Method Article

Metoda badań przesiewowych i walidacji opornych mutacji przeciwko inhibitorom kinaz

DOI:

10.3791/51984

⸱

December 7th, 2014

 ,  ,  , 
1Divisions of Experimental Hematology and Cancer Pathology, Cancer Blood Disease Institute, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pojawienie się genetycznej oporności na terapię inhibitorami kinaz stanowi poważne wyzwanie dla skutecznej terapii przeciwnowotworowej. Identyfikacja i charakterystyka mutacji opornych na nowo opracowany lek pomaga w lepszym zarządzaniu klinicznym i projektowaniu leków nowej generacji. W tym miejscu opisujemy nasz protokół badań przesiewowych in vitro i walidacji opornych mutacji.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odkrycie BCR/ABL jako onkogenu sterującego w przewlekłej białaczce szpikowej (CML) zaowocowało opracowaniem imatynibu, który w rzeczywistości wykazał potencjał celowania w kinazę w nowotworach poprzez skuteczne leczenie pacjentów z CML. Obserwacja ta zrewolucjonizowała opracowywanie leków ukierunkowanych na kinazy onkogenne zaangażowane w różne inne nowotwory złośliwe, takie jak EGFR, B-RAF, KIT i PDGFR. Jednak jedną z głównych wad terapii antykinazowych jest pojawienie się mutacji oporności na leki, które powodują, że cel ma zmniejszone lub utracone powinowactwo do leku. Zrozumienie mechanizmów stosowanych przez oporne warianty nie tylko pomaga w opracowaniu inhibitorów nowej generacji, ale także daje impuls do leczenia klinicznego z wykorzystaniem medycyny spersonalizowanej. Opisaliśmy strategię badań przesiewowych opartą na wektorach retrowirusowych w celu zidentyfikowania spektrum mutacji nadających oporność w BCR/ABL, co pomogło w opracowaniu inhibitorów BCR/ABL nowej generacji. Używając Ruxolitinib i JAK2 jako pary docelowej leku, tutaj opisujemy metody badań przesiewowych in vitro, które wykorzystują mysie komórki BAF3 wyrażające losową bibliotekę mutacji kinazy JAK2.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kinazy białkowe są kluczowymi enzymami regulującymi wewnątrzkomórkowe szlaki transdukcji sygnału, które pozornie modulują każdą funkcję komórkową. Właściwa kontrola sygnalizacji za pośrednictwem kinazy ma kluczowe znaczenie dla homeostazy i rozwoju, który opiera się głównie na prawidłowej regulacji kinaz, fosfataz i ich degradacji przez UPS (system proteasomu ubikwityny). Rozregulowane kinazy znajdują się w centralnym stadium wielu nowotworów i są związane z wieloma chorobami ludzkimi 1. Ludzki genom koduje ponad 500 kinaz białkowych, które zostały powiązane, bezpośrednio lub pośrednio, z ~400 chorobami ludzkimi 2. Obserwacje te potwierdziły koncepcję terapeutycznego celowania w kinazy przez inhibitory małocząsteczkowe 3-5.

Demonstracja inhibitorów kinazy ABL, takich jak Imatinib, w leczeniu przewlekłej białaczki szpikowej (CML) dostarczyła dowodu na słuszność koncepcji tego podejścia6,7. Obserwacja ta nie tylko zrewolucjonizowała terapię antykinazą, ale także wymusiła ideę identyfikacji zmian genetycznych w innych chorobach nowotworowych w celu ukierunkowania terapeutycznego, co doprowadziło do odkrycia onkogennych mutacji w JAK2 od czerwienicy prawdziwej (PV) i pacjentów z nowotworami mieloproliferacyjnymi (MPN). Odkrycie to wzbudziło duże zainteresowanie leczeniem MPN poprzez celowanie w JAK2 za pomocą inhibitorów kinaz małocząsteczkowych. Obecnie prawie tuzin inhibitorów JAK2 jest w badaniach klinicznych, a jeden z nich został niedawno zatwierdzony do leczenia zwłóknienia szpiku. Podczas gdy specyficzne ukierunkowanie na kinazy onkogenne przez inhibitory małocząsteczkowe w nowotworach przynosi obiecujące wyniki, cierpi również z powodu rozwoju oporności na leczenie. W rzeczywistości, do tej pory u pacjentów leczonych inhibitorami kinaz, takimi jak imatynib, gefitynib, erlotynib i dazatynib, rozwijały się mutacje oporności, głównie poprzez nabywanie mutacji w domenie kinazy, do której lek jest skierowany 8-10. Oporność w wyniku mutacji genowej uwypukla ograniczenia celowanej monoterapii przeciwko kinazom onkogennym i stanowi kolejne wyzwanie w rozwoju coraz skuteczniejszej chemioterapii nowotworów. Mechanistyczne i funkcjonalne konsekwencje lekooporności powinny stanowić uzasadnienie dla wyboru i projektowania uzupełniających się związków do opracowywania leków. Mutacje zidentyfikowane za pomocą badań przesiewowych in vitro wykazały wysoki stopień korelacji z mutacjami stwierdzonymi u pacjentów. W związku z tym badania przesiewowe in vitro w kierunku mutacji, które nadają lekooporność na daną parę docelową leku w rozwoju klinicznym lub przedklinicznym, pomagają w identyfikacji wzorców oporności, które mogą powodować nawrót kliniczny. Identyfikacja tych zmutowanych form jest nie tylko pomocna w monitorowaniu pacjentów pod kątem odpowiedzi na lek i nawrotu, ale także ma zasadnicze znaczenie dla projektowania bardziej wytrzymałych inhibitorów nowej generacji. Na przykład opracowanie inhibitorów BCR/ABL nowej generacji, nilotynibu i ponatynibu, było możliwe dzięki lepszemu zrozumieniu mechanistycznemu uzyskanemu dzięki badaniom mutagenezy, strukturalnym i funkcjonalnym.

Wcześniej, opisaliśmy wyniki naszego badania przesiewowego z wykorzystaniem mutagenezy losowej BCR/ABL, aby ujawnić spektrum mutacji nadających odporność na inhibitory takie jak Imatinib11,12, PD16632612 i AP2416313. Wyniki nie tylko zidentyfikowały mutacje nadające oporność kliniczną i nawrót choroby, ale także dostarczyły mechanistycznego zrozumienia oporności na leki i zasad rządzących funkcją kinazy11,14. W tym miejscu przedstawiamy dodatkowe szczegóły metodologiczne, wykorzystując ruksolitynib i JAK2 jako parę docelową leku, aby umożliwić szersze zastosowanie tej strategii badań przesiewowych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie procedury w tym protokole zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Narodowego Instytutu Zdrowia dotyczącymi etycznego traktowania i opieki nad zwierzętami oraz zgodnie z zatwierdzonym protokołem IACUC dotyczącym użytkowania zwierząt.

1. Utrzymanie linii komórkowej

  1. Hodowla komórek BAF3 w pożywce RPMI-1640 uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą i penicyliną/streptomycyną (100 jednostek/ml i 100 μg/ml) oraz zużytą pożywką hodowlaną komórek Wehi. Hoduj HEK293T komórki w DMEM uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą i penicyliną/streptomycyną (100 jednostek/ml i 100 μg/ml). Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2.

2. Budowa plazmidu

  1. Sklonuj mysz JAK2 i jej onkogenną izoformę JAK2-V617F w pMSCV-puro-GW za pomocą klonazy LR przy użyciu standardowej procedury klonowania rekombinacji.
  2. W celu budowy wektora ekspresji lucyferazy (pMSCV-Luc-Cherry-GW) stosowanego w obrazowaniu in vivo, amplifikuj lucyferazy z wektora pLVX-Tet-ON metodą PCR przy użyciu starterów (LUC-SD / RP TTACAATTTGGACTTTCCG i LUC-SD / FP-CACCATGGAAGACCCAAAAC), a następnie klonowania w pENTR-SD-TOPO w celu wygenerowania pENTR-Luc, który jest używany do przenoszenia genu lucyferazy w wektorze retrowirusowym, pMSCV-Cherry-GW przez klonowanie za pośrednictwem rekombinacji przy użyciu klonazy LR.

3. Przygotowanie biblioteki losowych mutacji, badanie przesiewowe i identyfikacja mutacji

3.1) Losowa mutageneza

  1. Sklonuj na całej długości dzikiego typu JAK2 i mutację V617F do wektora retrowirusowego pMSCV-puro-GW przy użyciu komercyjnej technologii klonowania rekombinacyjnego.
  2. Użyj 1 μg plazmidowego DNA JAK2-V617F do transformacji komórek XL-1 Red E. coli, które są wadliwe w mechanizmach naprawy DNA, co pozwala im na włączenie losowych mutacji podczas replikacji. Mówiąc dokładniej, wymieszaj 50 - 100 ng DNA (więcej niż 100 ng DNA zmniejsza wydajność transformacji) ze 100 μl kompetentnych komórek we wstępnie schłodzonej probówce polipropylenowej i inkubuj na lodzie przez 30 minut, delikatnie wirując co 5 minut. Aby uzyskać dobre pokrycie biblioteki, użyj od czterech do sześciu probówek kompetentnych komórek.
    UWAGA: Więcej niż 100 ng DNA zmniejsza wydajność transformacji
  3. Zanurzyć probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C w celu uzyskania szoku cieplnego trwającego 45 sekund i inkubować na lodzie przez 2 minuty. Następnie dodaj 1 ml pożywki SOC (2,0% tryptonu, 0,5% ekstraktu drożdżowego, 0,05% NaCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4 i 0,4% D-glukozy). Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 225–250 obr./min przez 90 minut.
  4. Płytki z każdej probówki na czterech 10 cm płytkach z agarem LB zawierających 100 μg/ml ampicyliny. Inkubować płytki przez 16-24 godziny w temperaturze 37 °C.
  5. Podążając za widocznymi koloniami, zbierz je, zeskrobując płytki sterylnym skrobakiem do płytek. Zbierz komórki z każdej płytki i wyizoluj plazmidowe DNA za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji plazmidu.
    UWAGA: Zwykle kolonie są mniejsze i potrzebują 18-24 godzin, aby być widocznym, ponieważ są to wolno rosnące szczepy bakteryjne. Na tym etapie należy ocenić niejednorodność mutacji w bibliotece poprzez trawienie restrykcyjne za pomocą częstego obcinacza, takiego jak Sau3A1 lub Taq1, lub sekwencjonowanie.

3.2) Produkcja supernatantów retrowirusowych i transdukcja

  1. Na dzień przed transfekcją rozłóż 4 x 106 komórek HEK 293T na 100 cm szalkach w DMEM zawierających 10% FCS, penicylinę/streptomycynę i 2 mM L-glutaminę.
  2. Następnego dnia wymień pożywkę i przetransfekuj komórki zmutagenizowaną biblioteką pMSCV-JAK2-V617F. Na każdą 10 cm płytkę wymieszać 10 μg DNA (5 μg z biblioteki plazmidów i 5 μg plazmidu z opakowaniami retrowirusowymi, pCLEco) z 40 μl FuGENE do całkowitej objętości 400 μl przy użyciu pożywki DMEM wolnej od surowicy. Inkubować mieszaninę DNA i lipidów przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po 20 minutach dodaj kroplami kompleks DNA-lipid na HEK293T komórek.
  3. Po sześciu godzinach zmienić pożywkę do transfekcji na świeżą pożywkę i inkubować płytki przez 48 godzin w temperaturze 37 °C w celu produkcji wirusa. Po 48 godzinach inkubacji zebrać supernatanty wirusowe przefiltrowane przez filtr akrotarczowy 0,45 μm.

3.3) Wybór odpornych klonów in vitro

  1. W przypadku lekoopornych mutantów JAK2-V617F należy przeprowadzić transdukcję 100 milionów komórek BAF3 za pomocą 100 ml supernatantów wirusa o mianie wirusa 0,5-1 x106. Dokładniej rzecz ujmując, zmieszać 108 komórek ze 100 ml supernatantu wirusa do całkowitej objętości 300 ml za pomocą pożywki RPMI, zawierającej 10% surowicy i 24 μg/ml poliberenu (końcowe stężenie ployberenu wynosi 8 μg/ml). Rozprowadź te mieszalniki komórkowe w wielu sześciodołkowych płytkach (4-5 ml na studzienkę).
  2. Odwirować płytki przy 1,250 x g przez 90 minut w temperaturze 25 °C. Po odwirowaniu inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
  3. Następnego dnia połącz komórki razem i wymieszaj z ruksolitynibem i pożywką zawierającą miękki agar i posiadaj w sześciu dołkach. Dla każdego stężenia leku należy wymieszać 10 ml transdukowanych komórek BAF3 (10-20 milionów komórek) z odpowiednią ilością ruksolitynibu w probówce o pojemności 50 ml. Uzupełnić objętość do 40 ml za pomocą RPMI zawierającego 20% surowicy. Dodać 10 ml 1,2 % agaru do komórek, starannie wymieszać i rozłożyć na płytkach sześciodołkowych.
  4. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez dwa tygodnie. Zbierz odporne kolonie za pomocą końcówek pipet o pojemności 0,2 ml i hoduj je pojedynczo na 24-dołkowych płytkach przez 3-4 dni.
  5. Odporne komórki BAF3 należy zebrać przez odwirowanie przy 450 x g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Wyizoluj genomowe DNA za pomocą komercyjnego zestawu do izolacji genomowego DNA. PCR amplifikuje cDNA JAK2 o pełnej długości ze 100 ng genomowego DNA przy użyciu starterów (mJAK2FP-ATGGCCTGCCTTACAATGACAG i mJAK2RP-GGTTCTGGAAGTCTGCTTGG) oraz systemów PCR o wysokiej wierności z długimi matrycami.
  6. Oddzielić produkty PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Usunąć 3,4 kb prążka DNA reprezentującego ramkę kodującą JAK2 i wyizolować DNA za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji żelem. Sekwencjonuj całą długość cDNA za pomocą 8 wewnętrznych starterów (P1 - P8) obejmujących sekwencję kodującą i analizuj sekwencje za pomocą komercyjnego oprogramowania.

4. Walidacja in vitro opornych mutacji

Wiele klonów komórkowych posiada więcej niż jedną mutację, Aby przetestować udział każdej mutacji w fenotypie odporności, wygeneruj wybrane warianty przez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce, używając plazmidu pMSCV-JAK2V-617F jako szablonu.

  1. Przeprowadź mutagenezę ukierunkowaną na plazmid pMSCV-JAK2-V617F przy użyciu komercyjnego zestawu mutagenezy i oligonukleotydów zaprojektowanych do tworzenia mutacji punktowych. Potwierdź tożsamość zmutowanych klonów poprzez sekwencjonowanie.
  2. Transdukuj komórki BAF3 za pomocą retrowirusów wykonanych przy użyciu zmutowanych plazmidów, a następnie selekcji za pomocą puromycyny w dawce 1 μg / ml.
  3. Płytka 104 komórek BAF3-JAK2-V617F (50 μl RPMI z 10% FCS) do każdego dołka na 96-dołkowej płytce. Oddzielnie dodać 50 μl pożywki zawierającej ruksolitynib do studzienek w poprzek płytki (końcowe stężenie: 0, 1, 3, 5, 10 i 20 μM) i inkubować płytki przez 60 godzin w temperaturze 37 °C.
  4. Ocenić żywotność komórek, dodając 10 μl odczynnika WST-1 do każdego dołka, a następnie inkubować w temperaturze 37°C przez 2-4 godziny. Zapisać absorbancję przy A450 za pomocą czytnika płytek. Wykonać wszystkie testy w trzech egzemplarzach i wykreślić uśrednioną absorbancję w stosunku do stężeń INCB018424. Wykonaj najlepiej dopasowaną krzywą sigmoidalną przy użyciu algorytmu dopasowania krzywej nieliniowej. Oceń stężenie leku powodujące 50% żywotność komórek jako komórkowego IC50.
  5. Następnie umieść sześć milionów komórek BAF3 eksprymujących warianty JAK2 na sześciodołkowych płytkach w pożywce RPMI zawierającej 10% surowicy ze wzrostem stężenia ruksolitynibu i inkubuj przez 4-6 godzin w temperaturze 37 °C.
  6. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 450 x g przez pięć minut w temperaturze 4 °C. Przemyć komórki jeden raz PBS i poddać lizie w 20 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 5 mM EDTA, 1mM EGTA, 1 mM fluorku sodu, 2 mM wanadanu sodu i 5% glicerolu uzupełnionego koktajlem inhibitorów proteazy i inhibitorami fosfatazy. Sonikuj zawiesinę komórek przez 1 minutę, a następnie dodaj 5x bufor ładujący żel (350 mM Tris-HCl [pH 6,8], 500 mM DTT, 15% SDS, 10 mM Benzamidyny, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 5 mM Wanadan sodu, koktajl proteazy, 50% glicerolu i 0,001% błękitu bromofenolowego) i denaturację w temperaturze 70 °C przez 5-10 min.
  7. Rozpuścić białka na 8% żelu poliakryloamidowym SDS w warunkach denaturacji. Wykonaj immunoblotting za pomocą mysiego monoklonalnego anty-phopsho STAT5. Usuń skrzepy i ponownie poddaj je poliklonalnemu przeciwciału anty-SATA5 królika. Wizualizacja pasm za pomocą odczynników ECL zgodnie z zaleceniami dostawcy.

5. Walidacja in vivo

  1. Transdukuj komórki BAF3 eksprymujące lucyferazy i wiśnię (transdukowane retrowirusami wykonanymi z pMSCV-Luc-cherry GW) z wirusami eksprymującymi JAK2-V617F i opornymi wariantami. Wybierz komórki, które przetrwają selekcję puromycyny pod kątem ekspresji JAK2 i jego wariantów oporności.
  2. Wstrzyknij dwa miliony aktywnie rosnących komórek BAF3-Luc / wiśni przenoszących JAK2-V617F i jego oporne warianty w 200 μl PBS do 6 myszy Balb / C poprzez wstrzyknięcie żyły ogonowej.
  3. Po trzech dniach od przeszczepu komórek należy wstrzyknąć myszom ruksolitynib (100 mg/kg) dwa razy dziennie przez dwa tygodnie.
  4. Wykonaj obrazowanie bioluminescencyjne oparte na lucyferazie za pomocą systemu obrazowania. .
    1. Krótko mówiąc, przygotuj roztwór lucyferyny, rozpuszczając 300 mg do 25 ml sterylnej wody dejonizowanej, porcjuj w mniejszych objętościach i przechowuj.
      UWAGA: Lucyferynę należy przechowywać w temperaturze -80 °C i chronić przed światłem do czasu użycia.
    2. Wstrzyknąć 250 μl każdej myszy za pomocą IP, aby osiągnąć 125 mg/kg dla każdej myszy. Znieczulij myszy z tej samej grupy razem za pomocą wziewnego izofluranu (1,5%-2,0%) w szczelnie zamkniętym pudełku. Nałóż maść weterynaryjną na oko, aby zapobiec wysuszeniu.
      UWAGA: Czas potrzebny myszom na sen (10-15 minut) pozwolił na osiągnięcie szczytu aktywności lucyferyny. Utrzymuj spójny czas między grupami, aby uniknąć różnic.
  5. Natychmiast przenieś myszy do etapu komory obrazowania i utrzymuj znieczulenie na poziomie 1,5-2% izofluoranu podczas zabiegów obrazowania. Myszy obrazowe z sekwencyjną ekspozycją 0,1, 0,5, 1, 5, 30, 60 i 300 s. Rejestruj obrazy i określaj ilościowo intensywność bioluminescencji za pomocą oprogramowania do akwizycji i analizy obrazów. Po obrazowaniu przywróć myszy z powrotem do klatki.
  6. Ponadto, in vivo chimeryzm zbiera wszystkie komórki szpiku kostnego. Poddaj myszy eutanazji za pomocą CO2 przez 5 minut, a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Zbierz kości i zmiażdż w 4 ml zimnego PBS, aby zebrać szpik kostny. Przeanalizuj procent komórek wiśniowo-dodatnich pod mikroskopem fluorescencyjnym i określ ilościowo za pomocą FACS. Zbierz dwadzieścia tysięcy zdarzeń z każdej próbki.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pojawienie się mutacji genetycznych stanowi wielkie wyzwanie dla celowanej terapii antykinazowej. Badania nad mutacjami, oprócz dostarczania mechanistycznych i funkcjonalnych informacji, które odgrywają zasadniczą rolę w wyborze i projektowaniu opracowywania leków nowej generacji, umożliwiają również lepsze zarządzanie kliniczne i mogą w przyszłości być bardziej pomocne w spersonalizowanym leczeniu. W tym eksperymencie pokazujemy badania przesiewowe w kierunku mutacji oporności na ruksolitynib w kinazie JAK2-V617F (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sukces kliniczny imatynibu w leczeniu CML wykazał nie tylko potencjał celowania w kinazy różowe przez inhibitory małocząsteczkowe, ale także ujawnił ograniczenia terapii celowanej: nawrót kliniczny i pojawienie się mutacji oporności na leki w genie docelowym. Identyfikacja mutacji oporności pomaga w lepszym zarządzaniu klinicznym i opracowywaniu inhibitorów nowej generacji. Protokół ten opisuje metodologię identyfikacji mutacji lekoopornych w docelowym genie. Metoda ta wykorzystuje losowo zmutowaną bibliotekę plazmidów w...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez granty dla M.A. z NCI (1RO1CA155091), NHLBI (1R21HL114074) i Fundacji Badań nad Leukemią. M.A. jest laureatem nagrody V-Scholar od V- Foundation. Autorzy są wdzięczni dr Sarze Rohrabaugh za redakcję.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Hodowla komórkowa i tkankowa 
Ogniwa BaF3Ogniwa ATCC
HEK293TATCC
pMSCV-JAK2-V617F-puro.GWPrezent od Rossa Levine'a
pMSCV-JAK2-V617F/Y931C. GWWyprodukowany we własnym zakresie
pMSCV-JAK2-V617F/L983F. GWWyprodukowano we własnym zakresie
pMSCV-JAK2-V617F/P58A. GWWyprodukowano we własnym pMSCV-V617F-Cherry.GW
Wyprodukowano we własnym
zakresie pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GWWyprodukowano we własnym
zakresie pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GWWyprodukowano w domu
pMSCV-Luciferase-puro.GWWyprodukowano w domu
RPMICellgro (corning)15-040-CV
DMEMCellgro (corning)15-013-CV
Penn/StrepCellgro (corning)30-002-CI
FBSAtlanta biologicalS11150
Trypsyna EDTA 1XCellgro (corning)25-052-CI
1x PBSCellgro (corning)21-040-CV
L-GlutaminaCellgro (corning)25-005-CL
PuromycinGibco (life technologies)A11138-03
Siarczan protaminySigmaP33695 mg/ml zapas w wodzie
Roztwór błękitu trypanowego (0,4%)SigmaT8154
DMSOCellgro (corning)25-950-CQC
INCB018424 (Ruxolitinib)ChemieTeK941678-49-5
WST-1Roche11644807001
Filtr dyskowy 0,45 mikronaPALL2016-10
70 mikronów nylonowy sitko komórkoweBecton Dickinson352350
Kultura
XL-1 czerwona E. komórki coliAgilent Tech200129
SOCNew England BiolabsB90920s
AmpicylinaSigmaA0166100 mg/ml roztwór podstawowy 
Bacto agarDifco214050
Wspaniały rosółBecton Dickinson243820
Genemat agarozyE-3119-500
Zestawy
Dneasy Zestaw krwi i tkanekQiagen69506
Rozwiń system PCR z długimi szablonamiKreator 1168134001
System czyszczenia żelu Sv i PCRPromegaA9282
Pure Yield mini system przygotowania plazmiduPCR PromegaA1222
z technologią bramki z pDONR 221 i OmniMAX 2 Kompetentne komórkiInvitrogen12535029
Gateway  LR Clonase Enzyme mix Odczynniki
Mouse
60316 i 60317
Isoflorane (Isothesia TM)Butler Schien29405
Instrumenty
Inkubator CO2 NAPCO serii 8000 WJThermo scientific
Wirówka z wirnikiem kubełkowym 5810REppendorf
TC-10Bio-RADNie jest to konieczne, do zliczania komórek można użyć standardowego hemocytomemetru
bakteryjnaRoche System klonowania Invitrogen 11791019 Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade Promega P1043 1/2 cc Lo-Dose u-100 strzykawka insulinowa 28 G1/2 Becton Dickinson 329461 Mortor tłuczek Coor tek  Automatyczny licznik komórek

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huse, M., Kuriyan, J. The conformational plasticity of protein kinases. Cell. 109, 275-282 (2002).
  2. Melnikova, I., Golden, J. Targeting protein kinases. Nat Rev Drug Discov. 3, 993-994 (2004).
  3. Cohen, P. Protein kinases--the major drug targets of the twenty-first century. Nat Rev Drug Discov. 1, 309-315 (2002).
  4. Dancey, J., Sausville, E. A. Issues and progress with protein kinase inhibitors for cancer treatment. Nat Rev Drug Discov. 2, 296-313 (2003).
  5. Noble, M. E., Endicott, J. A., Johnson, L. N. Protein kinase inhibitors: insights into drug design from structure. Science. 303, 1800-1805 (2004).
  6. Druker, B. J., et al. Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome. N Engl J Med. 344, 1038-1042 (2001).
  7. Druker, B. J., et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nat Med. 2, 561-566 (1996).
  8. Gorre, M. E., et al. Clinical resistance to STI-571 cancer therapy caused by BCR-ABL gene mutation or amplification. Science. 293, 876-880 (2001).
  9. Shah, N. P., et al. Multiple BCR-ABL kinase domain mutations confer polyclonal resistance to the tyrosine kinase inhibitor imatinib (STI571) in chronic phase and blast crisis chronic myeloid leukemia. Cancer Cell. 2, 117-125 (2002).
  10. Branford, S., et al. High frequency of point mutations clustered within the adenosine triphosphate-binding region of BCR/ABL in patients with chronic myeloid leukemia or Ph-positive acute lymphoblastic leukemia who develop imatinib (STI571) resistance. Blood. 99, 3472-3475 (2002).
  11. Azam, M., Latek, R. R., Daley, G. Q. Mechanisms of autoinhibition and STI-571/imatinib resistance revealed by mutagenesis of BCR-ABL. Cell. 112, 831-843 (2003).
  12. Azam, M., et al. Activity of dual SRC-ABL inhibitors highlights the role of BCR/ABL kinase dynamics in drug resistance. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 9244-9249 (2006).
  13. Azam, M., et al. AP24163 inhibits the gatekeeper mutant of BCR-ABL and suppresses in vitro resistance. Chem Biol Drug Des. 75, 223-227 (2010).
  14. Azam, M., Seeliger, M. A., Gray, N. S., Kuriyan, J., Daley, G. Q. Activation of tyrosine kinases by mutation of the gatekeeper threonine. Nat Struct Mol Biol. 15, 1109-1118 (2008).
  15. Soverini, S., et al. Implications of BCR-ABL1 kinase domain-mediated resistance in chronic myeloid leukemia. Leukemia research. 38, 10-20 (2014).
  16. Deshpande, A., et al. Kinase domain mutations confer resistance to novel inhibitors targeting JAK2V617F in myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 26, 708-715 (2012).
  17. Koppikar, P., et al. Heterodimeric JAK-STAT activation as a mechanism of persistence to JAK2 inhibitor therapy. Nature. 489, 155-159 (2012).
  18. Marit, M. R., et al. Random mutagenesis reveals residues of JAK2 critical in evading inhibition by a tyrosine kinase inhibitor. PLoS One. 7, 43437(2012).
  19. Weigert, O., et al. Genetic resistance to JAK2 enzymatic inhibitors is overcome by HSP90 inhibition. The Journal of experimental medicine. 209, 259-273 (2012).
  20. Kesarwani, M., Huber, E., Azam, M. Overcoming AC220 resistance of FLT3-ITD by SAR302503. Blood cancer journal. 3, 138(2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Drug Resistance MutationsKinase Inhibitor ScreeningRandom Mutation LibraryIn Vitro ScreeningSite Directed MutagenesisJAK2 V617FRuxolitinib ResistanceBAF3 CellsRetroviral VectorIC50 Validation

Related Articles