Pobieranie, izolacja i analiza cytometryczna przepływowa próbek z ludzkiej szyjki macicy

Podsumowanie

Użycie pobierania próbek cytoszczotek do pobierania limfocytów i monocytów z szyjki macicy jest minimalnie inwazyjną techniką, która dostarcza próbek do analizy odporności żeńskich dróg rodnych. W tym protokole opisujemy pobieranie próbek cytoszczotek i izolację komórek odpornościowych do testów cytometrii przepływowej.

Streszczenie

Pomimo znaczenia patogenów błony śluzowej (w tym HIV) dla zdrowia publicznego, stosunkowo niewiele wiadomo na temat odporności błony śluzowej, szczególnie na żeńskie drogi rodne (FGT). Ponieważ transmisja heteroseksualna stanowi obecnie dominujący mechanizm przenoszenia wirusa HIV i biorąc pod uwagę ciągłe rozprzestrzenianie się infekcji przenoszonych drogą płciową (STI), kluczowe znaczenie ma zrozumienie wzajemnych zależności między gospodarzem a patogenem w błonie śluzowej narządów płciowych. Znaczne luki w wiedzy na temat odporności na FGT wynikają częściowo z trudności w skutecznym pobieraniu i przetwarzaniu próbek błony śluzowej. Aby ułatwić badania przy wystarczającej wielkości próby, techniki pobierania muszą być minimalnie inwazyjne i skuteczne. W tym celu zoptymalizowano protokół pobierania próbek cytoszczoteczki szyjki macicy, a następnie izolacji komórek jednojądrzastych szyjki macicy (CMC). Korzystając z immunofenotypowania opartego na cytometrii przepływowej ex vivo, możliwe jest dokładne i wiarygodne ilościowe określenie częstości występowania i fenotypów populacji limfocytów/monocytów CMC. Technikę tę można połączyć z pobraniem płukania szyjki macicy i pochwy (CVL), które zawiera rozpuszczalne mediatory immunologiczne, w tym cytokiny, chemokiny i antyproteazy, z których wszystkie można wykorzystać do określenia środowiska przeciw- lub prozapalnego w pochwie.

Wprowadzenie

Większość nowych zakażeń wirusem HIV na całym świecie powstaje poprzez transmisję heteroseksualną, przy czym kobiety stanowiły 47% nowych infekcji w 2011 roku (UNAIDS¹). Zrozumienie żeńskich dróg rodnych (FGT), jednego z głównych portali wejściowych dla HIV i innych patogenów przenoszonych drogą płciową, ma ogromne znaczenie na drodze do znalezienia skutecznych strategii zapobiegania zakażeniom. Odpowiedzi immunologiczne na błonie śluzowej narządów płciowych są wyraźnie unikalne i różnią się od tych mierzonych we krwi obwodowej². Jednak obecna wiedza na temat dynamiki immunologicznej w FGT jest w najlepszym razie ograniczona. Do tej pory badania środowiska immunologicznego błony śluzowej koncentrowały się głównie na tkankach limfatycznych związanych z jelitami (GALT), gdzie stało się jasne, że wczesne zdarzenia w tkankach błony śluzowej po zakażeniu mają silny wpływ na późniejszą progresję choroby^3,4. Pobieranie próbek z błony śluzowej narządów płciowych stanowi duże wyzwanie i jest przynajmniej częściowo odpowiedzialne za brak zrozumienia immunologii FGT. Rozwiązanie zagadki dynamiki immunologicznej między gospodarzem a patogenem w kontekście odrębnego środowiska, jakim jest FGT, wymaga skutecznych metod zbierania i analizowania próbek z tego miejsca.

FGT jest podzielony na dwie sekcje: górny odcinek rozrodczy, który obejmuje jajowody, endometrium i szyjkę macicy, oraz dolny odcinek zawierający ectocervix i pochwę (sprawdzone przez Kaushic et al⁵). Nadal nie jest jasne, jaki jest względny udział tych różnych miejsc w zakażeniu wirusem HIV, ale uważa się, że oba miejsca mogą przyczyniać się do pojawienia się wirusa HIV⁶. Limfocyty T stanowią 40-50% leukocytów w górnych i dolnych drogach rozrodczych, podczas gdy makrofagi stanowią około 10% (przegląd w Rodriguez-Garcia i wsp. ²). Limfocyty T można wykryć w pochwie, szyjce macicy i błonie śluzowej macicy. Makrofagi są silniej zlokalizowane w błonie śluzowej macicy i tkance łącznej mięśniówki macicy niż w szyjce macicy, chociaż można je wykryć w obu tkankach. Wreszcie, plazmocytoidalne komórki dendrytyczne (pDC) i komórki Langerhansa można również wykryć w tkankach FGT. Fenotyp i proporcje populacji immunologicznych oraz ich podatność na zakażenie wirusem HIV mogą się znacznie różnić w zależności od cykli hormonalnych, stosowania hormonalnych środków antykoncepcyjnych, bakteryjnego zapalenia pochwy lub aktywności seksualnej^5,7-9.

Do badania populacji immunologicznej i środowiska FGT opracowano różne metody. Biopsja szyjki macicy, cytoszczoteczki szyjkowe i płukanie szyjki macicy i pochwy (CVL)^10-12 są najczęściej stosowane w literaturze. Pobieranie CVL metodą płukania PBS jest najprostszą metodą i pozwala na badanie białek modulujących układ odpornościowy, ale skutkuje wyjątkowo niską wydajnością komórek, a zatem nie nadaje się do badania populacji komórek odpornościowych FGT¹³. Z drugiej strony próbki CVL są bardzo przydatne do oceny środowiska immunologicznego FGT poprzez pomiar ekspresji różnych cytokin, chemokin lub czynników przeciwdrobnoustrojowych przy użyciu metod takich jak ELISA, cytokina perełkowa¹⁴ lub spektrometria mas^15,16. Charakterystykę częstości, fenotypów i funkcji komórek odpornościowych można osiągnąć poprzez pobieranie komórek jednojądrzastych szyjki macicy (CMC) za pomocą cytoszczotek szyjki macicy lub biopsji szyjki macicy.

Pobieranie próbek z biopsji szyjki macicy jest metodą inwazyjną, która zwiększa dyskomfort i ryzyko krwawienia, a gojenie po zabiegu trwa od 2 do 11 dni, w zależności od statusu immunologicznego kobiety¹². Z kolei cytoszczoteczki szyjkowe szyjki macicy, mimo mniejszej wydajności pobranych komórek, są mniej inwazyjną i wygodniejszą metodą pobierania komórek odpornościowych z FGT. Obie metody mogą osiągnąć tę samą wydajność leukocytów CD45+, ale do uzyskania tej samej ilości komórek zawartych w jednej biopsji¹³ konieczne są dwie sekwencyjne cytoszczoteczki szyjki macicy. Niemniej jednak pobieranie próbek cytoszczoteczki nadal zapewnia akceptowalną liczbę komórek (około 5000 komórek CD45+/cytoszczoteczkę) do dalszego fenotypowania ex vivo za pomocą cytometrii przepływowej¹⁴. Na tych próbkach można również przeprowadzić charakterystykę funkcjonalną, ponieważ stymulację i wewnątrzkomórkową cytometrię przepływową lub qPCR przeprowadzono przy użyciu CMC pochodzących z cytoszczotek w celu zidentyfikowania odpowiedzi immunologicznych specyficznych dla HIV¹⁷ lub polaryzacji komórek Th¹⁸. Ekspansja populacji limfocytów T może również ułatwić badania funkcjonalne z CMCs¹⁹.

Ważne jest, aby zauważyć, że biopsje i cytoszczotki pobierają próbki z różnych części FGT. Biopsje są pobierane z górnej części nabłonka i zrębu szyjki macicy^12,13, podczas gdy cytoszczotki szyjkowe pobierają próbki z szyjki macicy, zbierając komórki pochodzące z nabłonka szyjki macicy i przypuszczalnie strefy transformacji. Próbki Cytobrush pobierają zatem próbki z regionu składającego się z pojedynczej warstwy nabłonka walcowatego, podczas gdy biopsje obejmują obszar wyłożony płaskonabłonkowym nabłonkiem warstwowym⁵. W rezultacie charakter populacji leukocytów pobranych za pomocą biopsji szyjki macicy i cytoszczoteczki różni się. Biopsje pobierają większą ilość limfocytów T CD3 +, podczas gdy cytoszczoteczki powodują pobranie większej ilości monocytów / makrofagów CD14 +¹³.

Studiowanie immunologii FGT jest przedmiotem zainteresowania od wielu lat^20-22 i zgromadziliśmy dużą wiedzę specjalistyczną w zakresie badań CMC pochodzących z cytoszczotek. Nasze badania koncentrują się głównie na badaniu zakażonych wirusem HIV, niezakażonych i narażonych na zakażenie wirusem HIV seronegatywnych (HESN) pracownic seksualnych z Nairobi w Kenii. Wirus HIV preferencyjnie replikuje się w aktywowanych limfocytach T²³, a mniejsza liczba aktywowanych komórek, które mogą być celem wirusa HIV w FGT, może przyczynić się do ochrony przed nabyciem wirusa HIV. Zgodnie z tą hipotezą, kilka badań opisało niższą aktywację immunologiczną wśród osób świadczących usługi seksualne HESN, które są wysoce narażone na HIV, ale pozostają niezakażone^24,25, a ten spoczynkowy fenotyp obserwuje się również w FGT¹⁴. W tym miejscu opisano metodologię przetwarzania i oceny aktywacji limfocytów T w próbkach CMC pochodzących z cytoszczotek szyjki macicy za pomocą cytometrii przepływowej ex vivo.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Komisje etyki badań zarówno Uniwersytetu Manitoba, jak i Narodowego Szpitala Kenyatta / Uniwersytetu w Nairobi zatwierdziły to badanie i uzyskano pisemną świadomą zgodę od wszystkich uczestników badania.

1. Przygotowanie pożywek i probówek do zbierania CMC

1. Przygotować roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami (PBS) (137,93 mM NaCl, 2,67 mM KCl, 8,1 mM Na₂HPO₄, 1,47 mM KH₂PO₄). Autoklaw do sterylności. Można go przechowywać w temperaturze 4 ºC przez kilka miesięcy.
2. Wstępnie podwielokrotne 5 ml PBS przelać do probówki sokoła o pojemności 50 ml (po jednej na próbkę, która ma zostać pobrana) i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu pobrania próbki.
3. Oznaczyć 2-4 kriowiale lub 1,5 ml probówek mikrowirówkowych na próbkę, aby zebrać popłuczyny do przechowywania.
4. Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych: RPMI 1640 + 1% penicylina/streptomycyna/amfoterycyna B (stężenie końcowe odpowiednio 100 jednostek/ml, 100 μg/ml i 250 ng/ml, bez dodatku FCS/FBS.

2. Zbiór próbek Cytobrush

Pobieranie próbek cytobrush to nieinwazyjna procedura, która musi być wykonana przez przeszkolonego lekarza lub ginekologa.

1. Zbierz komórki jednojądrzaste szyjki macicy (CMC) za pomocą cytoszczoteczki, jak i drewnianego lub plastikowego skrobaka. Pobrać CMC od uczestnika poddanego badaniu wziernika, wkładając skrobak i obracając wokół szyjki macicy (ryc. 1). Włóż cytoszczoteczkę do szyjki macicy, obróć o 360° i natychmiast umieść zarówno cytoszczoteczkę, jak i skrobak w 50 ml probówce Falcon zawierającej 5 ml PBS.
2. Przechowywać próbki na lodzie/w temperaturze 4 ºC do czasu przetworzenia. Aby utrzymać żywotność komórek, należy przetwarzać próbki w ciągu 2 godzin od pobrania.
3. Jeśli to możliwe, należy pobrać dopasowane próbki krwi w zielonych górnych wakutainerach heparyny do izolacji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC), aby służyły jako komparator/kontrola do analizy CMC.

3. Izolacja CMC

Przeprowadź przetwarzanie próbki w laboratorium poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2, w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego w podwójnych rękawicach.

1. Podczas pobierania próbki CMC mogą zostać zanieczyszczone krwią. Należy wykluczyć z badania próbki z widocznym zanieczyszczeniem krwi, aby zapobiec mylącemu włączeniu PBMC do próbki końcowej. Ze względu na małą liczbę limfocytów wyizolowanych z próbek CMC, niewielkie zanieczyszczenie krwi może łatwo przytłoczyć składnik limfocytów CMC.
2. Wiruj probówki sokoła zawierające zarówno cytoszczotkę, jak i skrobak przez 45 sekund, aby oddzielić komórki od szczotek. Podczas tego procesu próbki mogą się pienić; To normalne.
3. Użyj cytoszczotki, aby zeskrobać pozostały materiał ze skrobaka i wyrzuć skrobak do roztworu wybielacza. Aby zebrać wszelkie pozostałe komórki przyczepione do szczotki/skrobaka, użyj świeżej rękawicy, aby ścisnąć skrobak między kciukiem a palcem wskazującym. Przesuń szczoteczkę w dół, pozwalając na zebranie komórek i PBS w tej samej probówce o pojemności 50 ml. Wyrzuć cytoszczotę do roztworu wybielacza i wyrzuć rękawicę.
   WAŻNE: Do każdej próbki należy używać nowych rękawic.
4. Dopasuj nylonowe sitko o średnicy 100 μm do świeżej probówki Falcon o pojemności 50 ml. Za pomocą pipety transferowej pobrać zawiesinę komórek PBS z probówki z próbką i przefiltrować przez sitko do świeżej probówki.
5. Dodać 5 ml RPMI 1640 do oryginalnej probówki na próbkę. Za pomocą pipety transferowej umyj boki probówki z próbką za pomocą RPMI i przenieś przez filtr do nowej probówki zbiorczej. Umyj również spód nylonowego filtra za pomocą RPMI.
6. Odwirowywać próbki przez 10 minut przy 514 x g. Na tym etapie bardzo ważne jest, aby pozostawić wyłączony hamulec wirówki, aby zapobiec przemieszczeniu się granulki CMC.
7. Delikatnie usunąć sklarowany osad z probówki, uważając, aby nie naruszyć osadu. Wielkość granulek będzie bardzo zmienna; W niektórych próbkach osad jest dość duży ze względu na obecność dużej liczby komórek nabłonkowych, podczas gdy w innych przypadkach osad jest ledwo widoczny i wysoce przezroczysty.
8. Zawiesić granulkę poprzez delikatne poruszenie rurki sokoła. Dodać 5 ml PBS w celu przepłukania próbki.
9. Wirować ponownie przez 10 minut przy 514 x g bez hamulca wirówki.
10. Ostrożnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad jak powyżej. Komórki są gotowe do kriokonserwacji (przy użyciu protokołu kriokonserwacji PBMC), stymulacji lub fenotypowania metodą cytometrii przepływowej.

4. Barwienie powierzchni CMC i cytometria przepływowa

1. Zawiesić osad z etapu 3.10 w 100 μl roztworu blokującego i przenieść do płytki 96-dołkowej lub probówki FACS. Receptura roztworu blokującego (do blokowania receptorów Fcγ) jest następująca: 1,8 μl mysiej IgG (stężenie końcowe 0,2 μg/μl), 5 μl FBS i 93,2 μl FACS wash (PBS+2%FBS). Barwienie można przeprowadzić w płytce 96-dołkowej, jeśli rozmiary granulek są wystarczająco małe, ale może być konieczne wykonanie w probówkach FACS, jeśli granulki są rutynowo duże. Ważne jest, aby odpowiednio miareczkować przeciwciała.
2. Zatrzymać próbki na 10 minut na lodzie/w temperaturze 4 °C.
3. Przemyć komórki 100 μl FACS Wash (PBS + 2% FBS) w 96-dołkowych płytkach lub 500 μl w probówkach FACS. Wirować przy 600 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C z hamulcem włączonym na niskim poziomie (lub wyłączonym, jeśli ustawienie hamulca na niskim poziomie jest niedostępne).
4. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy przez mieszanie. Dodaj Plamę żywotności (barwnik żywotności Live Dead, który można naprawić). Przygotuj barwnik żywotności zgodnie z instrukcjami producenta. Może być konieczne miareczkowanie do użycia w każdym zestawie laboratorium/cytometru. Inkubować przez 30 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.
5. Przemyć komórki 100 μl/500 μl PBS (dla płytki 96-dołkowej/probówek FACS). Wirować przy 600 x g przez 10 minut z hamulcem przy niskim lub zerowym hamowaniu. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki.
6. Inkubować komórki z koktajlem przeciwciał markerowych powierzchniowych w łącznej objętości 100 μl. WAŻNE: Zoptymalizuj i miareczkuj każdy panel cytometrii przepływowej przed barwieniem próbki. Inkubować komórki przez 30 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.
7. Powtórzyć krok 4.5. w przypadku barwienia na płytce 96-dołkowej, przenieść komórki do probówki FACS i rozcieńczyć do końcowej objętości 750 μl FACS Wash zawierającego 1% paraformaldehydu (PFA) (lub CytoFix, rozcieńczony 1:4). Przejdź do akwizycji danych na cytometrze przepływowym.

5. Pobieranie i przygotowanie płukania szyjki macicy (CVL)

1. Przed pobraniem próbek cytoszczoteczki należy użyć strzykawki, aby przemyć szyjkę macicy 2 ml sterylnego PBS i odessać płukanie z tylnego otworu.
2. Pobrać zasysaną próbkę płukania do probówki sokoła o pojemności 15 ml i przechowywać na lodzie/w temperaturze 4 °C do czasu przetworzenia.
3. Odwirować próbkę o masie 400 x g przez 7 minut w celu usunięcia resztek komórkowych.
4. Zebrać supernatant, podzielić próbkę na 1 ml lub 500 μl podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -70 °C. Podwielokrotności można rozmrażać w celu przeprowadzenia testu ELISA lub analizy matrycy kulkowej białek CVL, ale należy unikać wielokrotnych cykli zamrażania/rozmrażania.
5. W razie potrzeby ponownie zawieś osad resztek komórkowych w RNA Później, aby zmierzyć ekspresję RNA, postępując zgodnie z protokołem producenta.

6. Akwizycja danych

1. Przygotuj zestaw probówek kompensacyjnych, który pasuje do panelu przeciwciał. Uruchom rurki kompensacyjne, aby dostosować nakładanie się widma. Uruchom próbki na dowolnym wielokolorowym cytometrze przepływowym, który jest skonfigurowany dla przeciwciał sprzężonych z fluorochromem używanych w panelu.
2. Najpierw pobierz próbkę PBMC, aby dostosować napięcie rozpraszania do przodu (FSC) i rozpraszania bocznego (SSC) w celu wykrycia populacji limfocytów. Staraj się, aby były one na poziomie 100 na każdej osi w skali liniowej. Przeprowadzenie kontroli PBMC znacznie ułatwi znalezienie populacji limfocytów CMC.
3. Próg FSC dla próbek CMC może wymagać podwyższenia w stosunku do próbek PBMC ze względu na rozmazanie osi SSC przy niskich wartościach FSC.
4. Wiruj każdą rurkę przed nabyciem. Zdobądź całą probówkę, aby zmaksymalizować liczbę zebranych zdarzeń bramki limfocytów. Uważnie monitoruj maszynę, aby uniknąć zatkania.
5. Wyeksportuj dane do programu do analizy cytometrii przepływowej, takiego jak FlowJo.

7. Strategia bramkowania

1. Wybierz opcję Forward side scatter high (FSC-H)/Forward side scatter area (FSC-A), aby określić populację singletów.
2. Wybierz opcję Czas w funkcji markera fluorescencyjnego (jako przykład FITC), aby kontrolować jakość akwizycji. Zmiana natężenia przepływu może spowodować pojawienie się artefaktów w danych. Wyklucz wszystkie obszary, które wykazują rozbieżność w natężeniu przepływu.
3. Zidentyfikuj populację limfocytów na wykresie SSC-A/FSC-A. Użyj kontrolki PBMC, aby ułatwić identyfikację. Należy pamiętać, że populacja limfocytów CMC może nie być tak wyraźna jak kontrola PBMC.
4. Bramka na barwniku SSC-A / żywotności w celu wykluczenia martwych komórek z żywych komórek. Martwe komórki mogą niespecyficznie zawierać przeciwciała, które wprowadzą artefakty.
5. Bramka na SSC-A / CD3 w celu identyfikacji populacji limfocytów T. Z tej bramki zidentyfikuj populacje CD4+ i CD8+.

Wyniki

Wieloparametrowa cytometria przepływowa jest potężnym narzędziem do analizy fenotypów i funkcji podzbiorów komórek w wcześniej niescharakteryzowanych tkankach. Analiza próbek CMC może dostarczyć informacji zarówno na temat populacji limfocytów, jak i monocytów przy odpowiednich strategiach bramkowania.

Reprezentatywna strategia bramkowania CMC, w porównaniu z dopasowanym profilem PBMC, jest pokazana na rysunku 2. Wykres FSC-A w stosunku do FSC-H pozwala na wykluczenie dubletów...

Dyskusja

Biorąc pod uwagę duże luki w wiedzy na temat odporności na żeńskie drogi rodne (FGT), analiza fenotypowa CMC może dostarczyć szerokiego wachlarza informacji na temat wielu populacji limfocytów w szyjce macicy. W połączeniu z analizą proteomiczną i pomiarami wiremii w płukaniu szyjki macicy, odporność na infekcje przenoszone drogą płciową (STI) i inne patogeny można przeanalizować w różnych populacjach.

Uwagi techniczne - CMC: Izolacja i skuteczne barwienie próbek CMC może być ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
100 μ m Sitko komórkowe do probówki Falcon 50 ml	BD	352360	Przetwarzanie CMC
RPMI 1640	Hyclone	SH30027.01	Przetwarzanie CMC
Surowica bydlęca płodu	Technologia życia	16000044	Przetwarzanie CMC
Technologia Fungizone	Life	15290-018	Przetwarzanie
CMC Penicylina/streptomycyna	Sigma	P4333-20ml	Przetwarzanie CMC
50 ml probówka Falcon	Fisher	14-959-49A	Przetwarzanie CMC
Jednorazowa pipeta transferowa do banku krwi	Fisher	13-711-6M	Przetwarzanie CMC
Cytobrush plus	Cooper chirurgiczne	C0121	CMC pobieranie
Jednorazowy skrobak do szyjki macicy	Szybkie medyczne	pobieranie próbek CMC 2183
15 ml Rurka Falcon	Fisher	14-959-70c	Probówka CVL
1,5 ml Eppendorf	Fisher	05-402-18	Przechowywanie CPL
ŻYWY/MARTWY Zestaw do naprawiania barwienia komórek	Invitrogen	Various	Odczynnik do cytometrii przepływowej
Bufor utrwalający (4% PFA)	554655	Cytometria przepływowa Regeant
Mysz IgG	Sigma	I8765	Regeant do cytometrii przepływowej