Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja i hodowla zdysocjowanych neuronów czuciowych z zarodków piskląt

14.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51991

⸱

24 września 2014

 ,  , 
1Department of Natural Sciences, Assumption College

W tym artykule

Podsumowanie

Modele hodowli komórkowych zapewniają szczegółową kontrolę nad warunkami środowiskowymi, a tym samym stanowią potężną platformę do wyjaśnienia wielu aspektów biologii komórek neuronalnych. Opisujemy szybką, niedrogą i niezawodną metodę izolacji, dysocjacji i hodowli neuronów czuciowych z zarodków piskląt. Podano również szczegółowe informacje na temat przygotowania podłoża i immunocytochemii.

Streszczenie

Neurony to wielopłaszczyznowe komórki, które przenoszą informacje niezbędne do różnych funkcji, w tym czucia, ruchu motorycznego, uczenia się i pamięci. Badanie neuronów in vivo może być trudne ze względu na ich złożoność, zróżnicowane i dynamiczne środowisko oraz ograniczenia techniczne. Z tych powodów badanie neuronów in vitro może okazać się korzystne dla rozwikłania złożonych tajemnic neuronów. Dobrze zdefiniowany charakter modeli hodowli komórkowych zapewnia szczegółową kontrolę nad warunkami środowiskowymi i zmiennymi. Tutaj opisujemy, jak izolować, dysocjować i hodować neurony pierwotne z zarodków piskląt. Ta technika jest szybka, niedroga i generuje solidnie rosnące neurony czuciowe. Procedura konsekwentnie wytwarza kultury, które są wysoce wzbogacone o neurony i mają bardzo mało komórek nieneuronalnych (mniej niż 5%). Neurony pierwotne nie przylegają dobrze do nieobrobionego szkła lub plastiku z kultur tkankowych, dlatego opisano szczegółowe procedury tworzenia dwóch odrębnych, dobrze zdefiniowanych substratów zawierających lamininę do posiewu neuronów. Hodowane neurony są wysoce podatne na wiele technik komórkowych i molekularnych, w tym koimmunoprecypitację, obrazowanie żywych komórek, RNAi i immunocytochemię. Procedury podwójnej immunocytochemii na tych hodowanych neuronach zostały zoptymalizowane i opisane tutaj.

Wprowadzenie

Neurony to złożone komórki, które przenoszą informacje niezbędne do różnych funkcji, w tym czucia, widzenia, ruchu motorycznego, uczenia się i pamięci. Inaczej niż w przypadku innych typów komórek, neurony wydłużają procesy przypominające ramiona, zwane aksonami, tworząc niezbędne autostrady neuronalne do komunikacji. Podczas rozwoju wyspecjalizowane przedziały znajdujące się na końcach rosnących aksonów, zwane stożkami wzrostu, przechodzą przez koncert sygnałów zewnątrzkomórkowych, aby doprowadzić akson do odpowiedniego miejsca docelowego. Skomplikowane mechanizmy molekularne, które leżą u podstaw nawigacji stożka wzrostu, nie są w pełni poznane. Aby lepiej zrozumieć te mechanizmy, badacze wykorzystali modele hodowli komórkowych do badania neuronów w zdefiniowanym i uproszczonym środowisku in vitro. Badanie neuronów w kulturze1 doprowadziło do znacznego postępu w naszym zrozumieniu biologii komórek neuronalnych, w tym: różnicowanianeuronów2, dynamiki cytoszkieletu, endocytozy i transportu, regulacji dendrytów3,4, regeneracji aksonów5 oraz stanów klinicznych, takich jak neuropatie6. Ponadto hodowane neurony są wysoce podatne na szeroki zakres technik badawczych, w tym immunocytochemię, koimmunoprecypitację powierzchni komórek, Western blot, transfekcję, RNAi i obrazowanie na żywo, takie jak analiza poklatkowa ruchliwości stożka wzrostu. Tak więc hodowla neuronów pierwotnych jest potężnym podejściem do wyjaśnienia wielu aspektów biologii komórkowej neuronów.

Model hodowli komórkowej zapewnia badaczom szczegółową kontrolę nad warunkami środowiskowymi i zmiennymi. Na przykład podłoże, na którym neurony są pokryte (i na których rosną), mogą być łatwo manipulowane. W tym miejscu podajemy szczegółowe instrukcje dotyczące generowania dwóch różnych substratów, jednej o niskim stężeniu lamininy-1, a drugiej o nasyconych stężeniach lamininy-1. Co zaskakujące, różne stężenia tej samej cząsteczki mogą mieć dramatyczny wpływ na stan wewnętrzny neuronów, a także na skład ich powierzchni komórki. Na przykład wewnątrzkomórkowe poziomy cAMP i powierzchniowe poziomy integryn znacznie różnią się w neuronach pokrytych tymi dwoma podłożami7,8. Dodatkowe badania wykazały, że inne cząsteczki, w tym fibronektyna i proteoglikany siarczanu chondroityny, wpływają na ekspresję cząsteczek na powierzchni komórki i ruchliwość neuronów7-11. Ponadto rozpuszczalne cząsteczki, takie jak neurotrofiny i neurotropiny, również wpływają na skład błony komórkowej i ruchliwość neuronów12-16 i mogą być łatwo i dokładnie manipulowane w modelu hodowli komórkowej.

Tutaj opisujemy metody izolacji i hodowli zdysocjowanych neuronów czuciowych z zarodków piskląt. Procedura ta została wykorzystana do dokonania znaczących przełomów w neurobiologii, w tym wzrostu aksonów5,7,8,10,11,16-21 i została zmodyfikowana z procedury zaprojektowanej do izolacji komórek zwojowych22. Takie podejście ma kilka zalet. Po pierwsze, wiele cech rozwoju ganglionu korzenia grzbietowego piskląt (DRG) jest dobrze scharakteryzowanych, w tym ramy czasowe narodzin, wydłużenie aksonów i profile ekspresji białek2,23-28, zapewniając w ten sposób pouczającą podstawę, na której można budować pouczające eksperymenty in vitro. Po drugie, zdysocjowane kultury neuronalne pozwalają badaczowi na bardziej bezpośrednie badanie neuronów w porównaniu z alternatywnymi podejściami wykorzystującymi nienaruszone eksplantaty DRG (które zawierają neurony i komórki nieneuronalne) i/lub mieszanymi kulturami zawierającymi zarówno zdysocjowane neurony, jak i komórki nieneuronalne. Po trzecie, opisana tutaj procedura jest prosta, niedroga i przystępna dla studentów. Dlatego technika ta może być wykorzystywana zarówno do celów badawczych, jak i dydaktycznych. Co więcej, niewielkie zmiany tego protokołu powinny pozwolić na szybkie, wysokowydajne oczyszczanie neuronów ze źródeł innych niż DRG. Na przykład procedura ta może zostać zmodyfikowana w celu zapewnienia wzbogaconych neuronów kultur z innych tkanek, takich jak embrionalne przodomózgowie lub rdzeń kręgowy.

Protokoły immunocytochemiczne zostały zoptymalizowane dla tych zdysocjowanych kultur neuronalnych i są szczegółowo opisane tutaj. Przedstawiono procedurę podwójnej immunocytochemii przeciwko cząsteczce adhezji komórek nerwowych (NCAM) i integrynom β1. Dane uzyskane za pomocą tych metod immunocytochemicznych wykorzystano do zbadania wzorca przestrzennego i intensywności kilku cząsteczek w hodowanych neuronach8,16.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych: mycie kwasem i pieczenie

  1. Co najmniej 2 dni przed sekcją (krok 2) rozpocznij następujące kroki w celu przygotowania szkiełek nakrywkowych. Wykonaj etap mycia kwasem, aby usunąć oleje i dokładnie wyczyścić szkiełka nakrywkowe.
  2. Załaduj szkiełka nakrywkowe do porcelanowego uchwytu, który ustawia szkiełka nakrywkowe w pionie i zapobiega ich stykaniu się. Zanurz uchwyt i szkiełka nakrywkowe w szklanym pojemniku histologicznym wypełnionym 2 M kwasem solnym (HCl). Alternatywnie, jeśli uchwyt na porcelanę nie jest dostępny, rozłóż ~20 szkiełek nakrywkowych poziomo, aby przykryć dno szklanej szalki Petriego o średnicy 100 mm i zanurz szkiełka nakrywkowe w 2 M HCl.
  3. Umieść szklane naczynie (ze szkiełkami nakrywkowymi zanurzonymi w kwasie) na stole bujanym w dygestoriach i pozwól na delikatne kołysanie przez co najmniej 5 godzin w temperaturze pokojowej. Alternatywnie, szkiełka nakrywkowe należy myć kwasem przez noc w tych samych warunkach.
  4. Umyć szkiełka nakrywkowe destylowanymH2O(dH2O), przenosząc porcelanowy uchwyt załadowany szkiełkami nakrywkowymi z 2 M HCl do czystego szklanego pojemnika histologicznego wypełnionegodH2O. Alternatywnie, zdekantować 2 M HCl ze szklanej szalki Petriego z szkiełkami nakrywkowymi i ponownie napełnićdH2O.
  5. Umyć przez ponowne opróżnienie dH2O i ponowne napełnienie szklanego naczynia świeżą dH2O. Powtórz w sumie 3 szybkie mycia.
  6. Dłuższy cykl mycia należy rozpocząć od ponownego umieszczenia szklanego naczynia (z szkiełkami nakrywkowymi i dH2O) na bujaku. Pozostawić do delikatnego mieszania przez 10-30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie zdekantować dH2O i dodać świeże dH2O. Powtórz w sumie co najmniej dziesięć prań. Alternatywnie kontynuuj mycie przez noc.
  7. Umyte szkiełka nakrywkowe umieścić w piecu nagrzanym do temperatury 350 °C. W przypadku korzystania z uchwytu porcelanowego należy wyjąć uchwyt z pojemnika szklanego wypełnionego dH2O, a następnie umieścić uchwyt z szkiełkami nakrywkowymi bezpośrednio w piecu. W przypadku użycia szklanej szalki Petriego zdekantować dH2O i umieścić szklane naczynie z szkiełkami nakrywkowymi w piecu.
  8. Piec szkiełka nakrywkowe przez co najmniej pięć godzin lub przez noc w temperaturze 350 °C.
  9. Po zakończeniu pieczenia usuń szkiełka nakrywkowe z porcelanowego uchwytu za pomocą drobnych kleszczyków i umieść w sterylnej szklanej szalce Petriego o średnicy 100 mm. Pozostaw szkiełka nakrywkowe, które nie były pierwotnie umieszczone w porcelanowym uchwycie, w szklanej szalce Petriego.

2. Sekcja piskląt i izolacja DRG

  1. Wyjąć z inkubatora płodne, wyprofilowane jajo piskląt White Leghorn (utrzymywane w temperaturze 37-38,5 °C z delikatnym kołysaniem).
    UWAGA: Poprzednie badania wykorzystywały dzień embrionalny 7-10 do izolacji DRG2,8,11-13,16.
  2. Umieść wybrane jajko w okapie z przepływem laminarnym. Wszystkie wymienione poniżej procedury należy przeprowadzić w warunkach aseptycznych w okapie z przepływem laminarnym przy użyciu sterylnych roztworów i narzędzi. Podgrzej wszystkie roztwory w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  3. Rozbij jajko i umieść jego zawartość na plastikowej szalce Petriego o średnicy 100 mm. Użyj standardowych kleszczy, aby przenieść zarodek na inną 100-milimetrową szalkę Petriego.
  4. Za pomocą pipety Pasteura dodaj podgrzany 1x PBS do szalki Petriego, aby tkanka była mokra. Odetnij głowę zarodkowi, szczypiąc szyję drobnymi kleszczami. Przenieść ciało na inną czystą szalkę Petriego o średnicy 100 mm.
  5. Dodaj ciepłe F12HS10 (F12 szynki, 10 mM HEPES, 100 jednostek/ml penicyliny, 0,1 mg/ml streptomycyny, 10% płodowej surowicy bydlęcej) do naczynia za pomocą pipety Pasteura, aby tkanka była mokra. Użyj kleszczy, aby ustawić zarodek na jego grzbietowej stronie (ryc. 1A).
  6. Umieścić 100 mm plastikową szalkę Petriego zawierającą tkankę zarodkową na lornetkowym stereowizyjnym mikroskopie preparacyjnym w kapturze z przepływem laminarnym. Użyj cienkich kleszczyków, aby wykonać pionowe nacięcie w linii środkowej od ogona do szyi, ściskając rozwijającą się skórę właściwą, aby odsłonić serce, płuca i inne narządy. Alternatywnie wykonaj serię małych łez, aby odsłonić narządy wewnętrzne.
  7. Delikatnie użyj 2 zestawów sterylnych cienkich kleszczy, aby: a) chwycić za szyję i b) chwycić aortę lub inną tkankę znajdującą się bezpośrednio nad sercem i pociągnąć w kierunku ogona, patrosząc zwierzę.
  8. Nałóż ciepłą F12HS10 pipetą Pasteura na chusteczkę. Użyj kleszczy, aby usunąć wszelkie pozostałe narządy sercowo-naczyniowe, oddechowe lub trawienne, aby odsłonić rozwijające się żebra, kręgosłup i DRG (ryc. 1B-1D).
  9. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj drobnych kleszczy, aby dalej usunąć narządy i zebrać DRG po obu stronach kręgosłupa lędźwiowego, poniżej żeber. Zbieraj DRG, wyrywając nienaruszone DRG z zarodka. Ściśnij i odetnij korzenie, które sięgają od DRG w kierunku rdzenia kręgowego i chwytając rozwijający się nerw, który sięga od DRG w kierunku obwodu lub odwrotnie.
  10. Umieść nienaruszone DRG w naczyniu hodowlanym o średnicy 35 mm wypełnionym ciepłym F12HS10. Usuń nadmiar tkanki, takiej jak korzenie grzbietowe lub brzuszne, które mogły przylgnąć do DRG, z nienaruszonych DRG w szalce 35 mm, ściskając drobnymi kleszkami.
  11. Aby uzyskać DRG lepsze niż odcinek lędźwiowy, należy usunąć brzuszną połowę kręgosłupa piersiowego i szyjnego. Odbywa się to poprzez wykonanie nacięcia w rozwijającym się kręgosłupie prostopadłym do osi rdzenia kręgowego w górnej części odcinka szyjnego i kolejnego cięcia w górnym odcinku lędźwiowym. Następnie wykonaj nacięcia równoległe do osi rdzenia kręgowego wzdłuż prawej i lewej strony kręgosłupa. Podnieś brzuszną połowę kręgosłupa z zarodka, który odsłania rdzeń kręgowy (ryc. 1E-1F).
  12. Aby umożliwić łatwy dostęp do DRG, usuń rdzeń kręgowy w odcinku piersiowym i szyjnym, chwytając rdzeń kręgowy cienkimi kleszczami. Użyj kleszczy, aby wyjąć rdzeń kręgowy z kręgosłupa. W przybliżeniu rdzeń kręgowy klatki piersiowej znajduje się na poziomie żeber, a obszar szyjny jest wyższy od żeber.
  13. Zbierz nienaruszone DRG klatki piersiowej i szyjki macicy za pomocą cienkich kleszczy i umieść je w ciepłym F12HS10 z innymi DRG. Usuń nadmiar tkanki, która może przylegać do DRG.
  14. Przepłucz wnętrze nowej szklanej pipety Pasteura za pomocą F12HS10, aby zapobiec przywieraniu DRG do ścianek pipety. Za pomocą przepłukanej pipety przenieś wszystkie DRG i F12HS10 z małej szalki Petriego do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i natychmiast przejdź do kroku 3.
    UWAGA: Dodatkowe zarodki mogą być preparowane w celu zwiększenia liczby DRG. DRG powinny być przechowywane w F12HS10 w temperaturze 37 °C do momentu przygotowania do etapu 3.

3. Dysocjacja, wzbogacanie i kulturowanie neuronów DRG – część 1

  1. Umieść stożkową probówkę z nienaruszonymi DRG w wirówce i delikatnie wiruj (200 x g) przez 2-3 minuty. Upewnij się, że DRG opadły na dno probówki. Jeśli nie, zakręć ponownie.
  2. Za pomocą pipety delikatnie usuń F12HS10, pozostawiając granulki DRG w spokoju. Dodaj 2 ml 1x PBS bez wapnia i magnezu (CMF), usuwając osad DRG. Ponownie odwiruj i usuń CMF PBS, pozostawiając nienaruszoną osadę DRG. Powtórz ten etap płukania, w sumie trzy płukania, aby usunąć płodową surowicę bydlęcą w F12HS10, która zakłóciłaby trawienie trypsyny w następnym kroku.
  3. Dodać 2 ml podgrzanej trypsyny do 15 ml probówki zawierającej 2 ml CMF PBS i DRG. Umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 10-15 minut, aby strawić DRG do zdysocjowanych komórek.
  4. Podczas inkubacji przygotować F12H + suplement zawierający pożywkę (F12 Ham's, 10 mM HEPES 100 jednostek/ml penicyliny, 0,1 mg/ml streptomycyny, 10 ng/ml NT3, 10 ng/ml NGF, 200 mM l-glutaminy i N2) i ogrzać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Zazwyczaj 10 ml całkowitej pożywki wystarcza na 4-5 szalek o średnicy 35 mm pierwotnych neuronów czuciowych. Rozpocznij również rozmrażanie lamininy-1 do powlekania szkiełek nakrywkowych (krok 4).
  5. Delikatnie rozcierać DRG w roztworze trypsyny za pomocą pipety p1000 i wizualnie sprawdzić, czy nie ma nienaruszonych DRG. Kontynuować rozcieranie do momentu, gdy nienaruszone DRG nie będą już widoczne gołym okiem i/lub pozwolić na dłuższą inkubację trypsyny w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż do dysocjacji nienaruszonych DRG. Aby chronić neurony DRG przed uszkodzeniem, unikaj pęcherzyków powietrza podczas rozcierania i ogranicz trawienie trypsyny do <30 min.
  6. Probówka wirówkowa zawierająca zdysocjowane DRG i trypsynę w ilości 200 x g przez 3-5 minut w celu uzyskania osadu. W razie potrzeby wiruj dłużej, aż utworzy się granulka.
  7. Ostrożnie odessać trypsynę, nie przerywając osadu. Dodać 2 ml F12HS10 do granulek. Delikatnie rozcierać DRG za pomocą końcówki do pipet p1000.
  8. Przenieść całą zawartość z 15 ml stożkowej probówki do naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm. Przepłukać probówkę 8 ml F12HS10 i przenieść ją do naczynia hodowlanego, po 2 ml na raz, w sumie 10 ml. Ten etap płukania pomaga zebrać komórki, które mogły pozostać przyklejone do ścianek probówki.
  9. Umieścić 100 mm naczynie hodowlane (z 10 ml F12HS10 i zdysocjowanymi komórkami DRG) w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C na 3 godziny
    UWAGA: CO2 nie jest wymagany w inkubatorze, ponieważ HEPES buforuje pH pożywki przy braku CO2 . Podczas inkubacji komórki glejowe wiążą się z powierzchnią plastiku hodowli tkankowej, a neurony mają tendencję do luźnego przylegania do podłoża glejowego.

4. Powlekanie krykieł mytych kwasem i pieczonych szkiełek nakrywkowych Lamininą-1

  1. Rozmrozić sterylne porcje zamrożonej lamininy-1 na lodzie.
  2. W sterylnych warunkach dodać 1 ml sterylnego 1x PBS do 50 μl podwielokrotności lamininy-1.
  3. Za pomocą spektrofotometru uzyskać wartość absorbancji lamininy-1 przy długości fali 280 nm. Użyj tej wartości w poniższym równaniu, aby określić stężenie lamininy-1.

ABS 280 = (stężenie mg/ml) * (współczynnik ekstynkcji białka)
Współczynnik ekstynkcji dla lamininy-1 wynosi 0,86.

  1. W sterylnych warunkach rozcieńczyć lamininę-1 1X PBS, aby uzyskać stężenia 1 mg/ml i 20 mg/ml. Użyć tych dwóch zastosowanych stężeń lamininy-1, aby uzyskać dziesięciokrotną różnicę lamininy-1 związanej ze szkiełkiem nakrywkowym (odpowiednio 30 ng/cm2 i 300 ng/cm2) po inkubacji7,8,10.
  2. W okapie z przepływem laminarnym za pomocą cienkich kleszczyków umieść jedno umyte kwasem i upieczone szkiełko nakrywkowe na dnie jednego naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm. Powtórz w razie potrzeby, aby uzyskać potrzebną liczbę potraw.
  3. Poddaj szkiełka nakrywkowe działaniu światła UV przez 20-30 minut, aby dodatkowo zapewnić sterylizację. Na tym etapie trzymaj pokrywkę naczynia zdjętą.
  4. Dodać 400 μl przygotowanej lamininy-1 do każdego szklanego szkiełka nakrywkowego. Użyj końcówki pipety, aby rozprowadzić lamininę-1, aby zapewnić pełne pokrycie szkiełka nakrywkowego. Napięcie powierzchniowe pozwoli lamininie-1 pozostać na szkiełku nakrywkowym i nie rozprzestrzeniać się na dnie naczynia hodowlanego, co jest wymagane.
  5. Przykryj naczyniem i pozwól lamininie-1 inkubować przez 2-3 godziny w temperaturze pokojowej (optymalnie 3 godziny).
  6. Po inkubacji lamininy-1 przepłukać szkiełka nakrywkowe techniką aseptyczną sterylnym PBS w kapturze z przepływem laminarnym. Usunąć roztwór ze szkiełka nakrywkowego i dodać 400 μl PBS. Odczekaj 5-10 min. Powtórz w sumie 3 płukania.
  7. Pozostaw PBS na szkiełku nakrywkowym po ostatnim płukaniu. Nie należy łamać napięcia powierzchniowego podczas płukania i nie dopuszczać do wyschnięcia szkiełek nakrywkowych. Pozostaw pokrywkę, aż będzie gotowa do nałożenia zdysocjowanych neuronów na pokrywę.

5. Dysocjacja, wzbogacanie i kulturowanie neuronów DRG – część 2

  1. Po inkubacji za pomocą sterylnej pipety o pojemności 10 ml delikatnie przepłukać dno naczynia o średnicy 100 mm zawierającego zdysocjowane komórki DRG. Trzymaj naczynie pod kątem ~45°, wyciągnij ~7 ml F12HS10 za pomocą pipety, a następnie delikatnie wylej 7 ml na około 1/3 naczynia. Powtórz 5 razy, delikatnie usuwając neurony.
  2. Obróć naczynie i powtórz procedurę płukania, przez kolejne sześć płukań, na kolejnej 1/3 naczynia. Powtórz procedurę ponownie dla pozostałej 1/3 naczynia. W ten sposób delikatnie spłucz całe dno naczynia F12HS10, aby usunąć neurony.
  3. Za pomocą tej samej pipety przenieś F12HS10 zawierające neurony z szalki o średnicy 100 mm do stożkowej rurki o średnicy 15 mm. Wirować przez 5-10 minut przy 200 g do komórek osadzania.
  4. Usuń F12HS10, pozostawiając granulat w spokoju. Zawiesić osad z 2 ml podgrzanych suplementów F12H +.
  5. Użyj hemocytometru, aby określić gęstość komórek.
  6. W razie potrzeby rozcieńczyć komórki suplementami F12H +, aby uzyskać pożądane stężenie posiewu (120 000 komórek/ml dla szkiełek nakrywkowych pokrytych 1 μg/ml lamininy-1 i 40 000 komórek/ml dla szkiełek nakrywkowych pokrytych 20 μg/ml lamininy-18,16).
  7. Usunąć PBS z szkiełek nakrywkowych pokrytych lamininą i natychmiast umieścić 400 μl komórek na szkiełkach nakrywkowych. Ostrożnie przenieść naczynie do nawilżonego inkubatora do hodowli komórkowych o temperaturze 37 °C. Pozostaw do inkubacji przez co najmniej 1 godzinę i do 3 godzin, aby umożliwić neuronom przyleganie do lamininy-1.
  8. W sterylnych warunkach delikatnie zalej 35-milimetrowe szalki zawierające neurony 1,6 ml suplementów F12H +.
    UWAGA: W tym czasie napięcie powierzchniowe na szkiełku nakrywkowym może zostać przerwane. Neurony odpowiednio przylegały do lamininy-1 na szkiełku nakrywkowym.
  9. Włóż komórki z powrotem do inkubatora i inkubuj przez noc. Następnego dnia wykonaj eksperymenty, takie jak immunocytochemia.

6. Immunocytochemia

  1. Przed immunocytochemią ciepły roztwór utrwalający (4% paraformaldehydu, 30% sacharozy 2X PBS) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Przed utrwaleniem komórek potraktuj różnymi odczynnikami, takimi jak netryna-1, Mn2+, jeż soniczny, semaforyna i efryna16,29-31.
  2. Powoli wyjąć 1 ml z 2 ml suplementów F12H + z naczynia hodowlanego. Delikatnie dodaj 1 ml podgrzanego roztworu utrwalającego. Pozostawić do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 10-15 minut.
  3. Ostrożnie usunąć roztwór utrwalający i dodać 2 ml PBS. Nanieść roztwór w kierunku krawędzi naczynia, unikając możliwego przemieszczenia się utrwalonych komórek w wyniku zastosowania PBS. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  4. Powtórz pranie PBS, w sumie 5 prań. Nie pozwól, aby komórki wyschły podczas jakiegokolwiek etapu immunocytochemii.
  5. Usuń PBS. Zastosuj 1 ml roztworu blokującego (0,1% Triton-X, 1X PBS, 5% normalna surowica kozia). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Alternatywnie, aby zabarwić cząsteczki powierzchniowe, nie należy używać Triton-X w roztworze blokującym8.
  6. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w roztworze blokującym zgodnie z zaleceniami producenta. Użyj 1:500 dla przeciwciał przeciwko NCAM i aktywowanych integryn β116. Usunąć roztwór blokujący, dodać 1 ml roztworu przeciwciał pierwszorzędowych i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
  7. Usunąć roztwór przeciwciał pierwszorzędowych i dodać 2 ml 1X PBS. Inkubować przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz w sumie 4 prania PBS. W razie potrzeby pranie można przedłużyć.
  8. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w stosunku 1:1,000 w roztworze blokującym. Usunąć PBS, dodać 1 ml roztworu przeciwciał drugorzędowych i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Przeciwciała drugorzędowe są wrażliwe na światło. Od tego momentu utrzymuj roztwory i komórki w ciemności tak bardzo, jak to możliwe.
  9. Usuń wtórny roztwór przeciwciał i przepłucz 5x 1x PBS, tak jak poprzednio.
  10. Nałóż ~60-80 μl Fluoromount G na szkiełko mikroskopowe. Za pomocą cienkich szczypiec delikatnie wyjmij szkiełko nakrywkowe z naczynia i opuść szkiełko nakrywkowe do Fluoromount G na szkiełko mikroskopowe. Unikaj pęcherzyków powietrza.
  11. Szkiełka należy przechowywać poziomo w temperaturze 4 °C w ciemności. Po 12-24 godzinach Fluormount G ulegnie polimeryzacji, a szkiełko nakrywkowe zostanie mocno przymocowane do szkiełka mikroskopowego. Obrazowanie komórek po tym etapie polimeryzacji jest zakończone.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisany tutaj protokół umożliwia badaczom hodowlę wzbogaconej populacji dysocjowanych embrionalnych neuronów sensorycznych z bardzo niewielką ilością (np. <5%) komórek nie neuronalnych7,8,10,16. Liczne zwoje korzeni grzbietowych (DRG) można pozyskać z obszarów lędźwiowo-krzyżowych, piersiowych i szyjnych. W zależności od potrzeb badacza, DRG z tych odrębnych regionów anatomicznych można łatwo wyizolować. Na przykład Rycina 1 przedstawia obrazy zarodka kury na różnych etapach sekcji...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tutaj przedstawiamy szczegółowe protokoły izolacji i hodowli zdysocjowanych neuronów czuciowych z zarodka pisklęcia. Procedura ta generuje wzbogaconą populację silnie rosnących neuronów in vitro7,8,10,16. Do tych hodowanych neuronów można zastosować liczne techniki komórkowe i molekularne, w tym immunocytochemię, która jest opisana tutaj. Protokół ten został niedawno wykorzystany do ilościowej oceny intensywności aktywowanych integryn znakowanych immunologicznie w czuciowych stożkach wzrostu8,16<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Alison Philbrook, Belindzie Barbagallo i Michaelowi Francisowi za wnikliwe komentarze do tego artykułu. Badania przedstawione w tej publikacji zostały poparte nagrodą R15 AREA 1R15NS070172-01A1 przyznaną MLL.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sterylne małe szalki do hodowli (35 mm)Corning430165
Sterylne duże szalki do hodowli (100 mm)Falcon353003
Sterylne duże szalki Petriego (100 mm)VWR89000-302
Szklana szalka Petriego (100 mm)VWRD108962
Kleszcze do drobnychNarzędzia do nauki11251-10
Kleszcze standardoweFine Science Tools1100-12
Szkiełka nakrywkowe (22 x 22 mm)Fisher12 518 105KGrubość 0,13-0,17 mm jest optymalna do mikroskopii
Porcelanowy uchwyt na szkiełko nakrywkoweThomas scientific8542E40
Surowica bydlęcapłodu Gibco17502-048użyj 50 ml porcji na 500 ml podłoża Ham's F12
HClVWRVW3204-1stosować w 2 M, można użyć dwa razy przed wyrzuceniem
NaClSigmaS9888użyć 5 M roztworu NaCl dla lamininy-1 roztworu podstawowego
Laminin-1Invitrogen23017-015Dodać 72 &mikro; l sterylnego 5 M NaCl i podwielokrotność na 50 &mikro; l
15 ml Stożkowa probówkapotraktowana komórkowo229411
PBS CMF 10xGibco14200stosowany przy 1x, rozcieńczony sterylną wodą filtrowaną Millipore
PBS 10xGibco14080używany przy 1x, rozcieńczony sterylną wodą filtrowaną Millipore
Ham's F12Lonza12-615F
Albumina surowicy bydlęcej płodu (BSA)Gibco10438stosować w F12HS20 przy 10%
HEPESSigmaH3375przygotować sterylny roztwór 1 M w wodzie destylowanej, rozcieńczyć w pożywce F12 do uzyskania końcowego stężenia 10 mM
Penicylina/streptomiocinSigmaP0781użyć 5 ml w 500 ml pożywki F12
NT3MiliporeGF031Dodać 1 ml sterylnej wody Millipore, podwielokrotność w sterylnych warunkach, przechowywać w temperaturze -20 °; C, stosować w końcowym stężeniu 10 ng/ml w pożywce F12H, utrzymywać w -20 & stopniach; C zamrażarka bez rozmrażania
NGFRnD systemy256-GFDodać 1 ml sterylnego 1x PBS z 0,1% BSA, podwielokrotność w sterylnych warunkach, przechowywać w temperaturze -20 stopni; C, stosowany w końcowym stężeniu 10 ng/ml w pożywce F12H
L-GlutaminaSigmaG7513podwielokrotność w sterylnych warunkach, przechowywać w temperaturze -20 ° C, stosować przy końcowym stężeniu 200 mM w pożywce F12H
TrypsynaSigmaT4049podwielokrotność w sterylnych warunkach, przechowywać w temperaturze -20 & stopni; C
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Gibco15260
Inne potrzebne przedmioty: ogólne narzędzia do preparacji, w tym szklane pipety Pasteura, płodne białe jaja kurze leghorn, inkubator do jaj kontrolnych (nawilżany, 37 ° C), komora inkubacji komórek (nawilżona, 37 &; C), kaptur z przepływem laminarnym, lornetka stereowizyjna luneta preparacyjna
Tabela odczynników immunocytochemicznychsacharoza Sigma S9378 stosowany w roztworze utrwalającym (4% paraformaldehye, 30% sacharozy, 2x PBS)Triton-X 100 Sigma T-8787 Paraformaldehyd Sigma P6148 stosowany w roztworze utrwalającym (4% paraformaldehye, 30%
sacharoza, 2x PBS)
Fluoromount GSouthern Biotech0100-01
Normalna kozia surowicaTechnologie życiaPCN500
Szkiełka mikroskopoweVWR16004-430
Tabela przeciwciał pierwotnych
Przeciwciało przeciwko NCAMMilliporeAB5032poliklonalne
przeciwciało przeciwko aktywowany & beta; 1 połknięcieMilliporeMAB19294monoklonalne
Tabela przeciwciał wtórnych
Goat anty-mysie IgG Alexa 488Life technologiesA11001
Kozia anty-królicza IgG Alexa 548Technologie życioweA11036
materiałów

Bibliografia

  1. Millet, L. J., Gillette, M. U. Over a century of neuron culture: from the hanging drop to microfluidic devices. The Yale journal of biology and medicine. 85, 501-521 (2012).
  2. Guan, W., Puthenveedu, M. A., Condic, M. L. Sensory neuron subtypes have unique substratum preference and receptor expression before target innervation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 1781-1791 (2003).
  3. Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Which way to go? Cytoskeletal organization and polarized transport in neurons. Molecular and cellular neurosciences. 46, 9-20 (2011).
  4. Kapitein, L. C., Yau, K. W., Hoogenraad, C. C. Microtubule dynamics in dendritic spines. Methods in cell biology. 97, 111-132 (2010).
  5. Snow, D. M. Pioneering studies on the mechanisms of axonal regeneration. Developmental neurobiology. 71, 785-789 (2011).
  6. Melli, G., Hoke, A. Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert opinion on drug discovery. 4, 1035-1045 (2009).
  7. Condic, M. L., Letourneau, P. C. Ligand-induced changes in integrin expression regulate neuronal adhesion and neurite outgrowth. Nature. 389, 852-856 (1997).
  8. Lemons, M. L., Condic, M. L. Combined integrin activation and intracellular cAMP cause Rho GTPase dependent growth cone collapse on laminin-1. Experimental neurology. 202, 324-335 (2006).
  9. Beller, J. A., et al. Comparison of sensory neuron growth cone and filopodial responses to structurally diverse aggrecan variants, in vitro. Experimental neurology. 247, 143-157 (2013).
  10. Condic, M. L., Snow, D. M., Letourneau, P. C. Embryonic neurons adapt to the inhibitory proteoglycan aggrecan by increasing integrin expression. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 19, 10036-10043 (1999).
  11. Lemons, M. L., Barua, S., Abanto, M. L., Halfter, W., Condic, M. L. Adaptation of sensory neurons to hyalectin and decorin proteoglycans. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 4964-4973 (2005).
  12. Guan, W., Condic, M. L. Characterization of Netrin-1, Neogenin and cUNC-5H3 expression during chick dorsal root ganglia development. Gene Expr Patterns. 3, 369-373 (2003).
  13. Guan, W., Wang, G., Scott, S. A., Condic, M. L. Shh influences cell number and the distribution of neuronal subtypes in dorsal root ganglia. Developmental biology. 314, 317-328 (2008).
  14. Kolpak, A., Zhang, J., Bao, Z. Z. Sonic hedgehog has a dual effect on the growth of retinal ganglion axons depending on its concentration. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 3432-3441 (2005).
  15. Kolpak, A. L., et al. Negative guidance factor-induced macropinocytosis in the growth cone plays a critical role in repulsive axon turning. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 10488-10498 (2009).
  16. Lemons, M. L., et al. Integrins and cAMP mediate netrin-induced growth cone collapse. Brain research. 1537, 46-58 (2013).
  17. Snow, D. M., Atkinson, P. B., Hassinger, T. D., Letourneau, P. C., Kater, S. B. Chondroitin sulfate proteoglycan elevates cytoplasmic calcium in DRG neurons. Developmental biology. 166, 87-100 (1994).
  18. Snow, D. M., Brown, E. M., Letourneau, P. C. Growth cone behavior in the presence of soluble chondroitin sulfate proteoglycan (CSPG), compared to behavior on CSPG bound to laminin or fibronectin. Int J Dev Neurosci. 14, 331-349 (1996).
  19. Snow, D. M., Lemmon, V., Carrino, D. A., Caplan, A. I., Silver, J. Sulfated proteoglycans in astroglial barriers inhibit neurite outgrowth in vitro. Experimental neurology. 109, 111-130 (1990).
  20. Snow, D. M., Letourneau, P. C. Neurite outgrowth on a step gradient of chondroitin sulfate proteoglycan (CS-PG). Journal of neurobiology. 23, 322-336 (1992).
  21. Snow, D. M., Mullins, N., Hynds, D. L. Nervous system-derived chondroitin sulfate proteoglycans regulate growth cone morphology and inhibit neurite outgrowth: A light, epifluorescence, and electron microscopy study. Microsc Res Tech. 54, 273-286 (2001).
  22. Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1, 791-803 (1988).
  23. Firnhaber, C., Hammarlund, M. Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function. PLoS genetics. 9, e1003921(2013).
  24. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 195, 231-272 (1992).
  25. Hollyday, M. Chick wing innervation. I. Time course of innervation and early differentiation of the peripheral nerve pattern. The Journal of comparative neurology. 357, 242-253 (1995).
  26. Hollyday, M., Morgan-Carr, M. Chick wing innervation. II. Morphology of motor and sensory axons and their growth cones during early development. The Journal of comparative neurology. 357, 254-271 (1995).
  27. Honig, M. G., Kueter, J. The expression of cell adhesion molecules on the growth cones of chick cutaneous and muscle sensory neurons. Developmental biology. 167, 563-583 (1995).
  28. Tosney, K. W., Landmesser, L. T. Development of the major pathways for neurite outgrowth in the chick hindlimb. Developmental biology. 109, 193-214 (1985).
  29. Dontchev, V. D., Letourneau, P. C. Nerve growth factor and semaphorin 3A signaling pathways interact in regulating sensory neuronal growth cone motility. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 6659-6669 (2002).
  30. Munoz, L. M., et al. Ephrin-A5 inhibits growth of embryonic sensory neurons. Developmental biology. 283, 397-408 (2005).
  31. Roche, F. K., Marsick, B. M., Letourneau, P. C. Protein synthesis in distal axons is not required for growth cone responses to guidance cues. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 638-652 (2009).
  32. Condic, M. Adult neuronal regeneration induced by transgenic integrin expression. Journal of Neuroscience. 21, 4782-4788 (2001).
  33. Hory-Lee, F., Russell, M., Lindsay, R. M., Frank, E. Neurotrophin 3 supports the survival of developing muscle sensory neurons in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2613-2617 (1993).
  34. Toyofuku, T., et al. FARP2 triggers signals for Sema3A-mediated axonal repulsion. Nature neuroscience. 8, 1712-1719 (2005).
  35. Steinmetz, M. P., et al. Chronic enhancement of the intrinsic growth capacity of sensory neurons combined with the degradation of inhibitory proteoglycans allows functional regeneration of sensory axons through the dorsal root entry zone in the mammalian spinal cord. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 8066-8076 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zwoje korzeni grzbietowychdysocjacja kom rekpod o a lamininoweimmunocytochemiahodowla kom rkowawysiew neuron wtrawienie trypsyncytometria przep ywowa
Izolacja i hodowla zdysocjowanych neuronów czuciowych z zarodków piskląt
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.