Model in vitro do badania patofizjologii komórkowej w leukodystrofii komórek globoidalnych

Summary

Komórki globoidalne są charakterystyczną cechą patologiczną choroby Krabbego, leukodystrofii, która obecnie nie ma skutecznej długoterminowej terapii. Opracowaliśmy model hodowli komórkowej w celu zbadania wrodzonej biologii i potencjału chorobotwórczego aktywowanego mikrogleju oraz jego transformacji w komórki globoidalne.

Abstract

Dokładna funkcja wielojądrowego mikrogleju, zwanego komórkami globoidalnymi, które są wyjątkowo obfite w ośrodkowym układzie nerwowym leukodystrofii komórek globoidalnych (GLD), jest niejasna. Ta luka w wiedzy została utrudniona przez brak odpowiedniego modelu badań in vitro. W niniejszym artykule opisujemy pierwotny mysi system hodowli glejowej, w którym leczenie psychozyną powoduje wielojądrowość mikrogleju przypominającą charakterystyczne komórki globoidalne występujące w GLD. Korzystając z tego nowatorskiego systemu, określiliśmy warunki i tryby analizy do badania komórek globoidalnych. Potencjalne zastosowanie tego systemu modelowego zostało potwierdzone w naszym poprzednim badaniu, w którym zidentyfikowano potencjalną rolę metaloproteinazy macierzy (MMP)-3 w GLD. Ten nowatorski system in vitro może być użytecznym modelem do badania powstawania i funkcjonowania, ale także potencjalnej manipulacji terapeutycznej tych unikalnych komórek.

Introduction

Leukodystrofia globoidalnokomórkowa (GLD), znana również jako choroba Krabbego, jest śmiertelną chorobą demielinizacyjną wynikającą z mutacji powodujących utratę funkcji w genie¹ galatocerebrozydazy (galc). Najbardziej rozpowszechnioną postacią GLD jest wariant dziecięcy, który charakteryzuje się początkiem we wczesnym dzieciństwie i charakteryzuje się agresywnym klinicznym przebiegiem pogorszenia funkcji motorycznych i poznawczych, prowadzącym do przedwczesnej śmierci, często przed piątym^{rokiem życia}. Badania genetyczne służą do weryfikacji diagnozy GLD⁴. Neuropatologia GLD ujawnia rozległą demielinizację, atrofię neuronów, astroglejozę i obecność nabrzmiałych wielojądrzastych mikrogleju zwanych komórkami globoidalnymi^5-7. Identyfikacja komórek globoidalnych, często zawierających kanalikowe inkluzje w swojej cytoplazmie, była cechą definiującą GLD przez ostatnie 97 lat, chociaż specyficzna funkcja tych rzucających się w oczy komórek pozostawała nieuchwytna.

Udział niemielinizującego gleju (mikrogleju i astrocytów) w patogenezie GLD od dawna uważany jest za wtórną odpowiedź na głęboką demielinizację w tej chorobie⁸. Co ciekawe, pierwszy opis tej choroby, dokonany przez Knuda Krabbego w 1916^roku5, donosił o tworzeniu się wielojądrowych fagocytów zawierających resztki lipidów, które zostały nazwane "komórkami globoidalnymi" i są cechą charakterystyczną tej choroby.

Komórki globoidalne są cechą charakterystyczną patologii GLD, chociaż ich rola w GLD jest od dawna ignorowana. Co ciekawe, komórki te są jednymi z najwcześniejszych charakterystycznych zmian w tkance OUN GLD. Ten brak wiedzy mógł wynikać z założenia, że tworzenie się wielojądrowych fagocytów, zwanych w innych chorobach komórkami olbrzymimi, jest zwykle uważane za konsekwencję patologii, a nie początkową patogenną siłę napędową⁹. Dlatego przeprowadzono niewiele badań badających mechanizm, w wyniku którego komórki globoidalne są tworzone z fagocytów, szczególnie w OUN GLD. Procedura opisana w tym raporcie koncentruje się na znaczeniu tworzenia komórek globoidalnych w OUN i naszym poprzednim wykazaniu, że indukowana psychozyną wielojądrowość mikrogleju in vitro i te komórki wykazywały wyższy poziom aktywności fagocytarnej. Zgodnie z tymi obserwacjami, komórki globoidalne w mózgach drgających często zawierają PAS-dodatnie szczątki, co sugeruje wysoki poziom aktywności fagocytarnej. Stwierdzono również, że komórki globoidalne są immunododatnie pod względem ferrytyny (markera mikrogleju)¹⁰, KP-1/CD68 (markera monocytów), a niektóre są również dodatnie pod względem wimentyny (pośredniego białka filamentu i markera astrocytów i aktywowanego mikrogleju)¹¹, HLA-DRa (receptor powierzchniowy MHCII) oraz TNF-α⁷ i Iba-1 (białko wiążące wapń używane do identyfikacji mikrogleju)¹². Opierając się na tym zbiorze markerów, komórki globoidalne pochodzą z mikrogleju, który rozwija unikalny fenotyp.

Pomimo ich unikalności, specyficzna funkcja i wkład GC w patogenezę GLD zostały w dużej mierze przeoczone. Uważa się, że komórki globoidalne są wtórną konsekwencją przewlekłej demielinizacji. Jednak wcześniejsze badania badające czasowy związek komórek globoidalnych z patologią istoty białej GLD zidentyfikowały obecność komórek globoidalnych w późnym okresie embrionalnym do wczesnego okresu posturodzeniowego; czasy poprzedzające apoptozę oligodendrocytów i jawną demielinizację¹³. Tak więc sekwencja czasowa rozwoju neuropatologii w GLD sugeruje, że komórki globoidalne powstają przed demielinizacją w tej chorobie¹⁴. Doprowadziło to do naszej hipotezy, że wczesne tworzenie się komórek globoidalnych w GLD może reprezentować definiujące zdarzenie patogenne, a nie wtórną, reaktywną odpowiedź na uszkodzenie oligodendrocytów¹⁵. Ponadto rozregulowanie aktywności mikrogleju w GLD zostało uznane za czynnik ograniczający długoterminową skuteczność terapii hematopeotycznych komórkami macierzystymi w leczeniu tej choroby¹⁶. W związku z tym oczekuje się, że badanie funkcji komórkowych i regulacji mikrogleju i komórek globoidalnych w odpowiedzi na psychozynę dostarczy nowych informacji na temat patogenezy GLD.

Do niedawna brak odpowiedniego modelu, w którym można by badać powstawanie komórek globoidalnych, ograniczał zrozumienie dokładnej funkcji i udziału tych komórek w patologii GLD. W ostatnich badaniach ustalono, że komórki podobne do globoidalnych mogą powstawać w bezpośredniej odpowiedzi na psychozynę, patogenną toksynę lipidową, która gromadzi się w GLD. Odkryliśmy, że mikroglej, ale nie makrofagi, są aktywowane i przekształcane w komórki globoidalne w pierwotnych hodowlach gleju w odpowiedzi na psychozynę¹⁵. Stwierdzono, że w tej transformacji w komórki globoidalne pośredniczy proteaza zewnątrzkomórkowa, metaloproteinaza macierzy (MMP)-3¹⁵. Niedawno rozszerzyliśmy te odkrycia i ustaliliśmy, że aktywowane psychozyną komórki mikrogleju i globoidalne rozwinięte w tym systemie modelowym in vitro są silnie toksyczne dla oligodendrocytów i komórek progenitorowych oligodendrocytów. W związku z tym, rozważając w kontekście GLD, wczesna akumulacja psychozyny i tworzenie komórek globoidalnych przed demielinizacją potwierdzałoby wyłaniającą się pierwotną i prawdopodobnie patogenną rolę mikrogleju w tej chorobie.

Proponujemy, że badanie tworzenia komórek globoidalnych ujawni nowe informacje na temat patogenezy GLD, które przyczynią się do naszego zrozumienia tej choroby. Co więcej, ten nowy model komórkowy GLD może zapewnić nowy format, na podstawie którego można testować nowatorskie podejścia terapeutyczne w celu przeciwdziałania patologicznym zmianom w tej chorobie. W związku z tym w niniejszym raporcie przedstawiamy szczegółowy protokół rozwoju in vitro komórek globoidalnych indukowanych psychozyną z pierwotnych kultur gleju niemielinizacyjnego.

Protocol

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z Polityką Humanitarnej Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych określonymi przez Biuro Dobrostanu Zwierząt Laboratoryjnych (NIH) i tylko za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Centrum Zdrowia Uniwersytetu Connecticut.

1. Przygotowanie mieszanych kultur glejowych

1. Wysterylizuj wszystkie narzędzia przed użyciem. Dodaj 3 ml lodowatego sterylnego zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) niezawierającego kationów (Mg²⁺ lub Ca²⁺) do trzech sterylnych 60 mm szalek Petriego utrzymywanych na lodzie, aby utrzymać niską temperaturę.
2. Wyizoluj korę od pourodzeniowych szczeniąt myszy P0-P2, jak opisano wcześniej^17,18.
   UWAGA: Struktury podkorowe, takie jak hipokampy, nie są uwzględnione w tych kulturach.
3. Ostrożnie usuń opony mózgowe, a następnie przenieś izolowaną korę do świeżego HBSS i zdysocjuj tkanki enzymatycznie, używając zestawu do preparowania tkanek nerwowych zgodnie z protokołem producenta.
4. Umieść komórki w sterylnych kolbach T-175 i inkubuj przez noc w pożywce [zmodyfikowana pożywka orła (DMEM) firmy Dulbecco z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) zawierającą 1x penicylinę/streptomycynę].
5. Wymień wszystkie nośniki następnego dnia na świeże. Kontynuuj inkubację kultur, z regularną zmianą pożywki, przez około 3 tygodnie lub do momentu powstania monowarstwy komórkowej.
   UWAGA: Ta monowarstwa będzie składać się z astrocytów i mikrogleju w stosunku około 10:1¹⁹.

2. Indukcja komórek globoidalnych w mieszanych kulturach glejowych

1. Przygotować szkiełka nakrywkowe z powłoką ECM.
   1. Okrągłe szkiełka nakrywkowe namoczyć sterylnym 1 N kwasem solnym (HCl) na sterylnej szalce Petriego przez 30 minut. Umyć szkiełka nakrywkowe sterylną wodą 3x, a następnie namoczyć w 95% EtOH przez co najmniej 20 minut, a następnie pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.
   2. Umieścić kropelki rozcieńczonych materiałów powlekających białko macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) na arkuszu Parafilmu (np. 150-250 μl/kroplę lamininy 10 μg/ml rozpuszczoną w sterylnym roztworze buforu fosforanowego [PBS]). Rozprowadzić kropelki tak, aby szkiełka nakrywkowe nie stykały się po umieszczeniu na tych kropelkach. Delikatnie umieść każde wysuszone szkiełko nakrywkowe na kropli za pomocą kleszczy.
   3. Szkiełka nakrywkowe pozostawić na kropelkach na ok. 4-6 godzin w kapturze hodowlanym przy zamkniętym skrzydle.
   4. Umieść szkiełka nakrywkowe z powłoką ECM (stroną z powłoką ECM do góry) w każdym z dołków płytki 24-dołkowej. Umyć każdą studzienkę sterylnym PBS 3x i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie potrzebna.
2. Przygotowanie komórek glejowych do posiewu na szkiełkach nakrywkowych.
   1. Odessać pożywkę z kultur glejowych i delikatnie przemyć monowarstwę glejową 3x 10 ml sterylnego PBS. Następnie dodać 8-10 ml roztworu trypsyny-EDTA do T-175 i inkubować przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C.
   2. Gdy większość monowarstwy zostanie oderwana, dodać 20 ml kompletnej pożywki do kolby, aby zatrzymać trypsynizację. Zebrać pożywkę zawierającą oderwane komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i wirować przez 10 minut w temperaturze pokojowej o wymiarach 300 x g.
   3. Odessać supernatant bez naruszania osadu, a następnie ponownie zawiesić komórki w 2 ml świeżej, kompletnej pożywki, delikatnie pipetując roztwór za pomocą pipety P1000.
   4. Określ liczbę komórek za pomocą hemocytometru, a następnie ponownie zawieś komórki w kompletnym podłożu o pożądanej gęstości (np. 10,⁵ komórek/ml). Umieścić komórki na szkiełkach nakrywkowych pokrytych ECM (np. 500 μl w każdym dołku płytki 24-dołkowej). Dodać dodatkowe świeże, kompletne podłoża do każdego dołka przez 3-5 dni inkubacji w temperaturze 37 °C lub do momentu, gdy komórki osiągną pożądaną wizualną zbieżność.
3. Leczenie psychozyną.
   1. Rozpuść psychozynę do stężenia podstawowego (108,3 mM) w dimetylosulfotlenku (DMSO). Rozcieńczyć ten materiał w 100% EtOH, aby uzyskać materiał roboczy, który można następnie dodać do każdego dołka na płytce 24-dołkowej, aby osiągnąć końcowe stężenie 10 μM.
   2. W momencie dodawania psychozyny delikatnie zakręć płytką hodowlaną, aby wymieszać psychozynę z pożywką hodowlaną. Uzupełnij psychozynę, dodając równowartość 10 μM co drugi dzień przez jeden tydzień.
4. Po 7 dniach leczenia psychozyną zebrać pożywkę i odpipetować 500 μl zimnego 4% paraformaldehydu (PFA) do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby utrwalić komórki. Następnie przemyć każdą studzienkę 3x PBS, a następnie utrzymać płytki w temperaturze 4 °C do czasu przetworzenia do immunocytochemii (patrz poniżej).
   UWAGA: W tym momencie można pobrać pożywkę do hodowli komórkowych do testu enzymatycznego lub ELISA, jeśli jest to pożądane.

3. Immunocytochemia (ICC) do wizualizacji komórek globoidalnych

1. Zastąp PBS buforem blokującym [PBS + 0,3% Tween-20 + 5% normalna surowica kozia (NGS)] i inkubuj komórki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
2. Inkubować utrwalone komórki w pierwszorzędowych surowicach odpornościowych przeciwko Iba-1 [(1:1,000) rozcieńczony w PBS + 0,3% Tween-20 + 2% NGS] przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć każdą studzienkę PBS 3x 5 min/pranie.
3. Dodać odpowiednie wtórne przeciwciało sprzężone z fluorescencją w celu identyfikacji znakowania przeciwciała pierwszorzędowego i przeciwbarwienia za pomocą 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI, 1:1,000) w celu identyfikacji jąder. Inkubować w roztworze przeciwciał drugorzędowych przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i przemywać PBS 3x 5 min.
4. Zamontuj każde szkiełko nakrywkowe do szkiełek mikroskopowych za pomocą medium montażowego. Wyświetlanie preparatów pod mikroskopem fluorescencyjnym do analiz wizualnych i ilościowych.

4. Analiza i charakterystyka komórek globoidowych w hodowli pierwotnej

1. Użyj następujących trzech kryteriów morfologicznych, aby zidentyfikować komórkę globoidalną w hodowli:
   1. Zidentyfikuj komórki globoidalne za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przez immunopozytywne znakowanie markera mikrogleju, Iba-1+.
   2. Zidentyfikuj komórki globoidalne jako wielojądrowe (tj. zawierające dwa lub więcej jąder dodatnich DAPI).
   3. Identyfikuj komórki globoidalne na podstawie zaokrąglonej morfologii, różniącej się od silnie rozgałęzionego wyglądu spoczynkowych komórek mikrogleju.
      UWAGA: Z tych hodowli można również pobierać komórki do analizy markerów powierzchniowych komórek i oznaczania ilościowego za pomocą cytometrii przepływowej.
2. Pomiar aktywacji fagocytarnej komórek mikrogleju i globoidalnych
   1. Aby ocenić aktywność fagocytarną mikrogleju traktowanego psychozyną, dodaj do studzienek kulki lateksowe z oznaczeniem FITC zgodnie z instrukcjami producenta. Dodaj fluorescencyjne kulki lateksowe sprzężone 48 godzin przed utrwaleniem za pomocą PFA. Utrwalić komórki potraktowane kulkami (jak wspomniano w sekcji 2.4) i przeprowadzić proces immunocytochemiczny (zgodnie z opisem w punkcie 3).
   2. Wybierz przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluoroforem, tak aby nie nakładały się na fluorescencyjne widma emisyjne kulek znakowanych fluoroforem.
   3. Przeanalizuj profile fagocytotyczne mikrogleju Iba-1+, identyfikując te komórki, które kolokalizują się z fluorescencyjnie znakowanymi kulkami.
      UWAGA: Psychozyna aktywuje mikroglej. Kulki fagocytozy zostaną zidentyfikowane w jednojądrowych i wielojądrowych komórkach Iba-1+ w tych warunkach hodowli.

5. Indukcja komórek globoidalnych z oczyszczonych kultur mikrogleju

UWAGA: Alternatywne podejście do rozszyfrowania sygnalizacji międzykomórkowej między astrocytem a mikroglejem to kolejna zaleta tego modelu komórek globoidalnych in vitro. Oczyszczanie pierwotnych komórek mikrogleju do ponownego posiewu lub kohodowli można osiągnąć dzięki ich niższej przyczepności w hodowli, jak opisano w poniższych krokach (patrz sekcja 5.2).

1. Zebrać pożywkę z przenikających się mieszanych kultur glejowych do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i utrzymywać w temperaturze 37 °C w inkubatorze.
2. Izolacja mikrogleju z pierwotnych mieszanych kultur glejowych.
   1. Po usunięciu pożywki z kolby T175 z mieszaną kulturą glejową, dodać ciepłą pożywkę do wytrząsania [składającą się z kompletnych pożywek + 25 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) + 25 mM wodorowęglanu sodu (Sigma)]. Potrząsać kolbami przez 3-4 godziny w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 100 obr./min (37 °C). Zebrać pożywkę z tak wstrząśniętych kolb do stożkowych probówek o pojemności 50 ml.
      UWAGA: Pożywka ta będzie zawierać mniej przylegający mikroglej z kolb.
   2. Wirować podłoże o masie 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant, a następnie ponownie zawiesić komórki w 2 ml pożywki kondycjonowanej przez astrocyty (zebranej w kroku 5.1).
   3. Ustalić liczbę komórek pobranych za pomocą hemocytometru, a następnie umieścić komórki mikrogleju na szkiełkach nakrywkowych pokrytych substratem (patrz sekcja 2.1) do celów immunocytochemicznych lub na płytkach dołkowych o bardzo niskiej przyczepności w celu przyszłego pobrania komórek globoidalnych do kohodowli z innymi typami komórek, takimi jak oligodendrocyty (jak opisano w następnej sekcji).
      UWAGA: Po posianiu mikrogleju można leczyć psychozyną (10 μM), jak opisano powyżej (patrz punkt 2.3).
3. Współhodowla z pierwotnymi oligodendrocytami w celu analizy cytotoksyczności.
   UWAGA: Pobranie mikrogleju poddanego działaniu psychozyny z płytek o niskiej przyczepności w celu późniejszej kohodowli na pierwotne kultury oligodendrocytów lub komórek progenitorowych oligodendrocytów może być wykorzystane do zbadania potencjalnej funkcji cytotoksycznej tych komórek globoidalnych in vitro.
   1. Opracowanie kultur pierwotnych oligodendrocytów przy użyciu ustalonych metod^18,20. Aby zebrać mikroglej potraktowany psychozyną, delikatnie pipetuj, aby oderwać luźno przylegające komórki od dna studzienek. Zebrać komórki, odwirować przy 300 x g przez 10 minut, a następnie ostrożnie ponownie zawiesić w pożywce różnicującej oligodendrocyty [składającej się z pożywki neurobazalnej, L-glutaminy (1x), suplementu B-27 (1x) i trójjodotyroniny (T3, 10 ng/ml)].
   2. Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru, a następnie zasiej mikroglej w kulturze oligodendrocytów o stężeniu 1 x 10⁵ komórek/ml, co daje przybliżony stosunek mikrogleju/oligodendrocytów 1:2. Inkubuj jako kokulturę do 3 dni.
   3. Ustalić komórki do immunocytochemii (patrz punkt 2.4). W razie potrzeby należy pobrać pożywki do hodowli komórkowych do testu ELISA lub analiz chemicznych.

Results

Ten protokół, jak napisano, powinien zająć około 36 dni od początku do końca (Zobacz Rysunek 1: Eksperymentalny schemat przepływu pracy). Z naszego doświadczenia wynika, że rozwój komórek "globoidalnych" w tym pierwotnym systemie hodowli jest zarówno wiarygodny, jak i powtarzalny: tworzenie się komórek wielojądrowych w odpowiedzi na psychozynę obserwuje się konsekwentnie po 7 dniach leczenia.

Immunocytochemiczne barwienie mikrogleju za pomocą Iba-1 w połączeniu z jądrowym prze...

Discussion

Opisany w niniejszym dokumencie protokół zapewnia nowy system modelowy, w którym można badać rozwój i charakterystykę funkcjonalną aktywowanych komórek mikrogleju i globoidalnych. Wcześniejsza praca Im et al. wykorzystanie linii komórkowej HEK293 dostarczyło szablonu do opracowania obecnego protokołu do badania tworzenia komórek globoidalnych²¹. Należy również podkreślić, że komórki globoidalne uzyskane w modelu różnią się od natywnych komórek globoidalnych identyfikowalnych w GLD. Na przykład rutynow...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hank' s zrównoważony roztwór soli (HBSS) niezawierający kationów (Mg2+ i Ca2+).	Technologie życiowe	14175-095
Zestaw do dysocjacji tkanek nerwowych	Miltenyi	130-092-628
40 μ m sitko do komórek	Fisherbrand	22363547
Hank' s zrównoważony roztwór soli (HBSS) zawierający kationy (Mg2+ i Ca2+).	Gibco	14025-092
Zmodyfikowana pożywka orła Dulbecco (DMEM)	Gibco	11995-065
płodowa surowica bydlęca (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
Penicilin/Streptomycyna	Technologie życia	15070-063
Laminin	Sigma	L2020
Roztwór trypsyna-EDTA	Technologie życiowe	25299-056
Psychozyna	Sigma	P9256
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Sigma	D2650
Paraformaldehyd (PFA)	Mikroskopia elektronowa Nauka	19208
Normalna surowica kozia (NGS)	Invitrogen	PCN5000
Iba-1	WAKO	019-19741
Alexa Fluor sprzężony surowice	odpornościowe Technologie życia	Różne
podłoża montażowe	Southern Biotech	OB100-01
Zestaw do testów fagocytarnych	Cayman Chemicals	500290
HEPES	Sigma	BP310-500