Ekspresja białek rekombinowanych w biologii strukturalnej w komórkach zawiesinowych HEK 293F: nowatorskie i dostępne podejście

Podsumowanie

Ekspresja białek rekombinowanych przez systemy ssaków staje się atrakcyjną metodą wytwarzania kompleksów białkowych dla biologii strukturalnej. W tym artykule przedstawiamy prosty, ale bardzo wydajny system ekspresji wykorzystujący hodowane w zawiesinie komórki ssaków do oczyszczania kompleksów białkowych do badań strukturalnych.

Streszczenie

Ekspresja i oczyszczanie dużych ilości rekombinowanych kompleksów białkowych jest podstawowym wymogiem dla badań biologii strukturalnej. Przez ponad dwie dekady prokariotyczne systemy ekspresji, takie jak E. coli, zdominowały literaturę naukową w stosunku do kosztownych i mniej wydajnych eukariotycznych linii komórkowych. Pomimo wyraźnej przewagi pod względem wydajności i kosztów ekspresji białek rekombinowanych w bakteriach, brak specyficznych kofaktorów, białek opiekuńczych i modyfikacji potranslacyjnych może powodować utratę funkcji, nieprawidłowe fałdowanie i może zakłócać interakcje białko-białko niektórych eukariotycznych kompleksów wielocząsteczkowych, receptorów powierzchniowych i wydzielanych białek. Zastosowanie systemów ekspresji komórek ssaków może rozwiązać te problemy, ponieważ zapewniają one eukariotyczne środowisko ekspresji. Jednak niska wydajność białka i wysokie koszty takich metod do niedawna ograniczały ich zastosowanie w biologii strukturalnej. Tutaj opisujemy prostą i dostępną metodę ekspresji i oczyszczania miligramowych ilości białka poprzez wykonywanie przejściowych transfekcji hodowanych w zawiesinie komórek HEK (Human Embryonic Kidney) 293F.

Wprowadzenie

Szybki postęp molekularnej biologii komórki i ciągłe zapotrzebowanie na ulepszone leki w medycynie stworzyły potrzebę dla biologów strukturalnych, aby przyglądać się coraz bardziej złożonym strukturom białkowym. Mogą one często wymagać szczególnych modyfikacji potranslacyjnych, molekularnych białek opiekuńczych i kofaktorów, aby wspierać ich skomplikowane fałdowanie i aktywność enzymatyczną. Podczas gdy zdecydowana większość struktur obecnych w Banku Danych o Białkach została uzyskana przy użyciu bakteryjnych systemów ekspresji, prokariota nie są w stanie przeprowadzić dużej liczby tych modyfikacji i brakuje im wielu niezbędnych kofaktorów eukariotycznych. Może to stanowić problem w badaniach dużych kompleksów wielopodjednostkowych, które są aktywowane przez małe cząsteczki sygnałowe, a także w przypadku białek jądrowych, powierzchniowych i wydzielanych komórek, które wymagają skomplikowanych mechanizmów fałdowania. Wiele szczepów E. coli zostało zaprojektowanych w celu przezwyciężenia niektórych z tych ograniczeń¹. Jednak w ostatnich latach zastosowanie systemów ekspresji ssaków rośnie, ponieważ niezawodnie wytwarzają one białka eukariotyczne, których ekspresja w innym przypadku byłaby problematyczna w innych układach². Obecnie możliwe jest uzyskanie stabilnych i przejściowych linii ekspresyjnych komórek ssaków za pomocą różnych technik, które obejmują transdukcję wirusa po transfekcję za pośrednictwem substancji chemicznych, fizyczny transfer genów, taki jak elektroporacja i bezpośrednia iniekcja³. Chociaż wszystkie te metody mają swój własny zestaw zalet i wad, tylko kilka z nich nadaje się do badań strukturalnych, które są albo zbyt drogie, albo czasochłonne.

Tutaj opisujemy bardzo prostą, szybką, niedrogą, a jednocześnie wysoce efektywną metodę ekspresji kompleksów białkowych dla biologii strukturalnej w zawieszonych komórkach ssaków. Podejście to wykorzystuje przejściową kotransfekcję linii komórkowej ludzkiego embrionalnego nerki (HEK) (np. komórek Freestyle HEK 293F). Komórki te pochodzą z linii komórkowej HEK 293, są przystosowane do wzrostu w kulturach zawiesinowych, osiągając wysokie gęstości przy użyciu pożywek bez surowicy (takich jak FreeStyle 293 Expression Medium). Komórki są następnie przejściowo transfekowane przy użyciu rozgałęzionej wersji polietylenininy (PEI), niedrogiego odczynnika polimerowego, który, jak doniesiono, działa dla szerokiego zakresu komórek ssaków⁴ poprzez tworzenie kompleksów DNA/PEI, które dostają się do komórki gospodarza przez endocytozę⁵. Metoda ta nadaje się zarówno do eksperymentów na małą skalę (30 ml), jak i na dużą skalę (do 300 ml) i może wytwarzać wysokie poziomy oczyszczonych kompleksów białkowych. Jest to szczególnie przydatne do badania białek, które wymagają złożonych mechanizmów fałdowania, kofaktorów lub szczególnych modyfikacji potranslacyjnych, których nie mogą przeprowadzić komórki bakterii, drożdży i owadów.

W tym protokole prezentujemy ekspresję i oczyszczanie centralnego rusztowania trójbiałkowego z kompleksu represji transkrypcyjnej Sin3A. Składa się on z deacetylazy histonowej 1 (HDAC1), tłumika wadliwego wyciszenia 3 (SDS3) i niezależnego od przełącznika 3 (Sin3A). Oczyszczony kompleks służy do wysokoprzepustowych prób krystalizacji.

Protokół

UWAGA: Protokół jest odpowiedni dla każdej skali ekspresji, dlatego objętości i ilości odczynników powinny być skalowane proporcjonalnie. Dla tego protokołu należy użyć odpowiedniego wektora ekspresji ssaków. Tutaj użyliśmy zmodyfikowanego wektora ekspresji pcDNA 3.1, który wygodnie umożliwia włączenie lub wykluczenie znacznika powinowactwa w zależności od wyboru enzymów restrykcyjnych użytych w klonowaniu (ryc. 1). Poniższy protokół opisuje transfekcję na dużą skalę.

1. Hodowla na dużą skalę/transfekcja w 1 litrowych butelkach rolkowych

Hoduj i utrzymuj HEK293F komórki przystosowane do zawiesiny zgodnie ze standardowymi protokołami. Zazwyczaj kultury starterowe o pojemności od 30 do 100 ml są hodowane w stożkowych kolbach do hodowli komórkowych o pojemności 250 ml.

1. Komórki nasienne w proporcji 0,5 x 10⁶ komórek/ml do końcowej objętości 300 ml w każdej butelce rolkowej o pojemności 1 l.
   UWAGA: Butelki rolkowe mieszczą od minimum 150 ml do maksimum 300 ml kultury zawiesiny. W przypadku transfekcji na większą skalę użyj wielu butelek.
2. Inkubować przez 24 godziny w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną w temperaturze 37 °C, 120 obr./min i 5% CO_{2 do} momentu, aż komórki osiągną gęstość 1,0 x 10⁶ komórek/ml (komórki powinny dzielić się mniej więcej co 24 godziny).
3. Odpipetować łącznie 300 μg wysterylizowanego przez filtr DNA (patrz metoda uzupełniająca) do 30 ml PBS i energicznie wirować przez 3 sek.
   UWAGA: Użyj łącznie 1 μg DNA na milion transfekowanych komórek. Jeśli dwa lub więcej plazmidów ma być jednocześnie transfekowanych, zmniejsz ilość każdego z nich, tak aby stosunek DNA do komórek pozostał stały.
4. Dodać 1,2 ml 0,5 mg/ml wysterylizowanego przez filtr PEI do roztworu PBS/DNA i energicznie wirować przez 3 sekundy.
5. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
6. Dodaj mieszaninę DNA/PEI do komórek – które powinny mieć gęstość 1 x 10⁶ komórek/ml (krok 1.3).
7. Po kotransfekcji inkubować komórki w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną przez kolejne 48 godzin w temperaturze 37 °C, 120 obr./min i 5% CO₂ .
8. Białka wewnątrzkomórkowe należy zbierać przez odwirowywanie komórek przy 3 000 x g przez 5 minut i przechowywać osad w temperaturze -80 °C.
   UWAGA: Alternatywnie należy użyć standardowego inkubatora z wytrząsaniem (bez emisji_CO2), jeśli atmosfera powyżej kultury zostanie zastąpiona 5% CO₂ i pokrywka butelki jest szczelnie zamknięta. Atmosfera będzie musiała być wymieniana przy każdym przejściu (zwykle co 2 dni).

2. Oczyszczanie kompleksu białkowego z ekstraktu z całych komórek

Ten protokół jest zoptymalizowany do oczyszczania kompleksów jądrowych za pomocą białek oznaczonych flagą.

1. Rozmrozić osad komórkowy w ~ 40 ml wstępnie schłodzonego buforu do lizy (100 mM octanu potasu, 50 mM Tris pH 7,5, 5% glicerolu, 0,3% Triton X-100, inhibitory proteazy) na L hodowli.
2. Ponownie zawiesić granulkę, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół (aby uniknąć pienienia, nie wirować).
3. Dokładnie ponownie zawiesić komórki za pomocą homogenizatora szklanego. Sonikuj przez 3 cykle (15 sekund włączenia, 15 sekund wyłączenia). Wirować przy 30 000 x g przez 25 minut w temperaturze 4ºC i zachować supernatant.
4. Zrównoważyć 1,25 ml żywicy agarozowej upakowanej przeciw flagom na litr kultury, przemłukując trzykrotnie buforem równoważącym żywicę (100 mM octanu potasu, 50 mM Tris pH 7,5).
5. Inkubować ekstrakt z całych komórek z etapu 2.3 z żywicą powinowactwa w jednej lub kilku probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml i delikatnie obracać próbkę przez 30-120 minut w temperaturze 4 °C.
6. Odwirować przy 3 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant.
7. Przemyć żywicę 45 ml wstępnie schłodzonego buforu 1 (100 mM octanu potasu, 50 mM Tris pH 7,5, 5% glicerolu, 0,3% Triton X-100). Odwirować przy 3 000 x g przez 1 minutę i odrzucić supernatant.
8. Powtórz krok 2.7 używając buforu o wysokiej zawartości soli (300 mM octanu potasu, 50 mM Tris pH 7,5, 5% glicerolu), a następnie buforu o niskiej zawartości soli (50 mM octanu potasu, 50 mM Tris pH 7,5, 5% glicerolu) i buforu rozszczepiającego TEV (50 mM octanu potasu, 50 mM Tris pH 7,5, 0,5 mM TCEP).
   UWAGA: Upewnij się, że każde pranie jest krótkie, tj. wystarczające do całkowitego ponownego zawieszenia żywicy i nie dłużej.
9. Zebrać 10 μl próbki żywicy i rozcieńczyć w 1 objętości 2x buforu ładującego białko do analizy (kontrola białka związanego). Nie należy stosować środków redukujących, aby uniknąć uwolnienia przeciwciała z żywicy.
10. Ponownie zawiesić żywicę w 8-10 ml wstępnie schłodzonego buforu rozszczepiającego TEV i przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
11. Dodać ~40 μg proteazy TEV (z zapasu w dawce 1 mg/ml) na litr oryginalnej kultury i dobrze wymieszać, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół.
12. Zastąp atmosferę rurki gazem 100% N₂, aby zapobiec utlenianiu białek.
13. Delikatnie obrócić O/N w temperaturze 4ºC.
14. Wirować przy 3 000 x g przez 10 minut. Przenieść supernatant do ultrafiltra odśrodkowego z odpowiednią granicą masy cząsteczkowej i zagęścić do 500 μl.
15. Zebrać 10 μl próbki skoncentrowanego białka i rozcieńczyć w 1 objętości 2x buforu ładującego białko do analizy. (kontrola eluatu TEV).
16. Zebrać 10 μl próbki żywicy i rozcieńczyć w 1 objętości 2x buforu ładującego białko do analizy. Nie należy stosować środków redukujących, aby uniknąć uwalniania dużych ilości przeciwciał z żywicy. (kontrola żywicy po TEV).
17. Zrównoważyć kolumnę chromatograficzną wykluczającą wielkość z żelowym buforem filtracyjnym (50 mM octan potasu, 50 mM Tris pH 7,5, 0,5 mM TCEP).
18. Przefiltruj białko przez filtr 0,22 μm
19. Załaduj próbkę do kolumny i zbierz frakcje.
20. Pobrać próbki z kroków 2.9, 2.15 i 2.16 oraz frakcje filtracji żelu z kroku 2.19 na SDS-PAGE i barwieniu Coomassie w celu analizy.
    UWAGA: Zaleca się przeprowadzenie SDS-PAGE próbek z kroków 2.9, 2.15 i 2.16 przed filtracją żelową w celu potwierdzenia ekspresji białka docelowego.

Wyniki

Tutaj pokazujemy przejściową kotransfekcję i oczyszczanie trójskładnikowego kompleksu HDAC1, SDS3, Sin3A o pojemności 2 litrów (8 x 250 ml). HDAC1 i SDS3 oddziałują z Sin3A poprzez domenę interakcji HDAC (HID) Sin3A. Typowe oczyszczanie daje do 1 mg kompleksu na litr kultury.

Rysunek 1. Schemat zmodyfikowanego wektora ekspresji pcDNA 3.1. Plazmid trawiono za pomocą EcoRV i EcoRI w celu uwzględnienia znacznika powinowactwa i miejsca rozszczepienia TEV na końcu aminowym Sin3A. Aby sklonować nieoznakowane wersje HDAC1 i SDS3, wektor został przetworzony za pomocą KpnI i EcoRI.

Rysunek 2. SDS-PAGE pokazująca pierwszy etap oczyszczania. Pas "związanego białka" pokazuje kompleks związany z żywicą powinowactwa. Po trawieniu TEV znacznik obecny na Sin3A-HID jest odcinany, a kompleks jest eluowany z żywicy, jak pokazano na drugim i trzecim pasie żelu.

Rysunek 3. Chromatogram kompleksu białkowego oczyszczonego za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar. Zauważ, że czysty kompleks eluuje się w pustej objętości, ponieważ tworzy dimer w roztworze.

Rysunek 4. SDS-PAGE przedstawiające frakcje filtracji żelowej pokazane na rysunku 3.

Rysunek 5. Trypanowe komórki HEK 293F barwione na niebiesko o wymiarach 2,3x10⁶ komórek/ml gotowe do transfekcji. Komórki powinny być obecne tylko jako pojedyncze lub dzielące się komórki, podczas gdy duże skupiska mogą zostać rozbite przez energiczne wirowanie przez około 25 sekund.

problem	Możliwe przyczyny	akcja
Niska wydajność białka.	Mała liczba transfekowanych komórek.	Upewnij się, że gęstość komórek wynosi około 1,0 x 106 przed dodaniem mieszaniny reakcji transfekcji do hodowli.
	Komórki mogły być subhodowane zbyt wiele razy.	Użyć świeżych komórek wyjściowych po około 90 przejściach.
	DNA może być zdegradowane lub zawierać dużą ilość zanieczyszczeń.	Upewnij się, że używany plazmidowy DNA ma stosunek 260/280 między 1,8 a 2,0. Wskazane jest przeprowadzenie DNA na żelu agarozowym, aby ocenić jego jakość.
	Białka poddawane ekspresji nie są wystarczająco stabilne lub rozpuszczalne.	Przetestuj różne konstrukcje w małej skali przed zwiększeniem skali transfekcji. Upewnij się, że znaczniki nie ingerują w strukturę białka (białek) będących przedmiotem zainteresowania.
Komórki wyglądają na mętne i mają nietypowy kolor i/lub zapach.	Komórki są zakażone bakteriami lub drożdżami.	Przez cały czas należy stosować dobrą sterylną technikę. Fumigacja okapów z przepływem laminarnym i dezynfekcja UV pomieszczenia do hodowli komórkowych w przypadku infekcji pomaga w opanowaniu problemu.
Komórki mają niską żywotność.	Niewłaściwe pH w pożywce.	Upewnij się, że kultury są uprawiane z zawartością 5-8% CO2 przez cały czas.
	Komórki hodowano do gęstości ponad 3,0x106 komórek/ml.	Komórki nie powinny być hodowane do gęstości powyżej 2,5 x 106 komórek/ml bezpośrednio przed transfekcją i nigdy powyżej 3,0 x 106 komórek/ml.
Oczyszczanie powinowactwa nie zadziałało	Białko(y) nie ulega ekspresji.	Patrz wyżej.
	Warunki oczyszczania mogą być nieprawidłowe.	Dostosuj warunki buforowe (np. wysoka sól, niska sól, pH)

Tabela 1. Rozwiązywanie problemów.

system	Zalety	Wady
Bakteria E. coli	System szybkiego odciągania pokarmu Wysoka wydajność białka tani Nadaje się do niedrogiej produkcji białek znakowanych izotopowo	Brak ważnych białek opiekuńczych, które mogą być potrzebne do fałdowania białek Brak wielu modyfikacji potranslacyjnych Może brakować kofaktorów, które są ważne dla funkcji białka i/lub złożonego składania.
P. pastoris	Może wykonywać większość modyfikacji potranslacyjnych tani	Brak niektórych modyfikacji potranslacyjnych Może brakować kofaktorów, które są ważne dla funkcji białka i/lub złożonego składania.
Ekspresja bakulowirusa w komórkach owadów	Może wykonywać wszystkie modyfikacje potranslacyjne Bakulowirus jest mniej cytotoksyczny niż inne szczepy wirusa	Przygotowanie wirusa do transdukcji jest czasochłonne Wirus nie jest stabilny i nie może być przechowywany przez długi czas Komórkom owadów może brakować kofaktorów, które są ważne dla funkcji białka i/lub złożonego składania.
Bioreaktory z systemami ssaków	Może wykonywać wszystkie modyfikacje potranslacyjne Może dostarczyć wszystkie kofaktory potrzebne do funkcjonowania białek i złożonego składania Może hodować komórki o bardzo dużej gęstości Może wyrażać wszystkie białka ssaków, które wymagają skomplikowanych maszyn do składania Bardzo wysoka wydajność białka	Wymaga wyspecjalizowanego personelu do obsługi bioreaktora. Wymagany jest drogi sprzęt. Optymalizacja warunków wyrażeń może być czasochłonna.
Ogniwa zawieszenia HEK 293F	Może wykonywać wszystkie modyfikacje potranslacyjne Może dostarczyć wszystkie kofaktory potrzebne do funkcjonowania białek i złożonego składania Może wyrażać wszystkie białka ssaków, które wymagają skomplikowanej maszyny do składania Szybki i intuicyjny protokół transfekcji Stosunkowo niedrogie w porównaniu z bioreaktorami i/lub innymi dostępnymi na rynku odczynnikami do transfekcji.	Chociaż niedrogie, nie tak tanie jak ekspresja w bakteriach

Tabela 2. Zalety i wady głównych systemów ekspresji.

Dyskusja

Opracowaliśmy prostą i opłacalną metodę (PEI kosztuje znacznie mniej niż dostępne na rynku odczynniki do transfekcji lipofilowej) do ekspresji i oczyszczania dużych ilości rekombinowanych białek i kompleksów wielopodjednostkowych z komórek ssaków. Optymalna wydajność transfekcji i ekspresji może zostać osiągnięta, jeśli wysoce czyste plazmidowe DNA (260/280 między 1,8 a 2,0) jest używane w połączeniu z PEI, jak opisano w sekcji protokołu. Komórki muszą być hodowane w pożywkach wolnych od surowicy i antybiotyków, dlatego bezwzględnie wymagana jest sterylna technika pasażowania i transfekcji komórek, aby uniknąć kosztownych i czasochłonnych infekcji. Żywotność komórek powinna wynosić 90% lub więcej, a kultury nie powinny być hodowane do gęstości większej niż 2,5 x 10⁶ komórek/ml bezpośrednio przed transfekcją, ponieważ zmniejszy to wydajność białka. Aby transfekcja zakończyła się sukcesem, hodowle powinny zawierać tylko pojedyncze lub dzielące się komórki. Gromady mogą być rozbijane przez energiczne wirowanie w ciągu 20 do 30 sekund (ryc. 5). Stosunek każdego plazmidu użytego w kotransfekcji może być zmieniany przez użytkownika w zależności od stechiometrii badanego kompleksu. Wydajność odciągania można zoptymalizować dla białka będącego przedmiotem zainteresowania, dzięki czemu można ustalić odpowiedni czas odciągania. Oczyszczanie powinno być przeprowadzane w niskiej temperaturze próbki białka przez cały czas, aby zmniejszyć ryzyko niepożądanej degradacji proteolitycznej. Wybór znaczników i oczyszczających ma kluczowe znaczenie, ponieważ mogą one zakłócać działanie elementów strukturalnych lub miejsc aktywnych niektórych białek, często powodując zmniejszoną rozpuszczalność i/lub utratę aktywności enzymatycznej. Transfekcje na małą skalę są szczególnie przydatne do testowania różnych konstruktów do oczyszczania dużych kompleksów białkowych.

Obecnie dostępnych jest wiele różnych alternatywnych metodologii ekspresji rekombinowanych białek eukariotycznych (Tabela 2). Na przykład ekspresja bakulowirusa w komórkach owadów jest szeroko stosowana ze względu na jego wysoką skuteczność transdukcji i brak cytotoksyczności w porównaniu z innymi gatunkami wirusów⁶. Jednak proces wytwarzania wirusa jest czasochłonny, a jego niestabilność nie pozwala na przechowywanie wirusa przez długi czas. Z drugiej strony, systemy ekspresji drożdży oferują możliwość hodowania komórek do bardzo dużych gęstości w kulturach fermentorowych, co skutkuje wysoką wydajnością białka⁷. Wciąż jednak brakuje im pełnej gamy modyfikacji potranslacyjnych wymaganych do prawidłowego fałdowania białek eukariotycznych i interakcji ze swoimi partnerami białkowymi. Na przykład HDAC3 ulega ekspresji, ale nie fałduje się w E. coli. Jednak po ekspresji w komórkach 293F byliśmy w stanie oczyścić aktywny enzym w kompleksie z jego korepresorem (SMRT) i cząsteczką tetrafosforanu inozytolu (IP4)⁸, którego nie ma w komórkach prokariotycznych. Metoda ta pozwoliła nam również oczyścić i rozwiązać strukturę krystaliczną HDAC1 oddziałującą z MTA1 w kompleksie NuRD, który jest podobnie aktywowany przez IP4⁹. Idealnie byłoby, gdybyśmy zawsze chcieli mieć ekspresję białek eukariotycznych w ich naturalnym, fizjologicznym środowisku. Opisano systemy ekspresji ssaków wykorzystujące komórki HEK 293-EBNA1 w bioreaktorach^10-12 , które dają bardzo wysokie poziomy białka, ale ich użycie może być skomplikowane.

Nasza metoda jest prostą i dostępną alternatywą dla ekspresji w systemach bakterii, drożdży i bioreaktorów. Metoda odciągania jest szybka i nie wymaga użycia drogiego sprzętu, szczególnie jeśli atmosfera w butelce rolkowej lub kolbie zostanie zastąpiona 5% CO₂ i stosowane są standardowe inkubatory z wytrząsaniem. Wykorzystaliśmy te protokoły do jednoczesnej transfekcji wielu plazmidów i oczyszczania kompleksów z maksymalnie pięcioma białkami z wydajnością >1 mg / L hodowli. Co ciekawe, system pomaga w identyfikacji stabilnych, dobrze zachowujących się kompleksów. Na przykład ekspresja binarnego kompleksu HDAC1 i Sin3A dała ograniczoną wydajność białka, ale dodanie SDS3 spowodowało 5-krotnie większe ilości, a zatem prowadzi biologa strukturalnego w wyborze odpowiednich konstruktów i stabilnych kompleksów do krystalizacji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ogniwa FreeStyle HEK 293F	LifeTechnologies	R790-07
FreeStyle 293 Expression Medium	LifeTechnologies	12338-018
Anti-FLAG M2 Affinity Gel	SIGMA	A220
250 ml Kolba Erlenmeyera z wentylowaną nakrętką	Corning	431144
Butelki rolkowe z wentylowanymi	nakrętkami Corning	01836-02
Polietyleninina, 25 kDa, rozgałęziona	Sigma-Aldrich	408727	Zrobić zapasy 0,5 mg/ml w H2O, dostosować pH do 7,0 za pomocą rozcieńczonego HCl i przechowywać w temperaturze -20 - 4º C
			ekspresji ssaków
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)	Sigma-Aldrich	D8537
0,22 &mikro; m Filtry odśrodkowe	Amicon	UFC30GV00
15 ml Ultra filtry odśrodkowe (10 kDa odcięcie)	Amicon	UFC901008
Superdex  10/300 GL	GE Healthcare Nauki Przyrodnicze	17-5175-01