Protokół mikromacierzy tkankowej nowej generacji (ngTMA) do badań biomarkerów

Podsumowanie

Protokół ma na celu optymalizację konstrukcji i jakości mikromacierzy tkankowych do badań nad biomarkerami. Obejmuje aspekty planowania i projektowania, patologii cyfrowej, wirtualnych adnotacji do slajdów i automatycznego układania tkanek.

Streszczenie

Badania nad biomarkerami opierają się na mikromacierzach tkankowych (TMA). TMA są wytwarzane przez wielokrotne przenoszenie małych rdzeni tkankowych z bloku "dawcy" do bloku "biorcy", a następnie wykorzystywane do różnych zastosowań biomarkerowych. Budowa konwencjonalnych TMA jest pracochłonna, nieprecyzyjna i czasochłonna. W tym miejscu przedstawiono protokół wykorzystujący mikromacierze tkankowe nowej generacji (ngTMA). ngTMA opiera się na planowaniu i projektowaniu TMA, patologii cyfrowej i zautomatyzowanym mikromacierzowaniu tkanek. Protokół zilustrowano na przykładzie 134 pacjentów z przerzutowym rakiem jelita grubego. Pod uwagę brane są aspekty histologiczne, statystyczne i logistyczne, takie jak typ tkanki, określone regiony histologiczne i typy komórek do włączenia do TMA, liczba plamek tkankowych, wielkość próby, analiza statystyczna i liczba kopii TMA. Preparaty histologiczne dla każdego pacjenta są skanowane i przesyłane na internetową platformę cyfrową. Tam są one przeglądane i opisywane (oznaczane) za pomocą narzędzia o średnicy 0,6-2,0 mm, wielokrotnie przy użyciu różnych kolorów w celu rozróżnienia obszarów tkanki. Do instrumentu ładowane są bloki dawcze i 12 bloków "biorcy". Slajdy cyfrowe są pobierane i dopasowywane do obrazów bloku dawcy. Powtarzanie szyku regionów z adnotacjami jest wykonywane automatycznie, co skutkuje ngTMA. W tym przykładzie zaplanowano sześć ngTMA zawierających sześć różnych typów tkanek/stref histologicznych. Wymagane są dwie kopie ngTMA. Dla każdego pacjenta skanowane są od trzech do czterech preparatów; Konieczne są 3 uruchomienia skanowania, które są wykonywane w nocy. Wszystkie slajdy są opatrzone adnotacjami; Różne kolory są używane do reprezentowania różnych tkanek / stref, a mianowicie centrum guza, frontu inwazji, guza / zrębu, przerzutów do węzłów chłonnych, przerzutów do wątroby i normalnej tkanki. Wykonano 17 adnotacji/sprawę; Czas na adnotację to 2-3 min/sprawę. Produkowanych jest 12 ngTMA zawierających 4 556 plamek. Czas układania w szyk wynosi 15-20 godzin. Ze względu na swoją precyzję, elastyczność i szybkość, ngTMA jest potężnym narzędziem do dalszej poprawy jakości TMA stosowanych w badaniach klinicznych i translacyjnych.

Wprowadzenie

W ciągu ostatnich dwóch dekad, mikromacierze tkankowe (TMA) miały niezwykły wpływ na badania nad biomarkerami. TMA są zasadniczo "archiwami" tkankowymi wytwarzanymi przez wielokrotne przenoszenie małych rdzeni tkankowych, zwykle o średnicy od 0,6 do 2,0 mm, z zatopionych w parafinie bloków "dawcy" do pojedynczego bloku "biorcy" TMA (ryc. 1)¹. Korzystając z małego rozmiaru rdzenia, około 500 różnych plamek tkankowych od kilku lub wielu różnych pacjentów można ułożyć w jednym TMA².

Wykorzystanie TMA do prognostycznych lub predykcyjnych badań biomarkerów ma wiele zalet. Rozważmy przykład, w którym ekspresja biomarkera białkowego za pomocą immunohistochemii ma być oceniana na 450 pacjentach. Zamiast wykonywać 450 barwień immunohistochemicznych na 450 preparatach pacjenta wyciętych z tej samej liczby bloków, małe rdzenie z każdej próbki można umieścić w jednym bloku TMA. Nawet jeśli od każdego pacjenta pobiera się wiele rdzeni, wytwarzana jest minimalna liczba bloków. Ma to znaczący wpływ na drastyczne zmniejszenie kosztów i innych zasobów, a także zmniejszenie marnotrawstwa tkanek. Dodatkowo pozwala to na ocenę badań o odpowiedniej mocy z wykorzystaniem dużej liczby tkanek w tych samych warunkach eksperymentalnych.

TMA mają wiele różnych zastosowań. Na przykład można je wykorzystać do badania morfologii, ekspresji białek, ekspresji RNA i aberracji DNA po barwieniu różnymi barwnikami lub po immunohistochemii lub hybrydyzacji chromogennej, a nawet fluorescencyjnej in situ ^3-7. W ostatnich badaniach wykorzystano również TMA do testowania wewnątrz- i międzylaboratoryjnych zmian w protokołach barwienia, ustalenia swoistości lub wrażliwości przeciwciał na określone mutacje genów oraz do określenia odtwarzalności ekspresji białek między obserwatorami we współpracy międzynarodowej^8-11.

Budowa tradycyjnych TMA z wykorzystaniem tkanek pochodzących od pacjenta to długa, wieloetapowa procedura (Rysunek 2). Rozpoczyna się od wyszukania możliwych odpowiednich przypadków i wyboru preparatów diagnostycznych z archiwów w instytucie patologii lub innym instytucie, z którego są one pobierane. Patolog ocenia każdy slajd dla każdego przypadku i wybiera najbardziej reprezentatywny slajd do celów badania. Następnie obszar zainteresowania jest oznaczany za pomocą pisaka bezpośrednio pod mikroskopem. Jest to często trudne i nieprecyzyjne, a skutkuje jedynie "oszacowaniem", skąd powinny być pobierane stemple tkankowe. Następnie z archiwum pobierane są bloki parafiny odpowiadające tym oznaczonym preparatom. Dokonywane jest szybkie porównanie między blokiem a zjeżdżalnią. Za pomocą półautomatycznego lub domowego układu tkanek blok dawcy jest wycinany w szacowanym obszarze zainteresowania i przenoszony do bloku TMA biorcy. Budowa TMA przy użyciu tej techniki szykowania jest pracochłonna, czasochłonna, nieprecyzyjna i nieelastyczna. Szacuje się, że przygotowanie TMA 475 spotów w 3 egzemplarzach zajmuje około 84 godzin pracy.

Nowe podejście do budowy TMA zostało niedawno wprowadzone przez Instytut Patologii Uniwersytetu w Bernie, które opiera się na trzech komponentach: planowaniu i projektowaniu (lub doradztwie), patologii cyfrowej połączonej z wiedzą specjalistyczną w zakresie histologii i automatycznym ustawianiu TMA¹². Koncepcja ta nosi nazwę nowej generacji Tissue Microarray (ngTMA). Poniżej opisano protokół ngTMA na przykładzie 134 pacjentów z przerzutowym rakiem jelita grubego. W tym przypadku guzy pierwotne, a także przerzuty do węzłów chłonnych i przerzuty do wątroby mają zostać umieszczone w ngTMA w celu późniejszej analizy biomarkerów. Dodatkowo pożądane są małe rdzenie tkankowe od każdego pacjenta do przyszłej ekstrakcji kwasów nukleinowych.

Protokół

UWAGA: To badanie zostało zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną szpitala Insel w Bernie, Szwajcaria (07-10-13). Tkanki pobrano z Banku Nowotworów w Bernie, Instytutu Patologii, Uniwersytetu w Bernie.

1. Planowanie i projektowanie (doradztwo)

1. Zastanów się, na jakie pytanie badawcze należy odpowiedzieć. Zdecyduj o typach tkanek, które mają zostać uwzględnione w projekcie. Określ, jakie struktury histologiczne są ważne, aby odpowiedzieć na pytanie.
2. Ustal najbardziej użyteczną średnicę rdzenia i liczbę rdzeni na pacjenta dla projektu. Zdecyduj o liczbie kopii mikromacierzy tkankowej nowej generacji (ngTMA) w oparciu o liczbę biomarkerów, które mają być badane.
3. Weź pod uwagę aspekty statystyczne, takie jak wielkość próbki i analiza po skonstruowaniu mikromacierzy tkankowej (TMA). Określ liczbę pacjentów do włączenia do badania i ustal tkanki kontrolne dla macierzy.
4. Pobrać preparaty histologiczne (lub diagnostyczne) hematoksyliny i eozyny (H&E) każdego pacjenta. Przejrzyj pokrótce slajdy i zidentyfikuj te, które zawierają informacje i histologię istotne dla projektu.
   UWAGA: Wykonaj nowe sekcje bloków parafinowych, jeśli do skanowania i adnotacji szkiełek barwnikowych lub immunohistochemicznych jest pożądany specjalny szkiełko barwiące lub immunohistochemiczne, zamiast szkiełek H&E

2. Skanowanie slajdów

1. Włącz komputer i skaner slajdów i otwórz oprogramowanie do skanowania. Wybierz "tryb automatyczny" dla skanowania w jasnym polu z ekranu podglądu.
2. Kliknij "opcje skanowania", aby dostosować parametry jakości slajdu. W tym momencie wybierz, czy slajdy mają być skanowane bezpośrednio na platformę cyfrową dostępną przez Internet, czy na dysk lokalny (lub dysk zewnętrzny) i ustaw typy skanowania oraz liczbę punktów ostrości.
3. Kliknij "Parametry serwera", aby zeskanować do "Centrum spraw". Na tym etapie dodaj więcej czasopism, oznacz wszystkie slajdy i ustaw folder w Case Center, w którym slajdy powinny być przechowywane. Każdy magazynek mieści do 25 slajdów.
4. Sprawdź jakość/czystość rzeczywistych preparatów histologicznych do skanowania. W razie potrzeby wyczyść szkiełka 70% etanolem.
5. Załaduj do 25 slajdów na magazyn z etykietami skierowanymi do wewnątrz (Rysunek 3A)
6. Umieść magazynek w skanerze. W przypadku więcej niż jednego czasopisma umieść je jeden na drugim.
7. Rozpocznij skanowanie slajdu, klikając zieloną strzałkę (Rysunek 3B). Po zeskanowaniu wszystkich slajdów rozładuj magazynki i wyłącz program, komputer i skaner slajdów.

3. Cyfrowa adnotacja slajdów

1. Wprowadź adres przeglądarki centrum zarządzania slajdami cyfrowymi i pobierz bezpłatne oprogramowanie do przeglądania slajdów cyfrowych.
2. Otwórz oprogramowanie przeglądarki slajdów cyfrowych i wybierz folder zawierający slajdy cyfrowe (Rysunek 4A).
3. Dodawaj notatki, zmieniaj kolejność i zarządzaj folderem slajdów cyfrowych, przypisuj prawa użytkownika współpracownikom lub dodawaj załączniki do folderu.
4. Kliknij żądany slajd cyfrowy, który pojawi się w przeglądarce slajdów cyfrowych.
5. Korzystając z narzędzia do powiększania, oceń slajd i znajdź obszary zainteresowania do integracji z ngTMA.
6. Korzystając z narzędzia do adnotacji TMA, wybierz rozmiar żądanego rdzenia i kolor adnotacji. Umieść adnotację na slajdzie cyfrowym, klikając ją (Rysunek 4B).
7. Przenieś adnotację do żądanych struktur histologicznych w celu włączenia do ngTMA (ryc. 4C).
8. Powtórz ten proces adnotacji ponownie, używając narzędzia adnotacji, wybierając rozmiar rdzenia i żądany kolor adnotacji. Powtórz wyświetlanie slajdów i dodawanie adnotacji do wszystkich slajdów w folderze.
9. Alternatywnie, umieść rdzenie tkanek do PCR w probówkach o pojemności 0,2 ml, zamiast integrować je z TMA. Opisuj slajdy, używając innego koloru, aby zidentyfikować te miejsca do dalszej analizy molekularnej.
10. Utwórz listę wszystkich obserwacji wraz z odpowiadającymi im adnotacjami i kolorami.

4. Budowa mikromacierzy tkankowej

1. Pobierz odpowiednie bloki tkanki parafinowej dla wszystkich szkiełek cyfrowych z adnotacjami, posortuj bloki w żądanej kolejności do mikromacierzania tkanek.
2. Upewnij się, że bloki tkanek mają grubość co najmniej 4 mm. Jeśli nie, konieczne jest ponowne osadzenie tkanki.
3. Włącz komputer i automatyczny przyrząd do mikromacierza tkankowego. Otwórz oprogramowanie mikromacierzy tkankowej i podaj nazwę projektu
4. Wykonaj "Wymianę narzędzia" i wybierz wymaganą średnicę narzędzia dla projektu (tj. 0,6, 1,0, 1,5 lub 2,0 mm).
5. Załaduj do 12 bloków TMA "odbiorcy" do maszyny. Nadaj identyfikator każdemu z 12 bloków
6. Utwórz układ TMA dla każdego bloku adresatów. Zwróć uwagę na projekt TMA z liczbą rzędów, kolumn i pustych linii, a także odległością między rdzeniami. Utwórz nowy układ dla każdego bloku adresatów lub używaj tego samego układu wielokrotnie.
7. Umieść kursor na układzie bloku odbiorcy, aby pobrać pierwszy rdzeń.
8. Następnie załaduj do 60 bloków dawcy do mikromacierzy tkankowej (ryc. 5A). Umieść dziesięć bloków w każdym rzędzie od A do F. Nadaj każdemu blokowi identyfikator dawcy. Obserwuj obrazy każdego bloku dawcy na ekranie komputera, które są automatycznie uzyskiwane przez mikromacierz tkankową.
9. Zaczynając od pierwszego bloku, kliknij "Slajd". Obserwuj slajd cyfrowy z adnotacjami zapisany w cyfrowym centrum zarządzania slajdami (lub na dysku zewnętrznym) za pomocą cyfrowej przeglądarki slajdów. Wyświetl obraz bloku dawczego i slajdu cyfrowego obok siebie.
10. Wybierz punkty odniesienia na obrazie bloku, aby nałożyć obraz bloku dawcy na slajd cyfrowy
11. Po kliknięciu "Dalej" obserwuj adnotacje na większym obrazie bloku. (Rysunek 5B). Kliknij na górze adnotacji, aby potwierdzić i kliknij "Start".
    UWAGA: Spowoduje to, że mikromacierz tkankowa rozpocznie wiercenie otworu o średnicy 0,6 mm w bloku biorczym w wybranym punkcie początkowym. Następnie, w drugim kroku, za pomocą narzędzia do wykrawania, narzędzie przebija otwór w tkance z wybranego bloku dawcy w dokładnie opisanym i potwierdzonym obszarze. Rdzenie są następnie przenoszone od dawcy do bloku biorcy.
12. Po około 500 rdzeniach wyczyść wiertło i narzędzie do wykrawania za pomocą wacika z ksylenu.
13. Jeśli pożądane są rdzenie tkanek (zamiast przebijania w ngTMA), kliknij narzędzie "PCR" dla bloku, potwierdź do 4 adnotacji i naciśnij "Start". Spowoduje to przebicie i przeniesienie rdzeni do probówki o pojemności 0,2 ml.
14. Powtórzyć punkty od 4.9 do 4.11 z drugim blokiem dawczym i tak dalej.
15. Po wykorzystaniu wszystkich bloków dawczych wprowadź drugą rundę bloków dawczych (61-120) do mikromacierzy tkankowej i kontynuuj kroki od 4.8 do 4.11.
16. Odświeżanie obrazów bloków dawcy i biorcy podczas postępu projektu podczas wiercenia i wykrawania (Rysunek 5C).
17. Wykonaj "Eksport" po zakończeniu projektu. Zlokalizuj plik .xslx z identyfikatorami bloków dawcy i odbiorcy, lokalizacją wszystkich stempli w TMA, a także układem/projektem TMA w wyeksportowanym folderze. Zapisz wszystkie obrazy bloku dawcy ze wszystkimi nałożonymi adnotacjami jako obrazy jpg w wyeksportowanym folderze (Rysunek 5D). Ostatni blok TMA jest wtedy gotowy.

Wyniki

Planowanie i projektowanie

W tym przypadku wykorzystano przykład 134 pacjentów z przerzutowym rakiem jelita grubego, których badano pod kątem konkretnej serii biomarkerów. Dla tych pacjentów zaplanowano nie tylko wykonanie ngTMA, ale także ekstrakcję DNA, a następnie analizę mutacyjną określonego genu.

Podczas fazy planowania i projektowania ngTMA zdecydowano o następujących kwestiach. U każdego pacjenta zbadanych zostanie 6 różnych obszarów histologicznych: centrum guza, front inwazyjny guza, obszary o najgęstszym pączkowaniu nowotworu (oddziaływanie guz-stroma), tkanka prawidłowa, przerzuty do węzłów chłonnych oraz przerzuty do wątroby. W ramach projektu uwzględnione zostaną trzy miejsca z każdego obszaru tkanki nowotworowej oraz dwa miejsca z tkanki prawidłowej (n=17 miejsc na pacjenta). Ponieważ planowane jest zbadanie ponad 50 biomarkerów w materiale pacjentów, pożądane są dwie kopie końcowego ngTMA. Ze względu na możliwie niewielki rozmiar przerzutów do węzłów chłonnych i przerzutów odległych, do konstrukcji TMA dla wszystkich tkanek wybrano małą średnicę rdzenia wynoszącą 0,6 mm.

Ponadto zaplanowano, aby każdy obszar został ułożony w osobnej macierzy, w taki sposób, aby powstało 6 ngTMA zawierających różne obszary histologiczne: ngTMA zawierające tkanki z: a) centrum guza, b) frontu nacieku, c) obszarów pączkowania guza, d) tkanki prawidłowej, e) przerzutów do węzłów chłonnych oraz f) przerzutów do wątroby.

Dla projektu TMA z wykorzystaniem narzędzia o średnicy 0,6 mm wybrano optymalny odstęp 0,4 mm pomiędzy wycięciami. Ponieważ ocena punktów tkankowych w długich rzędach i kolumnach jest często uciążliwa, wybrano dwa różne układy. Dla bloków nowotworowych z 3 wycięciami na obszar tkanki stworzono projekt składający się z sześciu części. Przekłada się to na łączną liczbę 402 wycięć tkankowych. W przypadku wycięć z tkanek prawidłowych uwzględniono 2 wycięcia na przypadek. Wybrano układ mieszczący łącznie 432 wycięcia.

Ponadto, w każdym przypadku dodatkowo zostanie wycięte do 4 rdzeni o średnicy 0.6 mm i umieszczonych w probówkach 0.2 ml. Rdzenie tkankowe te zostaną również opisane.

Podsumowując, zostanie przygotowanych 6 ngTMA z różnych tkanek (5 macierzy nowotworowych x 3 wycięcia x 134 pacjentów; 1 macierz tkanek prawidłowych x 2 wycięcia x 134 pacjentów), a dodatkowo 4 rdzenie na pacjenta do probówek. Łącznie zostanie wykonanych 2814 adnotacji.

Następnie z archiwum preparatów pobiera się odpowiadające im skrawki barwione H&E od wybranych pacjentów. Każdy przypadek zostaje krótko zweryfikowany przez patologa i wyselekcjonowane zostają najbardziej reprezentatywne skrawki dla każdego typu tkanki.

Skanowanie

Tworzone są cyfrowe preparaty każdego przekroju histologicznego w celu późniejszej adnotacji. W niniejszym badaniu dla każdego przypadku należy zeskanować 3–4 preparaty tkankowe. t. j., pierwotny rak jelita grubego, z lub bez sąsiednich tkanek prawidłowych, przerzuty do węzłów chłonnych i przerzuty do wątroby oraz opcjonalnie dodatkowy preparat zawierający prawidłową błonę śluzową.

Do skanera slajdów można w pełni załadować do 10 różnych magazynów, co pozwala na zeskanowanie 250 slajdów w jednym cyklu. Czas skanowania oraz rozmiar cyfrowego slajdu zależą od wymiarów tkanki i pożądanego współczynnika jakości. Współczynnik jakości mieści się w zakresie od 0 do 100. W tym przypadku wybrano współczynnik jakości 60, ponieważ pozwala on uzyskać mniejszy rozmiar pliku skanowania bez zauważalnej utraty jakości obrazu. Małe biopsje można zeskanować w czasie krótszym niż 30 sec, natomiast całe przekroje tkankowe, takie jak te użyte w niniejszym przykładzie, mogą wymagać od 2 do 10 min. Rozmiar cyfrowego slajdu może wynosić od 2 MB do 2 GB. Przy zastosowaniu współczynnika jakości 60 powstają skany o rozmiarze od 600 MB do 1 GB.

Do realizacji tego projektu wymaganych jest od 402 do 536 slajdów, co łącznie daje 3 serie skanowania. Każda seria jest przeprowadzana przez noc. Potrzebna jest przestrzeń dyskowa o pojemności około 500 GB. Slajdy są skanowane bezpośrednio na platformę cyfrową o nazwie Case Center (ngtma.unibe.pathcasecenter). Case Center jest dostępna z każdego miejsca z dostępem do sieci po wprowadzeniu wyznaczonej nazwy użytkownika i hasła.

Adnotacja

Podczas adnotacji należy wziąć pod uwagę dwa aspekty: 1) różne obszary tkanek powinny otrzymać różne kolory adnotacji oraz 2) liczba adnotacji powinna odpowiadać liczbie pożądanych kopii końcowego ngTMA.

W tym przypadku dla pojedynczej kopii wybrano 3 punkty na obszar nowotworu. Dla 2 kopii każdy region musi zostać opisany za pomocą 6 punktów. Przydatne oznaczenia to: zielony dla tkanki prawidłowej, niebieski dla centrum guza, żółty dla frontu naciekania nowotworu, czerwony dla obszarów pączkowania nowotworu (oddziaływanie nowotwór/zręb), czarny dla przerzutów do węzłów chłonnych, turkusowy dla przerzutów odległych, a biały dla regionów przeznaczonych do pobrania materiału do probówek. Opisanie każdego przypadku zajmuje 2-3 min.

Konstrukcja ngTMA

Niniejsze badanie wymaga przygotowania 6 bloków ngTMA w 2 kopiach, co daje łącznie 12 końcowych bloków. Maksymalna liczba bloków odbiorczych, jaką może obsłużyć urządzenie do tworzenia macierzy (arrayer), wynosi 12. Każdy blok guza będzie zawierał 402 punktów tkankowych, a każdy blok tkanki prawidłowej 268 punktów, co daje łącznie 4 556 punktów w całym projekcie.

Dla każdego bloku biorcy tworzony jest układ TMA, a następnie projekt zostaje zapisany (Rysunki 6A, 6B). Do urządzenia do tworzenia macierzy tkankowych można równolegle załadować 60 bloków tkankowych; wykonuje się obraz każdego bloku dawcy. Zaczynając od pierwszego bloku dawcy, z systemu Case Center pobierany jest odpowiadający mu adnotowany preparat cyfrowy. Przeprowadzane jest dopasowanie preparatów, co może zająć od 1 do 3 min. Adnotacje zostają potwierdzone, a następnie uruchamia się proces wycinania rdzeni (Rysunek 7). Czas wycinania i przeniesienia rdzeni wynosi około 12 s. Strata rdzeni podczas tej procedury jest minimalna. Całkowity czas tworzenia macierzy dla tego projektu wynosi około 24 h, wliczając czas dopasowania preparatów do bloków oraz ponownego załadowania instrumentu. Przykłady ngTMA przedstawiono na Rysunku 8A. W tym samym czasie można wyciąć rdzenie do późniejszych analiz molekularnych (Rysunek 8B).

Rysunek 1. A) Blok „dawca”. Rdzenie z bloku dawcy są wycinane i przenoszone do B) bloku biorcy, czyli mikroarray tkankowego (TMA).

Rysunek 2. Konwencjonalny schemat pracy przy tworzeniu macierzy tkankowej (TMA). A) Preparaty histologiczne są pobierane z archiwum i B) przekazywane patologowi do oceny. C-D) Na preparatach nanosi się adnotacje wskazujące „szacowany” obszar do przeniesienia. E) Pobierane są odpowiadające im bloki tkankowe. F) Blok i preparat są porównywane w celu dopasowania, co G) czasami może być trudnym zadaniem. H-J) Następnie odbywa się proces tworzenia macierzy tkankowej. K) Rdzenie są wielokrotnie przenoszone i L) konstruowana jest końcowa macierz TMA.

Rycina 3. A) W każdym magazynku do skanowania można umieścić do 25 preparatów. B) Możliwa jest regulacja współczynnika jakości oraz rozmiaru. Postęp skanowania można monitorować.

Rycina 4. A) Zeskanowane preparaty można przesłać na platformę internetową Case Center. B) Możliwość przeglądania preparatów cyfrowych. Narzędzie do adnotacji TMA pozwala użytkownikowi wybrać rozmiar i kolor rdzenia wymagany do adnotacji. C) Adnotacje można nanosić bezpośrednio na cyfrowy preparat. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina 5. A) Do urządzenia do tworzenia mikromacierzy tkankowych można załadować do 60 bloków, mianowicie po 10 bloków dawców w rzędzie oraz 12 bloków biorców. B) Wykonuje się zdjęcie każdego bloku dawcy, a następnie pobiera cyfrowy preparat. Następuje dopasowanie bloku do preparatu, a adnotacje służą do wycinania rdzeni z bloków. C) Postęp tworzenia macierzy można monitorować podczas pracy urządzenia. D) Po zakończeniu wycinania generowany jest eksport lokalizacji każdego punktu w układzie oraz obraz każdego bloku dawcy z odpowiadającymi mu adnotacjami.

Rysunek 6. Te układy TMA zostały wykorzystane do rozmieszczenia A) bloków nowotworowych oraz B) tkanek prawidłowych.

Rycina 7. Zrzut ekranu oprogramowania do tworzenia macierzy tkankowej. Po lewej stronie w urządzeniu można umieścić 12 bloków odbiorczych. Na dole znajdują się obrazy każdego bloku dawcy. W centrum widoczny jest układ TMA, postęp wycinania oraz powiększone obrazy każdego bloku dawcy wraz z adnotacjami.

Rycina 8. A) Przykłady nowo utworzonych bloków ngTMA. B) Można pobrać dodatkowe wycinki tkanek do późniejszych analiz molekularnych. Rdzenie te są wycinane i umieszczane w probówkach 0.2 ml.

Rycina 9. Przykłady zastosowań biomarkerów w technice ngTMA. A) Barwienie immunohistochemiczne Ki67 w raku jelita grubego. Podwójne barwienie immunohistochemiczne HER2/in situ test hybrydyzacyjny wykazujący B) niska ekspresja białka (brązowy) i brak amplifikacji genu Her2 (czarny) w stosunku do centromeru (czerwony); C) wysoka ekspresja białka (brązowy) oraz amplifikacja genu Her2 (czarny) w stosunku do centromeru (czerwony). D) Chromogeniczny in situ hybrydyzacja Her2 wykazująca pojedyncze transkrypty mRNA w ngTMA raka piersi. E) Immunohistochemia CD8 w raku jelita grubego. F) Podwójne barwienie immunohistochemiczne dla markera pan-cytokeratyny AE1/AE3 (brązowy; komórki nowotworowe) oraz CD68 (czerwony; makrofagi) obrazujące mikrośrodowisko nowotworu w raku jelita grubego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

W niniejszym artykule przedstawiono protokół dla ngTMA. ngTMA to nowo opracowana koncepcja mikromacierzy tkankowej, obejmująca planowanie i projektowanie, patologię cyfrową i adnotację preparatów, a także zautomatyzowane mikromacierze tkanek¹².

W porównaniu z konwencjonalną mikromacierzą tkankową, ngTMA oferuje wiele zalet. W pierwszym kroku decydujące znaczenie ma faza planowania i projektowania. Nacisk kładziony jest na udzielenie odpowiedzi na ukierunkowane pytanie badawcze. Powinno to uwzględniać kwestie histologiczne (np. które regiony i ile miejsc chcę uwzględnić?), planowanie statystyczne (np. wielkość próby? W jaki sposób mogę później przeanalizować moje próbki?) oraz względy logistyczne (np. ile biomarkerów, a tym samym ile kopii ngTMA?). Specyficzny ngTMA jest tworzony z myślą o konkretnych potrzebach, niezależnie od tego, czy chodzi o badania przesiewowe biomarkerów i wysokoprzepustowość, czy też o badanie określonych aspektów histologicznych tylko w kilku dobrze wybranych przypadkach.

Jedną, jeśli nie najważniejszą, wadą konwencjonalnego mikromacierzania tkanek jest niska dokładność, z jaką wykonywane są oznaczenia na szkiełkach histologicznych. Badanie określonych struktur histologicznych, komórek lub regionów jest prawie niemożliwe. ngTMA pozwala na wysoką dokładność, ponieważ adnotacje są umieszczane bezpośrednio na slajdach cyfrowych. Dzięki temu badacz może precyzyjnie wybrać regiony do przebicia, w tym konkretne komórki. W tym przykładzie różne obszary w tym samym bloku tkankowym są wycinane w celu ułożenia w układ, takie jak centrum guza, front inwazji i obszary interakcji guz/zrąb, podkreślone obecnością małych skupisk komórek nowotworowych lub nawet pojedynczych komórek. Tę dokładność można osiągnąć tylko za pomocą ngTMA. Po trzecie, ponieważ preparaty są skanowane na internetową platformę cyfrową, przeglądanie slajdów i dodawanie adnotacji może odbywać się za pomocą komputera, a nie mikroskopu. Oprogramowanie do układania tkanek zapewnia przyjazny dla użytkownika interfejs o wysokim stopniu elastyczności, dzięki czemu można uzyskać różne układy i projekty ngTMA. Ponieważ konstrukcja TMA jest wykonywana automatycznie przez wiercenie, nie ma potrzeby praktycznego manewrowania, a czas budowy jest znacznie skrócony. Czas budowy TMA w tym przykładzie wynosi od 24 godzin. Stosując konwencjonalne podejście TMA i szacując 15 uderzeń na godzinę, projekt ten trwałby około 304 godzin.

ngTMA może być stosowany do badania ekspresji białek, mRNA lub DNA, a także ich kombinacji. Rysunek 9 ilustruje kilka z tych zastosowań w odniesieniu do potencjalnych biomarkerów. Standardowa immunohistochemia może być zastosowana do określenia wskaźnika proliferacji nowotworów przy użyciu Ki-67. Można zastosować połączone podejście do badania ekspresji białek i amplifikacji DNA dla genów takich jak HER2. Tkanki mogą być zbierane razem na jednym ngTMA w celu zmniejszenia kosztów, zużycia tkanek i innych zasobów. Ponadto można przeprowadzić chromogenną hybrydyzację mRNA in situ dla HER2 i innych genów w celu identyfikacji pojedynczych transkryptów mRNA w dużej liczbie przypadków przy użyciu minimalnej liczby szkiełek tkankowych. Immunohistochemię markerów immunologicznych, takich jak CD8, można uwidocznić w kontekście mikrośrodowiska guza. Podwójna immunohistochemia może być również wykorzystana do podkreślenia określonych obszarów zainteresowania, takich jak interakcje między komórkami odpornościowymi (oznaczonymi na czerwono) a komórkami nowotworowymi (oznaczonymi na brązowo) na froncie inwazji nowotworów. Taki obszar zainteresowania nie mógłby zostać uchwycony przy użyciu konwencjonalnej mikromacierzy tkankowej.

Niemniej jednak protokół ten zawiera pewne ograniczenia. Najważniejszym wyzwaniem jest nakładanie się na siebie bloku dawczego i szkiełka cyfrowego. Na ten krok może mieć wpływ kilka czynników. Po pierwsze, najnowsza sekcja z bloku powinna być używana do skanowania slajdów. W wielu przypadkach H&E nie jest ostatnim odcinkiem bloku dawczego, jest to raczej barwnik immunohistochemiczny lub inny. W takim przypadku można również użyć szkiełka barwiącego, o ile ostatnia plama zostanie zeskanowana i opatrzona adnotacjami lub należy wykonać nowy H&E. Należy również zachować ostrożność podczas wykonywania skrawków tkanek, ponieważ tkanki mogą rozszerzać się w kąpieli wodnej, co prowadzi do trudnego dopasowania szkiełka i bloku. Po drugie, w tej chwili projekty są ograniczone do 12 bloków TMA odbiorców przetwarzanych w jednym czasie. Większe projekty przekraczające 12 TMA muszą być przypisane do drugiej nazwy projektu. Po trzecie, bloki dawcze muszą być wykonane przy użyciu standardowych form i kaset, ponieważ instrument nie może dostosować się do różnych rozmiarów. Wreszcie, bloki donorowe muszą przekraczać minimalną wysokość (4 mm), aby uzyskać optymalne wiercenie. W niektórych przypadkach wymaga to ponownego osadzenia tkanek.

Setki publikacji z ostatnich kilku lat podkreślają, że TMA jest nieocenionym narzędziem do badań nad biomarkerami. TMA były używane do badania raka płuc¹³, jelita grubego⁷, piersi¹⁴, prostaty¹⁵, trzustki¹⁶, pęcherza moczowego¹⁷ i żołądka¹⁸ , żeby wymienić tylko kilka. Coraz większa liczba autorów łączy stosowanie TMA z analizą obrazu i poczyniono znaczne postępy w tym kierunku^19-21. Jednak poza kilkoma grupami badawczymi, które opublikowały innowacyjne pomysły TMA^22-24, niewiele uwagi poświęcono optymalizacji samej techniki TMA. Zautomatyzowane mikromacierze tkankowe, takie jak ATA-27 firmy Estigen/Beecher, zapewniają projektowanie układu oraz celowe i zautomatyzowane wykrawanie tkanek. Stanowi to jednak tylko 1 aspekt koncepcji ngTMA.

ngTMA jest znaczącym ulepszeniem w porównaniu z konwencjonalnymi technikami mikromacierzowania tkanek. Łączy w sobie wiedzę z zakresu histologii i projektowania TMA z elastycznością patologii cyfrowej i precyzją adnotacji cyfrowych z szybkością i niezawodnością zautomatyzowanej budowy TMA. Połączenie ngTMA i analizy obrazu w celu oceny biomarkerów białkowych i molekularnych będzie potężnym narzędziem do dalszej poprawy jakości badań klinicznych i translacyjnych w przyszłości.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pannoramic 250 Flash II	3DHistech		Skaner slajdów
TMA Grandmaster	3DHistech		Tissue Microarrayer
Pannoramic Viewer	3DHistech	darmowe	oprogramowanie do przeglądania slajdów
Centrum przypadków	3DHistech		Cyfrowa platforma slajdów