Wysokoprzepustowe miareczkowanie rekombinowanych wirusów eksprymujących lucyferazy

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia wysokoprzepustową metodę miareczkowania różnych wirusów RNA i DNA opartą na ekspresji lucyferazy przy użyciu automatycznych i ręcznych płynów.

Streszczenie

Standardowe testy płytek w celu określenia zakaźnych mian wirusów mogą być czasochłonne, nie są podatne na dużą ilość próbek i nie mogą być wykonane z wirusami, które nie tworzą blaszek. Jako alternatywę dla testów płytki nazębnej opracowaliśmy wysokoprzepustową metodę miareczkowania, która pozwala na jednoczesne miareczkowanie dużej ilości próbek w ciągu jednego dnia. Podejście to obejmuje zakażenie próbek wirusem znakowanym lucyferazy świetlika, przeniesienie zakażonych próbek do odpowiedniej permisywnej linii komórkowej, następnie dodanie lucyferyny, odczytanie płytek w celu uzyskania odczytów luminescencji, a na końcu konwersję z luminescencji na miana wirusa. Ocena cytotoksyczności przy użyciu barwnika żywotności metabolicznej może być łatwo włączona do przepływu pracy równolegle i dostarczyć cennych informacji w kontekście badania przesiewowego leków. Technika ta zapewnia niezawodną, wysokoprzepustową metodę określania miana wirusa jako alternatywę dla standardowego testu płytki miażdżycowej.

Wprowadzenie

Klasyczne testy płytek wirusowych nadal stanowią podstawę badań nad wirusami, mimo że mogą być bardzo czasochłonne i stanowić znaczące wąskie gardło w uzyskiwaniu wyników eksperymentów. Pojawiły się szybsze metody pośredniej kwantyfikacji wirusa, w tym ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (qPCR), ELISA i cytometria przepływowa^1-4. Najnowsze innowacje, takie jak licznik wirusów Virocyt, mogą bezpośrednio zliczać wirusy przy użyciu zaawansowanej technologii sortowania przepływowego oraz dzięki połączeniu barwników białkowych i DNA/RNA⁵. Chociaż wszystkie te metody niewątpliwie przyspieszyły tempo badań nad wirusami, każda z nich ma swoje zalety i wady. Na przykład qPCR może pozwolić na ilościowe określenie określonej sekwencji genomu wirusa, ale nie może skutecznie odróżnić zakaźnych od wadliwych wirionów⁶. Testy ELISA mogą być bardzo specyficzne, jednak wymagają odpowiedniego przeciwciała przeciwko pożądanemu docelowemu białku wirusowemu i mogą być bardzo kosztowne. Chociaż technologia cytometrii przepływowej oferuje wiele zalet i uległa znacznej poprawie, przepustowość i dostęp do wysoce specjalistycznego sprzętu pozostają przeszkodą. Co ważne, wszystkie te techniki nie nadają się idealnie do wysokoprzepustowych badań przesiewowych, dla których kluczowe znaczenie ma łatwość i czas wymagany na etapie kwantyfikacji wirusa.

Tutaj opisujemy wysokoprzepustową i łatwo zautomatyzowaną technikę mianowania wirusów, które wyrażają transgen lucyferazy świetlików (Fluc). Metoda ta generuje przybliżone miana wirusów w próbce testowej na podstawie sygnału luminescencji odczytanego poprzez równoległe użycie krzywej standardowej znanych ilości wirusa. Próbki zawierające nieznane ilości wirusa wykazującego ekspresję lucyferazy są przenoszone do permisywnej "plakowanej" linii komórkowej równolegle ze standardową krzywą rozcieńczenia wirusa, a luminescencja związana z wirusem jest odczytywana po kilku godzinach inkubacji. Pozwala to na szybkie, ilościowe, często tego samego dnia generowanie wyników, w przeciwieństwie do klasycznych protokołów oznaczania płytek, które zwykle wymagają kilku dni inkubacji w celu ręcznego policzenia widocznych blaszek^7-9.

Protokół przedstawia etapy naszej metody miareczkowania przy użyciu onkolitycznego wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej kodującego transgen Fluc (VSV∆51-Fluc) jako przykładu i dostarcza przegląd liczby 1. Przygotowanie próbki 2. Posiewanie dopuszczającej się linii komórkowej do miareczkowania wirusa przy użyciu automatycznego dozownika 3. Przygotowanie krzywej wzorcowej wirusa 4. Przeniesienie supernatantów próbki do permisywnej linii komórkowej za pomocą 96-dołkowego pipetora ręcznego 5. Ocena cytotoksyczności próbki przy użyciu odczynnika żywotności komórek 6. Przygotowanie substratu lucyferyny 7. Odczyt bioluminescencji i 8. Analiza danych.

Protokół

1. Przygotowanie próbki

1. Pobrać próbki zawierające wirusa wykazującego ekspresję lucyferazy (tutaj VSV∆51-Fluc jako przykład) do miareczkowania i przenieść na płytki 96-dołkowe. Alternatywnie należy przeprowadzać infekcje na 96-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych i bezpośrednio stosować supernatanty.
2. Pozostaw dwie kolumny nieobrobione w celu uwzględnienia krzywych standardowych. W przypadku doświadczeń przeprowadzanych bezpośrednio na płytkach 96-dołkowych, miano należy określić na koniec doświadczenia (40 godzin po zakażeniu) lub przechowywać w temperaturze -80 °C, a miano w późniejszym terminie.

2. Przygotowanie komórek permisywnych do miareczkowania wirusa

1. Na 24 godziny przed mianowaniem należy przygotować zawiesinę komórek Vero o stężeniu 2,5 x 10⁵ komórek/ml w zmodyfikowanym pożywce orła (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 30 mM HEPES i 1% penicyliny/streptomycyny. UWAGA: Chociaż ten protokół wykorzystuje komórki Vero, można użyć dowolnej odpowiedniej linii komórkowej permisywnej do infekcji VSV.
2. Wysiewaj 2,5 x 10⁴ komórek (100 μl) w 96-dołkowych białych płytkach z płaskim dnem za pomocą dozownika do mikropłytek.
   1. Przygotować 12 ml zawiesiny komórkowej na płytkę plus 5 ml do gruntowania.
   2. Kasetę z dozownikiem na mikropłytki należy oczyścić, przepłukując rurkę 50 ml sterylnej wody.
   3. Napełnić przewody dozownika mikropłytek zawiesiną komórkową i przepuścić przez nie 5 ml zawiesiny komórek.
   4. Wybierz program, który dozuje 100 μl do każdego dołka z 96-dołkowej płytki o białych ściankach. Dozować i powtórzyć w razie potrzeby dla dodatkowych płytek. Wysiewaj również kilka dołków w 96-dołkowej, przezroczystej płytce o płaskim dnie, jeśli do weryfikacji zdrowia i gęstości komórek używane są płytki o białych ściankach z nieprzezroczystym dnem.
   5. Po zakończeniu spłucz komórki z powrotem do oryginalnego pojemnika. Wyczyść kasetę, przepuszczając przez rurkę 50 ml 70% etanolu, a następnie 50 ml ciepłej, sterylnej wody.
   6. Upewnij się, że kaseta i rurki są odpowiednio czyszczone między użyciami.
3. Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 .}

3. Przygotowanie Wzorcowej Krzywej Wirusa

1. Przygotować wzorcową krzywą VSV∆51-Fluc w DMEM bez surowicy, tak aby końcowe stężenie jednostek tworzących płytkę miażdżycową (pfu) na ml po przeniesieniu na komórki Vero było następujące: 10⁸ pfu/ml, 10⁷ pfu/ml, 10⁶ pfu/ml, 10⁵ pfu/ml, 10⁴ pfu/ml, 10³ pfu/ml, 10² pfu/ml i 10¹ pfu/ml. Przygotuj 50 μl każdego stężenia na płytkę komórek Vero plus dodatkowe 10%.
   UWAGA: Miano zapasu wirusa lucyferazy będzie musiało zostać ocenione w klasyczny sposób¹⁰ w celu wygenerowania krzywej standardowej, która pozwoli na bezwzględną kwantyfikację. W przeciwnym razie względną kwantyfikację można osiągnąć bez dokładnych informacji o mianie poprzez arbitralne ustawienie miana wirusa na podstawie etapów rozcieńczania. Na przykład pierwsze rozcieńczenie krzywej wzorcowej można ustawić na 10⁸ jednostek wirusowych, a następne rozcieńczenie 1/10 na 10,⁷ i tak dalej. W tym kontekście należy wyrazić wartości jako zmianę krotności w porównaniu z wcześniej określoną próbką, ponieważ bezwzględna kwantyfikacja nie będzie dokładna.

4. Przeniesienie supernatantów próbki do komórek permisywnych

1. Sprawdź komórki Vero posiane na przezroczystej 96-dołkowej płytce pod mikroskopem świetlnym, aby potwierdzić, że monowarstwy zlewają się w co najmniej 95%.
2. Przenieść 25 μl supernatantu próbki na komórki Vero wysiane na płytkach o białych ściankach. Nie należy przenosić supernatantów do 2 kolumn przeznaczonych dla krzywych standardowych. UWAGA: Można to zrobić jednocześnie dla wszystkich studzienek na jednej płycie za pomocą 96-kanałowego regulatora cieczy.
3. Używając 8- lub 12-kanałowego pipetora wielokanałowego, dodać 25 μl każdego rozcieńczenia krzywej wzorcowej przygotowanej w kroku 3 do komórek Vero w 2 wyznaczonych kolumnach.
4. Odwirować płytki przez 5 minut przy 430 x g przy wilgotności względnej.
5. Inkubować przez 5 godzin w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 .}

5. Ocena żywotności komórek

1. UWAGA: Rozpoczynając od supernatantów uzyskanych z eksperymentów infekcyjnych przeprowadzonych na przezroczystych 96-dołkowych płytkach, żywotność próbki można ocenić przed kwantyfikacją za pomocą barwnika wskaźnika żywotności komórek, takiego jak rezazuryna.
2. Dodać rezazydynę w ilości równej 10% objętości w każdym dołku z 96-dołkowej płytki próbek zawierających wirusa i komórki. Uwzględnij kontrolki tylko komórki, a także kontrolkę tylko multimediów, aby określić wartości odpowiednio 100% i 0% żywotności.
3. Po 2-4 godzinach (czas inkubacji będzie się różnił w zależności od typu ogniwa i stężenia dostępnego w handlu lub odtworzonego proszku barwnika), odczytaj i zapisz sygnał za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych (wzbudzenie 530-560, emisja 590). Zgłoś żywotność komórki dla próbki zgodnie ze wzorem Względna aktywność metaboliczna = ((Sygnał próbki testowej - ujemny sygnał kontrolny) / (Sygnał kontrolny tylko komórka - ujemny sygnał kontrolny)) x 100%

6. Przygotowanie substratu lucyferyny

1. 30 minut przed końcem 5-godzinnej inkubacji przygotować lucyferynę do otrzymania roztworu o stężeniu 2 mg/ml w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS). Przygotuj 2,5 ml na talerz plus dodatkowe 2 ml. Chronić roztwór przed światłem. UWAGA: Lucyferyna może być również przygotowana wcześniej w ciągu dnia i przechowywana w temperaturze 4 °C do czasu użycia.

7. Odczyt bioluminescencji

1. Po 5-godzinnym okresie inkubacji dodaj 25 μl lucyferyny do każdej studzienki komórek Vero na białych płytkach stałych. Dodaj lucyferynę ręcznie lub za pomocą automatycznego dozownika zintegrowanego z luminometrem. UWAGA: Użycie przyrządu z odczytami tylko pojedynczego i punktu końcowego może wymagać dodania buforu do lizy zgodnego z lucyferazy przed dodaniem substratu lucyferyny w celu poprawy konsystencji.
2. Odczytaj tabliczki z następującymi parametrami:
   1. Wstrząsaj przez 5 sekund.
   2. Poczekaj 30 sekund.
   3. Odczyt luminescencji przy odpowiedniej stałej czułości / wartości ekspozycji. Jeśli opcja jest dostępna w urządzeniu, użyj odczytów wielopunktowych (np. matrycy 3 x 3), aby poprawić dokładność.
3. Rejestruj i zapisuj ilościowo określoną intensywność bioluminescencyjną.
4. Jeśli do dodania lucyferyny użyto automatycznego dozownika, oczyść lucyferynę i zalej linie ciepłą, sterylną wodą.

8. Analiza danych

1. Aby uzyskać dokładne wyniki, rozwiąż regresję nieliniową, aby wygenerować równanie Hilla na podstawie krzywych standardowych. Zastosuj to równanie do próbek, z których ma się miano, aby obliczyć jednostki ekspresji wirusa. Niektóre wirusy lub sytuacje mogą tworzyć krzywą standardową z liniową zależnością; W takim przypadku rozwiąż równanie liniowe.

Wyniki

Podsumowanie schematu postępowania opisującego metodę wysokoprzepustową przedstawiono na Rysunku 1. Rysunek 2 pokazuje wyniki typowej krzywej wzorcowej dla VSV∆51-Fluc. Analiza regresji nieliniowej czteroparametrowej pozwoliła na wygenerowanie wykresu Hilla, z którego można interpolować nieznaną liczbę jednostek tworzących pędy (pfu) (szacunkowy miano wirusa). Szacunkowe miana te nazywa się jednostkami ekspresji wirusowej (VEU). Rysunek 3A przedstawia VEU oraz miana uzyskane poprzez przeprowadzenie standardowego testu pęplykowego na tych samych próbkach¹⁰. Próbki pochodziły z eksperymentu, w którym zastosowano różne substancje chemiczne w celu zwiększenia replikacji i rozprzestrzeniania się VSV∆51-Fluc w komórkach 786-0. Wartości VEU interpolowane z krzywej wzorcowej muszą zostać pomnożone przez współczynnik oparty na rozcieńczeniu nadnadfiltrów z próbek przenoszonych na komórki Vero (w tym przypadku współczynnik rozcieńczenia wynosi 5). Korelację liniową między mianami a VEU przedstawiono na Rysunku 3B z R² wynoszącym 0,8083 i współczynnikiem korelacji Pearsona r wynoszącym 0,899 (p <0,0001). Na Rysunku 4 przedstawiono typowe dane dotyczące cytotoksyczności komórkowej uzyskane z testu metabolicznego dla komórek 786-0 traktowanych substancjami chemicznymi przed zakażeniem VSV∆51-Fluc. Na koniec, Rysunek 5 pokazuje typowe krzywe wzorcowe uzyskane dla różnych wirusów (wirusa opryszczki pospolitej (HSV), wirusa vaccinia oraz wirusa adeno-zależnego (AAV), wszystkie wykazujące ekspresję lucyferazy świetlikowej) oraz opisuje wymagane czasy inkubacji i cykle zamrażania i rozmrażania.

Rycina 1. Schemat wysokoprzepustowego miareczkowania wirusa i testu cytotoksyczności z użyciem VSV∆51-Fluc. (A) Wysiew 2.5 x 10⁴ komórek Vero na dołek (100 μl) i inkubacja w 37 °C. (B) Po 24 h przeniesienie 25 μl krzywej standardowej na komórki Vero (2 kolumny na płytkę). (C) Przeniesienie 25 μl próbek do miareczkowania na pozostałe komórki Vero. Wirowanie płytek i inkubacja w 37 °C. (D) Do płytki zawierającej oryginalne próbki dodanie odczynnika rezauryny w ilości równej 10% objętości w dołku. Inkubacja płytek w 37 °C. (E) Po 3 h odczyt i zapis fluorescencji oraz ocena cytotoksyczności. (F) Po 5 h dodanie 25 μl roztworu lucyferyny o stężeniu 2 mg/ml do każdego dołka z komórkami Vero. Odczyt luminescencji i obliczenie jednostek ekspresji wirusowej.

Rysunek 2. Przewidywana krzywa wzorcowa dla VSV∆51-Fluc. Ekspresję lucyferazy zmierzono 5 h po przeniesieniu supernatantu w pięciu różnych punktach w obrębie dołka przy użyciu luminometru, a bioluminescencję wyrażono w średnich względnych jednostkach światła (RLU). Średnią wartość RLU naniesiono w funkcji znanej wartości wejściowej pfu/ml w celu rozwiązania regresji nieliniowej i wyznaczenia równania Hilla. Przedstawiono średnią z dwóch powtórzonych krzywych oraz słupki błędu standardowego (r²= 0,9993).

Rysunek 3. Porównanie mian uzyskanych w standardowym teście plackowym z mianami uzyskanymi metodą wysokoprzepustową. (A) Miana wirusa w pfu/ml uzyskane w standardowym teście plackowym na komórkach Vero zestawiono z obliczonymi mianami wirusa (VEU/ml) z tych samych próbek, dla których miano wyznaczono za pomocą wysokoprzepustowego testu lucyferazowego. (B) Liniowa zależność między VEU/ml a mianem uzyskanym w standardowym teście plackowym. Przedstawiono krzywą regresji liniowej oraz współczynnik determinacji (R²).

Rysunek 4. Żywotność próbek. Żywotność próbek przed przeniesieniem nadsączu na komórki Vero określono poprzez ocenę aktywności metabolicznej komórek z wykorzystaniem dostępnego komercyjnie roztworu rezazuryny. Surowe wartości fluorescencji znormalizowano względem wartości dla studni niepoddanych działaniu leku i niezakażonych.

Rycina 5. Oczekiwane krzywe wzorcowe dla wirusów HSV, Vaccinia i AAV. Ekspresję lucyferazy mierzono w pięciu różnych punktach w obrębie studzienki za pomocą lumnometru, a bioluminescencję wyrażono w średnich względnych jednostkach światła (RLU). (A) Krzywa wzorcowa HSV została naniesiona na komórki Vero wysiane 24 hr wcześniej w gęstości 2,5 x 10⁴ komórek na studzienkę (100 μl), a pomiar lucyferazy wykonano 17 hr po przeniesieniu supernatantu (R²= 0,9489, n=1). Równanie Hilla wygenerowano poprzez rozwiązanie regresji nieliniowej. (B) Krzywa wzorcowa Vaccinia została naniesiona na komórki Vero wysiane 24 hr wcześniej w gęstości 2,5 x 10⁴ komórek na studzienkę (100 μl) i inkubowane przez 2,5 hr w temperaturze 37 °C, po czym wykonano pomiary lucyferazy (R²= 0,9892). Równanie liniowe wygenerowano poprzez rozwiązanie regresji liniowej. (C) Krzywa wzorcowa AAV została naniesiona na ludzkie komórki raka płuc (A549) wysiane 24 hr wcześniej w gęstości 2,5 x 10⁴ komórek na studzienkę (100 μl), a pomiar lucyferazy wykonano 24 hr po infekcji. Równanie Hilla wygenerowano poprzez rozwiązanie regresji nieliniowej. Przedstawiono średnią z pięciu powtórzeń krzywych wraz z słupkami błędów standardowych (R²= 0,9926).

Dyskusja

Opisane tutaj podejście oparte na lucyferazie zapewnia szereg zalet w porównaniu z innymi istniejącymi metodami, w tym łatwość, szybkość, minimalne zapotrzebowanie na sprzęt i stosunkowo niski koszt. Kluczowym czynnikiem przyczyniającym się do tego jest unikanie etapu seryjnego rozcieńczania. Niemniej jednak, oparte na seryjnym rozcieńczaniu pochodne tego protokołu są z pewnością wykonalne i zostały ostatnio wykorzystane do oceny miana Eboli wykazującego ekspresję lucyferazy w wysokoprzepustowym badaniu przesiewowym^{przeciwwirusowym 11}. Chociaż takie adaptacje są z natury bardziej czasochłonne i droższe, w razie potrzeby mogą zapewnić większy zakres dynamiki do kwantyfikacji wirusa. Oprócz tego, że szczególnie dobrze nadaje się do oceny miana wirusa w kontekście wysokoprzepustowych badań przesiewowych, nasza jednoetapowa metoda kwantyfikacji wirusa oparta na lucyferazy generuje dokładne szacunki zakaźnych wirionów w przypadku replikacji wirusów. Co więcej, odczyty luminescencji wraz z danymi cytotoksyczności z tego samego eksperymentu dają pełniejszy obraz wpływu warunków eksperymentalnych na komórki docelowe, co jest szczególnie przydatne w kontekście wirusów onkolitycznych i badań przesiewowych leków.

W przedstawionym przykładzie wykorzystano replikujący się ujemny wirus jednoniciowego RNA; Jednak protokół ten można dostosować do wielu wirusów replikujących się i niereplikujących z kilkoma niewielkimi zmianami protokołu. Obejmuje to wirusy DNA, takie jak krowianka, HSV i AAV (patrz ryc. 5). Próbki zakażone wirusami wewnątrzkomórkowymi, takimi jak na przykład wirus krowianki, wymagają etapu uwalniania wirusa przed oceną ilościową (np. co najmniej jednego cyklu zamrażania i rozmrażania). Stosując tę technikę do innych wirusów, konieczne jest zoptymalizowanie czasu inkubacji od przeniesienia supernatantu wirusowego lub lizatu do odczytu płytek przez luminometr. Parametr ten będzie zależał głównie od cyklu replikacji wirusa w permisywnej linii komórkowej i siły promotora napędzającego ekspresję lucyferazy. Najlepiej jest to zrobić, używając pełnej krzywej standardowej w kroku optymalizacji. Aby to zrobić, należy zainfekować odpowiednią permisywną linię komórkową różnymi powtórzeniami przygotowanej krzywej wzorcowej i odczytać każdą replikę w różnych punktach czasowych po transferze. Idealnie byłoby, gdyby wybrano punkt czasowy inkubacji, który prowadzi do liniowej zależności między LOG(RLU) a LOG(mianem) obejmującej oczekiwany zakres miana próbki. W przypadku VSV∆51-Fluc jest to zwykle od 10⁴ pfu/ml -10⁷ pfu/ml przez 5 godzin inkubacji. Jeśli oczekuje się, że od próbek będą niższe lub wyższe miana, można po prostu odpowiednio wydłużyć lub skrócić czas inkubacji. Alternatywnie, próbki można rozcieńczać, aby mieściły się w zakresie, tak jak ma to miejsce zazwyczaj w przypadku testu ELISA.

Jak wspomniano powyżej, metoda ta doskonale nadaje się do wykonywania wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków przy użyciu bibliotek leków, ponieważ większość kroków można zautomatyzować. Komórki można efektywnie posiać za pomocą automatycznego dozownika mikropłytek, bibliotekę leków można dodać za pomocą 96-kanałowego urządzenia do obsługi cieczy, wirusa można dodać za pomocą dozownika mikropłytek, a płytki odczytać za pomocą automatycznego luminometru. Teoretycznie można to również dostosować do formatów 384-dołkowych lub mniejszych; jednak ograniczeniem w tym celu jest liczba komórek, które można platerować, biorąc pod uwagę, że mniejsza liczba komórek prowadzi do węższego zakresu liniowości relacji LOG(RLU) do LOG(Titer). Wreszcie, ocena żywotności komórek przy użyciu resazuryny lub innych barwników metabolicznych może być łatwo włączona do przepływu pracy, co pozwala na dyskryminację związków cytotoksycznych w badaniach przesiewowych przeciwwirusowych lub identyfikację związków, które prowadzą do synergicznego zabijania w połączeniu z wirusami¹². Niemniej jednak ograniczenia tej metody obejmują wymóg transgenu eksprymującego wirusa lucyferazy, co nie zawsze jest możliwe, oraz dostępność wystarczająco liberalnej linii komórkowej. Jest jednak prawdopodobne, że możliwe jest dostosowanie metody do stosowania z innymi genami reporterowymi (np. GFP), pod warunkiem że metoda oznaczania ilościowego reportera ma odpowiednią liniowość i stosunek sygnału do szumu. Ogólnie rzecz biorąc, opisana metoda o wysokiej przepustowości może być modyfikowana tak, aby pasowała do wielu różnych wirusów i była dostosowana do różnych zastosowań.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zmodyfikowana pożywka Eagle's Medium firmy Dulbeccos (DMEM)	Corning	SH30243.01
Płodowa surowica bydlęca	NorthBio Inc.	NBSF-701
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Corning	21-040-CV
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1	Przygotuj 1 mM roztwór o pH 7,3
alamarNiebieski	AbD Serotec	BUF012B
Sól potasowa D-Lucyferyny	Biotium	10101-2
96-dołkowe, stałe, białe, płaskie płytki polistyrenowe z płaskiego dna poddane działaniu TC Płytki	Corning	3917	mogą być również używane do większej przepustowości
Synergy Mx	BioTek	SMTBL	Monochromator czytnik mikropłytek
Liquidator96	Mettler Toledo	LIQ-96-200	Ręczny system pipetowania 96 końcówek
Liquidator96 LTS Końcówki sterylizowane z filtrami	Mettler Toledo	LQR-200F	Odpowiednie są wszelkie sterylne końcówki z filtrem kompatybilne z wybranymi pipetami
Microflo	BioTek	111-206-21	Służy do płytki komórek w płytce 96-dołkowej
Fluoroskan Ascent FL	Thermo Scientific	5210450	Fluorometr do mikropłytek

384-dołkowe