazować około 1,000-2,000 komórek na studzienkę.
2. Nazywaj pliki obrazów systematycznie, tak aby każda nazwa pliku była unikalną kombinacją "nazwy eksperymentu", "adresu studni", "numeru ramki" i "identyfikatora kanału" w tej kolejności (Rysunek 3). Przykładowy zestaw danych używa "Niebieskiego" (barwienie DNA chromatyny) lub "Zielonego" (GFP) lub "Czerwonego" (fluoroforu barwionego immunologicznie) jako identyfikatorów kanałów. Adres studni, numer ramki i identyfikator kanału są dalej określane jako metadane obrazu. Użyj symbolu podkreślenia, aby uniknąć mylenia metadanych i ramki.
3. Nazwij pliki z tymi elementami metadanych w określonej kolejności. Jest to konieczne, aby upewnić się, że kolejne kroki oprogramowania prawidłowo grupują zestawy obrazów do analizy.
4. Pobierz i zainstaluj darmowe oprogramowanie Cell Profiler, Active Perl Community Edition, statystyczne środowisko programistyczne R i RStudio. Zaakceptuj wszystkie opcje domyślne podczas instalacji; Użytkownicy komputerów PC instalujący Active Perl powinni włączyć wszystkie opcje związane ze ścieżką, powiązaniem rozszerzenia pliku i mapowaniem skryptów, jeśli zostanie o to poproszony. Aktywny Perl jest opcjonalny dla użytkowników komputerów Mac, ale w przeciwnym razie będą musieli uruchomić skrypt Perla w kroku 3.2 z wiersza poleceń terminala, zamiast klikać ikony.
5. Otwórz oprogramowanie Cell Profiler, kliknij "Plik", "Importuj potok", a następnie "Z pliku" i wybierz plik 3_channels_pipeline.cppipe (rysunki S1A i S1B). Plik zawiera instrukcje niezbędne do tego, aby oprogramowanie mogło interpretować metadane pliku obrazu na podstawie opisanej konwencji nazw plików. Cell Profiler łączy teraz obrazy, ekstrahuje z nich intensywność jądrowego DNA i przeciwciał oraz wykorzystuje kanał GFP do obliczenia stosunku intensywności jądra do intensywności cytoplazmy dla każdej wykrytej komórki (ryc. 4 i 5).
6. Kliknij przycisk "Wyświetl ustawienia wyjściowe" w lewym dolnym rogu okna Cell Profiler. U góry nowego ekranu znajdują się pola tekstowe oznaczone jako "Domyślny folder wejściowy" i "Domyślny folder wyjściowy". Pojedynczo klikaj ikony folderów po prawej stronie tych pól i wybierz odpowiednio lokalizację plików obrazów do analizy i miejsce docelowe wyodrębnionych danych (Rysunek S1C).
7. Rozpocznij analizę obrazu, naciskając przycisk "Analizuj obrazy" w lewym dolnym rogu programu Cell Profiler. U dołu ekranu obserwuj pozostały czas ekstrakcji danych, przyciski "Zatrzymaj analizę" i "Pauza". W razie potrzeby wstrzymaj analizę, wybierając przycisk "Pauza" w dowolnym momencie, który jest przydatny podczas oglądania analizowanych obrazów (opisanych w kroku 2.8).
8. Opcjonalnie otwórz okna dla dowolnego kroku analizy obrazu, klikając ikony oczu w panelu po lewej stronie okna programu (Rysunek S1D). Obserwuj okno "IdentifyPrimaryObjects" oraz okna "Obiekty drugorzędne" i "Obiekty trzeciorzędne", aby sprawdzić, czy bieżące ustawienia w programie Cell Profiler do segmentacji obrazu są odpowiednie (patrz Rysunek 1 i Dyskusja, aby uzyskać porady dotyczące modyfikowania tych ustawień).
9. Kliknij "OK" w oknie komunikatu, które pojawia się po zakończeniu analizy. Przejdź do lokalizacji "Domyślny folder wyjściowy", w której wszystkie pliki danych z wynikami są zapisywane jako pliki o wartościach rozdzielanych przecinkami (.csv) (Rysunek S2A).

3. Ekstrakcja danych

1. Znajdź nowy plik 'Nuclei.csv', który znajduje się wśród danych wyjściowych programu Cell Profiler. Plik ten zawiera dane poszczególnych komórek dla intensywności fluorescencyjnych przeciwciał jądrowych, intensywności jądrowego DNA i wartości współczynnika reporterowego GFP-CDK2 (ryc. 6A i S2A).
   UWAGA: Różne laboratoria będą chciały przetwarzać tego typu dane tak, aby odpowiadały charakterowi ich własnych testów. Sugerowane dla obecnych danych jest bramkowanie komórek z każdego stanu leczenia zgodnie z danymi przeciwciał i wartościami reporterowymi GFP-CDK2 przy użyciu dostarczonego skryptu Perla "2_gate_classifier.pl".
2. Skopiuj dostarczony plik skryptu Perla "2_gate_classifier.pl" do tego samego folderu, co plik danych "Nuclei.csv" (Rysunek S2A). Kliknij dwukrotnie ikonę skryptu Perla i po wyświetleniu monitu wpisz pełną nazwę pliku danych, a następnie nazwę pliku ".csv" dla pliku, w którym komórki mają być bramkowane, a na końcu wartości bramki dla fluorescencji przeciwciała i danych reportera GFP-CDK2.
   UWAGA: Sposób zasadniczego określania ustawień bramki i stosowania ich do analizy danych omówiono poniżej w sekcji Dane reprezentatywne i na rysunku 6 (do analizy dostarczonych danych należy użyć odpowiednio "0,004" i "1,5"). Użytkownicy komputerów Mac powinni uruchomić skrypt Perla z wiersza poleceń terminala, wpisując: 'perl 2_gate_classifier.pl'.
3. Obserwuj nowo utworzony plik, który łączy surowe wartości testów pojedynczych komórek z oryginalnych danych Cell Profiler z etykietami subpopulacji, które pokazują, jak każda komórka z każdej studzienki radzi sobie z obiema bramkami (Rysunek 6C).
4. Wykreśl dane dla każdego warunku eksperymentalnego przy użyciu etykiet poszczególnych subpopulacji komórek, otwierając oprogramowanie RStudio. Kliknij "Plik" i "Otwórz plik", a następnie wybierz dostarczony plik "analysis.r". Postępuj zgodnie z poleceniami, aby wykreślić rysunki 6B, 7 i 8 w lewym górnym oknie programu RStudio (Rysunek S2B). W lewym górnym oknie, między symbolami podwójnego cudzysłowu w wierszach 5 i 6, wpisz adres komputera folderu zawierającego dane bramkowane. Dołącz odpowiednio literę dysku i nazwę samego pliku (np. "C:/analysis folder/analysis output" i "nuclei_gated.csv").
   UWAGA: Jeśli program RStudio jest używany po raz pierwszy na danym komputerze, należy najpierw zainstalować pakiet graficzny języka R "ggplot2". Jest to jednorazowy krok dla nowej instalacji programu RStudio, po którym ten krok staje się zbędny. Aby zainstalować "ggplot2", kliknij kartę o nazwie "Pakiety" nad oknem w prawym dolnym rogu RStudio, kliknij przycisk "Zainstaluj pakiety", który pojawia się poniżej. Pojawi się nowe okno. Wpisz "ggplot2" (pomijając cudzysłowy) w polu "Pakiety" w tym nowym oknie i na koniec kliknij przycisk "Zainstaluj", aby zamknąć okno, zainstalować niezbędne funkcje ggplot2 i powrócić do głównego okna RStudio, aby kontynuować od kroku 3.6.
5. Podświetl linie od 1 do 17 w lewym górnym oknie programu RStudio, a następnie kliknij przycisk "Uruchom". Spowoduje to wprowadzenie danych eksperymentalnych, wartości progowych i szczegółów lokalizacji odwiertu do R (rysunek S2C). R będzie teraz tymczasowo przechowywać odpowiednie dane do wykreślenia.
6. Zaznacz poszczególne bloki pozostałego kodu poniżej wiersza 17 i utwórz odpowiednie wykresy, klikając przycisk "Uruchom", tak jak poprzednio. Obserwuj wykresy w oknie w prawym dolnym rogu RStudio i zapisz liczbę formatów, klikając przycisk "Eksportuj" (rysunek S2D).
7. Podczas zamykania programu RStudio kliknij przycisk "Nie zapisuj" po wyświetleniu monitu. Zapobiega to nieporozumieniom przy następnym użyciu programu RStudio, który w przeciwnym razie będzie zawierał dane z poprzedniej sesji.

Results

Przykładowy zestaw obrazów wygenerowanych przy użyciu protokołu przesiewowego siRNA z odwróconą transfekcją został przygotowany i przeanalizowany za pomocą oprogramowania Cell Profiler. Uzyskane w ten sposób surowe dane liczbowe są takie, że każda komórka jest indywidualnie reprezentowana, można ją prześledzić wstecz do jej obrazu i studni pochodzenia oraz zmierzyć pod kątem kilku parametrów intensywności fluorescencji (ryc. 6A). Dla każdej zidentyfikowanej komórki określa się średnią intensywność fluorescencji jądrowej dla przeciwciała RB1 P-S780 oraz zintegrowaną intensywność DNA dla masek jądrowych zdefiniowanych barwnikiem DNA. Rejestrowane są również średnie wartości intensywności GFP dla jądra i regionów cytoplazmy każdej komórki, co pozwala na obliczenie fluorescencji jądrowej w porównaniu z cytoplazmatyczną reportera GFP-CDK2. W dalszej części tych algorytmicznych pomiarów intensywności fluorescencji wykorzystuje się te indywidualne dane komórkowe do zdefiniowania bramek dla dwóch testów, barwienia przeciwciał jądrowych i reportera GFP-CDK2. Opisano późniejszą adnotację komórek na podstawie wyników testu i wykorzystanie tych znaczników w celu umożliwienia dalszego scharakteryzowania określonych subpopulacji za pomocą trzeciego pomiaru (zawartość jądrowego DNA).

Wykresy histogramu surowych danych o intensywności fluorescencji zebrane dla każdego testu są skutecznym sposobem oceny, jak subpopulacje komórek zachowują się w różnych warunkach. Histogramy na rysunku 6B pokazują rozkład populacji danych poszczególnych komórek z potrójnych studzienek dla każdego stanu knockdown RNAi. Po lewej stronie znajdują się dane dotyczące intensywności przeciwciał jądrowych, a po prawej odpowiednie dane dotyczące reportera GFP-CDK2. Dane dotyczące przeciwciał RB1 P-S780 ujawniają, że komórki zasadniczo występują w dwóch populacjach w odniesieniu do tej modyfikacji potranslacyjnej i że populacje komórek z utratą RB1 fosforylowanego na S780 można odróżnić jako lewy pik intensywności jądrowej, który jest wzbogacony, gdy CDK6 jest powalany przez siRNA. Ten sam pik lewej strony jest widoczny, gdy sam RB1 jest celem RNAi, odzwierciedlając bezpośrednie usunięcie białka, a tym samym barwienie P-S780 RB1. W przeciwieństwie do tego, te same warunki eksperymentalne dla tych samych komórek, obserwowane za pomocą testu reporterowego GFP-CDK2, wykazują inną dynamikę w danych dotyczących poszczególnych komórek. Obserwuje się rozkład ciągły, z tylko jednym pikiem, ale siRNA, które zaburza cykl komórkowy (siCDK6) i powoduje akumulację w fazie G1, powoduje wydłużenie prawego ramienia tej dystrybucji (tj. wskazuje na zwiększoną obecność komórek wykazujących wzrost stosunku GFP jądra do cytoplazmy, wykreślonego na osi X).

Na histogramach na rysunku 6B pokazane są również wartości bramek (pionowe słupki), które są wybierane na podstawie rozkładów obu zestawów danych testowych. Reguła stosowana do danych przeciwciała P-S780 RB1 polega na zdefiniowaniu pozycji bramki jako pozycji połowy wysokości: maksymalnej szerokości na lewym ramieniu głównego (prawego) piku przy uwzględnieniu danych z ujemnych komórek kontrolnych (siRNA nieukierunkowanych). Dane zaznaczone na czerwono to komórki ze zredukowanym i nieobecnym P-S780 RB1, które są identyfikowane z tą bramką. Podobna bramka umieszczona na przeciwległym ramieniu rozkładu wartości współczynnika jest używana dla reportera GFP-CDK2. Powstałe w ten sposób komórki subpopulacji o wysokim stosunku, które nie mają lub charakteryzują się zmniejszoną aktywnością CDK2, są pokazane na zielono. Aby zilustrować analizę multipleksową dwóch testów, rysunek 6C przedstawia implementację obu wartości bramki przy użyciu skryptu 2_gate_classifier.pl perl w celu konwersji surowych danych (Rysunek 6A) do pliku z adnotacjami poniżej. Ten nowy plik zawiera oryginalne dane wraz z nową kolumną etykiet klas dla każdej komórki i dwiema wartościami bramek używanymi do ich rozróżniania (w tym przypadku użyto bramek wynoszących odpowiednio 0,004 dla danych przeciwciał i 1,5 dla reportera GFP-CDK2).

Po sklasyfikowaniu poszczególnych komórek z każdego stanu knockdown na podstawie dwóch testów, teraz można używać tych etykiet klas do pomocy w adnotacji wykresów danych testowych. Rysunek 7 przedstawia wykresy punktowe danych z poszczególnych komórek dla testów P-S780 RB1 i GFP-CDK2 z przykładowego zestawu danych dla wszystkich trzech warunków RNAi. Liczby opisujące ćwiartki na wykresach rozrzutu pokazują względne wartości procentowe każdej bramkowanej subpopulacji w stosunku do całości dla tego kontekstu knockdown i są generowane w R przy użyciu etykiet klas opisanych powyżej. Wykresy te ujawniają, że w porównaniu z komórkami transfekowanymi niedocelowym siRNA (Figura 7B), komórki transfekowane siCDK6 ujawniają rozkład danych netto przesunięty zarówno w dół na osi Y (wskazując na brak fosforylacji RB1 przy serynie 780), jak i w prawo na osi X (wskazując na niską aktywność CDK2, Figura 7C). Oczekuje się, że obie te zmiany doprowadzą do powalenia tego celu. W przeciwieństwie do tego, dane z komórek transfekowanych siRB1 (Figura 7A) wykazują utratę barwienia przeciwciał zgodnie z utratą epitopu, ale niewielki wpływ na rozkład danych dla reportera CDK2 w porównaniu z kontrolami transfekowanymi niedocelowym siRNA, co sugeruje, że nokaut RB1 nie ma dużego wpływu na reporter GFP-CDK2.

Aby dokładniej zbadać wykorzystanie danych o poszczególnych komórkach, klasyfikacji subpopulacji i multipleksowania testów, Rysunek 8 pokazuje wykres punktowy dla danych siCDK6 z Rysunku 7C wraz z sparowanymi profilami histogramu dla zintegrowanej intensywności DNA. Pary histogramów odnoszą się do przeciwległych połówek całej populacji, podzielonych na podstawie intensywności przeciwciał (po prawej stronie wykresu rozrzutu) lub wartości wskaźnika reporterowego GFP-CDK2 (powyżej wykresu rozrzutu). Kwantyfikacja intensywności jądrowego DNA dla tych populacji pokazuje dwa piki charakterystyczne dla zawartości DNA 2N i 4N jako odpowiednio lewy i prawy pik. Intencje bramek pokazanych na rysunkach 6, 7 i 8 są takie, że komórki zidentyfikowane jako niskie dla P-S780 RB1 (oznaczone: P-S780-) lub o wysokiej wartości współczynnika z reportera GFP-CDK2 (oznaczone: G1) będą w fazie G1 cyklu komórkowego. Rzeczywiście, histogramy profilu DNA dla subpopulacji zidentyfikowanych za pomocą któregokolwiek z tych testów zawierają głównie komórki o zawartości DNA 2N. Profile DNA przeciwnie bramkowanej populacji (oznaczone: P-S780+ lub Non-G1) zawierają komórki o rozkładach od 2N do 4N, zgodnie z takimi komórkami przyjmującymi szereg pozycji cyklu komórkowego po fazie G1.

Chociaż skupiono się tutaj na generowaniu i analizie danych z poszczególnych komórek z obrazów barwionych fluorescencyjnie, przydatna jest również możliwość zebrania tych danych i podsumowania każdego testu na podstawie studni po studni, aby monitorować zmienność między powtórzeniami i wydajność wszystkich studzienek dla danego testu na całej płycie danych. Rysunek 9 przedstawia dane z każdej obróbki siRNA podsumowane jako średnie wartości z potrójnych dołków dla procentu komórek w bramkach zastosowanych do A) danych P-S780 RB1 i B) danych reporterowych GFP-CDK2. Wartości wykreślone w A i B są generowane przez dwa dodatkowe skrypty Perla dostarczone z tym rękopisem; "antibody_fluorescence_summary.pl" i "G1assay_summary.pl". Skrypty te wykorzystują surowe dane utworzone przez Cell Profiler (Nuclei.csv) i raportują dane na i) całkowitą liczbę komórek zmierzonych na studnię, ii) liczbę komórek w bramce, iii) procent komórek w bramce i iv) średnią arytmetyczną zmierzonych, surowych danych dla tej studni. Jest to opcja odpowiednia do przeglądania dużych zestawów danych testowych, przed skupieniem się na indywidualnych danych dotyczących leczenia przy użyciu multipleksowanej oceny danych z poszczególnych komórek, jak pokazano na rysunkach 7 i 8. Przedstawione tutaj wykresy przedstawiają "iii) procentowe komórki w bramce" dla obu testów, które odpowiadają nienormalnym rozkładom danych widocznym dla danych P-S780 RB1 i GFP-CDK2 na histogramach na rysunku 6B. Skrypty te obliczają również "iv) średnią arytmetyczną zmierzonych, surowych danych dla tego odwiertu", co pasowałoby do analizy danych dla jednorodnych odpowiedzi populacji i normalnego rozkładu danych przed i po perturbacji eksperymentalnej.

Rysunek 1: Przegląd etapów procesu roboczego w celu ilościowej analizy danych obrazu mikroskopowego znakowanego fluorescencyjnie. Przepływ pracy jest tutaj reprezentowany w czterech krokach. (A) Po pierwsze, konieczne jest eksperymentalne przygotowanie komórek do obrazowania fluorescencyjnego. Opisany tutaj przykład to badanie przesiewowe, w którym przylegające ludzkie komórki nowotworowe traktowane siRNA są hodowane przez 48 godzin, utrwalane i barwione na 96-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. Różne warunki RNAi występują w trzech egzemplarzach w oddzielnych studzienkach w płytce. Komórki są barwione barwnikiem DNA, przeciwciałem specyficznym dla RB1 fosforylowanym na CDK4 i 6 selektywnym miejscu docelowym Serine-780 (P-S780 RB1), a także stabilnie eksprymują reporter GFP-CDK2, informując o wyjściu z cyklu komórkowego G1. Łącznie te sondy fluorescencyjne stanowią dwa testy oceniane oddzielnie w ramach przepływu pracy. (B) Równoległe obrazy mikroskopowe dla każdej sondy fluorescencyjnej (kanału) są generowane i nazywane w taki sposób, aby zawierały szczegóły, za pomocą których oprogramowanie do analizy obrazu może uporządkować dane. (C) Pliki obrazów są ładowane do oprogramowania Cell Profiler, które algorytmicznie identyfikuje pojedyncze komórki i związane z nimi pary jąder i cytoplazmy, a następnie zapewnia pomiary intensywności dla trzech sond fluorescencyjnych wykrytych w każdej z nich. (D) Wreszcie, skrypt Perla jest używany do organizowania surowych danych ilościowych. Ten krok stosuje bramki do danych o intensywności fluorescencji dla każdej komórki, skutecznie łącząc komórki w subpopulacje, które można wykreślić, śledzić i badać krzyżowo. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Dane eksperymentalne, które należy uzyskać za pomocą analizy obrazu. Utrwalone, potraktowane siRNA, znakowane fluorescencyjnie komórki z przykładowego zestawu danych zostały zobrazowane i wykonano odpowiednie pomiary intensywności dla każdej komórki. Reprezentatywne dane obrazu są wyświetlane dla każdego parametru zarejestrowanego podczas analizy obrazu. (A) Intensywność jądrowego DNA: Intensywność barwienia barwnika jądrowego DNA służy do uzyskania miary DNA na jądro. (B) Intensywność jądrowa fosfo-RB1: Barwienie immunologiczne specyficzne dla P-S780 RB1 przy użyciu pierwszorzędowego (czarnego) przeciwciała i fluorescencyjnie znakowanego przeciwciała drugorzędowego (czerwonego) umożliwia pomiar intensywności fosforylacji RB1 przy S780 na jądro. (C) Reporter GFP-CDK2: Użyte komórki stabilnie wyrażają białko reporterowe znakowane GFP, które przemieszcza się między jądrem a cytoplazmą w ustalonym wzorcu z cyklem komórkowym. Podwójny pomiar intensywności sparowanej jądrowej i cytoplazmatycznej GFP dla każdej komórki pozwala na obliczenie stosunku na komórkę, który można wykorzystać do odróżnienia fazy G1 od reszty cyklu komórkowego. Do zilustrowania analizy zostaną wykorzystane trzy cele siRNA; siRNA z kontroli ujemnej niebędącego celem zwalczania; siRNA CDK6 jako kontrola pozytywna w zaburzeniach fosforylacji RB1 i postępu cyklu komórkowego; RB1 siRNA w celu ustalenia swoistości przeciwciała. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Organizacja plików obrazów przed analizą obrazu. Obrazy pobrane z płytki hodowli tkankowej są systematycznie nazywane, aby umożliwić oprogramowaniu do analizy obrazu odniesienie danych obrazu z powrotem do pierwotnego kontekstu eksperymentalnego. Te informacje są umieszczane w nazwie pliku dla każdego obrazu. (A) Ponieważ każda studzienka na płytce eksperymentalnej może odpowiadać różnym celom lub zabiegom RNAi, adres studzienki stanowi część nazwy pliku. (B) Numer klatki jest częścią nazwy pliku, ponieważ każda studnia jest obrazowana w celu zebrania wielu, nienakładających się na siebie ramek. (C) Sondy fluorescencyjne z każdej klatki są obrazowane oddzielnie; W związku z tym nazwy plików muszą również odzwierciedlać, do którego kanału odnosi się każdy obraz. (D) Przykładowe nazwy plików, odnoszące się do studni (G12), klatka (2), gdzie każdy obraz reprezentuje jeden z kanałów (Niebieski, Czerwony, Zielony). Kropkowane linie łączą elementy nazwy pliku z odpowiednimi reprezentacjami schematu odpowiednio dla Well, Frame i Channel. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Wykorzystanie narzędzia Cell Profiler do pomiaru barwienia jądrowego DNA i przeciwciał. Dzięki ustawieniom w dostarczonym pliku potoku (3_channels_pipeline.cppipe) oprogramowanie do analizy obrazu Cell Profiler mierzy wartości intensywności fluorescencji jądrowego DNA i wiązania przeciwciał w odniesieniu do poszczególnych komórek. (A) Jądra są identyfikowane na "niebieskim" obrazie kanału barwionego DNA. (B) Pozycje jąder barwionych DNA są tymczasowo utrzymywane w "masce jąder". Maska jąder jest następnie nakładana na (C) obrazy kanałów niebieskiego i czerwonego (odpowiednio dane dotyczące fluorescencji DNA i przeciwciał), a wartości fluorescencji z segmentów obrazu, które nakładają się na maskę, są rejestrowane dla każdej zidentyfikowanej komórki. Pomyślna identyfikacja oddzielnych, sąsiadujących ze sobą jąder może być wizualnie oceniona na podstawie wyglądu maski Nuclei. Dla ilustracji, pokazane w kółku na tym obrazie maski, są przykłady, w których wybrane ustawienia algorytmu błędnie zidentyfikowały sąsiednie jądra jako pojedyncze jądro. Dostosowywanie ustawień algorytmu w celu zminimalizowania tych zdarzeń jest wprowadzone w sekcji Dyskusja. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Wykorzystanie narzędzia Cell Profiler do pomiaru intensywności jądrowej i cytoplazmatycznej GFP. Reporter CDK2 znakowany GFP przemieszcza się między jądrem a cytoplazmą w stosunku do pozycji cyklu komórkowego komórek. W tym samym czasie, gdy Cell Profiler oblicza intensywność jądra DNA i przeciwciała na komórkę (ryc. 4), oblicza również stosunek intensywności GFP do cytoplazmy dla każdej komórki. (A) Dane barwnika DNA dla każdego obrazu są wykorzystywane do wygenerowania maski jąder. (B) Cell Profiler wykorzystuje maskę jąder w połączeniu z obrazem GFP z reportera GFP-CDK2 do zasiewania pozycji każdej komórki, a następnie rozszerza się na obwód każdej komórki, aby oszacować całkowity ślad każdej komórki. Staje się to nową "maską komórki". (C) Maska jąder jest odejmowana od maski komórki, aby uzyskać serię konturów cytoplazmy przypominającą pączek, które stają się "maską cytoplazmy". (D) Maska jąder i maska cytoplazmy są używane przez Cell Profiler do pomiaru par jądrowych i cytoplazmatycznych wartości GFP. Te sparowane wartości są następnie wykorzystywane przez Cell Profiler do obliczania stosunków, które informują o pozycji każdej komórki w cyklu komórkowym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Ekstrakcja danych — przetwarzanie surowych danych pojedynczych komórek przez nakładanie bramek na wartości testu. Trendy biologiczne z danych poszczególnych komórek do barwienia przeciwciałami i testów reporterowych GFP-CDK2 są ekstrahowane przy użyciu danych bramkowanych. Histogramy surowych danych umożliwiają identyfikację odpowiednich wartości bramek. Są one następnie nakładane za pomocą skryptu Perla. (A) Produktem końcowym analizy plików obrazów z ustawieniami dostarczonymi dla programu Cell Profiler są pliki z wartościami oddzielonymi przecinkami (.csv). Pliki te zawierajądane poszczególnych komórek odnoszące się do każdego z różnych segmentów subkomórkowych. Plik "Nuclei.csv" zawiera wszystkie wybrane pomiary odnoszące się do użycia maski Nuclei. Pomiary te obejmują intensywność przeciwciał jądrowych, intensywność jądrowego DNA i stosunek GFP (jądro/cytoplazma). (B) Histogramy intensywności przeciwciał jądrowych (po lewej) i współczynniki reporterowe GFP-CDK2 (po prawej) wykreślone na podstawie danych z poszczególnych komórek dla każdego warunku knockdownu siRNA. Paski na wyświetlanych histogramach pokazują pożądane pozycje bramki dla tych testów. Kolorowe dane na histogramach wskazują bramkowane subpopulacje. (C) Bramki dla dwóch testów zilustrowanych w B są stosowane do surowych danych za pomocą skryptu Perla '2_gate_classifier.pl'. Skrypt tworzy zmodyfikowaną kopię oryginalnego pliku wyjściowego (Nuclei.csv) programu Cell Profiler, aby ułatwić późniejsze drukowanie. Dwie wartości bramki są rejestrowane w nowym pliku (tutaj wyróżnione kolorem) i dodawana jest nowa kolumna "Etykieta". Etykiety umieszczają każdą komórkę w jednej z czterech możliwych podgrup na podstawie dwóch wartości testu bramkowanego dla każdej komórki. Etykiety te są używane na kolejnych wykresach, które zawierają obliczenia udziału każdej subpopulacji, a także odniesienia do dodatkowych parametrów wygenerowanych w Cell Profiler. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Wykresy punktowe dla każdego warunku siRNA przedstawiające surowe dane dla poszczególnych komórek i pozycji bramek. Wykresy punktowe danych poszczególnych komórek ze wszystkich obrazów dla wskazanych warunków siRNA: (A) siRB1; B) kontrola ujemna nieukierunkowana na siNon-zwalczanie; (C) siCDK6. Na osi Y wykreślone są wartości fluorescencji jądrowej z barwienia anty-P-S780 RB1. Względem osi X wykreślone są odpowiednie wartości współczynnika obliczone na podstawie raportu GFP-CDK2. Czerwone i zielone paski wskazują pozycje bramek odpowiednio dla bramki P-S780 RB1 i bramki reporterskiej GFP-CDK2. Dwie bramki dzielą komórki na cztery subpopulacje, a liczby w powstałych kwadrantach to procentowa liczba komórek z każdej z nich. Adnotacje wokół osi A wskazują cztery możliwe elementy etykiety zastosowane do każdej komórki przez skrypt 2_gate_classifier.pl Perla. Etykiety te są pokazane w odniesieniu do odpowiedniej bramki testowej i są używane w skrypcie R (analysis.r) do generowania wykresów na rysunkach 6, 7 i 8. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 8: Subpopulacje komórek zdefiniowane przez dwa testy tranzytu G1 wykazują profile DNA 2N i 4N zgodne z wynikami testu. Wykres punktowy danych dla komórek siCDK6 jest powtórzony z rysunku 7C. Wokół wykresu punktowego znajdują się histogramy dla intensywności zintegrowanego jądrowego DNA odnoszące się do podzbiorów populacji. Te powyżej wykresu rozrzutu odnoszą się do testu reporterowego GFP-CDK2. Te po prawej stronie wykresu rozrzutu odnoszą się do samych pomiarów jądrowych przeciwciał fosfo-RB1. Kolorowe linie bramki są przedłużone, aby pokazać ich związek z histogramami. Wyświetlane są również etykiety bramek, za pomocą których wybrano dane komórek dla tych dodatkowych wykresów. Komórki z utratą RB1 fosforylowane na serynie 780 (P-S780-) lub te z wysokim stosunkiem reporterowym jądra do cytoplazmy GFP-CDK2 (wskazującym na niską aktywność CDK2) wykazują głównie profile DNA podobne do 2N, podczas gdy ich przeciwstawne odpowiedniki dla każdego odpowiedniego testu wykazują rozkład 2N i 4N, charakterystyczny dla mieszanej populacji komórek po fazie G1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9: Wykresy podsumowujące wartości testu bramkowanego dla każdego warunku siRNA. Wykresy zbiorcze danych bramkowanych (A) P-S780 RB1 i (B) danych GFP-CDK2 z potrójnych studzienek dla każdego warunku knockdown siRNA. Wartości zostały obliczone na podstawie surowych danych wyjściowych Cell Profiler (Nuclei.csv) przy użyciu skryptów Perla, 'antibody_fluorescence_summary.pl' (A) lub 'G1assay_summary.pl' (B). Wykreślone wartości są średnimi komórek procentowych w bramce zastosowanej do każdego testu. Słupki wskazują błędy standardowe obliczone na podstawie trzech dołków. Niesparowane, homoskedastyczne wartości P testu T dla każdego stanu knockdown w porównaniu z niedocelowym siRNA są pokazane powyżej wykreślonych danych, gdzie P < 0,001 (**) i P < 0,05 (*). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek S1. Konfiguracja oprogramowania Cell Profiler do analizy obrazu. (A) Zrzut ekranu programu Cell Profiler przed wprowadzeniem jakichkolwiek ustawień analizy obrazu. (B) Zrzut ekranu programu Cell Profiler po załadowaniu szczegółów algorytmu zawartych w pliku "3_channels_pipeline.cppipe". Podświetlona zakładka w lewym górnym rogu wskazuje, że na tym ekranie wyświetlane są parametry dla etapu analizy "LoadImages". Kliknięcie na pozostałe części listy poniżej spowoduje ujawnienie szczegółów dotyczących kolejnych kroków w analizie. (C) Zrzut ekranu programu Cell Profiler ze szczegółowymi informacjami na temat wprowadzonego folderu wejściowego i folderu wyjściowego. (D) Zrzut ekranu programu Cell Profiler po kliknięciu przycisku "Analizuj obrazy" w celu rozpoczęcia analizy. Na siebie nakładają się trzy nowe okna ilustrujące algorytmicznie wytworzone maski wygenerowane przez oprogramowanie na podstawie analizowanych obrazów. Dostęp do tych okien można uzyskać, klikając ikony "oka" w pozycji otwartej obok odpowiednich kroków w analizie, w lewym górnym rogu głównego okna Cell Profiler. Widoki te pomagają użytkownikowi zweryfikować, czy ustawienia generujące maski w kolorze konfetti zgadzają się z towarzyszącymi, oryginalnymi danymi w skali szarości.

Rysunek S2. Użycie Perla i RStudio do bramkowania danych poszczególnych komórek i wykreślania wynikowych subpopulacji komórek. (A) Prawy panel pokazuje folder wybrany do odbierania plików .csv wyjściowych (zielone ikony) z analizy Cell Profiler. Skrypty Perla dostarczone z rękopisem (niebieskie ikony) są kopiowane do tego folderu. Podświetlony jest skrypt Perla '2_gate_classifier.pl', który został dwukrotnie kliknięty myszką, aby utworzyć okno dialogowe w lewym panelu. Pokazane są podpowiedzi i odpowiadające im wpisane odpowiedzi niezbędne do wyodrębnienia danych poszczególnych komórek z pliku "Nuclei.csv". (B) Zrzut ekranu RStudio natychmiast po załadowaniu "analizy". Skrypt R'. Wyróżnione są polecenia przesyłania danych bramkowanych z A do oprogramowania przed kreśleniem (szczegóły dotyczące uwag w wierszach 5 i 6 będą musiały zostać dostosowane w zależności od tego, gdzie znajdują się dane bramkowane na komputerze używanym do analizy). (C) Zrzut ekranu programu RStudio po przesłaniu danych. (D) Zrzut ekranu RStudio pokazujący podświetlony blok kodu wymagany do wytworzenia wykresu pokazanego w prawym dolnym oknie. Kody dla każdej działki są oddzielone pustymi liniami i pogrupowane według typu działki.

Cel siRNA	Adresy studni płytowych
Niekierowanie (NT)	E5, F5, G5
Siatkówczak (RB)	E7, F7, G7
Kinaza zależna od cykliny 6 (CDK6)	B2, C2, D2

Tabela 1: Adresy studni i odpowiadające im warunki siRNA użyte w przykładowym zestawie danych.

Discussion

Opisany przebieg pracy obejmuje procedurę wielodołkowej perturbancji komórek przy użyciu siRNA, późniejszej detekcji markerów i wreszcie zastosowania szeregu kroków wspieranych przez oprogramowanie w celu ułatwienia ekstrakcji danych ilościowych z uzyskanych obrazów mikroskopii fluorescencyjnej. Podejście to koncentruje się na dostarczaniu wartości intensywności jądrowej i cytoplazmatycznej dla poszczególnych komórek, co ma szerokie zastosowanie praktyczne w wielu zastosowaniach opartych na komórkach. Przykładowe dane użyte w tym artykule zostały wygenerowane w warunkach przesiewowych siRNA, w których testowane są dwa testy fluorescencyjne dla tranzytu cyklu komórkowego fazy G1 i korelowane z bardziej bezpośrednim biofizycznym pomiarem zawartości jądrowego DNA.

Zastosowanie fluorescencyjnego barwienia DNA do obrazowania jądrowego DNA jest nieodzownym krokiem w procesie segmentacji obrazu, ponieważ umożliwia identyfikację pojedynczych komórek, a uzyskana w ten sposób "maska jąder" służy jako punkt wyjścia do identyfikacji odpowiednich regionów cytoplazmatycznych. Reporter CDK2 znakowany GFP, który ulega stabilnej ekspresji w komórkach, daje zmienny, ale konsekwentnie wyższy niż sygnał tła w cytoplazmie, za pomocą którego można wyznaczyć ten przedział. Ten sam proces analizy powinien mieć zastosowanie do analizy zdarzeń translokacji białek przy użyciu innych odpowiednich reporterów sprzężonych z fluorescencją i ich odpowiedzi na perurbancję. Ponadto zastąpienie reportera GFP-CDK2 barwnikami fluorescencyjnymi specyficznymi dla cytoplazmy pozwoliłoby na alternatywne zastosowanie tego algorytmu do pomiaru wymiarów cytoplazmy i względnych rozmiarów komórek na obrazach.

Innym zagadnieniem projektowym w opisanej tutaj strategii segmentacji obrazu jest wykorzystanie narzędzia Cell Profiler do dostarczania zintegrowanych wartości intensywności do kwantyfikacji DNA. Integracja wartości intensywności dla danych barwienia jądrowego DNA pozwala na możliwe różnice w wielkości jądra i stanowi ścisłe dopasowanie do profili kwantyfikacyjnych obserwowanych dla danych FACS barwionych jodkiem propidyny. Jednakże zintegrowana intensywność może nie stanowić odpowiedniego środka do oceny funkcji białka, w przypadku gdy średnie stężenie, zilustrowane średnią intensywnością fluorescencji antygenu, jest bardziej istotne biologicznie niż zintegrowana całkowita ilość białka (i związana z nią fluorescencja) w kompartmencie komórkowym. W związku z tym dla danych P-S780 RB1 i GFP zastosowano średnie wartości intensywności. Opcja przełączania między dwoma trybami (średnim lub zintegrowanym) oceny danych znajduje się w panelu "Eksport do arkusza kalkulacyjnego" w oprogramowaniu Cell Profiler.

Ustawienia analizy w pliku 3_channels_pipeline.cppipe są zoptymalizowane pod kątem obrazów w przykładowym zestawie danych. Analiza nowych zestawów obrazów za pomocą tego protokołu będzie wymagała, aby nazwy plików przyjęły konwencję nazewnictwa opisaną powyżej (Rysunek 3). Ponadto może być konieczne dostosowanie wartości czułości do jasności barwienia jądrowego DNA oraz progów intensywności tła w nowych zestawach obrazów w ustawieniach Cell Profiler. Biorąc pod uwagę kluczową rolę, jaką barwienie DNA odgrywa w tworzeniu różnych masek segmentacji obrazu, zastosowanie prawidłowych ustawień czułości dla tego kanału jest kluczem do udanej analizy nowych danych obrazowych za pomocą oprogramowania Cell Profiler. Dostarczony plik ustawień programu Cell Profiler (3_channels_pipeline.cppipe) zawiera uwagi dotyczące najczęściej używanych parametrów do dostosowywania analizy do nowych danych. Uwagi te znajdują się w polu tekstowym u góry ekranu w oknie głównym programu Cell Profiler i zawierają wskazówki dotyczące zmiany ustawień czułości i dostosowywania liczby kanałów do analizy. Jak wskazano w sekcji 2.8 Protokołu, w celu przetestowania ustawień dla nowych danych obrazu może być konieczne obserwowanie segmentacji obrazu podczas analizy obrazu poprzez kliknięcie otwierających ikony "oka" dla każdego z kroków protokołu "Identyfikuj...Obiekty" (Rysunek S1D). W szczególności wizualizacja danych obrazu za pomocą funkcji "IdentifyPrimaryOjects" pokaże, czy maska jąder jest prawidłowo identyfikowana na podstawie obrazów barwienia DNA. Na stronie oprogramowania Cell Profiler dla modułu "IdentifyPrimaryOjects" znajduje się współczynnik korekcji progu. Próba i błąd dostosowanie tej wartości naprawi większość błędów rozpoznawania jądra. Wartości równoważą kanał DNA z intensywnością tła dla każdego obrazu. Wartości progowego współczynnika korekcji oscylują wokół 1, gdzie większa wartość jest bardziej rygorystyczna (dobra w przypadku wyraźnych obrazów), a mniejsza niż 1 jest pobłażliwa (odpowiednia dla obrazów o mniejszym kontraście między barwieniem a tłem).

Nieprzetworzone dane wyjściowe poszczególnych komórek z Cell Profiler mogą być analizowane na różne sposoby, aby dostosować je do potrzeb innych badań. Pokazano tutaj użycie skryptu Perla do zastosowania bramek do dwóch parametrów mierzonych na komórkę, aby pomóc w wyodrębnieniu trendów biologicznych z danych i umożliwić odniesienie zidentyfikowanych subpopulacji do dodatkowych pomiarów. Chociaż równie możliwe jest włączenie elementów bramkowania w ramy Cell Profiler, alternatywna trasa zastosowana w tym przypadku zapewnia większą elastyczność i szybkość, szczególnie w przypadku konieczności oceny dużych zbiorów danych. Najwolniejszym etapem w fazach akwizycji obrazu obecnego protokołu jest uruchomienie oprogramowania Cell Profiler. Profiler komórek jest tutaj uruchamiany bez narzucania bramek w celu wytworzenia niebramkowanego zestawu surowych danych, który może być ponownie przeanalizowany za pomocą kolejnego skryptu Perla szybciej i, jeśli to konieczne, iteracyjnie z różnymi wartościami bramek. Nie wszystkie badania będą znały z wyprzedzeniem odpowiednie wartości bramek, ponieważ mogą się one różnić w zależności od odczynników w dowolnym zestawie danych i potencjalnie w czasie. W związku z tym zaleca się generowanie histogramów przedstawiających rozkład surowych danych uzyskanych z Cell Profiler dla kontroli pozytywnych i komórek z pozorowanymi zaburzeniami w celu zidentyfikowania odpowiednich wartości bramek dla parametrów będących przedmiotem zainteresowania.

Skrypty Perla są napisane tak, aby akceptować sztywno zdefiniowaną strukturę kolumn danych z Cell Profiler i mogą przestać działać, jeśli użytkownik zmodyfikuje liczbę parametrów wyświetlanych przez Cell Profiler za pomocą ustawień "ExportToSpreadsheet". Aby pomóc w implementacji modyfikacji ustawień, notatki są zawarte w plikach skryptów Perla. Aby je zobaczyć, wyświetl skrypt w edytorze tekstu, najlepiej w edytorze tekstu programisty ustawionym na kodowanie kolorami elementów Perla (np. http://www.activestate.com/komodo-edit). Te uwagi wskazują, gdzie należy dostosować skrypt, aby dostosować go do zmian w formacie danych. Podobnie jak w przypadku skryptów Perla, dostarczony plik R-code (analysis.r), zawierający instrukcje dotyczące wykreślania figur z danych analizy obrazu, można odczytać w edytorze tekstu lub oprogramowaniu RStudio, aby zobaczyć dodatkowe uwagi dotyczące użytkowania i adaptacji. Notatki te mogą być uzupełnione o szczegóły dotyczące wyrażeń regularnych i Perla¹² oraz pakietu ggplot2¹³ dla R, które stanowią podstawę dla tego, jak dane są odczytywane, opisywane i kreślone, odpowiednio.

Nowe badania wykorzystujące mikroskopię fluorescencyjną, a także surowe dane zdeponowane w publikacjach open source są podatne na metody analizy, takie jak te opisane tutaj. Sama natura danych o wysokiej zawartości nadaje się do analizy rekurencyjnej z różnymi akcentami analitycznymi w zależności od zainteresowań badawczych danego obserwatora. Chociaż pytania, które można zadać w odniesieniu do danych, są ograniczone przez pierwotnie użyte sondy, dane obrazowe mogą być często sensownie ponownie przeanalizowane poza zakresem badań, które je wygenerowały.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AllStars kontrola negatywna siRNA	Qiagen	1027280	Kontrola negatywna siRNA.
CDK6 siRNA	Dharmacon/ Niestandardowa synteza	NA	Sekwencja antysensowna: 5' CUCUAGGCCAGUCUUCUUCUU
RB1 siRNA	Dharmacon/ Niestandardowa synteza	NA	Sekwencja antysensowna: 5' GGUUCAACUACGCGUGUAATT
5x bufor siRNA	Thermo Scientific	B-002000-UB-100	Do rozcieńczenia wodą bez nukleaz, nieuzdatnioną DEPC.
Woda bez nulustu (bez DEPC)	Applied Biosystems	AM9937	Do rozcieńczania buforu siRNA.
Hiperfect	Qiagen	301705	Transfekcja lipidów.
DMEM	Life Technologies	41966052	pożywki do hodowli tkankowych z pirogronianem i wysoką glukozą.
96-dołkowa płytka do hodowli tkankowej	Falcon	3072	Plain, 96-dołkowa płytka do hodowli tkankowej do równoległego, przedziałowego mieszania kompleksów transfekcyjnych.
Packard Viewplate	Perkin Elmer LAS	6005182	96-dołkowa płytka TC z podstawą optyczną, na której komórki są transfekowane, hodowane, mocowane i ostatecznie obrazowane. Dostarczane z nieprzezroczystymi, samoprzylepnymi uszczelkami płytowymi, które są używane podczas przechowywania zużytych płyt.
Oddychająca	membrana Alpha Labs	LW2783	Sterylna, przepuszczająca gazy, przyczepna membrana.
Neutralna buforowana formalina, 10%	Sigma-Aldrich	HT5012-1CS	10% Formalina (4% formaldehyd) utrwalacz stosowany zgodnie z protokołem.
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100PC	Niejonowy detergent
[nagłówek]
Tris	Sigma-Aldrich	T1503	Trizma base (tris(hydroksymetylo)aminometan)
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287	Do roztworu do mycia płyt.
Przeciwciało anty-P-S780 RB1	Abcam	ab32513	Monoklonalne królicze
AlexaFluor647 Anty-królicze	Invitrogen	A21245	Wysoce adsorbowane krzyżowo, znakowane fluorescencyjnie przeciwciało drugorzędowe.
Hoechst 33342 (bisbenzimid)	Sigma-Aldrich	B2261	Fluorescencyjny, interkalujący chromatynę, barwnik DNA.
Roztwór permeabilizacyjny	NA	NA	0,1% Triton X-100 w 50 mM soli fizjologicznej buforowanej Tris, pH 8,0.
Roztwór do płukania płytek	NA	NA	Tris-buforowany solą fizjologiczną zawierający 0,1% Tween-20.
Roztwór blokowy	NA	NA	5% mleko w proszku w soli fizjologicznej buforowanej Tris i 0,1% Tween-20. Do blokowania płytki przed barwieniem immunologicznym i rozcieńczaniem przeciwciał.
Cell Profiler 2.1	Broad Institute		http://www.cellprofiler.org/download.shtml
Active Perl Community Edition	ActiveState		http://www.activestate.com/activeperl/downloads
R	Foundation		http://www.r-project.org
Rstudio	Rstudio		http://www.rstudio.com/