Przepływ pracy dla wysokiej zawartości, indywidualnej kwantyfikacji komórek markerów fluorescencyjnych na podstawie danych z mikroskopu uniwersalnego, wspierany przez oprogramowanie Open Source

Podsumowanie

Presented to elastyczny przepływ pracy w informatyce, umożliwiający multipleksowaną analizę obrazów fluorescencyjnie znakowanych komórek. Przepływ pracy określa ilościowo markery jądrowe i cytoplazmatyczne oraz oblicza translokację markerów między tymi przedziałami. Przedstawiono procedury perturbacji komórek z wykorzystaniem siRNA oraz wiarygodną metodologię wykrywania markerów za pomocą immunofluorescencji pośredniej w formatach 96-dołkowych.

Streszczenie

Postępy w zrozumieniu mechanizmów kontrolnych rządzących zachowaniem komórek w przylegających do siebie modelach hodowli tkanek ssaków stają się coraz bardziej zależne od sposobów analizy pojedynczych komórek. Metody, które dostarczają złożonych danych odzwierciedlających średnie wartości biomarkerów z populacji komórek, grożą utratą dynamiki subpopulacji, która odzwierciedla heterogeniczność badanego systemu biologicznego. W związku z tym tradycyjne podejścia są zastępowane lub wspierane przez bardziej wyrafinowane formy testów komórkowych opracowane w celu umożliwienia oceny za pomocą mikroskopii o wysokiej zawartości. Testy te potencjalnie generują dużą liczbę obrazów biomarkerów fluorescencyjnych, co jest możliwe dzięki dołączonym zastrzeżonym pakietom oprogramowania, co pozwala na wieloparametryczne pomiary na komórkę. Jednak stosunkowo wysokie koszty kapitałowe i nadmierna specjalizacja wielu z tych urządzeń uniemożliwiły ich dostęp do wielu badaczy.

Opisany tutaj jest uniwersalny proces pracy do ilościowego oznaczania intensywności wielu markerów fluorescencyjnych z określonych subkomórkowych regionów pojedynczych komórek, odpowiedni do użycia z obrazami z większości mikroskopów fluorescencyjnych. Kluczem do tego przepływu pracy jest implementacja ogólnodostępnego oprogramowania Cell Profiler¹ w celu rozróżnienia poszczególnych komórek na tych obrazach, podzielenia ich na zdefiniowane regiony subkomórkowe i dostarczenia wartości intensywności markerów fluorescencji specyficznych dla tych regionów. Ekstrakcja indywidualnych wartości intensywności komórek z danych obrazowych jest głównym celem tego przepływu pracy i zostanie zilustrowana analizą danych kontrolnych z ekranu siRNA dla regulatorów punktów kontrolnych G1 w przylegających komórkach ludzkich. Jednak przedstawiony tutaj przepływ pracy może być zastosowany do analizy danych z innych środków perturbacji komórek (np. złożonych badań przesiewowych) i innych form markerów komórkowych opartych na fluorescencji, a zatem powinien być przydatny dla szerokiego zakresu laboratoriów.

Wprowadzenie

Praca przedstawiona tutaj opisuje użycie darmowego oprogramowania Cell Profiler do przeprowadzenia sterowanego algorytmem podziału obrazów mikroskopowych fluorescencyjnych przylegających komórek w celu identyfikacji pojedynczych komórek i zdefiniowanych regionów subkomórkowych. Podejście to, określane jako segmentacja obrazu, umożliwia późniejszą wieloparametryczną analizę obrazowanych komórek poprzez ilościowe oznaczanie markerów znakowanych fluorescencyjnie zlokalizowanych w każdej komórce lub regionie subkomórkowym (określanych jako obiekty segmentowane). Ten przepływ pracy stanowi podstawę do umożliwienia analizy o wysokiej zawartości i ma służyć jako narzędzie, które może być dalej rozwijane i modyfikowane w celu dopasowania do wieloparametrycznych, indywidualnych analiz komórek w laboratoriach bez dostępu do specjalistycznych instrumentów o wysokiej zawartości lub zastrzeżonego oprogramowania. Pliki dostarczone z tym manuskryptem zawierają zestaw testowy odpowiednich surowych danych obrazu, ustawień algorytmu i skryptów pomocniczych do wygenerowania opisanej analizy. Podane ustawienia algorytmu dla narzędzia Cell Profiler są zoptymalizowane pod kątem przykładowego zestawu danych, a sekcja Dyskusja zawiera szczegółowe informacje o tym, jakie korekty mogą być konieczne, aby umożliwić korzystanie z danych obrazowych z innych badań.

Po wyodrębnieniu danych ilościowych za pomocą Cell Profiler, różne laboratoria mogą mieć różne wymagania co do sposobu wykorzystania informacji prezentowanych przez poszczególne wartości komórek w surowych danych; tutaj pokazano jedno podejście, za pomocą którego do surowych danych stosuje się bramki dla każdego testu. Za pomocą tych bramek dane są przekształcane w binarne warunki odpowiedzi, co pozwala na wizualizację trendów łączących różne terapie z subpopulacjami komórek poddawanych odpowiedzi zdefiniowanej przez bramki. Bramki ustala się na podstawie obserwacji rozkładów danych uzyskanych dla odpowiednich kontroli ujemnych i dodatnich dla każdego istotnego pomiaru. Wykorzystanie bramek to tylko jeden z przykładów zarządzania surowymi pomiarami opartymi na komórkach. Pokazano tu również wykorzystanie pomiarów intensywności jądrowego DNA w ich surowej postaci jako ciągłego zakresu wartości w połączeniu z bramkowanymi danymi. Należy rozważyć inne podejścia do zarządzania danymi analizy obrazu, w zależności od charakteru badania; Opisano statystyczne alternatywy dla stosowania bramek do przypisywania komórek do subpopulacji² oraz systematyczne porównania strategii podsumowywania danych o wysokiej zawartości w dużej liczbie parametrów³.

Analizy danych obrazowych o wysokiej zawartości znalazły zastosowanie w badaniach komórkowych nad reakcją na leki, genetyką odwróconą i sygnalizacją stresu środowiskowego ^4-6. Zaleta analizy o wysokiej zawartości wynika z faktu, że algorytmiczna analiza danych z mikroskopii fluorescencyjnej pozwala na jednoczesne uwzględnianie parametrów ilościowych i przestrzennych w poszczególnych komórkach⁷. W ten sposób można porównywać wyniki komórkowe dla wielu testów, śledzić zróżnicowane zachowanie subpopulacji komórek zdefiniowanych w teście w warunkach eksperymentalnych, a testy mogą obejmować uwzględnienie zmiennych morfologicznych. Omówione tutaj strategie i przepływ pracy analizy, podobnie jak w przypadku innych podejść o wysokiej zawartości, są w stanie dostarczyć multipleksowane dane, które są powiązane z poszczególnymi komórkami. Metody o wysokiej zawartości pasują do badań, które generują obrazy z mikroskopu fluorescencyjnego i mają zastosowanie do analizy danych, począwszy od dziesiątek obrazów wytwarzanych w konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej o niskiej przepustowości, a skończywszy na tysiącach obrazów wytwarzanych przy użyciu zautomatyzowanych platform przesiewowych o wysokiej zawartości.

Przepływ pracy jest tutaj zilustrowany przykładowymi danymi, z których mierzone są oddzielne testy, odpowiednio pod względem intensywności markerów fluorescencyjnych lub translokacji jądrowej/cytoplazmatycznej białka reporterowego fluorescencyjnego. Przepływ pracy jest elastyczny, ponieważ testy te mogą być rozpatrywane osobno lub w połączeniu, w zależności od każdego pytania badawczego przez różnych badaczy. Przykładowe dane są tworzone w ramach eksperymentu z interferencją RNA (RNAi) (rysunek 1). Małe interferujące oligonukleotydy RNA (siRNA) są używane do niszczenia określonych białek w ludzkich komórkach raka jelita grubego HCT116, co powoduje zmiany dla dwóch fluorescencyjnych reporterów aktywności kinazy zależnej od cyklin (CDK). Zależną od CDK6 fosforylację białka siatkówki jądrowej w serynie 780 (P-S780 RB1) ocenia się za pomocą barwienia przeciwciałami. W tych samych komórkach reporter aktywności CDK2 znakowany zielonym białkiem fluorescencyjnym (reporter GFP-CDK2) jest oceniany na podstawie jego stosunku jądrowego do cytoplazmatycznego, gdzie przy braku aktywności CDK2 reporter znajduje się w jądrze, a po aktywacji CDK2 przemieszcza się do cytoplazmy⁸. Dodatkowo, jądrowe DNA każdej komórki jest barwione przy użyciu barwnika interkalującego DNA, bisbenzimidu, który służy jako środek do identyfikacji komórek i definiowania granic jąder na obrazach, a także jako miara obfitości DNA dostarczająca informacji o pozycji komórki w cyklu komórkowym (ryc. 2).

Aktywności CDK6 i CDK2 są wykrywalne jako komórki przechodzące z fazy G1 do S cyklu komórkowego⁵ i następują po sobie^9,10 i w związku z tym oczekuje się ścisłej zgodności między dwoma reporterami w poszczególnych komórkach. Zastosowany tutaj zestaw danych demonstracyjnych analizuje jako przykład wpływ siRNA na CDK6, białko siatkówczaka (RB1) i nieukierunkowaną kontrolę negatywną (Tabela 1). Knockdown CDK6 powinien wywołać zarówno zmniejszenie epitopu RB1 P-S780, jak i akumulację komórek w fazie G1 cyklu komórkowego. Nokaut RB1 służy jako odczynnik kontrolny dla specyficzności przeciwciała fosfo-S780. Obrazy z mikroskopu fluorescencyjnego z utrwalonych^{formaliną, 11}, fluorescencyjnie barwionych komórek hodowli tkankowej HCT116 są wykorzystywane do algorytmicznej analizy obrazu. Uzyskane w ten sposób dane liczbowe są następnie wykorzystywane do porównywania osób zgłaszających i mierzenia wpływu różnych stanów powalających.

Potencjalny rozmiar danych generowanych przez ten rodzaj analizy może stanowić wyzwanie dla normalnych narzędzi analizy. Na przykład dane poszczególnych komórek mogą być większe niż może pomieścić niektóre programy do arkuszy kalkulacyjnych. Dołączone są skrypty Perla, które wykonują proste, wysoce powtarzalne, nadzorowane przetwarzanie danych, aby pomóc w analizie dużych zbiorów danych. Skrypty Perla są pisane specjalnie dla plików wyjściowych tworzonych przez program Cell Profiler podczas przetwarzania plików obrazów z określoną konwencją nazewnictwa plików (Rysunek 3) i pozwalają na użycie w analizie zmiennej liczby pól na studzienkę. Często ważne jest, aby bramkować dane testowe poszczególnych komórek w celu śledzenia trendów w subpopulacjach komórek⁵, a tutaj pokazano użycie skryptu Perla do oznaczania każdej komórki na podstawie ustawionej bramki wstępnie określonej dla każdego typu testu. Dołączone są również opcjonalne skrypty Perla, które podsumowują wyniki danych dla poszczególnych dołków (lub warunków), dostarczając: procentu komórek w ustawionej bramce i średnich wartości surowych wyników testu. Drugi, bardziej jednorodny sposób przeglądania danych, jest prawidłowy tam, gdzie odpowiedzi wpływają na wszystkie lub większość komórek w studni. Jak omówiono powyżej, taka ocena jest mniej przydatna niż ta, którą zapewnia bramkowanie danych z poszczególnych komórek, w których odpowiedź jest ograniczona do podzbioru komórek w populacji.

Użyteczność opisanego przepływu pracy nie ogranicza się do perturbacji przez siRNA lub opisane testy markerów. W badaniach wykorzystano to podejście do oznaczania odpowiedzi w eksperymentach z hodowlą tkankową z wykorzystaniem kombinacji siRNA, inhibitorów chemicznych i radioterapii oraz do oceny markerów innych niż aktywność CDK6 i CDK2⁵.

Koncepcyjnie, eksperymentalna strategia pozwala na automatyczne rejestrowanie różnych biologicznie użytecznych regionów subkomórkowych w pojedynczych komórkach obecnych na obrazach z mikroskopu fluorescencyjnego. W związku z tym podejście to może dostarczyć ilościowych, multipleksowanych danych ujawniających informacje biologiczne, które mogą zostać pominięte przez techniki koncentrujące się na populacjach, a nie na pojedynczych komórkach. Przy niewielkich modyfikacjach opisane podejście i proces analizy mogą dostarczyć ilościowych, indywidualnych danych komórkowych dla dowolnych wyników testów opartych na fluorescencji i odpowiedzi biologicznych komórki, w których interesująca jest ilościowa ocena zawartości DNA, kwantyfikacja fluorescencji jądrowej lub cytoplazmatycznej lub przenoszenie markerów między tymi dwoma przedziałami, indywidualnie lub w sposób multipleksowany. Ponieważ wymagania dotyczące publikowania coraz częściej skłaniają się ku przesyłaniu publicznie dostępnych danych surowych, dostęp do bezpłatnych narzędzi do analizy obrazów mikroskopowych, takich jak te opisane tutaj, oraz znajomość tych narzędzi będą również bezpośrednio interesujące dla laboratoriów, które chcą ponownie przeanalizować opublikowane dane.

Protokół

1. Eksperymentalne zaburzenia i znakowanie komórek dla markerów odpowiedzi (badanie siRNA z odwróconą transfekcją)

1. W sterylnej pipecie kapturowej do hodowli tkanek 70 μl siRNA 200 nM w buforze 1x siRNA w studzienkach sterylnej, gładkiej płytki 96-dołkowej. Rozcieńczyć lipid transfekcyjny w 40 objętościach pożywki DMEM bez surowicy i dozować 105 μl do każdej studzienki zawierającej siRNA.
   UWAGA: Rozcieńczenie 262,5 μl lipidu w 10,5 ml DMEM bez surowicy daje mieszankę wzorcową odpowiednią dla całej 96-dołkowej płytki siRNA, dostarczając 2,6 μl lipidu na dołek. Zastosowanie początkowego stężenia siRNA 200 nM na tym etapie zapewni stężenie robocze 20 nM w kroku 1.3, ale procedury będą działać w przypadku stężeń roboczych do 5 nM, przy odpowiednim dostosowaniu stężenia początkowego (tj. 50 nM). Niższe stężenie robocze może zmniejszyć liczbę wyników fałszywie dodatnich poza celem, chociaż może zmniejszyć wielkość odpowiedzi na cel, prowadząc do wzrostu odsetka wyników fałszywie ujemnych na celu.
2. Mieszaj płytkę delikatnymi wibracjami przez dziesięć minut w temperaturze pokojowej. Otrzymane 175 μl należy podzielić na trzy powtórzenia po 50 μl na cel na nieprzezroczystą, 96-dołkową płytkę z przezroczystą podstawą poddaną działaniu kultury tkankowej.
3. Odwrotny transfekt poprzez dozowanie 8 000 komórek na studzienkę w 150 μl DMEM zawierającym 10% surowicy bezpośrednio do 50 μl kompleksów lipidowo-siRNA. Ludzkie komórki jelita grubego HCT116 stabilnie eksprymują marker znakowany GFP, raportujący aktywność CDK2^5,8. Nie jest konieczne dalsze mieszanie. Uszczelnij płytkę sterylną, samoprzylepną, oddychającą membraną, aby kontrolować wilgotność i zapobiec "efektom krawędziowym" płytki, a następnie umieść płytkę w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ na 48 godzin.
4. Zassać pożywkę tak, aby niewielka pozostała ilość pożywki w studzienkach. Utrwal komórki, dodając 100 μl 4% buforowanego formaldehydu do każdej studzienki i inkubuj w dygestorium przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
5. Usunąć roztwór utrwalający, zasysając płytkę. W tym momencie albo należy przerwać eksperyment, przemywając płytkę trzykrotnie 100 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), a następnie przechowywać szczelnie zapieczętowane, poniżej 100 μl PBS w ciemności w temperaturze 4 °C przez okres do tygodnia, albo przystąpić do przepuszczalności komórek.
   UWAGA: Zalecamy obróbkę płytek tak szybko, jak to możliwe po utrwaleniu i generalnie preferujemy przechowywanie w pełni przetworzonych płyt. Biobójcze środki konserwujące, takie jak tiomersal, azydek sodu lub komercyjne alternatywy, mogą być dodawane w celu zapobiegania rozwojowi micoroganizmu. Dodanie inhibitorów fosfatazy pomaga w zachowaniu fosfoepitopów, a inne sposoby zachowania stanów modyfikacji białek mogą być przydatne w odpowiednich kontekstach testowych
6. Usunąć PBS z płytki i przepuszczalność komórek, dodając 100 μl roztworu do przepuszczalności. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej bez wstrząsania. Odessać roztwór przepuszczalny za pomocą pipety wielokanałowej. Powtórz ten krok trzy razy.
7. Zablokuj komórki, dodając 100 μl roztworu blokowego na studzienkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć roztwór blokowy, zasysając płytkę, a następnie sondować 50 μl przeciwciała anty P-S780 RB1 rozcieńczonego 500-krotnie w roztworze blokowym przez 2 godziny w ciemności w temperaturze pokojowej.
8. Umyj płytkę trzykrotnie 100 μl roztworu do przemywania płytek, pozostawiając roztwór na płytce na 5 minut za każdym razem. Sondować płytkę przez noc w ciemności w temperaturze 4 °C z 50 μl fluorescencyjnie znakowanego przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego 1000-krotnie w roztworze blokowym uzupełnionym 2 μM specyficznego dla chromatyny barwnika DNA bisbenzimidu. Umyć płytkę trzy razy, tak jak poprzednio, i przechowywać szczelnie zamkniętą, w temperaturze poniżej 100 μl PBS, w ciemności w temperaturze 4 °C. Zobrazować płytkę w ciągu dwóch tygodni.

2. Obrazowanie i segmentacja obrazu

1. Użyj konfokalnego lub wirującego mikroskopu fluorescencyjnego z obiektywem 20X, aby wykonać oddzielne 16-bitowe obrazy TIFF w skali szarości w trzech kanałach odpowiadających barwnikowi DNA, GFP i fluoroforom barwiącym immuno. Przechwyć wiele nienakładających się na siebie zestawów obrazów, nazywanych tutaj ramkami, aby zobrazować około 1,000-2,000 komórek na studzienkę.
2. Nazywaj pliki obrazów systematycznie, tak aby każda nazwa pliku była unikalną kombinacją "nazwy eksperymentu", "adresu studni", "numeru ramki" i "identyfikatora kanału" w tej kolejności (Rysunek 3). Przykładowy zestaw danych używa "Niebieskiego" (barwienie DNA chromatyny) lub "Zielonego" (GFP) lub "Czerwonego" (fluoroforu barwionego immunologicznie) jako identyfikatorów kanałów. Adres studni, numer ramki i identyfikator kanału są dalej określane jako metadane obrazu. Użyj symbolu podkreślenia, aby uniknąć mylenia metadanych i ramki.
3. Nazwij pliki z tymi elementami metadanych w określonej kolejności. Jest to konieczne, aby upewnić się, że kolejne kroki oprogramowania prawidłowo grupują zestawy obrazów do analizy.
4. Pobierz i zainstaluj darmowe oprogramowanie Cell Profiler, Active Perl Community Edition, statystyczne środowisko programistyczne R i RStudio. Zaakceptuj wszystkie opcje domyślne podczas instalacji; Użytkownicy komputerów PC instalujący Active Perl powinni włączyć wszystkie opcje związane ze ścieżką, powiązaniem rozszerzenia pliku i mapowaniem skryptów, jeśli zostanie o to poproszony. Aktywny Perl jest opcjonalny dla użytkowników komputerów Mac, ale w przeciwnym razie będą musieli uruchomić skrypt Perla w kroku 3.2 z wiersza poleceń terminala, zamiast klikać ikony.
5. Otwórz oprogramowanie Cell Profiler, kliknij "Plik", "Importuj potok", a następnie "Z pliku" i wybierz plik 3_channels_pipeline.cppipe (rysunki S1A i S1B). Plik zawiera instrukcje niezbędne do tego, aby oprogramowanie mogło interpretować metadane pliku obrazu na podstawie opisanej konwencji nazw plików. Cell Profiler łączy teraz obrazy, ekstrahuje z nich intensywność jądrowego DNA i przeciwciał oraz wykorzystuje kanał GFP do obliczenia stosunku intensywności jądra do intensywności cytoplazmy dla każdej wykrytej komórki (ryc. 4 i 5).
6. Kliknij przycisk "Wyświetl ustawienia wyjściowe" w lewym dolnym rogu okna Cell Profiler. U góry nowego ekranu znajdują się pola tekstowe oznaczone jako "Domyślny folder wejściowy" i "Domyślny folder wyjściowy". Pojedynczo klikaj ikony folderów po prawej stronie tych pól i wybierz odpowiednio lokalizację plików obrazów do analizy i miejsce docelowe wyodrębnionych danych (Rysunek S1C).
7. Rozpocznij analizę obrazu, naciskając przycisk "Analizuj obrazy" w lewym dolnym rogu programu Cell Profiler. U dołu ekranu obserwuj pozostały czas ekstrakcji danych, przyciski "Zatrzymaj analizę" i "Pauza". W razie potrzeby wstrzymaj analizę, wybierając przycisk "Pauza" w dowolnym momencie, który jest przydatny podczas oglądania analizowanych obrazów (opisanych w kroku 2.8).
8. Opcjonalnie otwórz okna dla dowolnego kroku analizy obrazu, klikając ikony oczu w panelu po lewej stronie okna programu (Rysunek S1D). Obserwuj okno "IdentifyPrimaryObjects" oraz okna "Obiekty drugorzędne" i "Obiekty trzeciorzędne", aby sprawdzić, czy bieżące ustawienia w programie Cell Profiler do segmentacji obrazu są odpowiednie (patrz Rysunek 1 i Dyskusja, aby uzyskać porady dotyczące modyfikowania tych ustawień).
9. Kliknij "OK" w oknie komunikatu, które pojawia się po zakończeniu analizy. Przejdź do lokalizacji "Domyślny folder wyjściowy", w której wszystkie pliki danych z wynikami są zapisywane jako pliki o wartościach rozdzielanych przecinkami (.csv) (Rysunek S2A).

3. Ekstrakcja danych

1. Znajdź nowy plik 'Nuclei.csv', który znajduje się wśród danych wyjściowych programu Cell Profiler. Plik ten zawiera dane poszczególnych komórek dla intensywności fluorescencyjnych przeciwciał jądrowych, intensywności jądrowego DNA i wartości współczynnika reporterowego GFP-CDK2 (ryc. 6A i S2A).
   UWAGA: Różne laboratoria będą chciały przetwarzać tego typu dane tak, aby odpowiadały charakterowi ich własnych testów. Sugerowane dla obecnych danych jest bramkowanie komórek z każdego stanu leczenia zgodnie z danymi przeciwciał i wartościami reporterowymi GFP-CDK2 przy użyciu dostarczonego skryptu Perla "2_gate_classifier.pl".
2. Skopiuj dostarczony plik skryptu Perla "2_gate_classifier.pl" do tego samego folderu, co plik danych "Nuclei.csv" (Rysunek S2A). Kliknij dwukrotnie ikonę skryptu Perla i po wyświetleniu monitu wpisz pełną nazwę pliku danych, a następnie nazwę pliku ".csv" dla pliku, w którym komórki mają być bramkowane, a na końcu wartości bramki dla fluorescencji przeciwciała i danych reportera GFP-CDK2.
   UWAGA: Sposób zasadniczego określania ustawień bramki i stosowania ich do analizy danych omówiono poniżej w sekcji Dane reprezentatywne i na rysunku 6 (do analizy dostarczonych danych należy użyć odpowiednio "0,004" i "1,5"). Użytkownicy komputerów Mac powinni uruchomić skrypt Perla z wiersza poleceń terminala, wpisując: 'perl 2_gate_classifier.pl'.
3. Obserwuj nowo utworzony plik, który łączy surowe wartości testów pojedynczych komórek z oryginalnych danych Cell Profiler z etykietami subpopulacji, które pokazują, jak każda komórka z każdej studzienki radzi sobie z obiema bramkami (Rysunek 6C).
4. Wykreśl dane dla każdego warunku eksperymentalnego przy użyciu etykiet poszczególnych subpopulacji komórek, otwierając oprogramowanie RStudio. Kliknij "Plik" i "Otwórz plik", a następnie wybierz dostarczony plik "analysis.r". Postępuj zgodnie z poleceniami, aby wykreślić rysunki 6B, 7 i 8 w lewym górnym oknie programu RStudio (Rysunek S2B). W lewym górnym oknie, między symbolami podwójnego cudzysłowu w wierszach 5 i 6, wpisz adres komputera folderu zawierającego dane bramkowane. Dołącz odpowiednio literę dysku i nazwę samego pliku (np. "C:/analysis folder/analysis output" i "nuclei_gated.csv").
   UWAGA: Jeśli program RStudio jest używany po raz pierwszy na danym komputerze, należy najpierw zainstalować pakiet graficzny języka R "ggplot2". Jest to jednorazowy krok dla nowej instalacji programu RStudio, po którym ten krok staje się zbędny. Aby zainstalować "ggplot2", kliknij kartę o nazwie "Pakiety" nad oknem w prawym dolnym rogu RStudio, kliknij przycisk "Zainstaluj pakiety", który pojawia się poniżej. Pojawi się nowe okno. Wpisz "ggplot2" (pomijając cudzysłowy) w polu "Pakiety" w tym nowym oknie i na koniec kliknij przycisk "Zainstaluj", aby zamknąć okno, zainstalować niezbędne funkcje ggplot2 i powrócić do głównego okna RStudio, aby kontynuować od kroku 3.6.
5. Podświetl linie od 1 do 17 w lewym górnym oknie programu RStudio, a następnie kliknij przycisk "Uruchom". Spowoduje to wprowadzenie danych eksperymentalnych, wartości progowych i szczegółów lokalizacji odwiertu do R (rysunek S2C). R będzie teraz tymczasowo przechowywać odpowiednie dane do wykreślenia.
6. Zaznacz poszczególne bloki pozostałego kodu poniżej wiersza 17 i utwórz odpowiednie wykresy, klikając przycisk "Uruchom", tak jak poprzednio. Obserwuj wykresy w oknie w prawym dolnym rogu RStudio i zapisz liczbę formatów, klikając przycisk "Eksportuj" (rysunek S2D).
7. Podczas zamykania programu RStudio kliknij przycisk "Nie zapisuj" po wyświetleniu monitu. Zapobiega to nieporozumieniom przy następnym użyciu programu RStudio, który w przeciwnym razie będzie zawierał dane z poprzedniej sesji.

Wyniki

Przykładowy zestaw obrazów wygenerowanych przy użyciu protokołu przesiewowego z zastosowaniem odwrotnej transfekcji siRNA został przygotowany i przeanalizowany za pomocą oprogramowania Cell Profiler. Powstałe numeryczne dane surowe są sformułowane w taki sposób, że każda komórka jest reprezentowana indywidualnie, co pozwala na prześledzenie jej pochodzenia aż do obrazu i konkretnej studzienki, a także na pomiar kilku parametrów intensywności fluorescencji (Rysunek 6A). Dla każdej zidentyfikowanej komórki wyznacza się średnią intensywność fluorescencji jądra dla przeciwciała P-S780 RB1 oraz zintegrowaną intensywność DNA dla masek jądra zdefiniowanych przez barwnik DNA. Rejestrowane są również średnie wartości intensywności GFP dla obszarów jądra i cytoplazmy każdej komórki, co umożliwia obliczenie fluorescencji jądrowej w stosunku do cytoplazmatycznej reportera GFP-CDK2. W dalszej części, po tych algorytmicznych pomiarach intensywności fluorescencji, dane z poszczególnych komórek służą do zdefiniowania bramek dla dwóch testów: barwienia przeciwciałami jądrowymi oraz reportera GFP-CDK2. Opisano również późniejszą adnotację komórek na podstawie wyników testów oraz wykorzystanie tych etykiet w celu umożliwienia dalszej charakterystyki specyficznych subpopulacji za pomocą trzeciego pomiaru (zawartości DNA w jądrze).

Wykresy histogramów surowych danych intensywności fluorescencji zebranych dla każdego testu są skutecznym sposobem oceny zachowania subpopulacji komórek w różnych warunkach. Histogramy na Rysunku 6B przedstawiają rozkłady populacyjne danych dla pojedynczych komórek z trzech powtórzeń dla każdego stanu wyciszenia RNAi. Po lewej stronie znajdują się dane dotyczące intensywności przeciwciał jądrowych, a po prawej odpowiadające im dane dla reportera GFP-CDK2. Dane dla przeciwciała P-S780 RB1 wykazują, że komórki w szerokim zakresie występują w dwóch populacjach w odniesieniu do tej modyfikacji potranslacyjnej oraz że populacje komórek z utratą fosforylacji RB1 na S780 można odróżnić jako lewy szczyt intensywności jądrowej, który ulega wzmocnieniu w przypadku wyciszenia CDK6 przez siRNA. Ten sam lewy szczyt obserwuje się, gdy celem RNAi jest samo RB1, co odzwierciedla całkowite usunięcie białka, a tym samym brak barwienia P-S780 RB1. W przeciwieństwie do tego, te same warunki eksperymentalne dla tych samych komórek, obserwowane za pomocą testu reporterowego GFP-CDK2, wykazują inną dynamikę w danych dla pojedynczych komórek. Obserwuje się rozkład ciągły z tylko jednym szczytem, jednak siRNA zakłócające cykl komórkowy (siCDK6) i powodujące akumulację w fazie G1 prowadzi do rozszerzenia prawego ramienia tego rozkładu (i.e. wskazując na zwiększoną obecność komórek wykazujących wzrost stosunku GFP jądro/cytoplazma, naniesionego na oś X).

Na histogramach na ryc. 6B przedstawiono również wartości bramkowania (pionowe paski), które zostały wyznaczone na podstawie rozkładów obu zestawów danych z analizy. Reguła zastosowana dla danych przeciwciała P-S780 RB1 polega na zdefiniowaniu pozycji bramki jako punktu w połowie wysokości i maksymalnej szerokości na lewym ramieniu głównego (prawego) piku, biorąc pod uwagę dane komórek kontrolnych negatywnych (siRNA nietargetujące). Komórki zaznaczone na czerwono to komórki z obniżonym poziomem lub brakiem P-S780 RB1, które zostały zidentyfikowane za pomocą tej bramki. Podobna bramka, umieszczona na przeciwległym ramieniu rozkładu wartości stosunku, została zastosowana dla reportera GFP-CDK2. Wynikowa subpopulacja komórek o wysokim stosunku, w których aktywność CDK2 jest obniżona lub jej brakuje, jest przedstawiona na zielono. Aby zilustrować analizę multipleksową obu testów, ryc. 6C pokazuje implementację obu wartości bramek przy użyciu skryptu Perl 2_gate_classifier.pl w celu przekształcenia surowych danych (ryc. 6A) w poniższy plik z adnotacjami. Nowy plik zawiera oryginalne dane wraz z nową kolumną etykiet klas dla każdej komórki oraz dwiema wartościami bramek użytymi do ich rozróżnienia (w tym przypadku zastosowano odpowiednio bramki o wartościach 0,004 dla danych przeciwciała i 1,5 dla reportera GFP-CDK2).

Po zaklasyfikowaniu poszczególnych komórek z każdego wariantu wyciszenia genów na podstawie dwóch testów, możliwe jest teraz wykorzystanie tych etykiet klas do pomocy w adnotacji wykresów danych z testów. Rysunek 7 przedstawia wykresy kropkowe danych z poszczególnych komórek dla testów P-S780 RB1 oraz GFP-CDK2 z przykładowego zestawu danych dla wszystkich trzech warunków RNAi. Liczby adnotujące kwadranty na wykresach kropkowych wskazują relatywne wartości procentowe każdej bramkowanej subpopulacji w stosunku do całości dla danego kontekstu wyciszenia i są generowane w programie R przy użyciu opisanych powyżej etykiet klas. Wykresy te ujawniają, że w porównaniu z komórkami transfekowanymi niecelującym siRNA (Rysunek 7B), komórki transfekowane siCDK6 wykazują całkowity rozkład danych przesunięty zarówno w dół na osi Y (wskazując brak fosforylacji RB1 na serynie 780), jak i w prawo na osi X (wskazując niską aktywność CDK2, Rysunek 7C). Oba te przesunięcia są oczekiwane w przypadku wyciszenia tego celu. W przeciwieństwie do tego, dane z komórek transfekowanych siRB1 (Rysunek 7A) wykazują utratę barwienia przeciwciałami, co jest zgodne z utratą epitopu, ale niewielki efekt w rozkładzie danych dla raportera CDK2 w porównaniu z kontrolami transfekowanymi niecelującym siRNA, co sugeruje, że wyciszenie RB1 nie wywołuje znaczącego wpływu na reporter GFP-CDK2.

Aby dalej zbadać wykorzystanie danych z pojedynczych komórek, klasyfikację subpopulacji oraz multipleksowanie analiz, Rycina 8 przedstawia wykres rozrzutu dla danych siCDK6 z Ryciny 7C wraz z powiązanymi profilami histogramów dla zintegrowanej intensywności DNA. Pary histogramów odnoszą się do przeciwstawnych połowy całej populacji, podzielonej na podstawie intensywności przeciwciał (po prawej stronie wykresu rozrzutu) lub wartości stosunku reportera GFP-CDK2 (powyżej wykresu rozrzutu). Ilościowe oznaczenie intensywności DNA jądrowego dla tych populacji wykazuje dwa piki charakterystyczne dla zawartości DNA 2N i 4N, odpowiednio jako piki lewy i prawy. Bramki przedstawione na Rycina 6, 7 i 8 zostały zaplanowane tak, aby komórki zidentyfikowane jako wykazujące niski poziom P-S780 RB1 (oznaczone jako: P-S780-) lub wysoką wartość stosunku z reportera GFP-CDK2 (oznaczone jako: G1) znajdowały się w fazie G1 cyklu komórkowego. Rzeczywiście, histogramy profili DNA dla subpopulacji zidentyfikowanych za pomocą którejkolwiek z tych analiz zawierają głównie komórki o zawartości DNA 2N. Profile DNA populacji z bramką przeciwstawną (oznaczone jako: P-S780+ lub Non-G1) zawierają komórki o rozkładach od 2N do 4N, co jest zgodne z tym, że komórki te zajmują różne pozycje w cyklu komórkowym po fazie G1.

Choć główną uwagę poświęcono tutaj generowaniu i analizie danych z pojedynczych komórek na podstawie obrazów barwionych fluorescencyjnie, przydatna jest również możliwość wykorzystania tych danych do podsumowania każdego testu w odniesieniu do poszczególnych studzienek, aby monitorować zmienność między powtórzeniami oraz wydajność wszystkich studzienek dla danego testu w obrębie całej płytki danych. Rycina 9 przedstawia dane z każdej terapii siRNA podsumowane jako wartości średnie z trzech powtórzeń dla procentu komórek w obrębie bram zastosowanych do A) danych P-S780 RB1 oraz B) danych raportera GFP-CDK2. Wartości przedstawione na wykresach A i B zostały wygenerowane za pomocą dwóch dodatkowych skryptów Perl dostarczonych do niniejszego manuskryptu: odpowiednio „antibody_fluorescence_summary.pl” oraz „G1assay_summary.pl”. Skrypty te wykorzystują surowe dane utworzone przez program Cell Profiler (Nuclei.csv) i raportują dane dla każdej studzienki jako: i) całkowitą liczbę komórek zmierzonych w studzience, ii) liczbę komórek w obrębie bramy, iii) procent komórek w obrębie bramy oraz iv) średnią arytmetyczną zmierzonych surowych danych dla danej studzienki. Jest to opcja odpowiednia do przeglądu dużych zestawów danych z testów, przed przejściem do analizy danych z poszczególnych terapii przy użyciu multipleksowej oceny danych z pojedynczych komórek, jak zilustrowano na Ryc. 7 i 8. Wykresy przedstawione tutaj obrazują „iii) procent komórek w obrębie bramy” dla obu testów, co jest odpowiednie dla nienormalnych rozkładów danych zaobserwowanych dla danych P-S780 RB1 i GFP-CDK2 na histogramach na Ryc. 6B. Skrypty te obliczają również „iv) średnią arytmetyczną zmierzonych surowych danych dla danej studzienki”, co byłoby odpowiednie dla analizy danych dotyczących odpowiedzi homogennych populacji oraz normalnego rozkładu danych przed i po perturbacji eksperymentalnej.

Rycina 1: Przegląd etapów procedury do ilościowej analizy danych z obrazowania mikroskopowego z zastosowaniem znaczników fluorescencyjnych. Procedura przedstawiona jest tutaj w czterech krokach. (A) Najpierw konieczne jest eksperymentalne przygotowanie komórek do obrazowania fluorescencyjnego. Opisanym tutaj przykładem jest przesiew, w którym adherentne ludzkie komórki nowotworowe traktowane siRNA są hodowane przez 48 godzin, utrwalane i barwione na 96-dołkowej płytce do hodowli tkanek. Różne warunki RNAi występują w trzech powtórzeniach w oddzielnych dołkach płytki. Komórki są barwione barwnikiem DNA oraz przeciwciałem specyficznym dla RB1 fosforylowanego w selektywnej dla CDK4 i 6 pozycji docelowej Seryna-780 (P-S780 RB1), a dodatkowo stabilnie eksponują reporter GFP-CDK2, informujący o wyjściu z fazy G1 cyklu komórkowego. Wspólnie sondy fluorescencyjne te stanowią dwa testy oceniane oddzielnie w ramach procedury. (B) Generowane są równoległe obrazy mikroskopowe dla każdej sondy fluorescencyjnej (kanału), które są nazywane w sposób zawierający szczegóły umożliwiające oprogramowaniu do analizy obrazu organizację danych. (C) Pliki obrazów są ładowane do oprogramowania Cell Profiler, które algorytmicznie identyfikuje poszczególne komórki oraz powiązane z nimi pary jąder i cytoplazmy, a następnie wyznacza pomiary intensywności dla trzech sond fluorescencyjnych wykrytych w każdej z nich. (D) Na koniec używany jest skrypt Perl do organizacji uzyskanych surowych danych ilościowych. Na tym etapie do danych intensywności fluorescencji dla każdej komórki stosuje się bramkowanie (gates), co skutecznie przypisuje komórki do subpopulacji, które mogą być wykreślone, śledzone i poddane analizie porównawczej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 2: Dane eksperymentalne uzyskane za pomocą analizy obrazu. Utrwalone komórki traktowane siRNA i znakowane fluorescencyjnie z przykładowego zestawu danych zostały poddane obrazowaniu, a następnie wykonano pomiary intensywności dla każdej komórki. Reprezentatywne dane obrazowe przedstawiono dla każdego parametru rejestrowanego podczas analizy obrazu. (A) Intensywność DNA jądrowego: Intensywność barwienia barwnikiem DNA jądrowego jest wykorzystywana do określenia ilości DNA na jądro. (B) Intensywność jądrowa fosfo-RB1: Barwienie immunocytochemiczne specyficzne dla P-S780 RB1 z użyciem przeciwciała pierwszorzędowego (czarny) i znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała wtórnego (czerwony) umożliwia pomiar intensywności fosforylacji RB1 w S780 na jądro. (C) Reporter GFP-CDK2: Wykorzystane komórki stabilnie eksponują białko reporterowe znakowane GFP, które translokuje między jądrem a cytoplazmą w określonym wzorcu zależnym od cyklu komórkowego. Podwójny pomiar skorelowanej intensywności GFP w jądrze i cytoplazmie dla każdej komórki pozwala na obliczenie stosunku dla pojedynczej komórki, który może służyć do odróżnienia fazy G1 od pozostałych faz cyklu komórkowego. Do zilustrowania analizy zostaną użyte trzy cele siRNA: niecelujący negatywny kontrolny siRNA; siRNA przeciwko CDK6 jako kontrola pozytywna w zaburzaniu fosforylacji RB1 i postępu cyklu komórkowego; siRNA przeciwko RB1 w celu ustalenia swoistości przeciwciał. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 3: Organizacja plików obrazów przed analizą obrazu. Obrazy pobrane z płytki do hodowli tkankowej są nazywane systematycznie, aby umożliwić oprogramowaniu do analizy obrazu powiązanie danych obrazowych z oryginalnym kontekstem eksperymentalnym. Informacje te są zawarte w nazwie pliku każdego obrazu. (A) Ponieważ każdy dołek na płytce eksperymentalnej może odpowiadać innym celom RNAi lub zabiegom, adres dołka stanowi część nazwy pliku. (B) Numer klatki jest częścią nazwy pliku, ponieważ każdy dołek jest obrazowany w celu zebrania wielu niepokrywających się klatek. (C) Sondy fluorescencyjne z każdej klatki są obrazowane oddzielnie; w związku z tym nazwy plików muszą również odzwierciedlać, do którego kanału odnosi się każdy obraz. (D) Przykładowe nazwy plików odnoszące się do dołka (G12), klatki (2), gdzie każdy obraz reprezentuje jeden z kanałów (niebieski, czerwony, zielony). Linie przerywane łączą elementy nazwy pliku z odpowiednimi reprezentacjami schematycznymi dla dołka, klatki i kanału. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Wykorzystanie programu Cell Profiler do pomiaru barwienia DNA jądrowego i przeciwciał. Przy ustawieniach zawartych w dostarczonym pliku potoku (3_channels_pipeline.cppipe), oprogramowanie do analizy obrazów Cell Profiler mierzy wartości intensywności fluorescencji dla DNA jądrowego i wiązania przeciwciał w odniesieniu do poszczególnych komórek. (A) Jądra są identyfikowane na obrazie z kanału „niebieskiego” dla zabarwionego DNA. (B) Pozycje zabarwionych DNA jąder są tymczasowo przechowywane w „masce jąder” (Nuclei mask). Maska jąder jest następnie nakładana na (C) obrazy z kanału niebieskiego i czerwonego (odpowiednio dane fluorescencyjne DNA i przeciwciał), a wartości fluorescencji z segmentów obrazu pokrywających się z maską są przypisywane do każdej zidentyfikowanej komórki. Poprawność identyfikacji oddzielnych, sąsiadujących jąder można ocenić wizualnie na podstawie wyglądu maski jąder. Dla ilustracji, w tym obrazie maski okręgiem zaznaczono przykłady, w których wybrane ustawienia algorytmu błędnie zidentyfikowały sąsiadujące jądra jako jedno jądro. Dostosowanie ustawień algorytmu w celu zminimalizowania takich zdarzeń zostało omówione w sekcji Dyskusja. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Wykorzystanie programu Cell Profiler do pomiaru intensywności GFP w jądrach i cytoplazmie. Reporter CDK2 znakowany GFP translokuje się między jądrem a cytoplazmą w zależności od etapu cyklu komórkowego komórek. Równocześnie z obliczaniem przez Cell Profiler intensywności sygnału DNA i przeciwciał w jądrach dla każdej komórki (Rycina 4), program oblicza stosunek intensywności GFP w jądrze do cytoplazmy dla każdej komórki. (A) Dane z barwienia DNA dla każdego obrazu są wykorzystywane do wygenerowania maski jąder (Nuclei mask). (B) Cell Profiler wykorzystuje maskę jąder w połączeniu z obrazem GFP z reportera GFP-CDK2, aby wyznaczyć pozycję każdej komórki, a następnie rozszerza ten obszar do obwodu każdej komórki, aby oszacować całkowity ślad każdej komórki. Powstaje w ten sposób nowa „maska komórki” (Cell mask). (C) Maska jąder jest odejmowana od maski komórki, co daje serię konturów cytoplazmy w kształcie pierścienia, które stają się „maską cytoplazmy” (Cytoplasm mask). (D) Maska jąder i maska cytoplazmy są wykorzystywane przez Cell Profiler do pomiaru par wartości GFP dla jądra i cytoplazmy. Te pary wartości są następnie używane przez Cell Profiler do obliczenia stosunków, które informują o pozycji każdej komórki w cyklu komórkowym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 6: Ekstrakcja danych – Przetwarzanie surowych danych z poszczególnych komórek poprzez nakładanie bramek na wartości analizy. Trendy biologiczne z danych poszczególnych komórek dla barwienia przeciwciałami oraz analiz reportera GFP-CDK2 są ekstrahowane przy użyciu danych bramkowanych. Histogramy surowych danych umożliwiają identyfikację odpowiednich wartości bramek. Są one następnie nakładane za pomocą skryptu Perl. (A) Produktem końcowym analizy plików obrazów w programie Cell Profiler z zastosowaniem dostarczonych ustawień są pliki wartości rozdzielonych przecinkami (.csv). Pliki te zawierają dane poszczególnych komórek odnoszące się do każdego z różnych segmentów wewnątrzkomórkowych. Plik ‘Nuclei.csv’ zawiera wszystkie wybrane pomiary odnoszące się do użycia maski jąder (Nuclei mask). Pomiary te obejmują intensywność przeciwciał w jądrze, intensywność DNA w jądrze oraz stosunek GFP (jądro/cytoplazma). (B) Histogramy intensywności przeciwciał w jądrze (po lewej) i stosunków reportera GFP-CDK2 (po prawej) wykreślone z danych poszczególnych komórek dla każdego warunku wyciszenia siRNA. Słupki na wyświetlonych histogramach wskazują pożądane położenia bramek dla tych analiz. Kolorowe dane na histogramach wskazują bramkowane subpopulacje. (C) Bramki dla dwóch analiz przedstawionych w punkcie B są stosowane do surowych danych za pomocą skryptu Perl ‘2_gate_classifier.pl’. Skrypt tworzy zmodyfikowaną kopię oryginalnego pliku wyjściowego z programu Cell Profiler (Nuclei.csv), aby ułatwić późniejsze wykresy. Dwie wartości bramek są zapisywane w nowym pliku (tutaj wyróżnione kolorem), a dodawana jest nowa kolumna „Label”. Etykiety te przypisują każdą komórkę do jednej z czterech możliwych podgrup na podstawie dwóch bramkowanych wartości analizy dla każdej komórki. Etykiety te są wykorzystywane w kolejnych wykresach, które zawierają obliczenia wkładu każdej subpopulacji, a także odniesienia krzyżowe do dodatkowych parametrów wygenerowanych w programie Cell Profiler. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina 7: Wykresy punktowe dla każdego warunku siRNA przedstawiające surowe dane dla poszczególnych komórek oraz pozycje bramek (gates). Wykresy punktowe danych poszczególnych komórek ze wszystkich obrazów dla wskazanych warunków siRNA: (A) siRB1; (B) siNon-targeting (kontrola negatywna); (C) siCDK6. Na osiach Y naniesiono wartości fluorescencji jądrowej z barwienia anty-P-S780 RB1. Na osiach X naniesiono odpowiadające im wartości stosunku obliczone z reportera GFP-CDK2. Czerwone i zielone paski wskazują odpowiednio pozycje bramek dla P-S780 RB1 oraz reportera GFP-CDK2. Dwie bramki dzielą komórki na cztery subpopulacje, a liczby nad powstałymi kwadrantami określają procentową liczbę komórek z każdej z nich. Adnotacje wokół osi dla A wskazują cztery możliwe elementy etykiet przypisane do każdej komórki przez skrypt Perl 2_gate_classifier.pl. Etykiety te są przedstawione w odniesieniu do ich odpowiednich bramek testowych i są wykorzystywane w skrypcie R (analysis.r) do generowania wykresów na rycinach 6, 7 oraz 8. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 8: Subpopulacje komórek zdefiniowane przez dwa testy przejścia G1 wykazują profile DNA 2N i 4N zgodnie z wynikiem testu. Wykres rozproszenia danych dla komórek siCDK6 został powtórzony z Rysunku 7C. Wokół wykresu rozproszenia znajdują się histogramy zintegrowanej intensywności jądrowego DNA odnoszące się do podzbiorów populacji. Te powyżej wykresu rozproszenia dotyczą testu reporterowego GFP-CDK2. Te po prawej stronie wykresu rozproszenia dotyczą wyłącznie pomiarów przeciwciała przeciwko fosfo-RB1 w jądrze. Kolorowe linie bramek zostały przedłużone, aby pokazać ich powiązanie z histogramami. Przedstawiono również etykiety bramek, na podstawie których dane komórkowe zostały wybrane do tych dodatkowych wykresów. Komórki z utratą fosforylacji RB1 na serynie 780 (P-S780-) lub te o wysokim stosunku jądrowym do cytoplazmatycznego reportera GFP-CDK2 (wskazującym na niską aktywność CDK2) wykazują głównie profile DNA typu 2N, podczas gdy ich przeciwnicy w każdym z odpowiednich testów wykazują rozkład 2N i 4N, charakterystyczny dla mieszanej populacji komórek w fazie po-G1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rycina 9: Wykresy podsumowujące wartości analizy z bramkowania dla każdego warunku siRNA. Wykresy podsumowujące dane z bramkowania dla (A) danych P-S780 RB1 oraz (B) danych GFP-CDK2 z trzech powtórnych studni dla każdego warunku wyciszenia siRNA. Wartości obliczono z surowych wyników programu Cell Profiler (Nuclei.csv) przy użyciu skryptów Perl: „antibody_fluorescence_summary.pl” (A) lub „G1assay_summary.pl” (B). Przedstawione wartości to średnie procentowe liczby komórek w obrębie bramki zastosowanej do każdego badania. Słupki wskazują błędy standardowe obliczone z trzech powtórnych studni. Nad przedstawionymi danymi naniesiono wartości P z nieparzystego, homoscedastycznego testu T dla każdego warunku wyciszenia w porównaniu z niedziałającym siRNA (non-targeting siRNA), gdzie P < 0,001 (**) i P < 0,05 (*). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rysunek S1. Konfiguracja oprogramowania Cell Profiler do analizy obrazów. (A) Zrzut ekranu programu Cell Profiler przed wprowadzeniem jakichkolwiek ustawień analizy obrazu. (B) Zrzut ekranu programu Cell Profiler po załadowaniu szczegółów algorytmu zawartych w pliku „3_channels_pipeline.cppipe”. Podświetlona karta w górnym lewym rogu wskazuje, że ten ekran wyświetla parametry etapu „LoadImages” analizy. Kliknięcie w pozostałe elementy listy poniżej wyświetli szczegóły kolejnych kroków analizy. (C) Zrzut ekranu programu Cell Profiler z wprowadzonymi ścieżkami do folderu wejściowego (Input Folder) i folderu wyjściowego (Output Folder). (D) Zrzut ekranu programu Cell Profiler po kliknięciu przycisku „Analyze images” w celu rozpoczęcia analizy. Nałożone są trzy nowe okna ilustrujące maski wygenerowane algorytmicznie przez oprogramowanie z analizowanych obrazów. Dostęp do tych okien uzyskuje się, klikając ikony „oka” do pozycji otwartej obok odpowiednich kroków analizy w górnym lewym rogu głównego okna programu Cell Profiler. Widoki te pomagają użytkownikowi zweryfikować, czy ustawienia generujące wielokolorowe maski są zgodne z towarzyszącymi im oryginalnymi danymi w skali szarości.

Rycina S2. Wykorzystanie języka Perl i środowiska RStudio do bramkowania danych poszczególnych komórek i wykreślania wynikowych subpopulacji komórek. (A) Panel po prawej przedstawia folder wybrany jako miejsce zapisu plików wyjściowych .csv (zielone ikony) z analizy w programie Cell Profiler. Skrypty Perl dostarczone wraz z manuskryptem (niebieskie ikony) zostały skopiowane do tego folderu. Zaznaczony jest skrypt Perl „2_gate_classifier.pl”, który został uruchomiony dwukrotnym kliknięciem myszy, co wywołało okno dialogowe widoczne w panelu po lewej. Przedstawiono polecenia i odpowiadające im wpisane odpowiedzi niezbędne do bramkowania danych poszczególnych komórek z pliku „Nuclei.csv”. (B) Zrzut ekranu RStudio bezpośrednio po wczytaniu skryptu „analysis.R”. Zaznaczone są polecenia służące do importu bramkowanych danych z punktu A do oprogramowania przed wykreśleniem (należy pamiętać, że szczegóły w liniach 5 i 6 muszą zostać dostosowane do lokalizacji bramkowanych danych na komputerze używanym do analizy). (C) Zrzut ekranu RStudio po zaimportowaniu danych. (D) Zrzut ekranu RStudio z zaznaczonym blokiem kodu wymaganym do wygenerowania wykresu widocznego w dolnym prawym oknie. Kody dla każdego wykresu są oddzielone pustymi liniami i pogrupowane według typu wykresu.

cel siRNA	Adresy studzienek płytki
nietargetujący (NT)	E5, F5, G5
Siatkówczaka (RB)	E7, F7, G7
Kinaza zależna od cyklin 6 (CDK6)	B2, C2, D2

Tabela 1: Adresy studzienek i odpowiadające im warunki siRNA użyte w przykładowym zestawie danych.

Dyskusja

Opisany przebieg pracy obejmuje procedurę wielodołkowej perturbancji komórek przy użyciu siRNA, późniejszej detekcji markerów i wreszcie zastosowania szeregu kroków wspieranych przez oprogramowanie w celu ułatwienia ekstrakcji danych ilościowych z uzyskanych obrazów mikroskopii fluorescencyjnej. Podejście to koncentruje się na dostarczaniu wartości intensywności jądrowej i cytoplazmatycznej dla poszczególnych komórek, co ma szerokie zastosowanie praktyczne w wielu zastosowaniach opartych na komórkach. Przykładowe dane użyte w tym artykule zostały wygenerowane w warunkach przesiewowych siRNA, w których testowane są dwa testy fluorescencyjne dla tranzytu cyklu komórkowego fazy G1 i korelowane z bardziej bezpośrednim biofizycznym pomiarem zawartości jądrowego DNA.

Zastosowanie fluorescencyjnego barwienia DNA do obrazowania jądrowego DNA jest nieodzownym krokiem w procesie segmentacji obrazu, ponieważ umożliwia identyfikację pojedynczych komórek, a uzyskana w ten sposób "maska jąder" służy jako punkt wyjścia do identyfikacji odpowiednich regionów cytoplazmatycznych. Reporter CDK2 znakowany GFP, który ulega stabilnej ekspresji w komórkach, daje zmienny, ale konsekwentnie wyższy niż sygnał tła w cytoplazmie, za pomocą którego można wyznaczyć ten przedział. Ten sam proces analizy powinien mieć zastosowanie do analizy zdarzeń translokacji białek przy użyciu innych odpowiednich reporterów sprzężonych z fluorescencją i ich odpowiedzi na perurbancję. Ponadto zastąpienie reportera GFP-CDK2 barwnikami fluorescencyjnymi specyficznymi dla cytoplazmy pozwoliłoby na alternatywne zastosowanie tego algorytmu do pomiaru wymiarów cytoplazmy i względnych rozmiarów komórek na obrazach.

Innym zagadnieniem projektowym w opisanej tutaj strategii segmentacji obrazu jest wykorzystanie narzędzia Cell Profiler do dostarczania zintegrowanych wartości intensywności do kwantyfikacji DNA. Integracja wartości intensywności dla danych barwienia jądrowego DNA pozwala na możliwe różnice w wielkości jądra i stanowi ścisłe dopasowanie do profili kwantyfikacyjnych obserwowanych dla danych FACS barwionych jodkiem propidyny. Jednakże zintegrowana intensywność może nie stanowić odpowiedniego środka do oceny funkcji białka, w przypadku gdy średnie stężenie, zilustrowane średnią intensywnością fluorescencji antygenu, jest bardziej istotne biologicznie niż zintegrowana całkowita ilość białka (i związana z nią fluorescencja) w kompartmencie komórkowym. W związku z tym dla danych P-S780 RB1 i GFP zastosowano średnie wartości intensywności. Opcja przełączania między dwoma trybami (średnim lub zintegrowanym) oceny danych znajduje się w panelu "Eksport do arkusza kalkulacyjnego" w oprogramowaniu Cell Profiler.

Ustawienia analizy w pliku 3_channels_pipeline.cppipe są zoptymalizowane pod kątem obrazów w przykładowym zestawie danych. Analiza nowych zestawów obrazów za pomocą tego protokołu będzie wymagała, aby nazwy plików przyjęły konwencję nazewnictwa opisaną powyżej (Rysunek 3). Ponadto może być konieczne dostosowanie wartości czułości do jasności barwienia jądrowego DNA oraz progów intensywności tła w nowych zestawach obrazów w ustawieniach Cell Profiler. Biorąc pod uwagę kluczową rolę, jaką barwienie DNA odgrywa w tworzeniu różnych masek segmentacji obrazu, zastosowanie prawidłowych ustawień czułości dla tego kanału jest kluczem do udanej analizy nowych danych obrazowych za pomocą oprogramowania Cell Profiler. Dostarczony plik ustawień programu Cell Profiler (3_channels_pipeline.cppipe) zawiera uwagi dotyczące najczęściej używanych parametrów do dostosowywania analizy do nowych danych. Uwagi te znajdują się w polu tekstowym u góry ekranu w oknie głównym programu Cell Profiler i zawierają wskazówki dotyczące zmiany ustawień czułości i dostosowywania liczby kanałów do analizy. Jak wskazano w sekcji 2.8 Protokołu, w celu przetestowania ustawień dla nowych danych obrazu może być konieczne obserwowanie segmentacji obrazu podczas analizy obrazu poprzez kliknięcie otwierających ikony "oka" dla każdego z kroków protokołu "Identyfikuj...Obiekty" (Rysunek S1D). W szczególności wizualizacja danych obrazu za pomocą funkcji "IdentifyPrimaryOjects" pokaże, czy maska jąder jest prawidłowo identyfikowana na podstawie obrazów barwienia DNA. Na stronie oprogramowania Cell Profiler dla modułu "IdentifyPrimaryOjects" znajduje się współczynnik korekcji progu. Próba i błąd dostosowanie tej wartości naprawi większość błędów rozpoznawania jądra. Wartości równoważą kanał DNA z intensywnością tła dla każdego obrazu. Wartości progowego współczynnika korekcji oscylują wokół 1, gdzie większa wartość jest bardziej rygorystyczna (dobra w przypadku wyraźnych obrazów), a mniejsza niż 1 jest pobłażliwa (odpowiednia dla obrazów o mniejszym kontraście między barwieniem a tłem).

Nieprzetworzone dane wyjściowe poszczególnych komórek z Cell Profiler mogą być analizowane na różne sposoby, aby dostosować je do potrzeb innych badań. Pokazano tutaj użycie skryptu Perla do zastosowania bramek do dwóch parametrów mierzonych na komórkę, aby pomóc w wyodrębnieniu trendów biologicznych z danych i umożliwić odniesienie zidentyfikowanych subpopulacji do dodatkowych pomiarów. Chociaż równie możliwe jest włączenie elementów bramkowania w ramy Cell Profiler, alternatywna trasa zastosowana w tym przypadku zapewnia większą elastyczność i szybkość, szczególnie w przypadku konieczności oceny dużych zbiorów danych. Najwolniejszym etapem w fazach akwizycji obrazu obecnego protokołu jest uruchomienie oprogramowania Cell Profiler. Profiler komórek jest tutaj uruchamiany bez narzucania bramek w celu wytworzenia niebramkowanego zestawu surowych danych, który może być ponownie przeanalizowany za pomocą kolejnego skryptu Perla szybciej i, jeśli to konieczne, iteracyjnie z różnymi wartościami bramek. Nie wszystkie badania będą znały z wyprzedzeniem odpowiednie wartości bramek, ponieważ mogą się one różnić w zależności od odczynników w dowolnym zestawie danych i potencjalnie w czasie. W związku z tym zaleca się generowanie histogramów przedstawiających rozkład surowych danych uzyskanych z Cell Profiler dla kontroli pozytywnych i komórek z pozorowanymi zaburzeniami w celu zidentyfikowania odpowiednich wartości bramek dla parametrów będących przedmiotem zainteresowania.

Skrypty Perla są napisane tak, aby akceptować sztywno zdefiniowaną strukturę kolumn danych z Cell Profiler i mogą przestać działać, jeśli użytkownik zmodyfikuje liczbę parametrów wyświetlanych przez Cell Profiler za pomocą ustawień "ExportToSpreadsheet". Aby pomóc w implementacji modyfikacji ustawień, notatki są zawarte w plikach skryptów Perla. Aby je zobaczyć, wyświetl skrypt w edytorze tekstu, najlepiej w edytorze tekstu programisty ustawionym na kodowanie kolorami elementów Perla (np. http://www.activestate.com/komodo-edit). Te uwagi wskazują, gdzie należy dostosować skrypt, aby dostosować go do zmian w formacie danych. Podobnie jak w przypadku skryptów Perla, dostarczony plik R-code (analysis.r), zawierający instrukcje dotyczące wykreślania figur z danych analizy obrazu, można odczytać w edytorze tekstu lub oprogramowaniu RStudio, aby zobaczyć dodatkowe uwagi dotyczące użytkowania i adaptacji. Notatki te mogą być uzupełnione o szczegóły dotyczące wyrażeń regularnych i Perla¹² oraz pakietu ggplot2¹³ dla R, które stanowią podstawę dla tego, jak dane są odczytywane, opisywane i kreślone, odpowiednio.

Nowe badania wykorzystujące mikroskopię fluorescencyjną, a także surowe dane zdeponowane w publikacjach open source są podatne na metody analizy, takie jak te opisane tutaj. Sama natura danych o wysokiej zawartości nadaje się do analizy rekurencyjnej z różnymi akcentami analitycznymi w zależności od zainteresowań badawczych danego obserwatora. Chociaż pytania, które można zadać w odniesieniu do danych, są ograniczone przez pierwotnie użyte sondy, dane obrazowe mogą być często sensownie ponownie przeanalizowane poza zakresem badań, które je wygenerowały.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
AllStars kontrola negatywna siRNA	Qiagen	1027280	Kontrola negatywna siRNA.
CDK6 siRNA	Dharmacon/ Niestandardowa synteza	NA	Sekwencja antysensowna: 5' CUCUAGGCCAGUCUUCUUCUU
RB1 siRNA	Dharmacon/ Niestandardowa synteza	NA	Sekwencja antysensowna: 5' GGUUCAACUACGCGUGUAATT
5x bufor siRNA	Thermo Scientific	B-002000-UB-100	Do rozcieńczenia wodą bez nukleaz, nieuzdatnioną DEPC.
Woda bez nulustu (bez DEPC)	Applied Biosystems	AM9937	Do rozcieńczania buforu siRNA.
Hiperfect	Qiagen	301705	Transfekcja lipidów.
DMEM	Life Technologies	41966052	pożywki do hodowli tkankowych z pirogronianem i wysoką glukozą.
96-dołkowa płytka do hodowli tkankowej	Falcon	3072	Plain, 96-dołkowa płytka do hodowli tkankowej do równoległego, przedziałowego mieszania kompleksów transfekcyjnych.
Packard Viewplate	Perkin Elmer LAS	6005182	96-dołkowa płytka TC z podstawą optyczną, na której komórki są transfekowane, hodowane, mocowane i ostatecznie obrazowane. Dostarczane z nieprzezroczystymi, samoprzylepnymi uszczelkami płytowymi, które są używane podczas przechowywania zużytych płyt.
Oddychająca	membrana Alpha Labs	LW2783	Sterylna, przepuszczająca gazy, przyczepna membrana.
Neutralna buforowana formalina, 10%	Sigma-Aldrich	HT5012-1CS	10% Formalina (4% formaldehyd) utrwalacz stosowany zgodnie z protokołem.
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100PC	Niejonowy detergent
[nagłówek]
Tris	Sigma-Aldrich	T1503	Trizma base (tris(hydroksymetylo)aminometan)
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287	Do roztworu do mycia płyt.
Przeciwciało anty-P-S780 RB1	Abcam	ab32513	Monoklonalne królicze
AlexaFluor647 Anty-królicze	Invitrogen	A21245	Wysoce adsorbowane krzyżowo, znakowane fluorescencyjnie przeciwciało drugorzędowe.
Hoechst 33342 (bisbenzimid)	Sigma-Aldrich	B2261	Fluorescencyjny, interkalujący chromatynę, barwnik DNA.
Roztwór permeabilizacyjny	NA	NA	0,1% Triton X-100 w 50 mM soli fizjologicznej buforowanej Tris, pH 8,0.
Roztwór do płukania płytek	NA	NA	Tris-buforowany solą fizjologiczną zawierający 0,1% Tween-20.
Roztwór blokowy	NA	NA	5% mleko w proszku w soli fizjologicznej buforowanej Tris i 0,1% Tween-20. Do blokowania płytki przed barwieniem immunologicznym i rozcieńczaniem przeciwciał.
Cell Profiler 2.1	Broad Institute		http://www.cellprofiler.org/download.shtml
Active Perl Community Edition	ActiveState		http://www.activestate.com/activeperl/downloads
R	Foundation		http://www.r-project.org
Rstudio	Rstudio		http://www.rstudio.com/

Środowisko programistyczne