Enterobacter sp. YSU rośnie w pożywce z minimalnymi solami glukozy. Auksotrofy są generowane przez przekształcenie go w transposom, który losowo wstawia się do genomu gospodarza. Mutanty są znajdowane przez replikowanie posiewu ze złożonej pożywki do minimalnej pożywki. Przerwane geny są identyfikowane przez ratowanie genów i sekwencjonowanie.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wytwarzanie auksotrofów Enterobacter sp. YSU z wykorzystaniem mutagenezy transpozonów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Bakterie prototroficzne rosną na pożywce M-9 z minimalną ilością soli uzupełnioną glukozą (pożywka M-9), która jest używana jako źródło węgla i energii. Auksotrofy można wytwarzać za pomocą transposomu. Dostępny na rynku transposom pochodzący z Tn5 stosowany w tym protokole składa się z liniowego segmentu DNA zawierającego pochodzenie replikacji R6K γ, gen oporności na kanamycynę i dwa końce sekwencji mozaiki, które służą jako miejsca wiązania transpozazy. Transposom, dostarczony jako kompleks białkowy DNA/transpozazy, jest wprowadzany przez elektroporację do szczepu prototroficznego, Enterobacter sp. YSU, i losowo włącza się do genomu tego gospodarza. Transformanty są replikowane na płytkach agarowych Luria-Bertani zawierających kanamycynę (LB-kan) i na pożywkach M-9 zawierających kanamycynę (M-9-kan). Transformanty, które rosną na płytkach LB-kan, ale nie na płytkach M-9-kan, są uważane za auksotrofy. Oczyszczony genomowy DNA z auksotrofu jest częściowo trawiony, ligowany i przekształcany w szczep pir+ Escherichia coli (E. coli). Pochodzenie replikacji R6Kγ umożliwia replikację plazmidu w szczepach pir + E. coli, a marker oporności na kanamycynę pozwala na selekcję plazmidu. Każdy transformant posiada nowy plazmid zawierający transpozon otoczony przerwanym regionem chromosomalnym. Sekwencjonowanie Sangera i narzędzie Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) sugerują przypuszczalną tożsamość przerwanego genu. Stosowanie tej strategii mutagenezy transposomów ma trzy zalety. Po pierwsze, nie opiera się na ekspresji genu transpozazy przez gospodarza. Po drugie, transposom jest wprowadzany do gospodarza docelowego przez elektroporację, a nie przez koniugację lub transdukcję, a zatem jest bardziej wydajny. Po trzecie, pochodzenie replikacji R6Kγ ułatwia identyfikację zmutowanego genu, który jest częściowo odzyskiwany w rekombinowanym plazmidzie. Technika ta może być wykorzystana do zbadania genów zaangażowanych w inne cechy Enterobacter sp. YSU lub szerszej gamy szczepów bakteryjnych.
Wprowadzenie
Bakterie prototroficzne rosną w pożywce M-9 zawierającej minimalną ilość soli zawierających glukozę (pożywka M-9), przekształcając glukozę przez centralne szlaki metabolizmu węgla w celu wytworzenia prekursorów, takich jak aminokwasy, kwasy nukleinowe i witaminy, do biosyntezy1. Pożywka M-9 zawiera chlorek amonu jako źródło azotu, fosforan sodu i potasu jako źródło buforowe i fosforowe, siarczan magnezu jako źródło siarki oraz glukozę jako źródło węgla i energii. Pożywka Luria-Bertani (LB) jest bogata w aminokwasy z tryptonu oraz w witaminy i czynniki wzrostu z ekstraktu drożdżowego. Wspomaga wzrost auksotrofów, które nie mogą syntetyzować aminokwasów, wita....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Elektroporacja kompetentnych komórek5,11
- Rozcieńczyć kulturę Enterobacter sp. YSU 1/20 w 50 ml świeżej pożywki LB i rosnąć z wytrząsaniem przy 120 obr./min i 30 °C do średnicy zewnętrznej (600 nm) między 0,4 a 0,6. Opcjonalnie hoduj inne szczepy bakterii w optymalnej temperaturze wzrostu.
- Schłodzić komórki na lodzie przez 5 minut i odwirować w temperaturze 4 °C i 7 000 x g przez 5 minut.
- Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić komórki w 50 ml sterylnej, lodowatej wody i odwirować w temperaturze 4 °C i 7 000 x g przez 5 minut. Powtórzyć ten krok.
- Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w objętośc....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Transformacja Enterobacter sp. YSU poprzez elektroporację z wykorzystaniem transposomu zainicjowała losową insercję do genomu gospodarza (Rysunek 1A,B). Udana elektroporacja pozwoliła na uzyskanie kilku tysięcy transformantów, które rosły na płytkach LB-kan. Aby uzyskać od 300 do 400 dobrze rozdzielonych kolonii na płytce, zoptymalizowano ilość mieszaniny transformacyjnej wysiewanej na każdą płytkę z agarem LB-kan. Każdy transformant zawierał co najmniej jedną insercję transposonu, jednak bez pr.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Mutageneza transpozonów z wykorzystaniem transposomu jest skutecznym narzędziem do generowania auksotrofów u Enterobacter sp. YSU i innych typów bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich3,4. Proces ten rozpoczęto od wprowadzenia transposomu pochodzącego z Tn5 do gospodarza za pomocą elektroporacji. Aby zidentyfikować kolonie z insercjami, nieprzekształcony szczep docelowy musiał być wrażliwy na kanamycynę, aby wybrać marker oporności przenoszony przez transpozon. Niektórzy gospodarze wytwarzają.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autor nie ma nic do zdradzienia.
Podziękowania
Autor chciałby podziękować wszystkim moim studentom studiów licencjackich i wszystkim moim studentom fizjologii mikrobiologicznej, którzy testowali moje pomysły na mutagenezę transpozonów podczas semestrów wiosennych 2010-2014. Praca ta została sfinansowana przez Wydział Nauk Biologicznych Uniwersytetu Stanowego w Youngstown.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| EZ-Tn5 R6Kγ Zestaw transposomów Ori / KAN-2 Tnp | Epicentrum (Illumina) | TSM08KR | |
| EC100D pir+ Elektrokompetentne epicentrum E. coli | (Illumina) | ECP09500 | Zdolne do replikacji plazmidów o pochodzeniu replikacji R6Kγ przy niskiej liczbie kopii |
| EC100D pir-116 Elektrokompetentne epicentrum E. coli | (Illumina) | EC6P095H | Zdolny do replikacji plazmidów z R6Kγ pochodzenie replikacji przy wysokiej liczbie kopii |
| 5X M-9 Sole | Thermo Fisher | DF048517 | |
| Lennox LB Broth | Thermo Fisher | BP1427-2 | |
| Agar | Amresco, Inc. | J637-1KG | Pożywka stała zawierała 1,6% (w/v) |
| siarczanu kanamycyny agaru | Amresco, Inc. | 0408-25G | W razie potrzeby nośnik zawierał 50 μ g/ml siarczan kanamycyny |
| D-glukoza jednowodny | Amresco, Inc. | 0643-1KG | |
| Ekstrakt drożdżowy | Amresco, Inc. | J850-500G | |
| Trypton | Amresco, Inc. | J859-500G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504-500G | |
| NaCl | Amresco, Inc. | X190-1KG | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| MgSO2 | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Super optymalny bulion z represją katabolityczną (SOC) | 0,5% (w/v) ekstrakt drożdżowy, 2% (w/v) trypton, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 i 20 mM Glukoza | ||
| BfuC I | NEB | R0636S | Częściowe trawienie genomowego DNA |
| Xho I | NEB | R0146S | Trawienie plazmidowe |
| Ligaza DNA T4 | NEB | M0202S | |
| Woda wolna od nukleaz | Amresco, Inc. | E476-1L | Do rozpuszczania wytrąconego DNA i reakcji endonukleazy restrykcyjnej |
| GenomeLab DTCS - Zestaw szybkiego startu | Beckman Coulter | 608120 | Sekwencjonowanie DNA |
| Wizard Zestaw do oczyszczania genomowego DNA | Promega | A1120A | |
| Wizard Plus SV Minipreps System oczyszczania DNA | Promega | A1460 | Replika do oczyszczania plazmidu |
| Blok galwaniczny | Thermo Fisher | 09-718-1 | |
| Aksamitne kwadraty | Thermo Fisher | 09-718-2 | Replika poszycia |
| PetriStickers | Zróżnicowana biotechnologia | PSTK-1100 | Siatka do repliki galwanizacji |
| szalek Petriego | Thermo Fisher | FB0875712 | |
| Gene Pulser II | BioRad | ||
| Elektroporacja Kuwety do elektroporacji – 2 mm | BioExpress | E-5010-2 | |
| Koncentrator próżniowy DNA CentriVap | Labconco | 7970010 | Suszenie DNA |
| System analizy DNA CEQ 2000XL Wektor | sekwencjonowania DNA | Beckman Coulter | |
| NTI Advance 11.5.0 | Life Technologies | 12605099 | analiza sekwencji DNA |
Bibliografia
- Kim, B. H., Gadd, G. M. Bacterial physiology and metabolism. , Cambridge University Press. Cambridge. (2008).
- Hayes, F. Transposon-based strategies for microbial functional genomics and proteomics. Annual review of genetics. 37, 3-29 (2003).
- Hoffman, L. M.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
