Stabilnie transgeniczne Hydry są wytwarzane przez mikroiniekcję plazmidowego DNA do embrionów, a następnie losową integrację genomową i rozmnażanie bezpłciowe w celu ustanowienia jednolitej linii. Transgeniczne Hydry są używane do śledzenia ruchów komórek, nadekspresji genów, badania funkcji promotora lub obniżania ekspresji genów za pomocą RNAi.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wytwarzanie transgenicznej hydry przez mikroiniekcję zarodka
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Jako członek gromady Cnidaria, siostrzanej grupy wszystkich bilateralistów, Hydra może rzucić światło na podstawowe procesy biologiczne wspólne dla zwierząt wielokomórkowych. Hydra jest używana jako model do badań nad regeneracją, tworzeniem wzorców i komórkami macierzystymi. Wysiłki badawcze są jednak utrudnione ze względu na brak wiarygodnej metody badania funkcji molekularnych zaburzeń genów. Rozwój metod transgenicznych ożywił badania nad biologią Hydry 1. Transgeniczna Hydra pozwala na śledzenie żywych komórek, sortowanie w celu uzyskania czystych populacji komórek do analizy biochemicznej, manipulowanie funkcją genów poprzez knockdown i nadmierną ekspresję oraz analizę funkcji promotora. Plazmidowe DNA wstrzyknięte do zarodków we wczesnym stadium losowo integruje się z genomem na wczesnym etapie rozwoju. Powoduje to powstanie piskląt, które wyrażają transgeny w plamach tkanki w jednej lub więcej z trzech linii (nabłonek ektodermalny, nabłonek endodermalny lub śródmiąższowy). Wskaźnik sukcesu uzyskania pisklęcia z tkanką transgeniczną wynosi od 10% do 20%. Rozmnażanie bezpłciowe pisklęcia transgenicznego służy do ustanowienia jednolicie transgenicznej linii w określonej linii. Generowanie transgenicznej Hydry jest zaskakująco proste i solidne, a tutaj opisujemy protokół, który można łatwo wdrożyć przy niskich kosztach.
Wprowadzenie
Hydra była używana do badania regeneracji, tworzenia wzorców i komórek macierzystych przez około 250 lat2. Hydra ma prosty plan ciała składający się z trzech linii komórkowych: nabłonka ektodermalnego, nabłonka endodermalnego i śródmiąższowego. Ciało rurkowe jest utworzone przez linie nabłonkowe ektodermalne i endodermalne, z których każda jest pojedynczą warstwą komórkową. Wszystkie komórki nabłonkowe w kolumnie ciała są mitotyczne. Kiedy komórki nabłonkowe są przemieszczane do kończyn3, głowy (ust i macek) na końcu jamy ustnej lub stopy (dysku podstawnego) na końcu kości ustnej, zatrzymują się w fazie G2 cyklu komórkowego i zmieniają los komórki4. Komórki linii śródmiąższowej znajdują się w szczelinach między komórkami nabłonka. Ta linia jest wspierana przez multipotencjalne komórki macierzyste, które znajdują się w ektodermalnej warstwie nabłonka kolumnyciała 5. Śródmiąższowe komórki macierzyste dają początek trzem typom komórek somatycznych (nerwów, komórek gruczołowych i nematocytów) oraz komórek rozrodczych6,7.
Jako członek gromady Cnidaria, siostrzanej grupy wszystkich bilateralistów, Hydra może rzucić światło na podstawowe procesy biologiczne wspólne dla zwierząt wielokomórkowych. Do niedawna wysiłki te były utrudnione przez brak wiarygodnych metod na zaburzenia funkcji genów. Jednak wraz z rozwojem metodologiitransgenicznej1 jesteśmy teraz w stanie w pełni wykorzystać Hydrę, aby lepiej zrozumieć podstawowe mechanizmy wspólne dla zwierząt wielokomórkowych, takie jak funkcja komórek macierzystych, regeneracja i modelowanie. Transgeniczne linie Hydry są ustanawiane przez wstrzyknięcie plazmidowego DNA do zarodków, co skutkuje losową integracją i chimeryczną ekspresją u znacznej częstotliwości piskląt. Linię o jednolitej ekspresji w określonej linii można ustalić przez rozmnażanie bezpłciowe. Zdolność do klonalnego rozmnażania transgenicznych linii Hydra jest przewagą nad większością modeli zwierzęcych, które mogą być rozmnażane tylko przez rozmnażanie płciowe. Ponadto komórki transgeniczne można łatwo śledzić in vivo ze względu na przezroczystość zwierzęcia i brak endogennych białek fluorescencyjnych 8.
W ciągu siedmiu lat od powstania pierwszych transgenicznych linii Hydry 1, takie linie były używane do różnych zastosowań. Ekspresja białek fluorescencyjnych w różnych typach komórek umożliwiła śledzenie ruchu komórek, obserwowanie zmian w kształcie komórek i śledzenie losów komórek zarówno w warunkach typu dzikiego, jak i po zaburzeniach chemicznych1,5,9-12. Ponadto ekspresja różnych białek fluorescencyjnych w różnych liniach pozwala na izolację FACS określonych populacji komórek. Technika ta została wykorzystana do sekwencjonowania mRNA specyficznych dla komórek macierzystych i małych RNA specyficznych dla linii13,14. Podczas gdy promotor jednego z dwóch genów aktyny Hydra był najczęściej stosowany, zidentyfikowano kilka promotorów specyficznych dla typu komórki i wykorzystano je do kierowania ekspresją GFP w transgenicznej Hydrze9,11,15,16. W przyszłości promotory specyficzne dla typu komórki pozwolą na obserwację i zbieranie dowolnych określonych typów komórek. Ponadto z powodzeniem zastosowano podejście transgeniczne w celu zdefiniowania działających na cis elementów regulatorowych promotora Wnt317.
Rozwój metod transgenicznych w Hydrze zapewnia solidne podejście do testowania funkcji genów poprzez ektopową ekspresję, nadekspresję i knockdown. Stworzono zwierzęta transgeniczne, które wykazują ekspresję białek znakowanych fluorescencyjnie w celu zbadania zarówno funkcji, jak i lokalizacji komórkowej18-20. Ponadto ekspresja spinek do włosów RNA w 3'UTR transgenu GFP prowadzi do knockdownu docelowych genów21,22. W tych podejściach GFP jest wymagany do identyfikacji i śledzenia tkanki transgenicznej podczas tworzenia linii transgenicznej. Jest jednak prawdopodobne, że w niektórych przypadkach cząsteczka GFP zakłócałaby funkcję znakowanego białka. Niedawne badania pokazują, że geny Hydry mogą być ułożone w konfigurację operonową, tj. powstają transkrypty policistroniczne, które są następnie rozdzielane przez addycję trans-spliced leader i oddzielnie translowane23. Umieszczając gen kodujący białko lub spinkę do włosów RNA w pozycji przed operonem i gen białka fluorescencyjnego w pozycji dolnej, można śledzić tkankę transgeniczną bez konieczności znakowania genu kodującego spinkę do włosów białka lub RNA. Metoda ta została wykorzystana do ekspresji spinki do włosów RNA w konfiguracji operonowej z DsRed2 w celu osiągnięcia knockdownu genu14.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie plazmidowego DNA, igieł i naczyń do iniekcji
- Przygotuj plazmidowe DNA za pomocą zestawu High Speed Maxi lub Midi i zagęścić DNA do 2,5 mg/ml za pomocą wytrącania etanolu. Osad DNA należy rozpuścić w wodzie dejonizowanej bez nukleaz. Przechowywać DNA w 10-20 μl podwielokrotności w temperaturze -20°C. (Patrz Tabela Uzupełniająca 1 w celu uzyskania wykazu dostępnych wektorów)
- Przygotować naczynie do wstrzykiwań z agarozy do budowy koryta do przechowywania zarodków na szalce Petriego o wymiarach 100 x 15 mm.
- Umieść szkiełko mikroskopowe o wymiarach 75 x 50 w szalce Petriego o wymiarach 100 x 15 mm pod kątem. Wlać około 50 ml 2% agarozy stopionej w pożywce Hydra 24 do szalki Petriego. Alternatywnie, najpierw wlej agarozę do naczynia i unieś na wierzchu "Foremkę do ryb z mikroiniekcją".
- Po zestaleniu się agarozy usuń szkiełko lub formę. Jeśli użyto szkiełka szklanego, odetnij nadmiar agarozy żyletką, aby utworzyć ścianę. Wlej pożywkę Hydra do naczynia i użyj jej natychmiast lub przechowuj w temperaturze 4°C do momentu, gdy będzie potrzebna. Uwaga: Naczynia do wstrzykiwań mogą być ponownie użyte, jeśli są przechowywane w temperaturze 4°C między użyciami.
- Wyciągnąć igły z kapilar ze szkła borokrzemianowego za pomocą filamentu na ściągaczu do mikropipet w następujących warunkach: ciepło 525, pociągnięcie 75, prędkość 100, czas 50. Przechowuj igły, wciskając je w wąski pasek gliny na szalce Petriego tak, aby były trzymane równolegle do dna naczynia.
- Aby przygotować roztwór do wstrzykiwań, należy połączyć 3 μl roztworu plazmidowego DNA o stężeniu 2,5 mg/ml z 2 μl 10% czerwieni fenolowej. Krótko zmieszać roztwór, a następnie wirować go przez 10 minut z maksymalną prędkością w mikrowirówce, aby usunąć wszelkie cząstki, które mogłyby zatkać igłę.
- Pod mikroskopem preparacyjnym przytnij igłę kilka milimetrów od końcówki za pomocą kleszczy, aby utworzyć mały otwór. Uwaga: Istnieje pewna elastyczność w odpowiednim rozmiarze otworu, ponieważ ciśnienie można dostosować w kroku 3.3, aby dostosować się do tej zmiany.
- Umieść szalkę Petriego tak, aby trzymała igłę w pozycji pionowej końcówką do dołu. Umieścić na igłę około 0,5 μl roztworu do wstrzykiwań, pipetując płyn do tylnej części igły. Pozwolić, aby działanie kapilarne wciągnęło roztwór do końcówki igły.
2. Przygotowanie zarodków do wstrzyknięcia
- Na co dzień skanuj kulturę szczepu Hydra AEP w poszukiwaniu polipów produkujących jaja. Zbierz te polipy i odłóż je na bok w osobnym naczyniu hodowlanym. Obserwuj te polipy co kilka godzin w ciągu dnia, aby monitorować postęp tworzenia jaj. Kiedy jaja przebijają się przez ektodermę i siedzą na pierścieniu cofniętych komórek ektodermalnych, są gotowe do wstrzyknięcia25. Umieść te polipy w naczyniu z kilkoma Hydrami, które mają jądra, na co najmniej 1 godzinę przed wstrzyknięciem, aby umożliwić zapłodnienie. Samce Hydry uwalniają plemniki bez specjalnej manipulacji.
- Jeśli samice znajdują się w kolonii AEP z w pełni uformowanymi jajami, które mają około 400 μm średnicy25 lub zarodki w stadium od 1 do 8 komórek, należy je również pobrać do wstrzyknięcia. Natychmiast wstrzyknąć zarodki, które rozpoczęły rozszczepianie. Uwaga: Nie jest możliwe odróżnienie w pełni uformowanych jaj od zygot jednokomórkowych, dlatego przed wstrzyknięciem należy je inkubować z samcami.
- Przed wstrzyknięciem należy usunąć większość tkanki rodzicielskiej powyżej i poniżej zarodka za pomocą skalpela z ostrzem #15. Pozostaw tylko zarodek z przymocowanym małym kawałkiem kolumny ciała, który w razie potrzeby będzie używany do manipulowania zarodkiem za pomocą kleszczy. Uwaga: Tkanka, która zostanie wypreparowana z zarodka, zregeneruje się i powinna zostać zachowana, aby zapewnić, że samice pozostaną w kolonii Hydra.
- Za pomocą pipety Pasteura przenieś zarodki do naczynia iniekcyjnego, układając je równolegle do ściany koryta agarozy.
3. Mikroiniekcja plazmidowego DNA
- Zamontuj mikrowtryskiwacz na stojaku magnetycznym, który znajduje się na żelaznej płycie. Zamontuj uchwyt do wstrzykiwań, który jest częścią mikrowtryskiwacza, która przytrzymuje igłę, na mikromanipulatorze joysticka. Zamontuj manipulator joysticka na żelaznej płycie za pomocą podstawki magnetycznej. Umieścić cały ten zestaw po prawej stronie mikroskopu preparacyjnego i ustawić uchwyt do wstrzykiwań tak, aby był widoczny w polu obserwacji.
- Umieścić naczynie iniekcyjne z zarodkami pod mikroskopem preparacyjnym, zorientowanym w taki sposób, aby pionowa ściana koryta agarozy znajdowała się po lewej stronie. Włożyć igłę do uchwytu do wstrzykiwań i opuścić końcówkę igły do podłoża Hydra w naczyniu.
- Powoli obracać pokrętło strzykawki w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara, aż olej mineralny wypełni górną część igły i zaobserwuje się stały strumień roztworu do wstrzykiwań wychodzący z igły do pożywki Hydra. Jeśli strumień jest zbyt silny, zmniejsz ciśnienie, obracając pokrętło w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Przećwicz ten krok, aby rutynowo uzyskać odpowiedni nacisk, który zależy od wielkości otworu igły (tj. od sposobu wciśnięcia igły w kroku 1.5). Uwaga: Jeśli strumień jest zbyt silny, zarodek nie przeżyje wstrzyknięcia.
- Patrząc przez mikroskop preparacyjny, przesuń naczynie do wstrzykiwań tak, aby pierwszy zarodek znalazł się w środku pola. Przesuń igłę tak, aby dotykała tego zarodka. Użyj mikromanipulatora, aby przekłuć zarodek igłą. Uwaga: Pionowa ściana koryta agarozy zapobiegnie zepchnięciu zarodka na bok przez igłę.
- Pozwól, aby roztwór do wstrzykiwań spłynął do zarodka przez 1 lub 2 sekundy, a następnie szybko wyjmij igłę. Jeśli zarodek ma więcej niż jedną komórkę, wstrzyknąć każdą komórkę osobno. Użyj kleszczy, aby zmienić orientację zarodka, aby wyrównać następną komórkę z końcówką igły.
- Po wstrzyknięciu pierwszego zarodka należy przesunąć szalkę tak, aby następny zarodek znalazł się w pozycji do wstrzyknięcia i powtórzyć procedurę; kontynuuj, aż wszystkie zarodki zostaną wstrzyknięte.
4. Hodowla i wylęg zarodków
- Przenieś wszystkie wstrzyknięte zarodki do naczynia z kilkoma Hydrami, które mają jądra (ma to na celu upewnienie się, że wszystkie zarodki są zapłodnione). Inkubować zarodki w inkubatorze w temperaturze 18 °C, kontynuując embriogenezę.
- Po osiągnięciu etapu naskórka przenieś każdy wstrzyknięty zarodek do indywidualnego dołka na 24-dołkowej płytce wypełnionej pożywką Hydra.
- Inkubować wstrzyknięte zarodki przez 2 tygodnie w ciemności w temperaturze 18 °C.
- Po 2-tygodniowym okresie inkubacji należy sprawdzić każdy wstrzyknięty zarodek pod mikroskopem preparacyjnym. Zwróćmy uwagę na przypadki, w których zarodek w stadium kutykularnym oderwał się od małego kawałka tkanki rodzicielskiej, a tkanka rodzicielska uległa regeneracji. Natychmiast usuń ten zregenerowany polip, aby nie pomylić go z nowym pisklęciem.
- Przenieś naczynie z wstrzykniętymi zarodkami pod światło akwariowe w RT. Sprawdzaj talerze każdego dnia i zbieraj pisklęta. Nowe pisklęta będą białe, ponieważ typowy różowy kolor polipów Hydra pochodzi od spożywanej przez nie artemii.
- Obserwuj pisklęta pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby wykryć ekspresję transgenu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Tworzenie transgenicznych linii Hydra
Karm transgeniczną młodzież co 2-3 dni Artemia nauplii. Młodzież czasami nie jedzy przez dzień lub dwa po wykluciu. Niektóre nowo wyklute osobniki nigdy nie zaczną żywić się i w związku z tym nie przeżyją. Jeśli osobnik jest transgeniczną w tkance nabłonkowej ektodermalnej (Rysunek 1A) lub endodermalnej, należy pozwolić zwierzęciu na pączkowanie i zbierać pąki, które posiadają najwięcej tkanki transgenicznej (
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Hydra rutynowo rozmnaża się bezpłciowo, ale potrzebuje bodźców środowiskowych, aby zacząć wytwarzać gamety. Bodźce te nie są dobrze zdefiniowane dla większości gatunków Hydra i mogą się różnić w zależności od szczepu. Istotną przeszkodą w produkcji transgenicznej Hydry jest regularne pozyskiwanie zarodków, ponieważ w warunkach laboratoryjnych może być trudno nakłonić Hydrę do seksualności. Szczep AEP25 z łatwością wytwarza gamety w laboratorium i jest to jedyny szczep, który...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez G. Harold & Leila Y. Mathers Award dla H.L. oraz grant NIH (R24 GM080527) dla R.E.S. C.E.J. był stypendystą NRSA Postdoctoral Fellow (NIH F32GM9037222) i jest obecnie wspierany przez Mentored Research Scientist Development Award od National Institute on Aging (K01AG04435). Serdecznie dziękujemy recenzentom za pomocne uwagi.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| E-mail szczepu | : Celina Juliano w celina.juliano@yale.edu lub Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp | ||
| High Speed Maxi Kit | Qiagen | 12662 | |
| 100 x 15 mm Szalki Petriego | BD Falcon | 351029 | |
| 75 x 50 mm Szklany szkiełko mikroskopowe | Sigma | CLS294775X50 | |
| Mikroiniekcja Forma rybna | IBI Scientific | FM-600 | |
| Szkło borokrzemianowe z filamentem | Sutter Instrument | BF100-50-10 | OD: 1,0 mm, ID: 0,50 mm, długość 10 cm |
| Płonący / brązowy ściągacz do mikropipet | Sutter Instrument | P-97 | |
| Phenol Red | Sigma | P3532 | |
| Kleszcze jubilerskie, Durmont #5 | Sigma | F6521 | |
| Ostrze skalpela #15 | Fisher | 50-822-421 | |
| Olej mineralny | Sigma | M8410-500ML | |
| Mikrowtryskiwacz | Narishige | IM-9B | |
| Stojak magnetyczny | Narishige | GJ-1 | |
| Żelazna płyta | Narishige | IP | |
| Joystick Mikromanipulator | Narishige | MN-151 |
Bibliografia
- Wittlieb, J., Khalturin, K., Lohmann, J. U., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. Transgenic Hydra allow in vivo tracking of individual stem cells during morphogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 6208-6211 (2006).
- Glauber, K. M., Dana, C. E., Steele, R. E. Hydra. Curr Biol. 20, 964-965 (2010).
- Holstein, T. W., Hobmayer, E., David, C. N. Pattern of epithelial cell cycling in hydra. Dev Biol. 148, 602-611 (1991).
- Dubel, S., Hoffmeister, S. A., Schaller, H. C. Differentiation pathways of ectodermal epithelial cells in hydra. Differentiation. 35, 181-189 (1987).
- Khalturin, K., et al. Transgenic stem cells in Hydra reveal an early evolutionary origin for key elements controlling self-renewal and differentiation. Dev Biol. 309, 32-44 (2007).
- Bosch, T., David, C. Stem Cells of Hydra magnipapillata can differentiate into somatic cells and germ line cells. Dev Biol. 121, 182-191 (1987).
- David, C. N., Murphy, S. Characterization of interstitial stem cells in hydra by cloning. Dev Biol. 58, 372-383 (1977).
- Chapman, J. A., et al. The dynamic genome of Hydra. Nature. 464, 592-596 (2010).
- Boehm, A. M., Bosch, T. C. Migration of multipotent interstitial stem cells in Hydra. Zoology (Jena). 115, 275-282 (2012).
- Glauber, K. M., et al. A small molecule screen identifies a novel compound that induces a homeotic transformation in Hydra. Development. 140, 4788-4796 (2013).
- Siebert, S., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. Cell type complexity in the basal metazoan Hydra is maintained by both stem cell based mechanisms and transdifferentiation. Dev Biol. 313, 13-24 (2008).
- Anton-Erxleben, F., Thomas, A., Wittlieb, J., Fraune, S., Bosch, T. C. Plasticity of epithelial cell shape in response to upstream signals: a whole-organism study using transgenic Hydra. Zoology (Jena). 112, 185-194 (2009).
- Hemmrich, G., et al. Molecular signatures of the three stem cell lineages in Hydra and the emergence of stem cell function at the base of multicellularity. Mol Biol Evol. , (2012).
- Juliano, C. E., et al. PIWI proteins and PIWI-interacting RNAs function in Hydra somatic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 337-342 (2014).
- Nishimiya-Fujisawa, C., Kobayashi, S. Germline stem cells and sex determination in Hydra. Int J Dev Biol. 56, 499-508 (2012).
- Milde, S., et al. Characterization of taxonomically restricted genes in a phylum-restricted cell type. Genome Biol. 10, 8(2009).
- Nakamura, Y., Tsiairis, C. D., Ozbek, S., Holstein, T. W. Autoregulatory and repressive inputs localize Hydra Wnt3 to the head organizer. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9137-9142 (2011).
- Gee, L., et al. beta-catenin plays a central role in setting up the head organizer in hydra. Dev Biol. 340, 116-124 (2010).
- Fraune, S., et al. In an early branching metazoan, bacterial colonization of the embryo is controlled by maternal antimicrobial peptides. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18067-18072 (2010).
- Bridge, D., et al. FoxO and stress responses in the cnidarian Hydra vulgaris. PLoS One. 5, e11686(2010).
- Boehm, A. M., et al. FoxO is a critical regulator of stem cell maintenance in immortal Hydra. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19697-19702 (2012).
- Franzenburg, S., et al. MyD88-deficient Hydra reveal an ancient function of TLR signaling in sensing bacterial colonizers. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19374-19379 (2012).
- Dana, C. E., Glauber, K. M., Chan, T. A., Bridge, D. M., Steele, R. E. Incorporation of a horizontally transferred gene into an operon during cnidarian evolution. PLoS One. 7, e31643(2012).
- Lenhoff, H. M. Hydra: Research Methods. Lenhoff, H. M. , Plenum Press. Ch. 4 29-34 (1983).
- Miller, M. A., Technau, U., Smith, K. M., Steele, R. E. Oocyte development in Hydra involves selection from competent precursor cells. Dev Biol. 224, 326-338 (2000).
- Lenhoff, H. M. Hydra: Research Methods. Lenhoff, H. M. , Plenum Press. Ch. 8 53-62 (1983).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
