Od plamki 2DE-Gel do funkcji białka: lekcja wyciągnięta z HS1 w przewlekłej białaczce limfocytowej

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokół, który łączy dwie techniki proteomiczne, mianowicie dwuwymiarową elektroforezę (2DE) i spektrometrię mas (MS), w celu identyfikacji różnie wyrażonych/potranslacyjnych zmodyfikowanych białek wśród dwóch lub więcej grup próbek pierwotnych. Takie podejście, wraz z eksperymentami funkcjonalnymi, pozwala na identyfikację i charakterystykę markerów prognostycznych/celów terapeutycznych.

Streszczenie

Identyfikacja cząsteczek biorących udział w inicjacji i progresji nowotworu jest fundamentalna dla zrozumienia biologii choroby, a w konsekwencji, dla klinicznego postępowania z pacjentami. W niniejszej pracy opiszemy zoptymalizowane podejście proteomiczne do identyfikacji cząsteczek zaangażowanych w progresję przewlekłej białaczki limfocytowej (CLL). Szczegółowo, lizaty komórek białaczkowych są rozwiązywane przez dwuwymiarową elektroforezę (2DE) i wizualizowane jako "plamy" na żelach 2DE. Analiza porównawcza map proteomicznych pozwala na identyfikację białek o zróżnicowanej ekspresji (pod względem liczebności i modyfikacji potranslacyjnych), które są wybierane, izolowane i identyfikowane za pomocą spektrometrii mas (MS). Funkcja biologiczna zidentyfikowanych kandydatów może być testowana za pomocą różnych testów (tj. migracji, adhezji i polimeryzacji F-aktyny), które zoptymalizowaliśmy dla pierwotnych komórek białaczkowych.

Wprowadzenie

Przewlekła białaczka limfocytowa (CLL), najczęstsza białaczka u dorosłych w krajach zachodnich, wywodzi się z nagromadzenia monoklonalnych nowotworowych limfocytów CD5⁺ B i jest klinicznie bardzo niejednorodna. Może występować w postaci przedbiałaczkowej, zdefiniowanej jako limfocytoza monoklonalna B-komórek B (MBL) ^1,2,3. W innych przypadkach choroba może objawiać się albo powolnym przebiegiem klinicznym, który może pozostawać stabilny przez lata, zanim będzie wymagał leczenia, albo jako postępująca choroba chemoreoporna z ponurym rokowaniem pomimo terapii. Wreszcie, może przekształcić się w często śmiertelnego chłoniaka o wysokim stopniu złośliwości (zespół Richtera-RS) ^2,3,4. Pacjenci są zwykle klasyfikowani w dwóch głównych podgrupach: dobre i złe rokowanie, w oparciu o zestaw czynników prognostycznych, które dostarczają uzupełniających się informacji na temat predyktorów wyniku choroby i przeżycia. Heterogeniczność kliniczna prawdopodobnie odzwierciedla heterogeniczność biologiczną. Wykazano, że wiele czynników genetycznych, mikrośrodowiskowych i komórkowych współdziała z patogenezą choroby, chociaż nie znaleziono mechanizmów jednoczących ⁵. Szczegółowo rzecz biorąc, kilka badań wykazało, że różnice w klinicznym przebiegu choroby można częściowo wyjaśnić obecnością (lub brakiem) niektórych markerów biologicznych, które mają wartość prognostyczną ^6,7,8. Dane te wykazały, że lepsze zrozumienie biologii choroby może dostarczyć dodatkowych wskazówek dotyczących klinicznego leczenia patologii poprzez identyfikację zarówno markerów prognostycznych, jak i celów terapeutycznych.

Celem niniejszego artykułu jest pokazanie, jak kombinacja różnych technik proteomicznych może być wykorzystana do identyfikacji białek zaangażowanych w początek i progresję CLL. Nasze podejście pokazuje, że możliwe jest połączenie ze sobą podstawowych danych proteomicznych i klinicznych⁵.

W obecnym przepływie pracy, pierwotne komórki białaczkowe od wybranych pacjentów (dobre vs złe rokowanie) są izolowane, a następnie wykorzystywane lizaty komórkowe do uzyskania map proteomicznych. 2DE pozwala na scharakteryzowanie profilu proteomicznego populacji komórek, w tym modyfikacji potranslacyjnych, dając w ten sposób pośrednią informację o aktywności biologicznej każdego białka. Lizaty całych komórek są rozpuszczane w pierwszym wymiarze w oparciu o punkt izoelektryczny, a następnie w drugim wymiarze w żelu poliakrylamidowym, który rozdziela białka na podstawie ich masy cząsteczkowej. Analiza porównawcza map proteomicznych pozwala na identyfikację białek o zróżnicowanej ekspresji (zarówno pod względem liczebności, jak i modyfikacji potranslacyjnych) jako plamek na żelu, które można ciąć i analizować za pomocą spektrometrii mas. Rola każdego kandydata może być następnie wykorzystana za pomocą różnych testów.

To podejście, ograniczone do CLL w obecnym manuskrypcie, może być łatwo rozszerzone na inne choroby/próbki, dostarczając w ten sposób informacji o proteomicznych/biologicznych różnicach między dwiema grupami (tj. patologiczne vs normalne, stymulowane vs niestymulowane, dzikie typu vs knockdown).

Protokół

UWAGA: Wszystkie próbki tkanek zostały pobrane za zgodą instytucjonalnej komisji przeglądowej szpitala San Raffaele (Mediolan, Włochy).

1. Próbki ludzkich tkanek i oczyszczanie komórek (Rysunek 1)

UWAGA: Limfocyty białaczkowe pozyskano z krwi obwodowej (PB) pacjentów z CLL, zdiagnozowanych zgodnie z metodą Mulligan et al. ⁹

1.1) Separacja komórek białaczkowych z krwi obwodowej

1. Pobrać krew obwodową do probówek do pobierania krwi typu vacutainer z heparyną sodową.
2. Przenieś krew do probówki o objętości 15 ml i dodaj koktajl do wzbogacania ludzkich limfocytów B w ilości 50 μL/mL całej krwi. Wymieszać dokładnie i inkubować przez 20 min w temperaturze pokojowej.
3. Rozcieńczyć próbkę równą objętością PBS + 2% FBS, delikatnie wymieszać, a następnie ostrożnie nanieść krew na warstwę Ficollu, dbając o to, aby nie przerwać interfejsu. Należy zachować proporcję co najmniej 1 części Ficollu na 2 części rozcieńczonej próbki (t.j. 4 ml Ficoll + 10 ml krwi w probówce 15 ml).
4. Wirować przy 400 x g w temperaturze pokojowej (20 °C) przez 20 min bez hamowania. Komórki mononuklearne znajdą się na granicy faz.
5. Ostrożnie odessaj frakcję pośrednią, aby odzyskać komórki, a następnie przelej je do nowej probówki. Przemyj komórki raz buforem PBS i odwiruj z prędkością 300 x g. 4 °C w ciemności przez 5 min. Osad znajdzie się na dnie.
6. Odlej nadsącz. Resuspenduj osad w pozostałym nadsączu, delikatnie potrząsając probówką palcami. Rozcieńcz osad w 10 ml kompletnego medium RPMI (RPMI 1640 uzupełnione o 10% płodowej surowicy cielęcej i 15 mg/ml gentamycyny) i policz komórki metodą wykluczania błękitu trypanu.

1.2) Ocena czystości

UWAGA: Czystość wszystkich preparatów musi być zawsze powyżej 99%.

1. 100 μl oczyszczonej zawiesiny komórkowej inkubować z następującymi przeciwciałami (dostępnymi komercyjnie; patrz Tabela materiałów): CD3_FITC (5 µl/test), CD14_PE (5 µl/test), CD19_ECD (6 µl/test), CD16-CD56_PC5 (2 µl/test), CD5_PC7 (4 µl/test), przez 20 min w temperaturze 4 °C w probówce do FACS.
2. Próbkę przemyć 4 ml PBS (wirować przez 5 min przy 300 x g), a następnie sprawdzić czystość za pomocą cytometrii przepływowej. Na wykresie zweryfikować procent komórek CLL (> 99%), które koekspresują CD19 i CD5 na swojej powierzchni, jak pokazano na Rysunku 1(6). Upewnić się, że preparaty są praktycznie pozbawione komórek NK, limfocytów T i monocytów, sprawdzając na wykresie procent CD3, CD14 i CD16-56, który powinien być bliski zeru.

1.3) Przechowywanie próbek

1. Do badań proteomicznych zebrać 25 x 10⁶ komórek do probówki 1,5 ml, odwirować komórki przy 300 x g przez 10 min, odrzucić supernatant i liofilizować osad przez 4 hr. Przechowywać w -80 °C do czasu użycia.
2. W przypadku testów walidacyjnych resuspenderć komórki w pełnym medium RPMI (ilość zależy od wybranego dalszego testu) i przejść do Kroku 4.

2. Elektroforeza dwuwymiarowa (2-DE) (Rycina 2)

2.1) Izoelektroogniskowanie (IEF)

1. Zsolubilizuj osady komórek CLL w końcowej objętości 380 μl buforu 2-DE (344 μl roztworu RBthio (9 M Urea, 10 mM Tris, 4% CHAPS), 30 μl 65mM DTT, 6 μl 2% buforu IPG ampholine pH 4-7).
2. Nałóż próbki białek (1 mg) na 18 pasków IPG (pH 4-7) i przeprowadź IEF zgodnie ze standardowym protokołem opisanym przez Conti et al. ¹⁰
3. Równoważ paski w 2 ml buforu równoważącego (EB: 50 mM pH 8.8 bufor Tris-HCl zawierający 6 M urea, 30% glicerolu, 2% SDS), uzupełnionego o 2% świeżego DTT, przez 15 minut w RT. Odlej EB+DTT i dodaj 2 ml EB uzupełnionego o 2.5% jodooctanu. Inkubuj przez 15 min w RT na platformie kołyszącej.

2.2) SDS-PAGE

1. Osuszyć paski na papierze, nie dotykając żelu, aby usunąć nadmiar EB. Nałożyć każdy pasek na górną część żelu do elektroforezy SDS-PAGE o gradiencie 9-16%. Dodać niewielką objętość buforu do elektroforezy SDS (Tris 25 mM, glicyna 192 mM, SDS 0,1% w/v) na górę żelu, aby ułatwić nałożenie paska.
2. Zapieczętować żel, dodając ~5 ml roztworu agaru (0,8%), aby zapobiec wypływaniu paska, następnie złożyć urządzenie elektroforetyczne i wypełnić je buforem do elektroforezy SDS. Przeprowadzić rozdzielanie przy natężeniu 60 mA/żel przez 4 hr w temperaturze 4 °C.
3. Wyjąć żel z urządzenia elektroforetycznego i umieścić go w odpowiednim pojemniku do barwienia.

2.3) Barwienie srebrem żelu preparatywnego

FIXER	50% metanol, 12% kwas octowy 0,05% formalina	2 godz. (lub przez noc)*
BUFOR PŁUKĄCY	35% etanolu	20 min (powtórzyć ten krok trzykrotnie)
Uczulanie	0,02% tiosiarczan sodu	2 min
PŁUKANIE	H2O	5 min (powtórzyć ten krok trzykrotnie)
AZOTAN SREBRA	0,2% azotan srebra 0,076% formalina	20 min
PŁUKANIE	H2O	1 min (powtórzyć ten krok dwukrotnie)
WYWOŁYWA CZY**WACZ**	6% węglan sodu, 0,0004% tiosiarczan sodu  0,05% formaliny	Do momentu uzyskania wystarczającego zabarwienia
STOP	50% metanol	30 min
	* 2 h to minimalny czas wymagany do utrwalenia białek

Tabela 1.

UWAGA: Plamki białkowe można uwidocznić, barwiąc żele metodą barwienia srebrem kompatybilną z MS¹¹. Wszystkie roztwory niezbędne do barwienia srebrem wymieniono w Tabeli 1.

1. Przygotować około 200 ml każdego roztworu/żelu i postępować zgodnie ze wskazówkami w Tabeli 1. Ostrożnie wlać każdy roztwór do kuwety do barwienia zawierającej żel. Wszystkie inkubacje przeprowadzać na platformie kołyszącej.
2. Po zabarwieniu usunąć roztwór zatrzymujący i pozostawić żel w 1% kwasie octowym do czasu akwizycji.

2.4) Pozyskiwanie i analiza obrazu żelu

1. Należy pozyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości za pomocą densytometru w ciągu 3 dni od barwienia.
2. Analizę wzorów białkowych 2-D należy przeprowadzić przy użyciu oprogramowania do żeli 2-DE.
   UWAGA: Oprogramowanie to umożliwia szybkie i wiarygodne porównywanie obrazów.
   1. Utwórz projekt, wybierając opcję „create a new project” z menu kontekstowego. Utwórz folder i zaimportuj żele, wybierając opcję „import gel images” dla plików z rozszerzeniem .tif, .png lub .gel.
   2. Po zaimportowaniu żeli i dodaniu ich do obszaru roboczego należy przeprowadzić automatyczną detekcję plamek, zaznaczając żele do analizy i wybierając z menu „edit > spot> detect”.
   3. Następnie należy przeprowadzić odejmowanie tła, wybierając z menu „subtract background”. Uwaga: Po tym kroku możliwe jest porównanie wielu żeli oraz wykrycie różnic lub podobieństw za pomocą analizy ilościowej i/lub jakościowej.

3. Identyfikacja białek za pomocą analizy MALDI-TOF MS (Rysunek 3)

3.1) Trawienie białek

1. Wypłucz żel wodą, a następnie wycinaj interesujące plamki z żeli, korzystając z metody ręcznej (wycinanie czystym skalpelem) lub automatycznej.
2. Przemyj cząsteczki żelu wodą (100-150 μl), odwiruj (30 s przy 400 x g) i odlej ciecz.
3. Dodać taką samą objętość (zależnie od objętości żelu) CH₃Dodaj CN do fragmentów żelu i odczekaj 10–15 min, aż fragmenty żelu się skurczą. Osusz cząsteczki żelu w wirówce próżniowej.
4. Dodać 75-100 µl 10 mM ditiotreitolu rozcieńczonego w 50 mM NH4₄HCO₃ i inkubować przez 30 min w temperaturze 56 °C (Krok redukcji). Ponownie obkurcz fragmenty żelu za pomocą CH₃CN opisany w punkcie 3.1.3.
5. Kontynuuj alkilację, dodając 75-100 µl roztworu 55 mM jodoacetamidu rozcieńczonego w 50 mM NH4HCO3₄HCO₃ i inkubować przez 20 min w temperaturze pokojowej w ciemności.
6. Ponownie skurcz fragmenty żelu za pomocą CH₃CN w objętości wystarczającej do pokrycia fragmentów żelu, zgodnie z opisem w kroku 3.1.3. Osuszyć w wirówce próżniowej.
7. Rehydratować cząsteczki w buforze zawierającym 25 mM NH4Cl₄HCO_3, 5 mM CaCl2₂,_{oraz 12,5 ng/}μl trypsyny w temperaturze 4 °C przez 20 min. Należy użyć takiej objętości buforu, aby zakryć fragmenty żelu. Usunąć niezaabsorbowany nadsącz z fragmentów żelu i dodać 25 mM NH₄HCO_3, 5 mM CaCl2₂ bez użycia trypsyny do pokrycia żelu.
8. Pozostawić próbki w 37 °C od co najmniej 3 godz. (minimalny czas wymagany do trawienia peptydów) do nocy.

3.2) Analiza spektrometrią mas (technika wysuszonej kropli)

1. Nanieś 1 μl każdej próbki na stalową płytkę MALDI i wymieszaj z 1 µl kwasu α-cyjanoforksycinnamicowego jako macierzy, przygotowanej w 50% CH₃CN i 0,1% TFA.
2. Uzyskaj widma mas na spektrometrze mas MALDI–TOF. Zbierz około 200 widm na punkt, dostosowując intensywność lasera tak, aby zapobiec nasyceniu sygnału lub go zwiększyć. Przetwórz widma za pomocą oprogramowania Data Explorer zgodnie z poniższym opisem:
   1. Zaimportuj plik .dat i wykonaj korekcję linii bazowej, wybierając „process > baseline correction”. Kalibruj masy, wykorzystując produkty autolizy trypsyny oraz piki macierzy, wybierając „process > mass calibration > manual calibration”; zaznacz piki bliskie m/z 855,1 oraz 2163,1 poprzez przeciągnięcie lewym przyciskiem myszy i wybierz odpowiadające im masy referencyjne, a następnie kliknij „plot” i „apply calibration” w oknie kalibracji manualnej.
   2. Dostosuj próg detekcji pików („peak > peak detection”), zduplikuj aktywny ślad („display > duplicate active trace”), zaznacz nowy ślad i wykonaj deizotopowanie („peak > deisotoping”). Używając makra „getpeaklist”, wygeneruj listę mas do identyfikacji. W razie potrzeby ręcznie usuń sygnały szumu uznane za piki, aby oczyścić listę i uzyskać lepszą identyfikację.
3. Zidentyfikuj białka poprzez przeszukiwanie kompleksowej, nieredundantnej bazy danych białek przy użyciu silników wyszukiwania ProFound oraz Mascot¹².
   1. We wszystkich wyszukiwaniach zastosuj następujące parametry: jedno pominięte cięcie na peptyd, utlenianie metioniny jako modyfikacja zmienna, karbamidometylowanie cysteiny jako modyfikacja stała oraz początkowa tolerancja masy wynosząca 50 ppm.

4. Analizy aktywności cytoszkieletu (Rysunek 4)

UWAGA: Komórki oczyszczone w kroku 1 należy resuspendować w pełnym medium RPMI (10⁶ komórek/200 μl).

4.1) Test migracji. Badanie to umożliwia ilościową ocenę zdolności migracyjnej analizowanych komórek (limfocytów). Należy użyć komory transwell o średnicy 6,5 mm i rozmiarze porów 5,0 μm oraz przeprowadzić test w trzech powtórzeniach. W przypadku różnych typów komórek należy zoptymalizować rozmiar porów oraz czas migracji (krok 4.1.3).

1. Przygotować dolną komorę, dodając 600 μl kompletnego medium RPMI z lub bez specyficznych stymulatorów (t. j. SDF-1) w celu pomiaru odpowiednio migracji indukowanej i spontanicznej.
2. Nałóż na to górną komorę i pozostaw układ do wyrównania parametrów przez 30 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze.
3. Zasiew 10⁶ komórki/200 μl w górnej komorze (całkowita liczba komórek) i inkubować płytkę przez 4 h w temperaturze 37 °C w inkubatorze.
4. Zdejmij górną komorę, zbierz pożywkę z dolnej komory i raz przemyj dolną komorę 1 ml PBS. Zbierz PBS do probówki.
5. Wirować przez 5 minut przy 300 x g, odlać nadsącz i zawiesić ponownie w 500 μl PBS
6. Za pomocą cytometrii przepływowej należy policzyć liczbę zmigrowanych komórek po 1 minucie akwizycji. W przypadku izolowanej populacji komórek nie jest konieczne dodawanie przeciwciał powierzchniowych. Należy sprawdzić liczbę komórek na dwuwymiarowym wykresie kropkowym (dot plot), uwzględniając rozproszenie boczne (side scatter) komórek oraz liczbę zdarzeń zliczonych w ciągu 1 minuty, która będzie wartością wykorzystaną do obliczeń.
7. Oblicz indeks migracji (MI) według wzoru:
   

4.2) Test adhezji. Test ten pozwala na pomiar zdolności adhezyjnej komórek. Przeprowadzić test w trzech powtórzeniach.

1. Przed pokryciem płytkę 96-dołkową (z płaskim dnem) 50 μl/dołek roztworu 2% BSA-PBS (jako tło) lub 1 μg ICAM-1 rozcieńczonego w PBS, przez noc w temperaturze 4 °C.
2. Przemyć płytkę dwukrotnie PBS-em i zablokować miejsca niespecyficzne, dodając 2% BSA-PBS (100 μl/dołek) na 1 hr w temperaturze 37 °C.
3. W międzyczasie resuspendować komórki w stężeniu 5 x 10⁶/ml w pełnym medium RPMI, oznakować je 1 mM CMFDA-green cell tracker i inkubować przez 30 min w temperaturze 37 °C.
4. Dodać 1 x 10⁶ komórek/dołek do uprzednio pokrytych dołków po odlaniu roztworu blokującego (Krok 4.2.2) i inkubować przez 1 hr w temperaturze 37 °C.
5. Ilościowo określić adhezję za pomocą czytnika ELISA (filtr wzbudzenia: 485 nM, filtr emisji: 535 nM). Wykonać pierwszy pomiar całkowitej liczby komórek wejściowych (INPUT).
6. Delikatnie przemyć płytkę 2% BSA-PBS (200 μl/dołek) 4 razy (x). Wykonać odczyt płytki po każdym etapie płukania (Adhesion_x).
7. Po odjęciu tła dla każdego pomiaru, obliczyć adhezję specyficzną (ADHESION):
   

4.3) Test polimeryzacji. Jest to test kolorymetryczny, który pozwala na ilościowe określenie polimeryzacji F-aktyny. Test należy przeprowadzić w trzech powtórzeniach.

1. Resuspender 1x10^6 komórek w 100 μl uprzednio ogrzanego kompletnego medium RPMI i dodać specyficzny stymulator (i.e. α-IgM 20 μg/ml) na 10 min.
2. Zatrzymać reakcję, dodając 400 μl 4% paraformaldehydu, i utrwalić komórki przez 10 min w RT.
3. Przemyć 3 razy buforem PBS (wirować przy 300 x g przez 5 min w 4 °C).
4. Odlać nadsącz i poddać komórki permeabilizacji przy użyciu PBS-saponiny 0.2% (200 μl) na lodzie przez 2 min.
5. Przemyć 3 razy PBS-saponiną 0.1% (wirować przy 100 x g przez 5 min w 4 °C), odlać nadsącz i resuspender w 100 μl PBS-saponiny 0.1%.
6. Barwić Phalloidin-Alexafluorem 488 (3 μg/ml) przez 30 min w temperaturze pokojowej w ciemności.
7. Przemyć 3 razy PBS-saponiną 0.1%. Odlać nadsącz i resuspender w 300 μl PBS.
8. Ilościowo określić zawartość F-aktyny za pomocą cytometrii przepływowej, obliczając średnią intensywność fluorescencji (MFI) falloidyny. Przeanalizować uzyskane dane na wykresie jednowymiarowym w celu wygenerowania histogramu na podstawie intensywności fluorescencji; wartość MFI zostanie przedstawiona w raporcie z wykresu.
9. Zmierzyć polimeryzację F-aktyny (∆ F-actin) zgodnie z wzorem:
   

Wyniki

Wyizolowaliśmy pierwotne leukemiczne limfocyty B z krwi obwodowej pacjentów z CLL i przeanalizowaliśmy mapy proteomiczne. Próbki (n = 104) podzielono na dwie główne podgrupy na podstawie cech klinicznych każdego pacjenta (zła prognoza vs dobra prognoza) i przeprowadzono analizę porównawczą żeli 2DE.

Analiza pozwoliła na identyfikację plamek wykazujących różnicową ekspresję pomiędzy dwoma podzespołami (pod względem obecności/braku lub przesunięcia na żelu, co sugeruje zmiany w modyfika...

Dyskusja

Celem niniejszego artykułu jest opisanie zoptymalizowanego protokołu identyfikacji cząsteczek biorących udział w patogenezie PBL, nawet jeśli podejście to można rozszerzyć na inne choroby i/lub inne typy próbek^16-18. Porównując profile proteomiczne 2 podgrup pacjentów z PBL, dobre i złe rokowanie¹⁹, wykazaliśmy, że różnią się one statusem fosforylacji HS1 i że jego aktywacja wpływa na zdolność migracji i adhezji komórek białaczkowych.

W odniesieniu do innych meto...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Acetonitryl	MERCK	61830025001730
Wodorowęglan amonu	SIGMA	A6141-500G
1,4-Ditioerytrytol	SIGMA	D9680-5G
Jodoacetamid	SIGMA	I6125-25G
Chlorek wapnia dwuwodny	SIGMA	223506-25G
Trypsyna, klasa sekwencjonowania	ROCHE	11418475001
α- kwas cyjano-4-hydroksycynamonowy	SIGMA	C2020-10G
Kwas trifluorooctowy	SIGMA	T6580
ZipTipµ-C18	MILLIPORE	ZTC18M096
RozetaSep Koktajl wzbogacający ludzkie komórki B	STEMCELL	15064
PBS	EUROCLONE	ECB4004L
FBS	DOMINIQUE DUTSCHER	S1810
Lymphoprep	SENTINEL DIAGNOSTYKA 1114547
Trypan Blue	SIGMA	T8154
CD19	BECKMAN COULTER	082A07770	ECD
CD5	BECKMAN COULTER	082A07754	PC5
CD3	BECKMAN COULTER	082A07746	FITC
CD14	BD	345785	PE
CD16	REDLICA BECKMAN	082A07767	PC5
CD56	REDLICA BECKMAN	082A07789	PC5
Ettan IPGphor 3 Izoelektryczny zespół ostrości	GE-Healthcare	11-0033-64
Mocznik	SIGMA	U6504
Tris-Hcl Bufor	BIO-RAD	161-0799
CHAPS	SIGMA	C2020-10G
DTT	SIGMA	D9163-5G
IPGstrips	GE-Healthcare	17-1233-01	Liniowe pH 4-7 18cm
IPGbuffer	GE-Healthcare	17-6000-86	pH 4-7
Glicerol	SIGMA	G6279
PROTEAN II XL Cell	BIO-RAD	165-3188
SDS	INVITROGEN	NP0001
Akrylamid	BIO-RAD	161-0156
Agarosio	INVITROGEN	16500
Metanol	SIGMA	32213
Kwas octowy	VWR	631000
Formalina	BIO-OPTICAL	05-K01009
Etanol	VWR	9832500
Tiosiarczan sodu	FLUKA	72049
Azotan srebra	FLUKA	85228
Dynamika molekularna Osobisty densytometr laserowy SI	Amersham Biosciences
ImageMaster 2D Platinum 5.0	Amersham Biosciences
Węglan sodu	MERCK	A0250292
MALDI-TOF Voyager-DE STR	Oprogramowanie Applied Biosystems
Data Explorer (wersja 3.2)	Applied Biosystems
transwell chambre o średnicy 6,6 mm	CORNING	3421
RPMI	EUROCLONE	ECB2000L	Z L-GLUTAMINĄ
Gentamyna	SIGMA	G1397
SDF-1	PREPROTECH	300-28A
	BECTON DICKINSON	353072
BSA	SANTA CRUZ	9048-46-8
ICAM-1	R& D Systems	720-IC
CMFDA	Life Thechnology	C7025	Zielona
IgM	SOUTHERNBIOTECH	2020-02
Paraformaldehyd	SIGMA	P6148
Saponina	SIGMA	S-7900
Falloidyna	Terapia życia	A12379	Alexa fluor 488