Immunodetekcja białek błony zewnętrznej za pomocą cytometrii przepływowej izolowanych mitochondriów

Podsumowanie

Opisana tutaj jest metoda wykrywania i ilościowego oznaczania białek zewnętrznej błony mitochondrialnej poprzez immunoznakowanie mitochondriów wyizolowanych z tkanek gryzoni i analizę za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta może być rozszerzona o ocenę funkcjonalnych aspektów subpopulacji mitochondrialnych.

Streszczenie

Metody wykrywania i monitorowania składników białkowych zewnętrznej błony mitochondrialnej w tkankach zwierzęcych są niezbędne do badania fizjologii i patofizjologii mitochondriów. Protokół ten opisuje technikę, w której mitochondria wyizolowane z tkanki gryzoni są znakowane immunologicznie i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej. Mitochondria są izolowane z rdzenia kręgowego gryzoni i poddawane szybkiemu etapowi wzbogacania w celu usunięcia mieliny, głównego zanieczyszczenia frakcji mitochondrialnych przygotowanych z tkanki nerwowej. Wyizolowane mitochondria są następnie znakowane wybranym przeciwciałem i fluorescencyjnie sprzężonym przeciwciałem drugorzędowym. Analiza za pomocą cytometrii przepływowej weryfikuje względną czystość preparatów mitochondrialnych poprzez barwienie barwnikiem specyficznym dla mitochondriów, a następnie wykrywanie i kwantyfikację białka znakowanego immunologicznie. Technika ta jest szybka, policzalna i wysokoprzepustowa, co pozwala na analizę setek tysięcy mitochondriów na próbkę. Ma zastosowanie do oceny nowych białek na powierzchni mitochondriów w normalnych warunkach fizjologicznych, a także białek, które mogą zostać nieprawidłowo zlokalizowane w tej organelli podczas patologii. Co ważne, metoda ta może być połączona z fluorescencyjnymi barwnikami wskaźnikowymi w celu informowania o pewnych aktywnościach subpopulacji mitochondrialnych i jest wykonalna dla mitochondriów z ośrodkowego układu nerwowego (mózg i rdzeń kręgowy), a także wątroby.

Wprowadzenie

Mitochondria to wysoce dynamiczne organelle, które przechodzą wiele rund rozszczepienia i fuzji, są transportowane do miejsc o wysokim zapotrzebowaniu na energię i szybko reagują na bodźce fizjologiczne¹. Ponieważ coraz częściej uznaje się, że mitochondria w różnych tkankach, a nawet w różnych przedziałach komórkowych, mają różne profile funkcjonalne, potrzebne są nowe metody identyfikacji tych odrębnych podzbiorów mitochondrialnych.

Mikroskopia dostarcza środków, dzięki którym można wizualizować poszczególne mitochondria i można określić obecność białka w mitochondriach lub w mitochondriach za pomocą immunofluorescencji². Jednak analiza ilościowa tą metodą jest pracochłonna i jest bardziej odpowiednia do eksperymentów z wykorzystaniem unieśmiertelnionych lub pierwotnych linii komórkowych. Badanie poszczególnych mitochondriów pochodzących z tkanek jest znacznie trudniejsze, a większość metod nie pozwala na łatwą identyfikację podzbiorów mitochondriów równolegle z oceną funkcji mitochondriów³.

Aby rozwiązać tę przeszkodę, opracowano nową metodę immunoznakowania mitochondriów wyizolowanych z tkanek gryzoni, a następnie analizowanych za pomocą cytometrii przepływowej. Pozwala to na szybkie wykrywanie i kwantyfikację białek zlokalizowanych na zewnętrznej błonie mitochondrialnej, co w porównaniu z analizą mikroskopową jest znacznie mniej pracochłonne i pozwala na analizę tysięcy mitochondriów w jednej próbce. Test ten można zastosować do monitorowania losu i względnej ilości białek błony zewnętrznej mitochondriów, które uważa się za konstytutywnie obecne w mitochondriach, rekrutacji białek do powierzchni mitochondriów lub wykrywania białek błędnie zlokalizowanych w mitochondriach w warunkach patologicznych. Co więcej, włączenie konwencjonalnych fluorescencyjnych barwników wskaźnikowych pozwala na jednoczesną ocenę niektórych aspektów funkcji mitochondriów w różnych subpopulacjach mitochondrialnych.

Protokół

Zwierzęta użyte w tym badaniu były traktowane ściśle według protokołu (N08001CVsr) zatwierdzonego przez Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM) Institutional Committee for the Protection of Animals, który przestrzega krajowych standardów określonych przez Canadian Council on Animal Care (CCAC).

Przygotuj wszystkie odczynniki wymagane do wykonania tego protokołu (Tabela 1). Wszystkie inne szczegóły dotyczące sprzętu, materiałów eksploatacyjnych i dostawców można znaleźć w Wykazie materiałów.

Tabela 1. Kompozycje buforowe.

1. Kolekcja rdzenia kręgowego szczura

1. Głęboko znieczulij szczura (Sprague Dawley) 4% izofloranem. Znieczulenie należy sprawdzić przy braku odruchu po uszczypnięciu w przednią łapę. Poddaj szczura eutanazji przez ścięcie głowy za pomocą gilotyny. Ta metoda eutanazji jest preferowana w stosunku do innych, które mogą zniekształcić rdzeń kręgowy.
2. Przetnij skórę na plecach, aby odsłonić kręgosłup. Przetnij kręgosłup nożyczkami do kości tuż nad kością miednicy. Wizualizuj otwór kręgosłupa.
3. Wprowadzić do kręgosłupa strzykawkę o pojemności 10 ml z końcówką pipety o pojemności 200 μl (przymocowaną poprzez lekkie stopienie nad płomieniem), wypełnioną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
4. Wypłukać rdzeń kręgowy, wywierając średni nacisk na tłok.
5. Jeśli w rdzeniu kręgowym znajduje się krew, spłucz PBS przed przejściem do następnego kroku.
   UWAGA: Ta metoda została również zwalidowana dla mózgu i wątroby. Jeśli zawiera te tkanki, zbierz połowę mózgu od szczura poddanego eutanazji i kawałek wątroby o wadze równej rdzeniowi kręgowemu. Wszystkie inne kroki pozostają identyczne.

2. Izolacja mitochondriów rdzenia kręgowego (Na podstawie Vande Velde et al. ⁴)

1. Zebrać cały nienaruszony rdzeń kręgowy i umieścić w szklanym homogenizatorze o pojemności 5 ml z 5 objętościami (~3,25 ml) buforu homogenizacyjnego (HB). Aby optymalnie odzyskać izolowane mitochondria, wykonuj wszystkie kroki na lodzie lub w zimnym pomieszczeniu. Homogenizuj tkankę ręcznie, aż nie pozostaną żadne duże kawałki tkanki, około ośmiu pociągnięć. Umieścić homogenat w dwóch (2 ml) lub trzech (1,7 ml) probówkach do mikrowirówek. Odwirować 1 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w mikrowirówce stołowej.
2. Odzyskać supernatant i umieścić w probówce ultrawirówkowej o pojemności 5 ml. Dodać 750 μl (~0,5 objętości) HB do probówki mikrowirówkowej zawierającej granulki i delikatnie zawiesić osad. Powtórz etapy wirowania i ponownego zawieszania jeszcze dwa razy. Zebrać wszystkie supernatanty (S1a i S1b) w tej samej probówce ultrawirówki o pojemności 5 ml powyżej. Ten krok służy do usunięcia drobnych zanieczyszczeń.
3. Wirować w puli S1 za pomocą ultrawirówki wyposażonej w wahliwy wirnik kubełkowy i wirować przy 17 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
4. Przechowywać supernatant (S2) do dalszego przetwarzania, jeśli frakcja cytozolowa jest przedmiotem zainteresowania (na przykład do analizy Western blot). Zawiesić osad (P2), surową frakcję mitochondrialną, w 4 ml HB+50 mM KCl. Odwirować 17 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w wahadłowym wirniku kubełkowym. Odrzucić supernatant i delikatnie zawiesić osad (P3) w 800 μl HB.
   UWAGA: Mitochondria są myte HB+50 mM KCl w celu usunięcia wszelkich niespecyficznych zanieczyszczeń związanych z mitochondriami.
5. Do nowej probówki ultrawirówkowej o pojemności 5 ml dodać dokładnie 800 μl zawieszonego osadu (P3).
6. Do tej probówki dodaj 200 μl jodiksanolu (medium o gradiencie gęstości), tworząc w ten sposób końcowe stężenie 12% jodiksanolu. Zawartość probówki należy delikatnie, ale dokładnie wymieszać poprzez pipetowanie za pomocą pilarki P1000. Dodanie najpierw jodiksanolu, a następnie zawiesiny osadu (P3) może być preferowane w celu ułatwienia dokładnego wymieszania. Wirować w ultrawirówce wyposażonej w wahliwy wirnik kubełkowy o sile 17 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
7. UWAGA: Wątroba nie zawiera mieliny i dlatego ten krok nie jest konieczny, jeśli przetwarzana jest tylko wątroba. Jeśli jednak wątroba jest przetwarzana jednocześnie z mitochondriami OUN, zaleca się równe traktowanie wszystkich tkanek.
8. Odessać warstwę mieliny w górnej części probówki i ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant. Pellet może być luźny. Zawiesić osad w 4 ml HB. Ponownie odwirować przy 17 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 4 ml HB. Powtórzyć wirowanie i usunąć supernatant.
9. Zawiesić końcowy osad (P7) w 100-200 μl HB i przenieść do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml. Ta próbka zawiera izolowane mitochondria.
10. Przejdź do kwantyfikacji białka. Rozcieńczyć próbki i krzywą wzorcową w 2% dodecylosiarczanie sodu (SDS), aby zapewnić odpowiednią rozpuszczalność mitochondriów podczas kwantyfikacji białka.

3. Znakowanie immunologiczne izolowanych mitochondriów do cytometrii przepływowej

1. Dla każdej badanej mieszaniny barwiącej należy pobrać pipetę z 25 μg wyizolowanych mitochondriów do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml. Dołącz niebarwioną próbkę do każdego eksperymentu; A dla każdego przeciwciała należy dołączyć próbkę do odpowiedniej kontroli izotypu.
2. Wirować przy 17 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C w mikrowirówce stołowej.
3. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić izolowane mitochondria w 50 μl buforu mitochondrialnego (bufor M) uzupełnionym 10% BSA wolnym od kwasów tłuszczowych przez 15 minut w temperaturze 4 °C (etap blokowania).
   UWAGA: Podczas etykietowania należy wykonywać inkubację w lodówce w temperaturze 4 °C.
4. Dodać przeciwciało pierwszorzędowe (królicze przeciwciało anty-Mfn2, 20 μg na ml) do probówki i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Określić optymalne stężenie każdego przeciwciała empirycznie przez miareczkowanie. Ze względu na zmienność stężenia i/lub czystości, różne partie tego samego przeciwciała od tego samego producenta mogą prowadzić do różnych wyników; Dlatego konieczne jest miareczkowanie dla każdej nowej partii przeciwciał.
5. Wypłukać niezwiązane przeciwciało pierwszorzędowe: Wirować przy 17 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i delikatnie zawiesić osad w 200 μl M buforu. Wirować przy 17 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 50 μl M buforu.
6. Dodać przeciwciało drugorzędowe (przeciwciało przeciw królikowi IgG fikoerytrynie (PE), 0,5 μg na ml) do probówki i inkubować próbki przez 30 minut w temperaturze 4 °C, chroniąc je przed światłem.
7. Wypłukać niezwiązane przeciwciało wtórne: Odwirować przy 17 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 μl M buforu. Wirować przy 17 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 μl M buforu.
8. Aby upewnić się, że zdarzenia są w rzeczywistości mitochondriami, wytlumanie mitochondriów należy zabarwić barwnikiem fluorescencyjnym specyficznym dla mitochondriów przez 15 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Jeśli pożądane jest barwienie innych parametrów funkcjonalnych (mitochondrialny potencjał transbłonowy lub produkcja ponadtlenków), przejdź do kroku 4. Jeśli nie, przejdź do kroku 5 w celu pobrania.
   UWAGA: Ważne jest, aby sprawdzić, czy widmo emisyjne przeciwciała drugorzędowego jest zgodne z widmem emisyjnym barwników funkcjonalnych. Na przykład, w przypadku weryfikacji czystości mitochondriów za pomocą komercyjnego barwnika o właściwościach spektralnych podobnych do FITC i potencjale transbłonowym za pomocą estru metylowego tetrametylorodaminy (TMRM), żywotnym przeciwciałem drugorzędowym byłaby allofykocyjanina (APC: Ex 650 nm/Em 660 nm). Dodać kontrole kompensacyjne, tj. próbkę znakowaną immunologicznie lub barwioną pojedynczym fluoroforem, jeśli ma to zastosowanie.
9. Przenieść do probówki odpowiedniej do ładowania cytometru przepływowego. (Aby ułatwić mały rozmiar próbki, w probówce cytometru przepływowego o pojemności 3 ml umieszcza się probówkę z mikromiareczkowaniem). Trzymaj próbki na lodzie i natychmiast przejdź do cytometru przepływowego w celu pobrania.

4. Oznaczanie potencjału transbłonowego mitochondriów i produkcji ponadtlenków mitochondriów za pomocą cytometrii przepływowej

1. Sprawdzić, czy izolowane mitochondria mają nienaruszony potencjał transbłonowy, barwiąc je 100 nM TMRM (Ex 548 nm/Em 574 nm)⁵, w kroku 3.8, przez 15 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Do celów porównania potencjału transbłonowego między próbkami i populacjami bardziej odpowiednie może być zastosowanie niższych/niegaszących stężeń TMRM (od 1 do 30 nM)⁶.
   1. Jako kontrolę barwienia TMRM, wybarwić izolowane mitochondria 100 nM TMRM w obecności 100 μM cyjanku karbonylu m-chlorofenylohydrazyny (CCCP), mitochondrialnego rozłącznika, który depolaryzuje mitochondria. Stężenie CCCP wymagane do depolaryzacji mitochondriów może być mniejsze, jeśli stosuje się niższe stężenia barwnika.
2. Sprawdzić, czy izolowane mitochondria wytwarzają mitochondrialny ponadtlenek poprzez barwienie odpowiednim mitochondrialnym wskaźnikiem ponadtlenkowym⁷, również na etapie 3.8, przez 15 minut w temperaturze pokojowej, chroniony przed światłem.
   1. Jako kontrolę produkcji mitochondriów ponadtlenkowych, wybarwić izolowane mitochondria barwnikiem w obecności 10 μM antymycyny A, inhibitora kompleksu III łańcucha oddechowego, który zwiększy produkcję mitochondriów ponadtlenkowych.

5. Akwizycja i analiza izolowanych mitochondriów znakowanych immunologicznie za pomocą cytometrii przepływowej

1. Konfiguracja przyrządu: Przełącz napięcia z trybu liniowego na logarytmiczny, aby ułatwić analizę izolowanych mitochondriów i ustaw napięcia (FSC: 450; SSC: 250). Upewnij się, że zdarzenia są zbierane w trybie FSC-A (obszarowym), a także FSC-W (szerokość) i FSC-H (wysokość), aby móc wykluczyć dublety (tj. dwa zdarzenia przechodzące przez detektor w tym samym czasie) w analizie po zebraniu danych. Ustaw liczbę zdarzeń do zebrania na 100 000. W razie potrzeby uzyskaj mechanizmy kontroli wynagrodzeń.
2. Akwizycja danych: Przed akwizycją danych należy unikać wirowania próbek. Zamiast tego wymieszaj, delikatnie stukając w rurkę. Początkowo zbieraj zdarzenia przy niskim ciśnieniu, podczas bramkowania. Brama na całkowitą populację. Dostosuj odpowiednio napięcia histogramów, zwykle szczyt niebarwionej próbki będzie odpowiadał drugiej dekadzie (10²). Po ustawieniu bramek i przetwarzaniu próbek ciśnienie można przełączyć na wysokie.
3. Analiza: Wizualizacja dubletów, wykreślając FSC-W w porównaniu z FSC. Zidentyfikuj podkoszulki i dublety. Bramka na podkoszulkach. Wybierz populację mitochondriów, bramkując zdarzenia, które są pozytywnie zabarwione barwnikiem selektywnym mitochondrialnie.
4. Określ etykietowanie tła na podstawie kontroli izotypu. Korzystając z próbki kontrolnej izotypu, określ procent populacji mitochondriów z dodatnim wynikiem na obecność przeciwciała Mfn2.

Wyniki

Mitochondria pochodzące z rdzenia kręgowego szczura mogą być znakowane immunologicznie przeciwciałem skierowanym przeciwko Mitofusin2 (Mfn2), białku biorącemu udział w fuzji zewnętrznej błony mitochondriów⁸. Po wyizolowaniu i znakowaniu przeciwciałem specyficznym dla Mfn2 i fluorescencyjnie sprzężonym przeciwciałem drugorzędowym, mitochondria są przetwarzane za pomocą cytometrii przepływowej (ryc. 1). Po pozyskaniu danych próbki są analizowane za pomocą oprogramowania do analizy cytometrii prz...

Dyskusja

Coraz bardziej oczywiste jest, że mitochondria odgrywają kluczową rolę zarówno w normalnej fizjologii, jak i chorobie. Podczas gdy immunoblotting może określić, które białka znajdują się w mitochondriach lub na powierzchni mitochondriów w określonym stanie, ta metoda informuje o średniej dla całej populacji. Metoda ta nie może dostarczyć informacji o względnej liczebności subpopulacji lub podzbiorów mitochondriów. Chociaż wcześniej zakładano, że wszystkie mitochondria są tworzone jednakowo, w tej dziedzinie coraz częście...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szczury	Charles River	Szczep kod 400	Dorosłe (od 9 tygodni do 18 tygodni) samce lub samice szczurów mogą być używane do protokołu izolacji. Zwykle stosuje się wagę szczurów w zależności od płci i wieku (samce od 300 do 500 g i samice od 200 do 350 g).
Homogenizator odcinowy	Kontes Glass Co.	885450-0022	Mikrowirówka Duall 22
	Thermo Scientific		Sorvall Legend Micro 17 R
Ultra-Clear Probówki do ultrawirówek	Beckman Coulter	344057	Przezroczyste, cienkościenne
Sorvall Ultrawirówka	Thermo Scientific		Sorvall WX UltraSeries
AH-650	Thermo Scientific
Opti-prep	Axis-Shield	1114542	Jodixanol, średni gradient gęstości
Bez kwasów tłuszczowych Surowica bydlęca Albumina	Sigma	A8806	Musi być wolna od kwasów tłuszczowych dla mitochondriów
Bursztynian sodu dwuzasadowy sześciowodny	Sigma	S9637
Królicze przeciwciało anty-Mitofusin2	Sigma	M6319
Królicze IgG	Jackson Badania immunologiczne	011-000-003
Anty-królicza IgG PE	eBioscience	12-4739-81
Mikrorurka do mianowania	Bio-Rad	223-9391	Do pobierania próbek metodą cytometrii przepływowej
MitoTrackerGreen (MTG)	Invitrogen	M7514	100 nM: Ex 490 nm/Em 516 nm
TMRM	Invitrogen	T668	100 nM: Ex 548 nm/Em 574 nm
CCCP	Sigma	C2759
MitoSOX Red	Invitrogen	M36008	5 µ M: Ex 540 nm/Em 600 nm
Antymycyna A	Sigma	A8874
Cytometr przepływowy LSR II	BD
BD BD FACSDiva Oprogramowanie	BD
FlowJo	TreeStar Inc.		Oprogramowanie służące do analizy
zestawu do oznaczania białek BCA	Test Pierce/Thermo Scientific	23225	Bradford nie jest zalecany, ponieważ nie jest kompatybilny z wysokimi stężeniami SDS