Pomiar przestrzennych i czasowych sygnałów Ca2+ u rzodkiewnika

Xiaohong Zhu; Aaron Taylor; Shenyu Zhang; Dayong Zhang; Ying Feng; Gaimei Liang; Jian-Kang Zhu

doi:10.3791/51945

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pomiar przestrzennych i czasowych sygnałów Ca²⁺ u rzodkiewnika

11.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51945

⸱

2 września 2014

Xiaohong Zhu¹ , Aaron Taylor² , Shenyu Zhang¹ , Dayong Zhang¹^,³ , Ying Feng¹^,⁴ , Gaimei Liang¹^,⁵ , Jian-Kang Zhu¹^,⁶

¹Department of Horticulture and Landscape Architecture, Purdue University, ²Bindley Bioscience Center, Purdue University, ³Institute of Biotechnology, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, ⁴College of Environmental & Resource Science, Zhejiang University, ⁵Dryland Agriculture Research Centre, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, ⁶Shanghai Center for Plant Stress Biology, Chinese Academy of Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Ca²⁺ reguluje różnorodne procesy biologiczne w roślinach. W tym miejscu przedstawiamy podejścia do monitorowania przestrzennych i czasowych sygnałów Ca^{2 +} wywołanych stresem abiotycznym w komórkach i tkankach rzodkiewnika przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników Ca^{2 +} Aequorin lub Case12.

Streszczenie

Sygnały rozwojowe i środowiskowe wywołują fluktuacje Ca²⁺ w komórkach roślinnych. Specyficzne dla bodźca przestrzenno-czasowe wzorce Ca^{2 +} są wyczuwane przez komórkowe białka wiążące Ca^{2 +}, które inicjują kaskady sygnalizacyjne Ca^{2 +}. Jednak nadal niewiele wiemy o tym, w jaki sposób generowane są specyficzne dla bodźca sygnały Ca²⁺. Specyfikę sygnału Ca²⁺ można przypisać wyrafinowanej regulacji aktywności kanałów^Ca2+ i/lub transporterów w odpowiedzi na dany bodziec. Aby zidentyfikować te składniki komórkowe i zrozumieć ich funkcje, kluczowe jest użycie systemów, które umożliwiają czułe i niezawodne rejestrowanie sygnałów Ca²⁺ zarówno na poziomie tkankowym, jak i komórkowym. Genetycznie kodowane wskaźniki Ca^{2 +}, które są ukierunkowane na różne przedziały komórkowe, zapewniły platformę do obrazowania konfokalnego żywych komórek komórkowych sygnałów Ca^{2 +}. Poniżej opisujemy instrukcje dotyczące korzystania z dwóch systemów detekcji^Ca2+: obrazowania luminescencyjnego Ca²⁺ FAS (sadzonki kleju foliowego) na bazie aequoryny oraz obrazowania fluorescencji konfokalnej Ca²⁺ opartej na case12. Obrazowanie luminescencyjne za pomocą systemu FAS zapewnia proste, niezawodne i czułe wykrywanie przestrzennych i czasowych sygnałów Ca²⁺ na poziomie tkankowym, podczas gdy obrazowanie konfokalne żywych komórek za pomocą Case12 zapewnia jednoczesne wykrywanie cytozolowych i jądrowych sygnałów Ca²⁺ w wysokiej rozdzielczości.

Wprowadzenie

Komórka roślinna reaguje na otoczenie za pomocą sygnalizacji, która koordynuje działania komórki. Wczesnym zdarzeniem sygnalizacji komórkowej w odpowiedzi na bodźce środowiskowe jest przejściowy wzrost Ca^{2 +}. Wzorzec lub sygnatura przejściowego wzrostu stężenia wolnego Ca²⁺ charakteryzuje się jego amplitudą, częstotliwością i czasem trwania. Wyraźne czasoprzestrzenne sygnatury Ca²⁺ regulują różne aktywności komórkowe¹. Określone bodźce, takie jak ciepło, zimno, sól, susza, światło lub hormony roślinne, mogą precyzyjnie dostroić czasoprzestrzenną aktywność kanałów Ca^{2 +} zlokalizowanych w błonie i / lub transporterów, co skutkuje specyficznymi sygnaturami Ca^{2 +}. Chociaż transportery Ca^{2 +} zostały dobrze scharakteryzowane, niewiele wiadomo o tożsamości molekularnej i funkcjach kanałów Ca^{2 +} w roślinach¹. Genetyczne badania przesiewowe dla mutantów ze zmienioną reakcją Ca^{2 +} na bodźce stresowe mogą być skutecznym podejściem do identyfikacji składników składających się na sygnatury Ca^{2 +}. Ostatnio opracowano kilka systemów wykrywania Ca^{2 +} opartych na Aequorin, które ułatwiają genetyczne badania przesiewowe składników sygnałowych Ca^{2 +} w odpowiedzi na atak patogenów i stres abiotyczny^2-4.

Aequorin został po raz pierwszy użyty do wykrywania sygnałów Ca²⁺ w roślinach na początku lat 90.⁵. Od tego czasu Aequorin jest ukierunkowany na różne przedziały komórkowe, takie jak cytoplazma⁵, jądro⁶, chloroplasty⁷, tonoplast⁸, mitochondria⁹ i zrąb¹⁰, a także na różne typy komórek w korzeniu w celu monitorowania specyficznych dla komórki sygnałów Ca^{2 +} ¹¹. Pomiary Ca²⁺ oparte na Aequorin ujawniają przestrzenną i czasową odpowiedź Ca²⁺ populacji komórek na bodźce stresowe. Jednak w większości przypadków odpowiedzi Ca^{2 +} pojedynczych komórek są niezsynchronizowane w reagującej tkance⁴. Dlatego zapis Aequorin Ca²⁺ niekoniecznie zgłasza sygnał Ca²⁺ w poszczególnych komórkach. W ostatnich latach genetycznie kodowane wskaźniki Ca^{2 +} na bazie białek fluorescencyjnych (FP), takie jak żółty kameleon (YCs)¹² i CASEs12¹³, zostały wykorzystane do badania sygnalizacji Ca^{2 +} z wysoką rozdzielczością subkomórkową. YC to wskaźniki Ca^{2 +} oparte na rezonansie fluorescencyjnym (FRET), zawierające warianty CFP i YFP połączone białkiem wiążącym Ca^{2 +} kalmoduliną i peptydem wiążącym kalmodulinę M13. Kalmodulina ulega zmianie konformacyjnej, ponieważ wiąże się z Ca²⁺, zbliżając w ten sposób CFP i YFP do siebie, co skutkuje zwiększonym transferem energii (wzmocniony FRET). Poziom FRET w czasie, obliczony w przybliżeniu jako stosunek intensywności sygnału YFP do CFP, odzwierciedla wewnątrzkomórkową dynamikę Ca^{2 +}. W roślinach zastosowano kilka wersji YC. YC3.6 był ukierunkowany na cytozol^14,15, jądro¹⁶, mitochondria¹⁷ i błonę plazmatyczną¹⁸, a YC4.6 i D4ER były ukierunkowane na ER^15,19, a D3cpv był ukierunkowany na peroksysomy²⁰. Rośliny transgeniczne wykazujące ekspresję YC umożliwiają obrazowanie dynamiki Ca^{2 +} w żywych komórkach w różnych przedziałach komórkowych różnych typów komórek. CASE (przypuszczalnie Calcium sensor) to pojedyncze białka fluorescencyjne z permutacją kołową (cpFP) zawierające kalmodulinę i peptyd wiążący kalmodulinę M13. Po związaniu się z Ca²⁺ CASE ulegają zmianom konformacyjnym, co prowadzi do wzrostu intensywności fluorescencji. Korelacja między reakcją fluorescencyjną CASE a stężeniem Ca²⁺pozwala na ilościowy pomiar wewnątrzkomórkowej dynamiki Ca^{2 +}. Wariant Case12 ma 12-krotnie zwiększoną fluorescencję w formach nasyconych Ca²⁺. Rośliny N. benthiminana przejściowo eksprymujące Case12 lub rośliny Arabidopsis stabilnie eksprymujące Case 12 wykorzystano do badania sygnalizacji Ca^{2 +} w obronie i stresie abiotycznym^4,21. Asynchroniczne przestrzenne i czasowe oscylacje Ca^{2 +} w komórkach reagujących na atak patogenu lub stres odwodnienia ujawniono za pomocą obrazowania Ca^{2 +} opartego na Case12.

Tutaj prezentujemy szczegółowe instrukcje dotyczące obrazowania luminescencyjnego na podstawie Aequorin dynamiki Ca²⁺ specyficznej dla tkanek i bodźców u siewek rzodkiewnika, oraz dla konfokalnego obrazowania cytozolowej i jądrowej dynamiki Ca²⁺ w komórkach korzenia rzodkiewnika wykazujących ekspresję Przypadku 12. Obrazowanie luminescencyjne FAS można dostosować do analizy dynamiki Ca^{2 +} wywołanej stresem w nienaruszonych roślinach lub tkankach nieopisanych tutaj, lub do badania przesiewowego mutagenizowanych populacji roślin Arabidopsis pod kątem mutantów ze zmienionymi sygnałami Ca^{2 +} wywołanymi stresem. Konfiguracja obrazowania Ca^{2 +} na żywych komórkach może być dostosowana do analizy dynamiki Ca^{2 +} w różnych przedziałach subkomórkowych lub w różnych typach komórek przy użyciu innych wskaźników Ca^{2 +}.