Neurony to złożone komórki, które przenoszą informacje niezbędne do różnych funkcji, w tym czucia, widzenia, ruchu motorycznego, uczenia się i pamięci. Inaczej niż w przypadku innych typów komórek, neurony wydłużają procesy przypominające ramiona, zwane aksonami, tworząc niezbędne autostrady neuronalne do komunikacji. Podczas rozwoju wyspecjalizowane przedziały znajdujące się na końcach rosnących aksonów, zwane stożkami wzrostu, przechodzą przez koncert sygnałów zewnątrzkomórkowych, aby doprowadzić akson do odpowiedniego miejsca docelowego. Skomplikowane mechanizmy molekularne, które leżą u podstaw nawigacji stożka wzrostu, nie są w pełni poznane. Aby lepiej zrozumieć te mechanizmy, badacze wykorzystali modele hodowli komórkowych do badania neuronów w zdefiniowanym i uproszczonym środowisku in vitro. Badanie neuronów w kulturze1 doprowadziło do znacznego postępu w naszym zrozumieniu biologii komórek neuronalnych, w tym: różnicowanianeuronów2, dynamiki cytoszkieletu, endocytozy i transportu, regulacji dendrytów3,4, regeneracji aksonów5 oraz stanów klinicznych, takich jak neuropatie6. Ponadto hodowane neurony są wysoce podatne na szeroki zakres technik badawczych, w tym immunocytochemię, koimmunoprecypitację powierzchni komórek, Western blot, transfekcję, RNAi i obrazowanie na żywo, takie jak analiza poklatkowa ruchliwości stożka wzrostu. Tak więc hodowla neuronów pierwotnych jest potężnym podejściem do wyjaśnienia wielu aspektów biologii komórkowej neuronów.
Model hodowli komórkowej zapewnia badaczom szczegółową kontrolę nad warunkami środowiskowymi i zmiennymi. Na przykład podłoże, na którym neurony są pokryte (i na których rosną), mogą być łatwo manipulowane. W tym miejscu podajemy szczegółowe instrukcje dotyczące generowania dwóch różnych substratów, jednej o niskim stężeniu lamininy-1, a drugiej o nasyconych stężeniach lamininy-1. Co zaskakujące, różne stężenia tej samej cząsteczki mogą mieć dramatyczny wpływ na stan wewnętrzny neuronów, a także na skład ich powierzchni komórki. Na przykład wewnątrzkomórkowe poziomy cAMP i powierzchniowe poziomy integryn znacznie różnią się w neuronach pokrytych tymi dwoma podłożami7,8. Dodatkowe badania wykazały, że inne cząsteczki, w tym fibronektyna i proteoglikany siarczanu chondroityny, wpływają na ekspresję cząsteczek na powierzchni komórki i ruchliwość neuronów7-11. Ponadto rozpuszczalne cząsteczki, takie jak neurotrofiny i neurotropiny, również wpływają na skład błony komórkowej i ruchliwość neuronów12-16 i mogą być łatwo i dokładnie manipulowane w modelu hodowli komórkowej.
Tutaj opisujemy metody izolacji i hodowli zdysocjowanych neuronów czuciowych z zarodków piskląt. Procedura ta została wykorzystana do dokonania znaczących przełomów w neurobiologii, w tym wzrostu aksonów5,7,8,10,11,16-21 i została zmodyfikowana z procedury zaprojektowanej do izolacji komórek zwojowych22. Takie podejście ma kilka zalet. Po pierwsze, wiele cech rozwoju ganglionu korzenia grzbietowego piskląt (DRG) jest dobrze scharakteryzowanych, w tym ramy czasowe narodzin, wydłużenie aksonów i profile ekspresji białek2,23-28, zapewniając w ten sposób pouczającą podstawę, na której można budować pouczające eksperymenty in vitro. Po drugie, zdysocjowane kultury neuronalne pozwalają badaczowi na bardziej bezpośrednie badanie neuronów w porównaniu z alternatywnymi podejściami wykorzystującymi nienaruszone eksplantaty DRG (które zawierają neurony i komórki nieneuronalne) i/lub mieszanymi kulturami zawierającymi zarówno zdysocjowane neurony, jak i komórki nieneuronalne. Po trzecie, opisana tutaj procedura jest prosta, niedroga i przystępna dla studentów. Dlatego technika ta może być wykorzystywana zarówno do celów badawczych, jak i dydaktycznych. Co więcej, niewielkie zmiany tego protokołu powinny pozwolić na szybkie, wysokowydajne oczyszczanie neuronów ze źródeł innych niż DRG. Na przykład procedura ta może zostać zmodyfikowana w celu zapewnienia wzbogaconych neuronów kultur z innych tkanek, takich jak embrionalne przodomózgowie lub rdzeń kręgowy.
Protokoły immunocytochemiczne zostały zoptymalizowane dla tych zdysocjowanych kultur neuronalnych i są szczegółowo opisane tutaj. Przedstawiono procedurę podwójnej immunocytochemii przeciwko cząsteczce adhezji komórek nerwowych (NCAM) i integrynom β1. Dane uzyskane za pomocą tych metod immunocytochemicznych wykorzystano do zbadania wzorca przestrzennego i intensywności kilku cząsteczek w hodowanych neuronach8,16.