Method Article

Protokół mikromacierzy tkankowej nowej generacji (ngTMA) do badań biomarkerów

DOI:

10.3791/51893

⸱

September 23rd, 2014

 ,  ,  , 
1Institute of Pathology, University of Bern

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ma na celu optymalizację konstrukcji i jakości mikromacierzy tkankowych do badań nad biomarkerami. Obejmuje aspekty planowania i projektowania, patologii cyfrowej, wirtualnych adnotacji do slajdów i automatycznego układania tkanek.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania nad biomarkerami opierają się na mikromacierzach tkankowych (TMA). TMA są wytwarzane przez wielokrotne przenoszenie małych rdzeni tkankowych z bloku "dawcy" do bloku "biorcy", a następnie wykorzystywane do różnych zastosowań biomarkerowych. Budowa konwencjonalnych TMA jest pracochłonna, nieprecyzyjna i czasochłonna. W tym miejscu przedstawiono protokół wykorzystujący mikromacierze tkankowe nowej generacji (ngTMA). ngTMA opiera się na planowaniu i projektowaniu TMA, patologii cyfrowej i zautomatyzowanym mikromacierzowaniu tkanek. Protokół zilustrowano na przykładzie 134 pacjentów z przerzutowym rakiem jelita grubego. Pod uwagę brane są aspekty histologiczne, statystyczne i logistyczne, takie jak typ tkanki, określone regiony histologiczne i typy komórek do włączenia do TMA, liczba plamek tkankowych, wielkość próby, analiza statystyczna i liczba kopii TMA. Preparaty histologiczne dla każdego pacjenta są skanowane i przesyłane na internetową platformę cyfrową. Tam są one przeglądane i opisywane (oznaczane) za pomocą narzędzia o średnicy 0,6-2,0 mm, wielokrotnie przy użyciu różnych kolorów w celu rozróżnienia obszarów tkanki. Do instrumentu ładowane są bloki dawcze i 12 bloków "biorcy". Slajdy cyfrowe są pobierane i dopasowywane do obrazów bloku dawcy. Powtarzanie szyku regionów z adnotacjami jest wykonywane automatycznie, co skutkuje ngTMA. W tym przykładzie zaplanowano sześć ngTMA zawierających sześć różnych typów tkanek/stref histologicznych. Wymagane są dwie kopie ngTMA. Dla każdego pacjenta skanowane są od trzech do czterech preparatów; Konieczne są 3 uruchomienia skanowania, które są wykonywane w nocy. Wszystkie slajdy są opatrzone adnotacjami; Różne kolory są używane do reprezentowania różnych tkanek / stref, a mianowicie centrum guza, frontu inwazji, guza / zrębu, przerzutów do węzłów chłonnych, przerzutów do wątroby i normalnej tkanki. Wykonano 17 adnotacji/sprawę; Czas na adnotację to 2-3 min/sprawę. Produkowanych jest 12 ngTMA zawierających 4 556 plamek. Czas układania w szyk wynosi 15-20 godzin. Ze względu na swoją precyzję, elastyczność i szybkość, ngTMA jest potężnym narzędziem do dalszej poprawy jakości TMA stosowanych w badaniach klinicznych i translacyjnych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatnich dwóch dekad, mikromacierze tkankowe (TMA) miały niezwykły wpływ na badania nad biomarkerami. TMA są zasadniczo "archiwami" tkankowymi wytwarzanymi przez wielokrotne przenoszenie małych rdzeni tkankowych, zwykle o średnicy od 0,6 do 2,0 mm, z zatopionych w parafinie bloków "dawcy" do pojedynczego bloku "biorcy" TMA (ryc. 1)1. Korzystając z małego rozmiaru rdzenia, około 500 różnych plamek tkankowych od kilku lub wielu różnych pacjentów można ułożyć w jednym TMA2.

Wykorzystanie TMA do prognostycznych lub predykcyjnych badań biomarkerów ma wiele zalet. Rozważmy przykład, w którym ekspresja biomarkera białkowego za pomocą immunohistochemii ma być oceniana na 450 pacjentach. Zamiast wykonywać 450 barwień immunohistochemicznych na 450 preparatach pacjenta wyciętych z tej samej liczby bloków, małe rdzenie z każdej próbki można umieścić w jednym bloku TMA. Nawet jeśli od każdego pacjenta pobiera się wiele rdzeni, wytwarzana jest minimalna liczba bloków. Ma to znaczący wpływ na drastyczne zmniejszenie kosztów i innych zasobów, a także zmniejszenie marnotrawstwa tkanek. Dodatkowo pozwala to na ocenę badań o odpowiedniej mocy z wykorzystaniem dużej liczby tkanek w tych samych warunkach eksperymentalnych.

TMA mają wiele różnych zastosowań. Na przykład można je wykorzystać do badania morfologii, ekspresji białek, ekspresji RNA i aberracji DNA po barwieniu różnymi barwnikami lub po immunohistochemii lub hybrydyzacji chromogennej, a nawet fluorescencyjnej in situ 3-7. W ostatnich badaniach wykorzystano również TMA do testowania wewnątrz- i międzylaboratoryjnych zmian w protokołach barwienia, ustalenia swoistości lub wrażliwości przeciwciał na określone mutacje genów oraz do określenia odtwarzalności ekspresji białek między obserwatorami we współpracy międzynarodowej8-11.

Budowa tradycyjnych TMA z wykorzystaniem tkanek pochodzących od pacjenta to długa, wieloetapowa procedura (Rysunek 2). Rozpoczyna się od wyszukania możliwych odpowiednich przypadków i wyboru preparatów diagnostycznych z archiwów w instytucie patologii lub innym instytucie, z którego są one pobierane. Patolog ocenia każdy slajd dla każdego przypadku i wybiera najbardziej reprezentatywny slajd do celów badania. Następnie obszar zainteresowania jest oznaczany za pomocą pisaka bezpośrednio pod mikroskopem. Jest to często trudne i nieprecyzyjne, a skutkuje jedynie "oszacowaniem", skąd powinny być pobierane stemple tkankowe. Następnie z archiwum pobierane są bloki parafiny odpowiadające tym oznaczonym preparatom. Dokonywane jest szybkie porównanie między blokiem a zjeżdżalnią. Za pomocą półautomatycznego lub domowego układu tkanek blok dawcy jest wycinany w szacowanym obszarze zainteresowania i przenoszony do bloku TMA biorcy. Budowa TMA przy użyciu tej techniki szykowania jest pracochłonna, czasochłonna, nieprecyzyjna i nieelastyczna. Szacuje się, że przygotowanie TMA 475 spotów w 3 egzemplarzach zajmuje około 84 godzin pracy.

Nowe podejście do budowy TMA zostało niedawno wprowadzone przez Instytut Patologii Uniwersytetu w Bernie, które opiera się na trzech komponentach: planowaniu i projektowaniu (lub doradztwie), patologii cyfrowej połączonej z wiedzą specjalistyczną w zakresie histologii i automatycznym ustawianiu TMA12. Koncepcja ta nosi nazwę nowej generacji Tissue Microarray (ngTMA). Poniżej opisano protokół ngTMA na przykładzie 134 pacjentów z przerzutowym rakiem jelita grubego. W tym przypadku guzy pierwotne, a także przerzuty do węzłów chłonnych i przerzuty do wątroby mają zostać umieszczone w ngTMA w celu późniejszej analizy biomarkerów. Dodatkowo pożądane są małe rdzenie tkankowe od każdego pacjenta do przyszłej ekstrakcji kwasów nukleinowych.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: To badanie zostało zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną szpitala Insel w Bernie, Szwajcaria (07-10-13). Tkanki pobrano z Banku Nowotworów w Bernie, Instytutu Patologii, Uniwersytetu w Bernie.

1. Planowanie i projektowanie (doradztwo)

  1. Zastanów się, na jakie pytanie badawcze należy odpowiedzieć. Zdecyduj o typach tkanek, które mają zostać uwzględnione w projekcie. Określ, jakie struktury histologiczne są ważne, aby odpowiedzieć na pytanie.
  2. Ustal najbardziej użyteczną średnicę rdzenia i liczbę rdzeni na pacjenta dla projektu. Zdecyduj o liczbie kopii mikromacierzy tkankowej nowej generacji (ngTMA) w oparciu o liczbę biomarkerów, które mają być badane.
  3. Weź pod uwagę aspekty statystyczne, takie jak wielkość próbki i analiza po skonstruowaniu mikromacierzy tkankowej (TMA). Określ liczbę pacjentów do włączenia do badania i ustal tkanki kontrolne dla macierzy.
  4. Pobrać preparaty histologiczne (lub diagnostyczne) hematoksyliny i eozyny (H&E) każdego pacjenta. Przejrzyj pokrótce slajdy i zidentyfikuj te, które zawierają informacje i histologię istotne dla projektu.
    UWAGA: Wykonaj nowe sekcje bloków parafinowych, jeśli do skanowania i adnotacji szkiełek barwnikowych lub immunohistochemicznych jest pożądany specjalny szkiełko barwiące lub immunohistochemiczne, zamiast szkiełek H&E

2. Skanowanie slajdów

  1. Włącz komputer i skaner slajdów i otwórz oprogramowanie do skanowania. Wybierz "tryb automatyczny" dla skanowania w jasnym polu z ekranu podglądu.
  2. Kliknij "opcje skanowania", aby dostosować parametry jakości slajdu. W tym momencie wybierz, czy slajdy mają być skanowane bezpośrednio na platformę cyfrową dostępną przez Internet, czy na dysk lokalny (lub dysk zewnętrzny) i ustaw typy skanowania oraz liczbę punktów ostrości.
  3. Kliknij "Parametry serwera", aby zeskanować do "Centrum spraw". Na tym etapie dodaj więcej czasopism, oznacz wszystkie slajdy i ustaw folder w Case Center, w którym slajdy powinny być przechowywane. Każdy magazynek mieści do 25 slajdów.
  4. Sprawdź jakość/czystość rzeczywistych preparatów histologicznych do skanowania. W razie potrzeby wyczyść szkiełka 70% etanolem.
  5. Załaduj do 25 slajdów na magazyn z etykietami skierowanymi do wewnątrz (Rysunek 3A)
  6. Umieść magazynek w skanerze. W przypadku więcej niż jednego czasopisma umieść je jeden na drugim.
  7. Rozpocznij skanowanie slajdu, klikając zieloną strzałkę (Rysunek 3B). Po zeskanowaniu wszystkich slajdów rozładuj magazynki i wyłącz program, komputer i skaner slajdów.

3. Cyfrowa adnotacja slajdów

  1. Wprowadź adres przeglądarki centrum zarządzania slajdami cyfrowymi i pobierz bezpłatne oprogramowanie do przeglądania slajdów cyfrowych.
  2. Otwórz oprogramowanie przeglądarki slajdów cyfrowych i wybierz folder zawierający slajdy cyfrowe (Rysunek 4A).
  3. Dodawaj notatki, zmieniaj kolejność i zarządzaj folderem slajdów cyfrowych, przypisuj prawa użytkownika współpracownikom lub dodawaj załączniki do folderu.
  4. Kliknij żądany slajd cyfrowy, który pojawi się w przeglądarce slajdów cyfrowych.
  5. Korzystając z narzędzia do powiększania, oceń slajd i znajdź obszary zainteresowania do integracji z ngTMA.
  6. Korzystając z narzędzia do adnotacji TMA, wybierz rozmiar żądanego rdzenia i kolor adnotacji. Umieść adnotację na slajdzie cyfrowym, klikając ją (Rysunek 4B).
  7. Przenieś adnotację do żądanych struktur histologicznych w celu włączenia do ngTMA (ryc. 4C).
  8. Powtórz ten proces adnotacji ponownie, używając narzędzia adnotacji, wybierając rozmiar rdzenia i żądany kolor adnotacji. Powtórz wyświetlanie slajdów i dodawanie adnotacji do wszystkich slajdów w folderze.
  9. Alternatywnie, umieść rdzenie tkanek do PCR w probówkach o pojemności 0,2 ml, zamiast integrować je z TMA. Opisuj slajdy, używając innego koloru, aby zidentyfikować te miejsca do dalszej analizy molekularnej.
  10. Utwórz listę wszystkich obserwacji wraz z odpowiadającymi im adnotacjami i kolorami.

4. Budowa mikromacierzy tkankowej

  1. Pobierz odpowiednie bloki tkanki parafinowej dla wszystkich szkiełek cyfrowych z adnotacjami, posortuj bloki w żądanej kolejności do mikromacierzania tkanek.
  2. Upewnij się, że bloki tkanek mają grubość co najmniej 4 mm. Jeśli nie, konieczne jest ponowne osadzenie tkanki.
  3. Włącz komputer i automatyczny przyrząd do mikromacierza tkankowego. Otwórz oprogramowanie mikromacierzy tkankowej i podaj nazwę projektu
  4. Wykonaj "Wymianę narzędzia" i wybierz wymaganą średnicę narzędzia dla projektu (tj. 0,6, 1,0, 1,5 lub 2,0 mm).
  5. Załaduj do 12 bloków TMA "odbiorcy" do maszyny. Nadaj identyfikator każdemu z 12 bloków
  6. Utwórz układ TMA dla każdego bloku adresatów. Zwróć uwagę na projekt TMA z liczbą rzędów, kolumn i pustych linii, a także odległością między rdzeniami. Utwórz nowy układ dla każdego bloku adresatów lub używaj tego samego układu wielokrotnie.
  7. Umieść kursor na układzie bloku odbiorcy, aby pobrać pierwszy rdzeń.
  8. Następnie załaduj do 60 bloków dawcy do mikromacierzy tkankowej (ryc. 5A). Umieść dziesięć bloków w każdym rzędzie od A do F. Nadaj każdemu blokowi identyfikator dawcy. Obserwuj obrazy każdego bloku dawcy na ekranie komputera, które są automatycznie uzyskiwane przez mikromacierz tkankową.
  9. Zaczynając od pierwszego bloku, kliknij "Slajd". Obserwuj slajd cyfrowy z adnotacjami zapisany w cyfrowym centrum zarządzania slajdami (lub na dysku zewnętrznym) za pomocą cyfrowej przeglądarki slajdów. Wyświetl obraz bloku dawczego i slajdu cyfrowego obok siebie.
  10. Wybierz punkty odniesienia na obrazie bloku, aby nałożyć obraz bloku dawcy na slajd cyfrowy
  11. Po kliknięciu "Dalej" obserwuj adnotacje na większym obrazie bloku. (Rysunek 5B). Kliknij na górze adnotacji, aby potwierdzić i kliknij "Start".
    UWAGA: Spowoduje to, że mikromacierz tkankowa rozpocznie wiercenie otworu o średnicy 0,6 mm w bloku biorczym w wybranym punkcie początkowym. Następnie, w drugim kroku, za pomocą narzędzia do wykrawania, narzędzie przebija otwór w tkance z wybranego bloku dawcy w dokładnie opisanym i potwierdzonym obszarze. Rdzenie są następnie przenoszone od dawcy do bloku biorcy.
  12. Po około 500 rdzeniach wyczyść wiertło i narzędzie do wykrawania za pomocą wacika z ksylenu.
  13. Jeśli pożądane są rdzenie tkanek (zamiast przebijania w ngTMA), kliknij narzędzie "PCR" dla bloku, potwierdź do 4 adnotacji i naciśnij "Start". Spowoduje to przebicie i przeniesienie rdzeni do probówki o pojemności 0,2 ml.
  14. Powtórzyć punkty od 4.9 do 4.11 z drugim blokiem dawczym i tak dalej.
  15. Po wykorzystaniu wszystkich bloków dawczych wprowadź drugą rundę bloków dawczych (61-120) do mikromacierzy tkankowej i kontynuuj kroki od 4.8 do 4.11.
  16. Odświeżanie obrazów bloków dawcy i biorcy podczas postępu projektu podczas wiercenia i wykrawania (Rysunek 5C).
  17. Wykonaj "Eksport" po zakończeniu projektu. Zlokalizuj plik .xslx z identyfikatorami bloków dawcy i odbiorcy, lokalizacją wszystkich stempli w TMA, a także układem/projektem TMA w wyeksportowanym folderze. Zapisz wszystkie obrazy bloku dawcy ze wszystkimi nałożonymi adnotacjami jako obrazy jpg w wyeksportowanym folderze (Rysunek 5D). Ostatni blok TMA jest wtedy gotowy.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Planowanie i projektowanie

Tutaj użyto przykładu 134 pacjentów z przerzutowym rakiem jelita grubego, którzy są badani pod kątem określonej serii biomarkerów. Dla tych pacjentów planowane jest nie tylko ngTMA, ale także ekstrakcja DNA, a następnie analiza mutacji dla określonego genu.

Podczas fazy planowania i projektowania ngTMA, zdecydowano o następujących aspektach. Od każdego pacjenta zostanie zbadanych 6 różnych regionów histologicznych: centrum guza, front inwazji guza, obszary najgęstszego pączkowania guza (interakcja guz/zrąb), normalna tkanka, przerzuty do węzłów chłonnych i przerzuty do wątroby. W projekcie mają zostać uwzględnione trzy plamki nowotworowe na obszarze tkanki nowotworowej i dwie plamki w tkankach prawidłowych (n = 17 plamek na pacjenta). Ponieważ planuje się zbadanie ponad 50 biomarkerów na tym materiale pacjenta, pożądane są dwie kopie końcowego ngTMA. Ze względu na możliwy mały rozmiar węzła chłonnego i odległe przerzuty, wybiera się małą średnicę rdzenia wynoszącą 0,6 mm do budowy TMA dla wszystkich tkanek.

Dodatkowo, planuje się, że każdy region będzie oddzielnie ułożony, tak aby powstało 6 ngTMA zawierających różne obszary histologiczne: ngTMA zawierające tkanki z a) centrum nowotworu, b) frontu inwazji, c) obszarów pączkowania guza, d) normalnej tkanki, e) przerzutów do węzłów chłonnych i f) przerzutów do wątroby.

Dla projektu TMA przy użyciu narzędzia 0,6 mm zostanie wybrana wygodna odległość 0,4 mm między stemplami. Ponieważ ocena plam tkankowych w długich rzędach i kolumnach jest często męcząca, wybiera się dwa różne wzory. W przypadku bloków nowotworowych z 3 stemplami na obszar tkanki tworzony jest projekt zawierający sześć części. Daje to łączną liczbę 402 uderzeń w tkanki. W przypadku zwykłych stempli tkankowych należy dołączyć 2 stemple na skrzynkę. Wybierany jest układ pasujący łącznie do 432 stempli.

Ponadto, dla każdego przypadku, do 4 rdzeni o średnicy 0,6 mm zostanie dodatkowo wycięte i umieszczone w probówkach o pojemności 0,2 ml. Te rdzenie tkankowe zostaną również opatrzone adnotacjami.

Podsumowując, zostanie wyprodukowanych 6 ngTMA różnych tkanek (5 matryc nowotworowych x 3 ciosy x 134 pacjentów; 1 normalna matryca tkankowa x 2 uderzenia x 134 pacjentów) oprócz 4 rdzeni na pacjenta dla probówek. Łącznie zostanie dokonanych 2814 adnotacji.

Następnie, odpowiednie slajdy H&E od wybranych pacjentów są pobierane z archiwum slajdów. Każdy przypadek jest krótko analizowany przez patologa i wybierane są najbardziej reprezentatywne preparaty każdego typu tkanki.

Skanowanie

Cyfrowe slajdy każdej sekcji histologicznej są tworzone do przyszłej adnotacji. W tym badaniu należy zeskanować 3-4 preparaty tkankowe w każdym przypadku, tj. pierwotny rak jelita grubego, z lub bez sąsiednich normalnych tkanek, przerzuty do węzłów chłonnych i przerzuty do wątroby oraz ewentualnie dodatkowy szkiełko zawierające normalną błonę śluzową.

Do 10 różnych magazynków można w pełni załadować do skanera slajdów; dlatego można zeskanować 250 slajdów w jednym przebiegu. Czas skanowania i rozmiar szkiełka cyfrowego różni się w zależności od wymiarów tkanki i pożądanego czynnika jakości. Współczynnik jakości waha się od 0 do 100. W tym przypadku wybierany jest współczynnik jakości 60, ponieważ daje mniejszy rozmiar pliku skanowania bez zauważalnej utraty jakości skanowania. Małe biopsje można zeskanować w czasie krótszym niż 30 sekund, podczas gdy całe skrawki tkanek, takie jak te użyte w tym przykładzie, mogą zająć od 2 do 10 minut. Rozmiar slajdu cyfrowego może również wynosić od 2 MB do 2 GB. Przy współczynniku jakości 60 generowane są skany o wielkości od 600 MB do 1 GB.

Do tego projektu wymagane jest od 402 do 536 slajdów, co daje łącznie 3 przebiegi skanowania. Każdy bieg wykonywany jest w nocy. Potrzebne jest około 500 GB przestrzeni dyskowej. Slajdy są skanowane bezpośrednio na platformę cyfrową o nazwie Case Center (ngtma.unibe.pathcasecenter). Case Center jest dostępne z dowolnego miejsca z dostępem do Internetu po wprowadzeniu wyznaczonej nazwy użytkownika i hasła.

Adnotacja

Do adnotacji należy wziąć pod uwagę dwa aspekty: 1) różne obszary tkanek powinny mieć różne kolory adnotacji i 2) liczba adnotacji powinna odzwierciedlać liczbę pożądanych kopii końcowego ngTMA.

W tym przypadku wybrano 3 miejsca na obszar guza dla pojedynczej kopii. W przypadku 2 kopii każdy region musi być opatrzony adnotacjami za pomocą 6 miejsc. Przydatne są zielone dla normalnej tkanki, niebieskie dla centrum guza, żółte dla frontu inwazji guza, czerwone dla obszarów interakcji pączkowania guza (guz / zrąb), czarne dla przerzutów do węzłów chłonnych, turkusowe dla odległych przerzutów i wreszcie białe dla obszarów, które mają być wykorzystane do jajowodów. Adnotacja do każdej sprawy zajmuje 2-3 min.

ngTMA Construction

To badanie wymaga skonstruowania 6 bloków ngTMA w 2 kopiach, co daje 12 końcowych bloków. Maksymalna liczba bloków adresatów, które mogą być obsługiwane przez macierz, wynosi 12. Każdy blok guza będzie zawierał 402 plamki tkankowe, a każdy normalny blok tkankowy będzie zawierał 268 plamek, co daje łącznie 4556 plamek w całym projekcie.

Dla każdego bloku odbiorcy tworzony jest układ TMA, a projekt jest zapisywany (Rysunki 6A, 6B). Do mikromacierzy tkankowej można równolegle załadować 60 bloków tkankowych; wykonywany jest obraz każdego bloku dawcy. Począwszy od pierwszego bloku dawcy, odpowiedni slajd cyfrowy z adnotacjami jest pobierany z Case Center. Wykonywane jest dopasowywanie slajdów, które może trwać od 1 do 3 minut. Adnotacje są potwierdzane, a macierz jest proszony o rozpoczęcie wykrawania (Rysunek 7). Czas wykrawania i transferu rdzenia wynosi około 12 sekund. Utrata rdzeni podczas tej procedury jest minimalna. Całkowity czas potrzebny na ułożenie tego projektu w układ wynosi około 24 godzin, wliczając w to czas na dopasowanie suwaka/bloku i ponowne załadowanie instrumentu. Niektóre przykłady ngTMA zilustrowano na rysunku 8A. W tym czasie można również wyciąć rdzenie do późniejszej analizy molekularnej (ryc. 8B).

figure-results-1
Rysunek 1. A) Blokada "dawcy". Rdzenie z bloku dawcy są wykrawane i przenoszone do B) bloku biorczego lub mikromacierzy tkankowej (TMA).

figure-results-2
Rysunek 2.Konwencjonalny przebieg pracy z mikromacierzą tkankową. A) Preparaty histologiczne są pobierane z archiwum i B) przekazywane patologowi do przeglądu. C-D) Na slajdach umieszczane są adnotacje wskazujące "szacowany" region do przeniesienia. E) Pobierane są odpowiednie bloki tkanki. F) Blok i suwak są porównywane pod kątem dopasowania, co może G) czasami być trudnym zadaniem. H-J) Następnie następuje mikromacierz tkanek. K) Rdzenie są wielokrotnie przenoszone i L) konstruowany jest końcowy TMA.

figure-results-3
Rysunek 3. A) W każdym magazynie można umieścić do 25 preparatów do skanowania. B) Można dokonać korekt współczynnika jakości i rozmiaru. Postęp skanowania można monitorować.

figure-results-4
Rysunek 4. A) Zeskanowane slajdy można przesłać na platformę internetową Case Center. B) Można oglądać slajdy cyfrowe. Narzędzie adnotacji TMA pozwala użytkownikowi wybrać rozmiar rdzenia i kolor wymagany do adnotacji. C) Adnotacje można umieszczać bezpośrednio na slajdzie cyfrowym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5. A) Do mikromacierzy tkankowej można załadować do 60 bloków, a mianowicie 10 bloków dawcy w rzędzie i 12 bloków biorców. B) Wykonywany jest obraz każdego bloku dawczego, pobierany jest szkiełko cyfrowe. Odbywa się dopasowywanie bloku i suwaka, a adnotacje są używane do przebijania bloków. C) Postęp układania można monitorować podczas wykrawania przyrządu. D) Po wykonaniu wykrawania wykonywany jest eksport lokalizacji każdego punktu w układzie, ale także obraz każdego bloku dawcy z odpowiednimi adnotacjami.

figure-results-6
Rysunek 6. Te układy TMA zostały wykorzystane do ułożenia A) bloków guza i B) normalnych tkanek.

figure-results-7
Rysunek 7. Zrzut ekranu oprogramowania do mikromacierzy tkankowej. Po lewej stronie w instrumencie można umieścić 12 bloków odbiorcy. Na dole znajdują się zdjęcia każdego bloku dawczego. W środku znajduje się układ TMA, postęp wykrawania, a także powiększone obrazy każdego bloku dawcy z adnotacjami.

figure-results-8
Rysunek 8.A) Kilka przykładów nowo utworzonych bloków ngTMA. B) Można pobrać dodatkowe stemple tkankowe do późniejszej analizy molekularnej. Rdzenie te są wykrawane i umieszczane w probówkach o pojemności 0,2 ml.

figure-results-9
Rysunek 9. Przykłady zastosowań biomarkerów ngTMA. A) Barwienie immunohistochemiczne Ki67 w raku jelita grubego. Podwójny test immunohistochemiczny HER2/hybrydyzacji in situ wykazujący B) niską ekspresję białka (brązowy) i brak amplifikacji genu Her2 () w stosunku do centromeru (czerwony); C) wysoka ekspresja białka (kolor brązowy) i amplifikacja genu Her2 (kolor) w stosunku do centromeru (kolor czerwony). D) Chromogenna hybrydyzacja in situ Her2 wykazująca pojedyncze transkrypty mRNA w raku piersi ngTMA. E) Immunohistochemia CD8 w raku jelita grubego. F) Podwójne barwienie immunohistochemiczne dla markera pan-cytokeratyny AE1 / AE3 (brązowy; komórki nowotworowe) i CD68 (czerwony; makrofagi) podkreślające mikrośrodowisko guza w raku jelita grubego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym artykule przedstawiono protokół dla ngTMA. ngTMA to nowo opracowana koncepcja mikromacierzy tkankowej, obejmująca planowanie i projektowanie, patologię cyfrową i adnotację preparatów, a także zautomatyzowane mikromacierze tkanek12.

W porównaniu z konwencjonalną mikromacierzą tkankową, ngTMA oferuje wiele zalet. W pierwszym kroku decydujące znaczenie ma faza planowania i projektowania. Nacisk kładziony jest na udzielenie odpowiedzi na ukierunkowane pytanie badawcze. Powinno to uwzględniać kwestie histologiczne (np. które regiony i ile miejsc chcę uwzględnić?), planowanie statystyczne (np. wielkość próby? W jaki sposób mogę później przeanalizować moje próbki?) oraz względy logistyczne (np. ile biomarkerów, a tym samym ile kopii ngTMA?). Specyficzny ngTMA jest tworzony z myślą o konkretnych potrzebach, niezależnie od tego, czy chodzi o badania przesiewowe biomarkerów i wysokoprzepustowość, czy też o badanie określonych aspektów histologicznych tylko w kilku dobrze wybranych przypadkach.

Jedną, jeśli nie najważniejszą, wadą konwencjonalnego mikromacierzania tkanek jest niska dokładność, z jaką wykonywane są oznaczenia na szkiełkach histologicznych. Badanie określonych struktur histologicznych, komórek lub regionów jest prawie niemożliwe. ngTMA pozwala na wysoką dokładność, ponieważ adnotacje są umieszczane bezpośrednio na slajdach cyfrowych. Dzięki temu badacz może precyzyjnie wybrać regiony do przebicia, w tym konkretne komórki. W tym przykładzie różne obszary w tym samym bloku tkankowym są wycinane w celu ułożenia w układ, takie jak centrum guza, front inwazji i obszary interakcji guz/zrąb, podkreślone obecnością małych skupisk komórek nowotworowych lub nawet pojedynczych komórek. Tę dokładność można osiągnąć tylko za pomocą ngTMA. Po trzecie, ponieważ preparaty są skanowane na internetową platformę cyfrową, przeglądanie slajdów i dodawanie adnotacji może odbywać się za pomocą komputera, a nie mikroskopu. Oprogramowanie do układania tkanek zapewnia przyjazny dla użytkownika interfejs o wysokim stopniu elastyczności, dzięki czemu można uzyskać różne układy i projekty ngTMA. Ponieważ konstrukcja TMA jest wykonywana automatycznie przez wiercenie, nie ma potrzeby praktycznego manewrowania, a czas budowy jest znacznie skrócony. Czas budowy TMA w tym przykładzie wynosi od 24 godzin. Stosując konwencjonalne podejście TMA i szacując 15 uderzeń na godzinę, projekt ten trwałby około 304 godzin.

ngTMA może być stosowany do badania ekspresji białek, mRNA lub DNA, a także ich kombinacji. Rysunek 9 ilustruje kilka z tych zastosowań w odniesieniu do potencjalnych biomarkerów. Standardowa immunohistochemia może być zastosowana do określenia wskaźnika proliferacji nowotworów przy użyciu Ki-67. Można zastosować połączone podejście do badania ekspresji białek i amplifikacji DNA dla genów takich jak HER2. Tkanki mogą być zbierane razem na jednym ngTMA w celu zmniejszenia kosztów, zużycia tkanek i innych zasobów. Ponadto można przeprowadzić chromogenną hybrydyzację mRNA in situ dla HER2 i innych genów w celu identyfikacji pojedynczych transkryptów mRNA w dużej liczbie przypadków przy użyciu minimalnej liczby szkiełek tkankowych. Immunohistochemię markerów immunologicznych, takich jak CD8, można uwidocznić w kontekście mikrośrodowiska guza. Podwójna immunohistochemia może być również wykorzystana do podkreślenia określonych obszarów zainteresowania, takich jak interakcje między komórkami odpornościowymi (oznaczonymi na czerwono) a komórkami nowotworowymi (oznaczonymi na brązowo) na froncie inwazji nowotworów. Taki obszar zainteresowania nie mógłby zostać uchwycony przy użyciu konwencjonalnej mikromacierzy tkankowej.

Niemniej jednak protokół ten zawiera pewne ograniczenia. Najważniejszym wyzwaniem jest nakładanie się na siebie bloku dawczego i szkiełka cyfrowego. Na ten krok może mieć wpływ kilka czynników. Po pierwsze, najnowsza sekcja z bloku powinna być używana do skanowania slajdów. W wielu przypadkach H&E nie jest ostatnim odcinkiem bloku dawczego, jest to raczej barwnik immunohistochemiczny lub inny. W takim przypadku można również użyć szkiełka barwiącego, o ile ostatnia plama zostanie zeskanowana i opatrzona adnotacjami lub należy wykonać nowy H&E. Należy również zachować ostrożność podczas wykonywania skrawków tkanek, ponieważ tkanki mogą rozszerzać się w kąpieli wodnej, co prowadzi do trudnego dopasowania szkiełka i bloku. Po drugie, w tej chwili projekty są ograniczone do 12 bloków TMA odbiorców przetwarzanych w jednym czasie. Większe projekty przekraczające 12 TMA muszą być przypisane do drugiej nazwy projektu. Po trzecie, bloki dawcze muszą być wykonane przy użyciu standardowych form i kaset, ponieważ instrument nie może dostosować się do różnych rozmiarów. Wreszcie, bloki donorowe muszą przekraczać minimalną wysokość (4 mm), aby uzyskać optymalne wiercenie. W niektórych przypadkach wymaga to ponownego osadzenia tkanek.

Setki publikacji z ostatnich kilku lat podkreślają, że TMA jest nieocenionym narzędziem do badań nad biomarkerami. TMA były używane do badania raka płuc13, jelita grubego7, piersi14, prostaty15, trzustki16, pęcherza moczowego17 i żołądka18 , żeby wymienić tylko kilka. Coraz większa liczba autorów łączy stosowanie TMA z analizą obrazu i poczyniono znaczne postępy w tym kierunku19-21. Jednak poza kilkoma grupami badawczymi, które opublikowały innowacyjne pomysły TMA22-24, niewiele uwagi poświęcono optymalizacji samej techniki TMA. Zautomatyzowane mikromacierze tkankowe, takie jak ATA-27 firmy Estigen/Beecher, zapewniają projektowanie układu oraz celowe i zautomatyzowane wykrawanie tkanek. Stanowi to jednak tylko 1 aspekt koncepcji ngTMA.

ngTMA jest znaczącym ulepszeniem w porównaniu z konwencjonalnymi technikami mikromacierzowania tkanek. Łączy w sobie wiedzę z zakresu histologii i projektowania TMA z elastycznością patologii cyfrowej i precyzją adnotacji cyfrowych z szybkością i niezawodnością zautomatyzowanej budowy TMA. Połączenie ngTMA i analizy obrazu w celu oceny biomarkerów białkowych i molekularnych będzie potężnym narzędziem do dalszej poprawy jakości badań klinicznych i translacyjnych w przyszłości.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować personelowi technicznemu Jednostki Badań Translacyjnych; Mary Economou, José Galván, Caroline Hammer, Dominique Müller, Liliane Schöni oraz zespół informatyczny w Instytucie Patologii Uniwersytetu w Bernie.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Pannoramic 250 Flash II3DHistechSkaner slajdów
TMA Grandmaster3DHistechTissue Microarrayer
Pannoramic Viewer3DHistechdarmoweoprogramowanie do przeglądania slajdów
Centrum przypadków3DHistechCyfrowa platforma slajdów

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4, 844-847 (1998).
  2. Tzankov, A., Went, P., Zimpfer, A., Dirnhofer, S. Tissue microarray technology: principles, pitfalls and perspectives--lessons learned from hematological malignancies. Exp Gerontol. 40, 737-744 (2005).
  3. Barlund, M., et al. Detecting activation of ribosomal protein S6 kinase by complementary DNA and tissue microarray analysis. J Natl Cancer Inst. 92, 1252-1259 (2000).
  4. Bubendorf, L., et al. Survey of gene amplifications during prostate cancer progression by high-throughout fluorescence in situ hybridization on tissue microarrays. Cancer Res. 59, 803-806 (1999).
  5. Garcia-Caballero, T., et al. Dual-colour CISH is a reliable alternative to FISH for assessment of topoisomerase 2-alpha amplification in breast carcinomas. Breast Cancer Res Treat. , 81-89 (2014).
  6. Schraml, P., et al. Tissue microarrays for gene amplification surveys in many different tumor types. Clin Cancer Res. 5, 1966-1975 (1999).
  7. Zlobec, I., et al. Role of RHAMM within the hierarchy of well-established prognostic factors in colorectal cancer. Gut. 57, 1413-1419 (2008).
  8. Hsu, F. D., et al. Tissue microarrays are an effective quality assurance tool for diagnostic immunohistochemistry. Mod Pathol. 15, 1374-1380 (2002).
  9. Marin, C., et al. Detection of BRAF p.V600E Mutations in Melanoma by Immunohistochemistry Has a Good Interobserver Reproducibility. Arch Pathol Lab Med. , 71-75 (2014).
  10. Polley, M. Y., et al. An International Ki67 Reproducibility Study. J Natl Cancer Inst. , 1897-1906 (2013).
  11. Zlobec, I., Terracciano, L., Jass, J. R., Lugli, A. Value of staining intensity in the interpretation of immunohistochemistry for tumor markers in colorectal cancer. Virchows Arch. 451, 763-769 (2007).
  12. Zlobec, I., Koelzer, V. H., Dawson, H., Perren, A., Lugli, A. Next-generation tissue microarray (ngTMA) increases the quality of biomarker studies: an example using CD3, CD8, and CD45RO in the tumor microenvironment of six different solid tumor types. J Transl Med. 11, 104(2013).
  13. Yoshida, A., et al. Immunohistochemical detection of ROS1 is useful for identifying ROS1 rearrangements in lung cancers. Mod Pathol. , 711-720 (2014).
  14. Droeser, R., et al. Differential pattern and prognostic significance of CD4+, FOXP3+ and IL-17+ tumor infiltrating lymphocytes in ductal and lobular breast cancers. BMC Cancer. 12, 134(2012).
  15. Fleischmann, A., et al. Androgen receptors are differentially expressed in Gleason patterns of prostate cancer and down-regulated in matched lymph node metastases. Prostate. 71, 453-460 (2011).
  16. Wang, T., et al. Pattern of breast cancer susceptibility gene 1 expression is a potential prognostic biomarker in resectable pancreatic ductal adenocarcinoma. Pancreas. 42, 977-982 (2013).
  17. Fleischmann, A., Rotzer, D., Seiler, R., Studer, U. E., Thalmann, G. N. Her2 amplification is significantly more frequent in lymph node metastases from urothelial bladder cancer than in the primary tumours. Eur Urol. 60, 350-357 (2011).
  18. Zhang, Z. Q., et al. Identification of Annexin A1 protein expression in human gastric adenocarcinoma using proteomics and tissue microarray. World J Gastroenterol. 19, 7795-7803 (2013).
  19. Chaux, A., et al. The epidermal growth factor receptor is frequently overexpressed in penile squamous cell carcinomas: a tissue microarray and digital image analysis study of 112 cases. Hum Pathol. 44, 2690-2695 (2013).
  20. McKenna, S. J., Amaral, T., Akbar, S., Jordan, L., Thompson, A. Immunohistochemical analysis of breast tissue microarray images using contextual classifiers. J Pathol Inform. 4, S13(2013).
  21. Pages, F., et al. Effector memory T cells, early metastasis, and survival in colorectal cancer. N Engl J Med. 353, 2654-2666 (2005).
  22. Komiya, A., et al. Application of a new technique, spiral tissue microarrays constructed using needle biopsy specimens, to prostate cancer research. Int J Oncol. 44, 195-202 (2014).
  23. Quintayo, M. A., et al. Virtual tissue microarrays: A novel and viable approach to optimising tissue micro-arrays for biomarker research applied to Ductal Carcinoma in Situ (DCIS). Histopathology. , 2-8 (2014).
  24. Torata, N., et al. Tissue tablet method: an efficient tissue banking procedure applicable to both molecular analysis and frozen tissue microarray. Hum Pathol. 45, 143-152 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Next generation Tissue MicroarrayTissue Microarray ConstructionDigital PathologyAutomated Tissue MicroarrayingHistological AnnotationTissue Core TransferBiomarker StudiesColorectal CancerTissue Block ArrayingDigital Slide Scanning

Related Articles