Immunodetekcja białek błony zewnętrznej za pomocą cytometrii przepływowej izolowanych mitochondriów

Podsumowanie

Opisana tutaj jest metoda wykrywania i ilościowego oznaczania białek zewnętrznej błony mitochondrialnej poprzez immunoznakowanie mitochondriów wyizolowanych z tkanek gryzoni i analizę za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta może być rozszerzona o ocenę funkcjonalnych aspektów subpopulacji mitochondrialnych.

Streszczenie

Metody wykrywania i monitorowania składników białkowych zewnętrznej błony mitochondrialnej w tkankach zwierzęcych są niezbędne do badania fizjologii i patofizjologii mitochondriów. Protokół ten opisuje technikę, w której mitochondria wyizolowane z tkanki gryzoni są znakowane immunologicznie i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej. Mitochondria są izolowane z rdzenia kręgowego gryzoni i poddawane szybkiemu etapowi wzbogacania w celu usunięcia mieliny, głównego zanieczyszczenia frakcji mitochondrialnych przygotowanych z tkanki nerwowej. Wyizolowane mitochondria są następnie znakowane wybranym przeciwciałem i fluorescencyjnie sprzężonym przeciwciałem drugorzędowym. Analiza za pomocą cytometrii przepływowej weryfikuje względną czystość preparatów mitochondrialnych poprzez barwienie barwnikiem specyficznym dla mitochondriów, a następnie wykrywanie i kwantyfikację białka znakowanego immunologicznie. Technika ta jest szybka, policzalna i wysokoprzepustowa, co pozwala na analizę setek tysięcy mitochondriów na próbkę. Ma zastosowanie do oceny nowych białek na powierzchni mitochondriów w normalnych warunkach fizjologicznych, a także białek, które mogą zostać nieprawidłowo zlokalizowane w tej organelli podczas patologii. Co ważne, metoda ta może być połączona z fluorescencyjnymi barwnikami wskaźnikowymi w celu informowania o pewnych aktywnościach subpopulacji mitochondrialnych i jest wykonalna dla mitochondriów z ośrodkowego układu nerwowego (mózg i rdzeń kręgowy), a także wątroby.

Wprowadzenie

Mitochondria to wysoce dynamiczne organelle, które przechodzą wiele rund rozszczepienia i fuzji, są transportowane do miejsc o wysokim zapotrzebowaniu na energię i szybko reagują na bodźce fizjologiczne¹. Ponieważ coraz częściej uznaje się, że mitochondria w różnych tkankach, a nawet w różnych przedziałach komórkowych, mają różne profile funkcjonalne, potrzebne są nowe metody identyfikacji tych odrębnych podzbiorów mitochondrialnych.

Mikroskopia dostarcza środków, dzięki którym można wizualizować poszczególne mitochondria i można określić obecność białka w mitochondriach lub w mitochondriach za pomocą immunofluorescencji². Jednak analiza ilościowa tą metodą jest pracochłonna i jest bardziej odpowiednia do eksperymentów z wykorzystaniem unieśmiertelnionych lub pierwotnych linii komórkowych. Badanie poszczególnych mitochondriów pochodzących z tkanek jest znacznie trudniejsze, a większość metod nie pozwala na łatwą identyfikację podzbiorów mitochondriów równolegle z oceną funkcji mitochondriów³.

Aby rozwiązać tę przeszkodę, opracowano nową metodę immunoznakowania mitochondriów wyizolowanych z tkanek gryzoni, a następnie analizowanych za pomocą cytometrii przepływowej. Pozwala to na szybkie wykrywanie i kwantyfikację białek zlokalizowanych na zewnętrznej błonie mitochondrialnej, co w porównaniu z analizą mikroskopową jest znacznie mniej pracochłonne i pozwala na analizę tysięcy mitochondriów w jednej próbce. Test ten można zastosować do monitorowania losu i względnej ilości białek błony zewnętrznej mitochondriów, które uważa się za konstytutywnie obecne w mitochondriach, rekrutacji białek do powierzchni mitochondriów lub wykrywania białek błędnie zlokalizowanych w mitochondriach w warunkach patologicznych. Co więcej, włączenie konwencjonalnych fluorescencyjnych barwników wskaźnikowych pozwala na jednoczesną ocenę niektórych aspektów funkcji mitochondriów w różnych subpopulacjach mitochondrialnych.

Protokół

Zwierzęta wykorzystane w niniejszym badaniu były traktowane w ścisłej zgodności z protokołem (N08001CVsr) zatwierdzonym przez Instytucjonalny Komitet Ochrony Zwierząt Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l’Université de Montréal (CRCHUM), który stosuje standardy krajowe określone przez Kanadyjską Radę ds. Opieki nad Zwierzętami (CCAC).

Przygotuj wszystkie odczynniki wymagane do przeprowadzenia tego protokołu (Tabela 1). Wszystkie pozostałe szczegóły dotyczące sprzętu, materiałów i dostawców znajdują się w Liście Materiałów.

Tabela 1. Składy buforów.

1. Pobieranie rdzenia kręgowego szczura

1. Głęboko znieczul szczura (rasy Sprague Dawley) przy użyciu 4% izofluranu. Potwierdź znieczulenie, sprawdzając brak odruchu po uciśnięciu przedniej łapy. Uśmierć szczura poprzez gilotynowanie. Ta metoda eutanazji jest preferowana nad innymi, które mogłyby zdeformować rdzeń kręgowy.
2. Nacinij skórę na grzbiecie, aby odsłonić kręgosłup. Przetnij kręgosłup nożyczkami do kości tuż powyżej kości miednicy. Zlokalizuj otwór w kanale kręgowym.
3. Wprowadź do kanału kręgowego strzykawkę o pojemności 10 ml z dołączonym końcem pipety 200 µl (przymocowanym poprzez lekkie stopienie nad płomieniem), wypełnioną solą fizjologiczną w buforze fosforanowym (PBS).
4. Wypłucz rdzeń kręgowy, wywierając umiarkowany nacisk na tłok strzykawki.
5. Jeśli na rdzeniu kręgowym znajduje się krew, przepłucz go PBS przed przejściem do następnego kroku.
   UWAGA: Metoda ta została zwalidowana również dla mózgu i wątroby. W przypadku pobierania tych tkanek, pobierz połowę mózgu z uśmierconego szczura oraz fragment wątroby o masie równej masie rdzenia kręgowego. Wszystkie pozostałe kroki pozostają bez zmian.

2. Izolacja mitochondriów z rdzenia kręgowego (na podstawie Vande Velde et al. ⁴)

1. Pobrać cały, nienaruszony rdzeń kręgowy i umieścić go w szklanym homogenizatorze o pojemności 5 ml z 5 objętościami (~3,25 ml) buforu do homogenizacji (HB). Aby zapewnić optymalną odzyskiwalność wyizolowanych mitochondriów, wszystkie etapy należy przeprowadzać w lodzie lub w pomieszczeniu chłodniczym. Homogenizować tkankę ręcznie, aż do całkowitego rozdrobnienia dużych fragmentów, wykonując około ośmiu pociągnięć. Homogenizat przenieść do dwóch probówek do mikrocentryfugi (2 ml) lub trzech (1,7 ml). Wirować z prędkością 1 300 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C w mikrocentryfudze laboratoryjnej.
2. zebrać nadsącz i przenieść go do probówki do ultrawirowania o pojemności 5 ml. Do probówki z osadem dodać 750 µl (~0,5 objętości) HB i delikatnie resuspendować osad. Kroki wirowania i resuspensji powtórzyć jeszcze dwukrotnie. Wszystkie nadsącze (S1a i S1b) połączyć w tej samej probówce do ultrawirowania o pojemności 5 ml. Ten etap służy do usunięcia drobnych zanieczyszczeń.
3. Połączone S1 wirować w ultrawirowarce wyposażonej w rotor z koszyczkami odchylanymi przy 17 000 × g przez 15 min w temperaturze 4 °C.
4. Nadsącz (S2) zachować do dalszej obróbki, jeśli frakcja cytozolowa jest przedmiotem zainteresowania (np. do analizy Western blot). Osad (P2), będący surową frakcją mitochondrialną, resuspendować w 4 ml HB+50 mM KCl. Wirować przy 17 000 × g przez 15 min w temperaturze 4 °C w rotorze z koszyczkami odchylanymi. Odrzucić nadsącz i delikatnie resuspendować osad (P3) w 800 µl HB.
   UWAGA: Mitochondria są płukane buforem HB+50 mM KCl w celu usunięcia niespecyficznych zanieczyszczeń związanych z mitochondriami.
5. Do nowej probówki do ultrawirowania o pojemności 5 ml dodać dokładnie 800 µl resuspendowanego osadu (P3).
6. Do probówki dodać 200 µl Iodixonolu (medium do gradientu gęstości), tworząc tym samym stężenie końcowe 12% Iodixonolu. Zawartość probówki wymieszać delikatnie, ale dokładnie za pomocą pipety P1000. W celu ułatwienia dokładnego wymieszania może być korzystniejsze dodanie najpierw Iodixonolu, a następnie resuspendowanego osadu (P3). Wirować w ultrawirowarce wyposażonej w rotor z koszyczkami odchylanymi przy 17 000 × g przez 15 min w temperaturze 4 °C.
7. UWAGA: Wątroba nie zawiera mieliny, dlatego ten etap nie jest konieczny, jeśli przetwarzana jest tylko wątroba. Jeśli jednak wątroba jest przetwarzana równolegle z mitochondriami OUN, zaleca się traktowanie wszystkich tkanek w ten sam sposób.
8. Odssać warstwę mieliny z górnej części probówki, a następnie ostrożnie usunąć i odrzucić nadsącz. Osad może być luźny. Resuspendować osad w 4 ml HB. Ponownie wirować przy 17 000 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Odrzucić nadsącz i resuspendować osad w 4 ml HB. Powtórzyć wirowanie i usunąć nadsącz.
9. Końcowy osad (P7) resuspendować w 100-200 µl HB i przenieść do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 ml. Próbka ta zawiera wyizolowane mitochondria.
10. Przejść do kwantyfikacji białka. Próbki oraz krzywą wzorcową rozcieńczyć w 2% dodecylosiarczanie sodu (SDS), aby zapewnić odpowiednią solubilizację mitochondriów podczas kwantyfikacji białka.

3. Immunoznakowanie wyizolowanych mitochondriów do cytometrii przepływowej

1. Dla każdej mieszaniny barwiącej poddawanej badaniu, nanieś pipetą 25 µg izolowanych mitochondriów do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 ml. W każdym eksperymencie należy uwzględnić próbkę niezbarwioną; a w przypadku każdego przeciwciała należy upewnić się, że dołączono próbkę dla odpowiedniej kontroli izotypowej.
2. Wiruj przy 17 000 x g przez 2 min w temperaturze 4 °C w mikrocentryfugę laboratoryjną.
3. Usunąć supernatant i zawiesić wyizolowane mitochondria w 50 µl bufor mitochondrialny (bufor M) uzupełniony o 10% BSA wolnej od kwasów tłuszczowych przez 15 min w 4 °C (etap blokowania).
   UWAGA: Podczas znakowania inkubacje należy prowadzić w lodówce w temperaturze 4 °C.
4. Dodaj przeciwciało pierwszorzędowe (królicze anty-Mfn2, 20 µg na ml) do probówki i inkubować przez 30 min w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Optymalne stężenie każdego przeciwciała należy określić empirycznie poprzez miareczkowanie. Ze względu na zmienność stężenia i/lub czystości, różne partie tego samego przeciwciała od tego samego producenta mogą prowadzić do różnych wyników; w związku z tym miareczkowanie jest konieczne dla każdej nowej partii przeciwciał.
5. Wypłukanie nieprzypisanego przeciwciała pierwszorzędowego: Wirować przy 17 000 x g przez 2 min w 4 °CUsuń nadosad i delikatnie resuspender osad w 200 µl Bufor M. Wirować przy 17 000 x g przez 2 min w temp. 4 °CUsuń nadsącz i resuspenduj osad w 50 µl Bufor M.
6. Dodaj przeciwciało wtórne (anty-królicze IgG z osła z fikoerytryną (PE), 0.5 µg na ml) do probówki i inkubować próbki przez 30 min w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.
7. Wypłukanie nieprzypisanego przeciwciała wtórnego: Wirowanie przy 17 000 x g przez 2 min w temperaturze 4 °COdciąć supernatant i resuspendować osad w 200 µl Bufor M. Wirować przy 17 000 x g przez 2 min w temp. 4 °COdessać supernatant i resuspender osad w 500 µl Bufor M.
8. Aby upewnić się, że analizowane zdarzenia są rzeczywiście mitochondriami, należy zabarwić wyizolowane mitochondria specyficznym fluorescencyjnym barwnikiem mitochondrialnym przez 15 min w temperaturze pokojowej, w ciemności. Jeśli planowane jest barwienie innych parametrów funkcjonalnych (potencjału błony mitochondrialnej lub produkcji anionów ponadtlenkowych), należy przejść do kroku 4. W przeciwnym razie należy przejść do kroku 5 w celu akwizycji danych.
   UWAGA: Należy upewnić się, że widmo emisji przeciwciała wtórnego jest zgodne z widmem barwników funkcjonalnych. Na przykład, w przypadku weryfikacji czystości mitochondriów za pomocą komercyjnego barwnika o właściwościach spektralnych podobnych do FITC oraz pomiaru potencjału błony za pomocą estru metylowego tetrametylorodaminy (TMRM), odpowiednim przeciwciałem wtórnym byłaby allofikocyjanina (APC: Ex 650 nm/Em 660 nm). Należy dodać kontrole kompensacji, t.j. próbkę immunoznakowaną lub barwioną pojedynczym fluoroforem, jeśli dotyczy.
9. Przenieś próbkę do probówki odpowiedniej do załadunku do cytometru przepływowego. (Aby ułatwić pracę z małą objętością próbki, probówkę do mikropłytek umieszcza się wewnątrz probówki do cytometrii przepływowej o pojemności 3 ml). Próbki należy przechowywać w lodzie i niezwłocznie przekazać do cytometru przepływowego w celu akwizycji danych.

4. Pomiar potencjału błony mitochondrialnej i produkcji anionorodnika supertlenkowego w mitochondriach za pomocą cytometrii przepływowej

1. W kroku 3.8 zweryfikuj, czy izolowane mitochondria posiadają nienaruszony potencjał błonowy, barwiąc je 100 nM TMRM (Ex 548 nm/Em 574 nm)⁵ przez 15 min w temperaturze pokojowej (RT), w ciemności. Do porównywania potencjału błonowego między próbkami i populacjami bardziej odpowiednie może być zastosowanie niższych, niegaszących stężeń TMRM (od 1 do 30 nM)⁶.
   1. Jako kontrolę barwienia TMRM, zabarw izolowane mitochondria 100 nM TMRM w obecności 100 µM cyjanorku karbonylowego m-chlorofenylhydrazyny (CCCP), będącego odsprzęgaczem mitochondrialnym, który powoduje depolaryzację mitochondriów. Stężenie CCCP wymagane do depolaryzacji mitochondriów może być niższe, jeśli zastosowano mniejsze stężenia barwnika.
2. W kroku 3.8 zweryfikuj, czy izolowane mitochondria wytwarzają mitochondrialny anion ponadtlenkowy, barwiąc je odpowiednim wskaźnikiem nadtlenku mitochondrialnego⁷ przez 15 min w temperaturze pokojowej (RT), w ciemności.
   1. Jako kontrolę produkcji mitochondrialnego anionu ponadtlenkowego, zabarw izolowane mitochondria barwnikiem w obecności 10 µM antymycyny A, inhibitora kompleksu III łańcucha oddechowego, który zwiększy produkcję mitochondrialnego anionu ponadtlenkowego.

5. Akwizycja i analiza immunoznakowanych izolowanych mitochondriów metodą cytometrii przepływowej

1. Konfiguracja instrumentu: Przełącz napięcia z trybu liniowego na logarytmiczny, aby ułatwić analizę izolowanych mitochondriów, i ustaw wartości napięć (FSC: 450; SSC: 250). Upewnij się, że zdarzenia są zbierane w trybach FSC-A (pole), FSC-W (szerokość) oraz FSC-H (wysokość), aby umożliwić wykluczenie dubletów (t.j. dwóch zdarzeń przechodzących przez detektor w tym samym czasie) podczas analizy po zakończeniu akwizycji danych. Ustaw liczbę zdarzeń do zebrania na 100 000. Pozyskaj kontrole kompensacji, jeśli są wymagane.
2. Akwizycja danych: Przed akwizycją danych unikaj mieszania próbek w vorteksie. Zamiast tego wymieszaj je, delikatnie opukując probówkę. Początkowo, podczas bramowania, zbieraj zdarzenia przy niskim ciśnieniu. Wyznacz bramkę dla całej populacji. Odpowiednio dostosuj napięcia histogramów; zazwyczaj szczyt próbki niebarwionej powinien odpowiadać drugiej dekadzie (10²). Po ustaleniu bramek i rozpoczęciu przetwarzania próbek można przełączyć ciśnienie na wysokie.
3. Analiza: Zwizualizuj dublety, wykreślając FSC-W względem FSC. Zidentyfikuj singlety i dublety. Wyznacz bramkę dla singletów. Wybierz populację mitochondriów, bramując zdarzenia, które zostały zabarwione dodatnio barwnikiem selektywnym dla mitochondriów.
4. Określ poziom tła na podstawie kontroli izotypowej. Korzystając z próbki kontroli izotypowej, określ procent populacji mitochondriów wykazujący dodatnie barwienie dla przeciwciała Mfn2.

Wyniki

Mitochondria wyizolowane z rdzeni kręgowych szczura mogą zostać immunoznakowane przeciwciałem skierowanym przeciwko Mitofuzynie 2 (Mfn2), białku zaangażowanym w fuzję zewnętrznej błony mitochondriów⁸. Po izolacji i znakowaniu swoistym przeciwciałem przeciwko Mfn2 oraz koniugowanym z fluoresceincją przeciwciałem wtórnym, mitochondria są analizowane za pomocą cytometrii przepływowej (Rysunek 1). Po akwizycji danych próbki są analizowane przy użyciu oprogramowania do analizy cytometrii przepływow...

Dyskusja

Coraz bardziej oczywiste jest, że mitochondria odgrywają kluczową rolę zarówno w normalnej fizjologii, jak i chorobie. Podczas gdy immunoblotting może określić, które białka znajdują się w mitochondriach lub na powierzchni mitochondriów w określonym stanie, ta metoda informuje o średniej dla całej populacji. Metoda ta nie może dostarczyć informacji o względnej liczebności subpopulacji lub podzbiorów mitochondriów. Chociaż wcześniej zakładano, że wszystkie mitochondria są tworzone jednakowo, w tej dziedzinie coraz częście...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szczury	Charles River	Szczep kod 400	Dorosłe (od 9 tygodni do 18 tygodni) samce lub samice szczurów mogą być używane do protokołu izolacji. Zwykle stosuje się wagę szczurów w zależności od płci i wieku (samce od 300 do 500 g i samice od 200 do 350 g).
Homogenizator odcinowy	Kontes Glass Co.	885450-0022	Mikrowirówka Duall 22
	Thermo Scientific		Sorvall Legend Micro 17 R
Ultra-Clear Probówki do ultrawirówek	Beckman Coulter	344057	Przezroczyste, cienkościenne
Sorvall Ultrawirówka	Thermo Scientific		Sorvall WX UltraSeries
AH-650	Thermo Scientific
Opti-prep	Axis-Shield	1114542	Jodixanol, średni gradient gęstości
Bez kwasów tłuszczowych Surowica bydlęca Albumina	Sigma	A8806	Musi być wolna od kwasów tłuszczowych dla mitochondriów
Bursztynian sodu dwuzasadowy sześciowodny	Sigma	S9637
Królicze przeciwciało anty-Mitofusin2	Sigma	M6319
Królicze IgG	Jackson Badania immunologiczne	011-000-003
Anty-królicza IgG PE	eBioscience	12-4739-81
Mikrorurka do mianowania	Bio-Rad	223-9391	Do pobierania próbek metodą cytometrii przepływowej
MitoTrackerGreen (MTG)	Invitrogen	M7514	100 nM: Ex 490 nm/Em 516 nm
TMRM	Invitrogen	T668	100 nM: Ex 548 nm/Em 574 nm
CCCP	Sigma	C2759
MitoSOX Red	Invitrogen	M36008	5 µ M: Ex 540 nm/Em 600 nm
Antymycyna A	Sigma	A8874
Cytometr przepływowy LSR II	BD
BD BD FACSDiva Oprogramowanie	BD
FlowJo	TreeStar Inc.		Oprogramowanie służące do analizy
zestawu do oznaczania białek BCA	Test Pierce/Thermo Scientific	23225	Bradford nie jest zalecany, ponieważ nie jest kompatybilny z wysokimi stężeniami SDS

Wirnik i wiadra