Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Sparowane nagrania całych komórek w organotypowych wycinkach hipokampa

15.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51958

⸱

28 września 2014

 ,  ,  , 
1Department of Physiology and Centre for Brain Research, University of Auckland, 2Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Nagrania par to równoczesne nagrania klamrów całych komórek z dwóch synaptycznie połączonych neuronów, umożliwiające precyzyjną elektrofizjologiczną i farmakologiczną charakterystykę synaps między poszczególnymi neuronami. Poniżej opisujemy szczegółową metodologię i wymagania dotyczące ustalenia tej techniki w organotypowych kulturach plastrów hipokampa w dowolnym laboratorium wyposażonym do elektrofizjologii.

Streszczenie

Zapisy par obejmują jednoczesne zapisy klamry całych komórek z dwóch synaptycznie połączonych neuronów, umożliwiając nie tylko bezpośrednią elektrofizjologiczną charakterystykę połączeń synaptycznych między poszczególnymi neuronami, ale także farmakologiczną manipulację neuronu presynaptycznego lub postsynaptycznego. W przypadku przeprowadzania w organotypowych kulturach warstw hipokampa, prawdopodobieństwo, że dwa neurony są połączone synaptycznie, jest znacznie zwiększone. Preparat ten umożliwia identyfikację typów komórek, a neurony zachowują swoją morfologię i właściwości funkcji synaptycznej podobne do tej w natywnej tkance mózgowej. Główną zaletą sparowanych zapisów całych komórek jest bardzo precyzyjna informacja, jaką może dostarczyć na temat właściwości transmisji synaptycznej i plastyczności, które nie są możliwe przy użyciu innych, bardziej prymitywnych technik wykorzystujących zewnątrzkomórkową stymulację aksonalną. Sparowane nagrania całych komórek są często postrzegane jako zbyt trudne do wykonania. Chociaż technika ta wiąże się z pewnymi wyzwaniami, nagrania w parach mogą być wykonywane przez każdego, kto jest przeszkolony w zaciskaniu łatek na całe komórki, pod warunkiem przestrzegania określonego sprzętu i kryteriów metodologicznych. Prawdopodobieństwo uzyskania synaptycznie połączonych sparowanych zapisów znacznie wzrasta w przypadku zdrowych wycinków organotypowych i stabilnej mikromanipulacji umożliwiającej niezależne osiągnięcie pre- i postsynaptycznych zapisów całych komórek. Podczas gdy pary komórek piramidalnych CA3-CA3 są najczęściej stosowane w organotypowym preparacie hipokampa w warstwach, technika ta odniosła również sukces w parach CA3-CA1 i może być dostosowana do dowolnych neuronów, które są synaptycznie połączone w tym samym preparacie plasterka. W tym manuskrypcie przedstawiamy szczegółową metodologię i wymagania dotyczące ustanowienia tej techniki w każdym laboratorium wyposażonym w elektrofizjologię.

Wprowadzenie

Receptory glutaminianu pośredniczą w większości pobudzającej transmisji synaptycznej w synapsach ośrodkowego układu nerwowego. Dwa główne podtypy jonotropowych receptorów glutaminianu zlokalizowanych w głowie kręgosłupa błony postsynaptycznej to receptory kwasu N-metylo-D-asparaginianu (NMDA) i α-amino-3-hydroksy-5-metyloizoloksazolo-4-proprionowego (AMPA). Przy spoczynkowych potencjałach błonowych receptory AMPA przenoszą większość prądu postsynaptycznego podczas transmisji synaptycznej. W hipokampie receptor NMDA odgrywa kluczową rolę w wyzwalaniu zmian w liczbie receptorów AMPA w błonie postsynaptycznej: działając jako "detektor koincydencji"1 w celu zainicjowania zmian w sile synaptycznej1, receptor NMDA uczestniczy w mechanizmach synaptycznych, które, jak się uważa, stanowią podstawę uczenia się i pamięci na poziomie subkomórkowym. W odpowiedzi na depolaryzację neuronu postsynaptycznego równolegle z uwalnianiem przekaźnika presynaptycznego, wapń dostaje się przez receptor NMDA, aby zainicjować insercję lub usunięcie receptora AMPA2. Ta dynamika receptorów leży u podstaw plastyczności synaps: wzrost siły synaps to długoterminowe wzmocnienie2,3 (LTP), podczas gdy spadek siły synaptycznej to długotrwała depresja4 (LTD). Dlatego uważa się, że ruch receptora AMPA jest odpowiedzialny za ekspresję plastyczności synaptycznej, podczas gdy receptory NMDA kontrolują jego indukcję.

Określenie dokładnych mechanizmów leżących u podstaw transmisji synaptycznej i plastyczności wymaga zbadania małych populacji synaps, najlepiej pojedynczych synaps. Podczas gdy niektóre synapsy doskonale nadają się do badania na tym poziomie, np. Kielich Held5, dla większości populacji synaptycznych jest to niezwykle trudne ze względu na mały i rozproszony charakter połączeń synaptycznych. Opracowano dwie główne techniki elektrofizjologiczne w celu zbadania pojedynczych połączeń synaptycznych: Pierwszą z nich jest minimalna stymulacja, w której zakłada się, że jedno włókno presynaptyczne jest stymulowane zewnątrzkomórkowo. Drugą techniką są nagrania sparowane, w których wykonywane są dwa jednoczesne nagrania całych komórek z neuronów połączonych synaptycznie. Główną zaletą minimalnej stymulacji jest to, że jest ona szybka i stosunkowo prosta do wykonania, polegająca na umieszczeniu zewnątrzkomórkowej elektrody stymulującej w przewodzie aksonalnym przy jednoczesnym zapisie z neuronu postsynaptycznego. Podstawowym problemem przy stosowaniu tej techniki jest to, że rzadko można zagwarantować niezawodną stymulację pojedynczej komórki, próba po próbie.

W ciągu ostatnich piętnastu lat rutynowo korzystaliśmy z par nagrań całych komórek z dwóch synaptycznie połączonych neuronów piramidowych6-17. Główną zaletą tej techniki jest to, że tylko jeden neuron presynaptyczny jest konsekwentnie i niezawodnie stymulowany. Pozwala również nie tylko na charakterystykę elektrofizjologiczną, ale także na farmakologiczną manipulację neuronem presynaptycznym6,18. Jednak prawdopodobieństwo połączeń synaptycznych między neuronami jest niskie, co utrudnia uzyskanie połączonych par19. Zastosowanie organtypowych kultur warstw mózgu pozwala ominąć tę przeszkodę, ponieważ połączenia synaptyczne mogą zostać przywrócone in vitro, a ponadto charakter powstałej łączności jest podobny do tej w natywnej tkance mózgowej20. Ponadto kultury organotypowe wyrażają LTP, LTD7-10,12-15,21 i dodatkowe formy krótkotrwałej plastyczności synaptycznej, w tym ułatwienie par impulsów (PPF) i depresję (PPD)6,22,23, umożliwiając badanie mechanizmów plastyczności w parach neuronów. Poniżej opisujemy szczegółową metodologię związaną z pomyślnym uzyskaniem sparowanych nagrań w tym systemie in vitro. Informacje te można łatwo zaadaptować do innych systemów eksperymentalnych, w tym ostrych wycinków i innych obszarów mózgu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Oświadczenie o etyce zwierząt:

Protokoły opisane w tym manuskrypcie są zgodne z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami ustalonymi przez Uniwersytet w Auckland i Uniwersytet Stanforda. Szczenięta szczurów P7 zostały poddane eutanazji przez szybkie ścięcie. Następnie natychmiast wykonuje się rozwarstwienie hipokampa, jak opisano poniżej.

1. Organotypowa kultura plastrów hipokampa

  1. preparat
    1. Przygotować pożywkę preparacyjną (używaną tylko do preparowania mózgu). Połączyć 200 ml minimum pożywki niezbędnej, 2 ml roztworu penicyliny i streptomycyny (po 10 000 jednostek każdego w 0,85% NaCl), 5 ml roztworu buforowego HEPES, 2 ml roztworu podstawowego 1 M Tris (pH 7,2) i wysterylizować filtrem z filtrem 0,22 μm. Przeprowadź sekcję hipokampa w lodowatym podłożu preparacyjnym.
    2. Ostudzić podłoże preparacyjne. Umieść pożywkę preparacyjną w zamrażarce na około 1 godzinę przed rozpoczęciem sekcji, aż płyn będzie bardzo zimny. Nie pozwól, aby tworzyły się duże kryształki lodu. Przechowywać na lodzie do czasu, aż będzie to wymagane.
    3. Przygotuj pożywkę hodowlaną (używaną do wszystkiego z wyjątkiem rozcinania hipokampów). Połącz 100 ml minimalnej pożywki niezbędnej (1x stężenie, płyn) z solami Hanka, z L-glutaminą, 2 ml roztworu penicyliny i streptomycyny (płyn, po 10 000 jednostek każdy, w 0,85% NaCl), 2,5 ml roztworu buforowego HEPES 1 M, 50 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka, 50 ml surowicy końskiej (zdefiniowanej, inaktywowanej termicznie) i sterylizuj filtrem z filtrem 0,22 μm.
    4. Przygotuj potrawy z kultur. Umieścić 1 ml pożywki hodowlanej na naczyniu hodowlanym o średnicy 35 mm i dodać wkładkę membranową do każdego naczynia. Umieść do siedmiu takich szalek na jednej szalce Petriego o średnicy 150 mm (zwanej dalej "talerzem"). Umieścić płytkę w inkubatorze CO2 na co najmniej godzinę przed rozpoczęciem sekcji, aby pożywka hodowlana w naczyniach osiągnęła odpowiednią temperaturę i pH.
  2. Wypreparowanie hipokampów od szczeniąt szczurów w 7. dniu po urodzeniu (P7)
    1. Przed zabiegiem należy wstępnie wysterylizować wszystkie narzędzia do preparowania w świetle UV.
    2. Po szybkim ścięciu głowy usuń mózg i umieść go w schłodzonym podłożu w jednym naczyniu, a następnie wyjmij go na kawałek zwilżonej bibuły filtracyjnej w celu sekcji. Oderwij korę mózgowia od śródmózgowia za pomocą, gładkich, pokrytych tworzywem sztucznym miniaturowych szpatułek, odsłaniając hipokamp. Przetnij sklepienie, a następnie delikatnie przełóż szpatułkę pod hipokampem, aby ją odchylić (ryc. 1A).
      UWAGA: Udane kultury plastrowe można przygotować przy użyciu zwierząt do P10.
    3. Przytnij odizolowany hipokamp z dala od reszty mózgu. Przenieś hipokampy do nowego naczynia zawierającego schłodzone podłoże preparacyjne za pomocą zwilżonego miękkiego pędzla (np. białego sobola #4).
    4. Podczas preparacji należy oczyścić spód (tj. bardziej płaską stronę) hipokampa splotu naczyniówkowego, ponieważ te gąbczaste, przypominające opony mózgowe tkanki utrudniają późniejsze oddzielenie od siebie wycinków hipokampa.
      UWAGA: Pozostaw te chusteczki na miejscu, jeśli nie można ich delikatnie usunąć.
    5. Wykonaj całą sekcję tak szybko, jak to możliwe, nie uszkadzając hipokampa.
      UWAGA: Staranna sekcja jest ważniejsza niż szybka, o ile warunki eksperymentalne są schłodzone. Pokrój hipokampy z trzech szczurów jednocześnie. Nie ma to wpływu na zdrowie plastrów, o ile całkowity czas od rozpoczęcia do momentu, gdy platerowane plastry trafiają do inkubatora, jest krótszy niż 30 minut.
  3. Krojenie
    1. Pokrój hipokampy poprzecznie na przekroje 400 μm za pomocą ręcznej krajalnicy do tkanek. Metoda, za pomocą której przeprowadza się krojenie, nie jest ważna, o ile nie jest nadmiernie uszkadzająca dla tkanki i wytwarza plastry o stałej grubości z łatwo widoczną architekturą laminarną (tj. róg Ammona jest łatwo widoczny jako zachowany w tkance).
    2. Połóż hipokampy na stoliku rozdrabniacza tkanek na wierzchu potrójnej grubości bibuły filtracyjnej #2. Hipokampy są krojone w całości, bez usuwania jakichkolwiek plasterków pojedynczo (tj. cały hipokamp pozostawia się na etapie rozdrabniania, dopóki wszystkie kawałki nie zostaną wykonane; w tym momencie przypomina się raczej bochenki pokrojonego chleba; Rysunek 1B).
    3. Przenieś hipokampy do podłoża preparacyjnego za pomocą miękkiego pędzla umieszczonego obok każdego hipokampa (biały sobol #2). Delikatnie popchnij każdy hipokamp na bok, aby przerwać przyleganie między hipokampem a leżącą poniżej bibułą filtracyjną. Przetocz szczotkę pod każdym hipokampem, aby podnieść go ze sceny. Umieścić wszystkie hipokampy na tej samej szalce Petriego o średnicy 35 mm ze schłodzonym podłożem preparacyjnym. Podziel hipokampy na pojedyncze plasterki, ręcznie mieszając naczynie naprzemiennie ruchami zgodnie z ruchem wskazówek zegara i przeciwnie do ruchu wskazówek zegara.
    4. Zbadaj plastry pod mikroskopem preparacyjnym i odrzuć te, które są uszkodzone, małe lub które nie mają wyraźnie widocznych warstw ciała komórek.
      UWAGA: Często zdarza się, że nie wszystkie plasterki zostaną w ten sposób skutecznie oddzielone od swojego rodzeństwa. W takim przypadku można je rozdzielić, obracając je na krawędzi i szturchając końcówkami cienkich kleszczy. "Dobre" plastry są następnie przenoszone na inną czystą szalkę Petriego zawierającą schłodzone podłoże preparacyjne za pomocą odciętej i wypolerowanej ogniowo pipety Pasteura (ryc. 1C-E).
  4. składowanie
    1. Umieść poszczególne plastry na wkładach filtra membranowego. Używając pipety Pasteura odciętej i wypolerowanej ogniowo, aby uzyskać większy otwór, pojedynczo przenieś plastry do wkładek hodowlanych.
      UWAGA: Ważny jest rozmiar otworu powstającego podczas cięcia i polerowania ogniowego pipety. Za małe, a plastry nie opuszczą łatwo pipety na membranę. Zbyt duży i nadmiar płynu umieszcza się na powierzchni membrany wraz z plastrem. Najlepsza średnica otworu to zazwyczaj około połowa średnicy cylindra pipety. Podczas cięcia średnicę tę można wybrać, przecinając w odpowiednim miejscu na stożku pipety.
    2. Przenoszenie plasterków
      1. Najpierw napełnij pipetę podłożem, a następnie zassaj pojedynczą kropelkę przy niewielkich siłach ssania. Dzięki temu plasterek znajduje się w pobliżu otworu pipety i zapobiega zbyt dużemu wydalaniu medium do wkładki w celu umieszczenia plasterka.
      2. Lekko dociśnij bańkę, aby utworzyła małą wiszącą kroplę, pozwól plasterkowi osiąść w tej kropli, a następnie dotknij tej kropli membraną i pozwól plasterkowi "spaść" na membranę. Zazwyczaj na każdej wkładce membranowej umieszcza się trzy plastry.
        UWAGA: Jeśli kropla płynu jest zbyt duża, kropelki z trzech plasterków mają tendencję do łączenia się na powierzchni membrany, a zatem wszystkie plastry zgromadzą się do środka membrany, co utrudni ich oddzielenie w celu późniejszego zapisu elektrofizjologicznego.
    3. Usuwanie płynów
      1. Odessać nadmiar pożywki z górnej części wkładki płytki hodowlanej dla wszystkich plasterków na tej płytce (3 plastry na wkładkę = 21 plastrów na płytkę), tak aby plastry nie były zanurzone w kałuży pożywki preparacyjnej ani otoczone nią.
      2. Wykonaj to za pomocą nieoszlifowanej, ale wypolerowanej ogniowo pipety Pasteura. Pozwól plasterkowi osiąść i przylgnąć do membrany przez minutę przed pipetowaniem. Uważaj, aby nie zassać plasterka do pipety. Przeprowadzić usuwanie płynu z wkładek, które są platerowane jako pierwsze, aby zapewnić wystarczająco dużo czasu, aby plastry osiadały.
    4. Przechowywanie plasterków
      1. Przechowywać kultury w plastrach w inkubatorze o stężeniu 5,0% CO2 w temperaturze 37 °C. Obserwuj ostateczny układ kultur na rysunku 1E. Poszczególne plastry spoczywają na wkładce płytki hodowlanej, która ma porowatą membranę jako dno, a wkładka ta mieści się w szalce Petriego wypełnionej niewielką ilością pożywki; W ten sposób plastry nie są zanurzane w pożywce, ale mają do niej dostęp tylko przez membranę na dnie wkładki z płytką hodowlaną.
      2. Opcjonalnie można usunąć plastry do badań, wyjmując wkładkę z płytki hodowlanej lub wycinając fragment membrany wkładki zawierający plasterek.
  5. konserwacja
    1. Wymień pożywkę na szalkach Petriego następnego dnia po zrobieniu kultur. Przenieść wkładkę płytki hodowlanej na nową płytkę Petriego zawierającą 1 ml świeżej pożywki hodowlanej, którą równoważy się w inkubatorze przez co najmniej godzinę przed przeniesieniem.
    2. Ponownie zmień podłoże w ten sam sposób trzeciego dnia po zrobieniu kultur. Trzeciego dnia przenieść kultury do inkubatora o temperaturze 34 °C. Pożywkę należy zmieniać dwa razy w tygodniu (co 3-4 dni).
    3. Zidentyfikuj zdrowe kultury. Wybierz zdrowe kultury do sparowanych nagrań całych komórek.
      UWAGA: Zdrowe kultury mają dobrze zdefiniowaną krawędź i wyraźnie zdefiniowaną piramidalną warstwę komórkową. Kultury z obecnymi ciemnymi (prawdopodobnie nekrotycznymi) obszarami lub wakuolizowanym wyglądem ze spłaszczonymi granicami są odrzucane. Stosując te kryteria, zwykle dwie trzecie kultur plasterków jest wystarczająco zdrowych, aby można je było rejestrować.
    4. Wykorzystaj te kultury w dość krótkim czasie. Nie należy używać tkanek, które są hodowane dłużej niż dwa tygodnie, ponieważ neurony zaczynają wykazywać lekko epileptyczne zachowanie, które powoli pogarsza się z czasem. Dokładna górna granica przeżycia neuronów nie jest znana, ale możliwe jest zarejestrowanie z funkcjonujących komórek piramidowych dopiero po 16 tygodniach hodowli.

2. Sparowane nagrania całych komórek

  1. ACSF i rozwiązania wewnątrzkomórkowe
    1. Przygotować roztwór elektrody presynaptycznej mieszając (w mM) 120 glukonianu potasu, 40 HEPES, 5 MgCl2, 2 NaATP i 0,3 NaGTP (pH 7,2 z KOH; osmolarność: 290 mOsm). Podczas gdy ten sam roztwór elektrody jest używany do neuronów postsynaptycznych, glukonian cezu (120 mM) jest zwykle używany jako główna sól w elektrodzie postsynaptycznej plus 5 mM QX314.
      UWAGA: Umożliwia to stabilne zaciskanie napięcia przy potencjałach dodatnich w celu rejestrowania postsynaptycznych prądów za pośrednictwem NMDAR8-10,13. Zapobiega również nadpobudliwości neuronu presynaptycznego wywołanej potasem przez wewnętrzny roztwór przepływający z postsynaptycznej elektrody rejestrującej przed wykonaniem uszczelnienia giga omów.
    2. Przygotować postsynaptyczny roztwór elektrody składający się (w mM) ze 120 glukonianu cezu, 40 HEPES, 5 MgCl2, 5 QX314, 2 NaATP i 0,3 NaGTP (pH 7,2 z CsOH; osmolarność: 290 mOsm). Wyciągnij szklane mikroelektrody o rezystancji 5-10 MΩ i napełnij przefiltrowanym roztworem wewnętrznym.
    3. Przygotować sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF) składający się (w mM) z 119 NaCl, 2,4 KCl, 1,3MgSO4, 2,4 CaCl2, 1 Na2HPO4, 26,2 NaHCO3, 11 glukozy, pH 7,4, nasycony 95% O2, 5% CO2 . UWAGA: Jeśli odpowiedzi za pośrednictwem AMPAR muszą zostać zablokowane w celu zbadania EPSC NMDAR, należy dołączyć 10 μM CNQX lub NBQX do ACSF.
  2. Uzyskaj sparowane nagrania całych komórek
    1. Aby zbadać transmisję synaptyczną między dwoma pojedynczymi neuronami, wyznacz jeden neuron jako neuron presynaptyczny i przytrzymaj w zacisku prądu, aby indukować potencjały czynnościowe i zainicjować transmisję synaptyczną.
    2. Oznacz drugi neuron jako neuron postsynaptyczny i trzymaj go w zacisku prądowym lub napięciowym w zależności od informacji wymaganych przez badacza. Uzyskaj szczegółowe badanie prądów glutaminergicznym, z EPSC za pośrednictwem AMPAR badanymi przy -65 mV i EPSC za pośrednictwem NMDAR badanymi przy +30 mV6-16, trzymając neuron postsynaptyczny w zacisku napięciowym
    3. Nawiąż sparowane nagranie. Aby ustanowić sparowany zapis, zawsze najpierw uzyskuje się presynaptyczny zapis całych komórek, co umożliwia uzyskanie wielu sekwencyjnych neuronów postsynaptycznych, aż do uzyskania jednego, który jest połączony synaptycznie. W przypadku przeprowadzania eksperymentów plastyczności synaptycznej szczególnie ważne jest uzyskanie najpierw neuronu presynaptycznego, ponieważ indukcja LTP w neuronie postsynaptycznym musi zostać zainicjowana w ciągu 10 minut od uzyskania zapisów całej komórki, aby zapobiec wypłukiwaniu czynników cytoplazmatycznych wymaganych dla LTP8,19.
    4. Unikaj utraty komórek spowodowanej ruchem. Głównym wyzwaniem podczas wykonywania sparowanych nagrań całych komórek jest uniknięcie zakłóceń wywołanych wibracjami i ruchem pierwszego nagrania całej komórki podczas uzyskiwania drugiego nagrania.
      1. Uzyskaj pierwszy zapis całej komórki, a następnie przesuń soczewkę mikroskopu o 10-200 μm w osi x tak, aby ustalony zapis znajdował się na krawędzi obszaru widocznego na monitorze (rysunek 2A).
      2. Podnieś soczewkę mikroskopu o ~5-10 mm, upewniając się, że ACSF nadal utrzymuje kontakt z soczewką. Zamontuj drugą elektrodę i wprowadź ją do menisku płynu (rysunek 2B).
      3. Przesuń elektrodę w płaszczyźnie x-y, aż znajdzie się bezpośrednio pod ścieżką światła przez soczewkę, ale nadal znacznie powyżej ustalonej elektrody rejestrującej. Gdy elektroda jest widoczna pod mikroskopem, upewnij się, że końcówka znajduje się na dalszej krawędzi monitora, z dala od pierwszej elektrody.
      4. Przesuń drugą elektrodę w dół w kolejności z ostrością mikroskopu, aż obie elektrody znajdą się w tej samej płaszczyźnie ogniskowej. Ważne jest, aby poziom nadciśnienia był wystarczająco silny, aby uniknąć zablokowania końcówki, ale nie za silny, aby zakłócić pierwszy zapis całej komórki. Przekłada się to na dodatnie ciśnienie indukujące ruch w 2-3 neuronach z elektrody, gdy po raz pierwszy wchodzi ona do plasterka.
      5. Zlokalizuj partnera postsynaptycznego w podobnej płaszczyźnie ogniskowej do pierwszego zapisu presynaptycznego (ryc. 2C). Nagrywanie polega na ogół na uzyskiwaniu sparowanych nagrań między neuronami piramidowymi CA3, drugą całą komórką z neuronu 0-200 mm pierwszego nagrania (ryc. 2C, D).
        UWAGA: Transmisja synaptyczna między parami neuronów jest stabilna w okresach do 3-4 godzin przy użyciu tych standardowych technik zapisu całych komórek.
  3. Plastyczność synaptyczna: Raz Po uzyskaniu udanej pary komórek piramidowych połączonych synaptycznie (ryc. 3A,B), zbadaj charakterystykę transmisji synaptycznej i plastyczności.
    1. Indukcja LTP.
      1. Indukuj LTP przez parowanie presynaptycznych potencjałów czynnościowych (1 Hz) z depolaryzacją postsynaptyczną do -10 do 0 mV przez 1 minutę (Figura 3C)7-9,12-14. Zainicjuj parowanie w ciągu 10 minut od włamania do neuronu postsynaptycznego.
        UWAGA: LTP może być również indukowany, gdy oba neurony są utrzymywane w zacisku prądowym, łącząc presynaptyczne i postsynaptyczne potencjały czynnościowe przy 1 Hz przez 1 minutę, z postsynaptycznym potencjałem czynnościowym wywoływanym 10 ms po wstrzyknięciu prądu do neuronu presynaptycznego8.
    2. Dalsze indukowanie LTD przez stymulację o niskiej częstotliwości (LFS) przy 1 Hz w połączeniu z niewielką depolaryzacją neuronu postsynaptycznego do -55 mV przez 5-10 minut (Figura 3C)9.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Łączność synaptyczną stwierdza się poprzez stymulację neuronu presynaptycznego do wygenerowania potencjału czynnościowego za pomocą impulsu prądu depolaryzującego (zazwyczaj 20-50 pA przez 20 msec) podawanego przez elektrodę rejestrującą. Następnie analizowany jest zapis prądu postsynaptycznego pod kątem obecności monosynaptycznego EPSC wywołanego z krótkim (<5 msec) i stałym opóźnieniem względem szczytu presynaptycznego potencjału czynnościowego (Ryc. 3A). W większości eksperymentów przed uzyskaniem ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tutaj opisaliśmy wymagania dotyczące ustanawiania udanych sparowanych zapisów całych komórek w organotypowych kulturach warstw hipokampa. Sparowane zapisy mogą być również wykonywane w wielu preparatach, w tym w ostrych plastrach i systemach hodowli dysocjacyjnych26,27. Chociaż skupiono się tutaj na indukcji dłuższych form plastyczności synaptycznej (a mianowicie LTP i LTD), ważne jest, aby podkreślić, że sparowane zapisy całych komórek w organotypowych, ostrych warstwach i zdysocjowanych preparatach komórkowy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować członkom laboratoriów Montgomery i Madison za pomocną dyskusję. Potwierdzamy finansowanie otrzymane z następujących źródeł w tym badaniu: NFNZ, AMRF, Marsden Fund, HRC i NIH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Minimalne niezbędne średniostabilne mikromanipulatory z napędem silnikowym 
Roztwór penicyliny i streptomycyny Płytka kąpiel tkankowa
buforowy HEPES KameraDIC
1 M RoztwórWzmacniacz
Hank' s Zrównoważony roztwórsoli Komputerowa
surowica dla koni Stół do izolacji drgań
Miniaturowe szpatułkiMikroskop pionowy
Miękki pędzelpozyskiwania i analizy danych
Ręczny rozdrabniaczŚciągacz elektrod
# 2 BibułaKlatka Faradaya
# 5 Kleszcze
Wkłady membranowe Inkubator
CO2 Kaptur
preparacyjny
klasy II
Roztwór podstawowy Tris powlekane tworzywem sztucznym do do tkanek filtracyjna

Bibliografia

  1. Dingledine, R., Borges, K., Bowie, D., Traynelis, S. F. The glutamate receptor ion channels. Pharmacology Reviews. 51, 7-61 (1999).
  2. Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Long-term potentiation - A decade of progress. Science. 285, 1870-1874 (1999).
  3. Bliss, T. V. P., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. Journal of Physiology. 232, 331-356 (1973).
  4. Dudek, S. M., Bear, M. F. Homosynaptic long-term depression in area CA1 of hippocampus and effects of N-methyl-D-aspartate receptor blockade. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 89, 4363-4367 (1992).
  5. Borst, J. G., Soria van Hoeve, J. The calyx of held synapse: from model synapse to auditory relay. Annual Reviews in Physiology. 74, 199-224 (2012).
  6. Pavlidis, P., Madison, D. V. Synaptic transmission in pair recordings from CA3 pyramidal cells in organotypic culture. Journal of Neurophysiology. 81, 2787-2797 (1999).
  7. Pavlidis, P., Montgomery, J. M., Madison, D. V. Presynaptic protein kinase activity supports long-term potentiation at synapses between individual hippocampal neurons. Journal of Neuroscience. 20 (12), 4497-4505 (2000).
  8. Montgomery, J. M., Pavlidis, P., Madison, D. V. Pair recordings reveal all-silent synaptic connections and the postsynaptic expression of long-term potentiation. Neuron. 29, 691-701 (2001).
  9. Montgomery, J. M., Madison, D. V. State-dependent heterogeneity in synaptic depression between pyramidal cell pairs. Neuron. 33, 765-777 (2002).
  10. Montgomery, J. M., Selcher, J. C., Hansen, J. E., Madison, D. V. Dynamin-dependent NMDAR endocytosis during LTD and its dependence on synaptic state. BMC Neuroscience. 6, 48(2005).
  11. Waites, C. L., et al. Synaptic SAP97 isoforms regulate AMPA receptor dynamics and access to presynaptic glutamate. Journal of Neuroscience. 29 (14), 4332-4345 (2009).
  12. Emond, M., et al. AMPA receptor subunits define properties of state-dependent synaptic plasticity. Journal of Physiology. 588, (Pt 11) 1929-1946 (2010).
  13. Li, D., et al. SAP97 directs NMDA receptor spine targeting and synaptic plasticity. Journal of Physiology. 589, (Pt 18) 4491-4510 (2011).
  14. Genoux, D., Bezerra, P., Montgomery, J. M. Intra-spaced stimulation and protein phosphatase 1 dictate the direction of synaptic plasticity. European Journal of Neuroscience. 33 (10), 1761-1770 (2011).
  15. Selcher, J. C., Xu, W., Hanson, J. E., Malenka, R. C., Madison, D. V. Glutamate receptor subunit GluA1 is necessary for long-term potentiation and synapse unsilencing, but not long-term depression in mouse hippocampus. Brain Research. 1435, 8-14 (2012).
  16. Arons, M. H., et al. Autism-associated mutations in ProSAP2/Shank3 impair synaptic transmission and neurexin-neuroligin-mediated transsynaptic signaling. Journal of Neuroscience. 32 (43), 14966-14978 (2012).
  17. Montgomery, J. M., Madison, D. V. Discrete synaptic states define a major mechanism of synapse plasticity. Trends in Neuroscience. 27 (12), 744-750 (2004).
  18. Miles, R., Poncer, J. C. Pair recordings from neurones. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 387-394 (1996).
  19. Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations and LTP. Science. 252 (5006), 722-724 (1991).
  20. Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends in Neuroscience. 20 (10), 471-477 (1997).
  21. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
  22. Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Paired-pulse facilitation and depression at unitary synapses in rat hippocampus: quantal fluctuation affects subsequent release. Journal of Physiology. 491, (Pt 1) 163-176 (1996).
  23. Debanne, D., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Cooperative interactions in the induction of long-term potentiation and depression of synaptic excitation between hippocampal CA3-CA1 cell pairs in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 93 (20), 11225-11230 (1996).
  24. Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346 (6280), 177-180 (1990).
  25. DeBello, W. M., et al. SNAP-mediated protein-protein interactions essential for neurotransmitter release. Nature. 373 (6515), 626-630 (1995).
  26. Bekkers, J. M., Stevens, C. F. Origin of variability in quantal size in cultured hippocampal neurons and hippocampal slices. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 87, 5359-5362 (1990).
  27. Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations, and LTP. Science. 252, 722-724 (1991).
  28. Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures. Journal of Neurophysiology. 73 (3), 1282-1294 (1995).
  29. Mitra, A., Blank, M., Madison, D. V. Developmentally altered inhibition in Ts65Dn, a mouse model of Down syndrome. Brain Research. 1440, 1-8 (2012).
  30. Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).
  31. Hanson, J. E., Blank, M., Valenzuela, R. A., Garner, C. C., Madison, D. V. The functional nature of synaptic circuitry is altered in area CA3 of the hippocampus in a mouse model of Down's syndrome. Journal of Physiology. 579, 53-67 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Przekaźnictwo synaptyczneelektrofizjologia patch-clampkomórki piramidowe CA3-CA3plastyczność synaptycznapodwójne rejestracje whole-cellminimalny obwód synaptycznyhodowle przekrojów hipokampazestaw elektrofizjologiczny
Sparowane nagrania całych komórek w organotypowych wycinkach hipokampa
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.