Modele hodowli komórkowych zapewniają szczegółową kontrolę nad warunkami środowiskowymi, a tym samym stanowią potężną platformę do wyjaśnienia wielu aspektów biologii komórek neuronalnych. Opisujemy szybką, niedrogą i niezawodną metodę izolacji, dysocjacji i hodowli neuronów czuciowych z zarodków piskląt. Podano również szczegółowe informacje na temat przygotowania podłoża i immunocytochemii.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja i hodowla zdysocjowanych neuronów czuciowych z zarodków piskląt
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Neurony to wielopłaszczyznowe komórki, które przenoszą informacje niezbędne do różnych funkcji, w tym czucia, ruchu motorycznego, uczenia się i pamięci. Badanie neuronów in vivo może być trudne ze względu na ich złożoność, zróżnicowane i dynamiczne środowisko oraz ograniczenia techniczne. Z tych powodów badanie neuronów in vitro może okazać się korzystne dla rozwikłania złożonych tajemnic neuronów. Dobrze zdefiniowany charakter modeli hodowli komórkowych zapewnia szczegółową kontrolę nad warunkami środowiskowymi i zmiennymi. Tutaj opisujemy, jak izolować, dysocjować i hodować neurony pierwotne z zarodków piskląt. Ta technika jest szybka, niedroga i generuje solidnie rosnące neurony czuciowe. Procedura konsekwentnie wytwarza kultury, które są wysoce wzbogacone o neurony i mają bardzo mało komórek nieneuronalnych (mniej niż 5%). Neurony pierwotne nie przylegają dobrze do nieobrobionego szkła lub plastiku z kultur tkankowych, dlatego opisano szczegółowe procedury tworzenia dwóch odrębnych, dobrze zdefiniowanych substratów zawierających lamininę do posiewu neuronów. Hodowane neurony są wysoce podatne na wiele technik komórkowych i molekularnych, w tym koimmunoprecypitację, obrazowanie żywych komórek, RNAi i immunocytochemię. Procedury podwójnej immunocytochemii na tych hodowanych neuronach zostały zoptymalizowane i opisane tutaj.
Wprowadzenie
Neurony to złożone komórki, które przenoszą informacje niezbędne do różnych funkcji, w tym czucia, widzenia, ruchu motorycznego, uczenia się i pamięci. Inaczej niż w przypadku innych typów komórek, neurony wydłużają procesy przypominające ramiona, zwane aksonami, tworząc niezbędne autostrady neuronalne do komunikacji. Podczas rozwoju wyspecjalizowane przedziały znajdujące się na końcach rosnących aksonów, zwane stożkami wzrostu, przechodzą przez koncert sygnałów zewnątrzkomórkowych, aby doprowadzić akson do odpowiedniego miejsca docelowego. Skomplikowane mechanizmy molekularne, które leżą u podstaw nawigacji stożka wzrostu, nie są w pełni poznane. Aby lepiej zrozumieć....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych: mycie kwasem i pieczenie
- Co najmniej 2 dni przed sekcją (krok 2) rozpocznij następujące kroki w celu przygotowania szkiełek nakrywkowych. Wykonaj etap mycia kwasem, aby usunąć oleje i dokładnie wyczyścić szkiełka nakrywkowe.
- Załaduj szkiełka nakrywkowe do porcelanowego uchwytu, który ustawia szkiełka nakrywkowe w pionie i zapobiega ich stykaniu się. Zanurz uchwyt i szkiełka nakrywkowe w szklanym pojemniku histologicznym wypełnionym 2 M kwasem solnym (HCl). Alternatywnie, jeśli uchwyt na porcelanę nie jest dostępny, rozłóż ~20 szkiełek nakrywkowych poziomo, aby przykryć dno szklanej szalki Petriego o średnic....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Opisany tutaj protokół umożliwia badaczom hodowlę wzbogaconej populacji dysocjowanych embrionalnych neuronów sensorycznych z bardzo niewielką ilością (np. <5%) komórek nie neuronalnych7,8,10,16. Liczne zwoje korzeni grzbietowych (DRG) można pozyskać z obszarów lędźwiowo-krzyżowych, piersiowych i szyjnych. W zależności od potrzeb badacza, DRG z tych odrębnych regionów anatomicznych można łatwo wyizolować. Na przykład Rycina 1 przedstawia obrazy zarodka kury na różnych etapach sekcji.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Tutaj przedstawiamy szczegółowe protokoły izolacji i hodowli zdysocjowanych neuronów czuciowych z zarodka pisklęcia. Procedura ta generuje wzbogaconą populację silnie rosnących neuronów in vitro7,8,10,16. Do tych hodowanych neuronów można zastosować liczne techniki komórkowe i molekularne, w tym immunocytochemię, która jest opisana tutaj. Protokół ten został niedawno wykorzystany do ilościowej oceny intensywności aktywowanych integryn znakowanych immunologicznie w czuciowych stożkach wzrostu8,16<.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Alison Philbrook, Belindzie Barbagallo i Michaelowi Francisowi za wnikliwe komentarze do tego artykułu. Badania przedstawione w tej publikacji zostały poparte nagrodą R15 AREA 1R15NS070172-01A1 przyznaną MLL.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sterylne małe szalki do hodowli (35 mm) | Corning | 430165 | |
| Sterylne duże szalki do hodowli (100 mm) | Falcon | 353003 | |
| Sterylne duże szalki Petriego (100 mm) | VWR | 89000-302 | |
| Szklana szalka Petriego (100 mm) | VWR | D108962 | |
| Kleszcze do drobnych | Narzędzia do nauki | 11251-10 | |
| Kleszcze standardowe | Fine Science Tools | 1100-12 | |
| Szkiełka nakrywkowe (22 x 22 mm) | Fisher | 12 518 105K | Grubość 0,13-0,17 mm jest optymalna do mikroskopii |
| Porcelanowy uchwyt na szkiełko nakrywkowe | Thomas scientific | 8542E40 | |
| Surowica bydlęca | płodu Gibco | 17502-048 | użyj 50 ml porcji na 500 ml podłoża Ham's F12 |
| HCl | VWR | VW3204-1 | stosować w 2 M, można użyć dwa razy przed wyrzuceniem |
| NaCl | Sigma | S9888 | użyć 5 M roztworu NaCl dla lamininy-1 roztworu podstawowego |
| Laminin-1 | Invitrogen | 23017-015 | Dodać 72 &mikro; l sterylnego 5 M NaCl i podwielokrotność na 50 &mikro; l |
| 15 ml Stożkowa probówka | potraktowana komórkowo | 229411 | |
| PBS CMF 10x | Gibco | 14200 | stosowany przy 1x, rozcieńczony sterylną wodą filtrowaną Millipore |
| PBS 10x | Gibco | 14080 | używany przy 1x, rozcieńczony sterylną wodą filtrowaną Millipore |
| Ham's F12 | Lonza | 12-615F | |
| Albumina surowicy bydlęcej płodu (BSA) | Gibco | 10438 | stosować w F12HS20 przy 10% |
| HEPES | Sigma | H3375 | przygotować sterylny roztwór 1 M w wodzie destylowanej, rozcieńczyć w pożywce F12 do uzyskania końcowego stężenia 10 mM |
| Penicylina/streptomiocin | Sigma | P0781 | użyć 5 ml w 500 ml pożywki F12 |
| NT3 | Milipore | GF031 | Dodać 1 ml sterylnej wody Millipore, podwielokrotność w sterylnych warunkach, przechowywać w temperaturze -20 °; C, stosować w końcowym stężeniu 10 ng/ml w pożywce F12H, utrzymywać w -20 & stopniach; C zamrażarka bez rozmrażania |
| NGF | RnD systemy | 256-GF | Dodać 1 ml sterylnego 1x PBS z 0,1% BSA, podwielokrotność w sterylnych warunkach, przechowywać w temperaturze -20 stopni; C, stosowany w końcowym stężeniu 10 ng/ml w pożywce F12H |
| L-Glutamina | Sigma | G7513 | podwielokrotność w sterylnych warunkach, przechowywać w temperaturze -20 ° C, stosować przy końcowym stężeniu 200 mM w pożywce F12H |
| Trypsyna | Sigma | T4049 | podwielokrotność w sterylnych warunkach, przechowywać w temperaturze -20 & stopni; C |
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | Gibco | 15260 | |
| Inne potrzebne przedmioty: ogólne narzędzia do preparacji, w tym szklane pipety Pasteura, płodne białe jaja kurze leghorn, inkubator do jaj kontrolnych (nawilżany, 37 ° C), komora inkubacji komórek (nawilżona, 37 &; C), kaptur z przepływem laminarnym, lornetka stereowizyjna luneta preparacyjna | |||
| Tabela odczynników immunocytochemicznychsacharoza Sigma S9378 stosowany w roztworze utrwalającym (4% paraformaldehye, 30% sacharozy, 2x PBS)Triton-X 100 Sigma T-8787 Paraformaldehyd Sigma P6148 stosowany w roztworze utrwalającym (4% paraformaldehye, 30% | |||
| sacharoza, 2x PBS) | |||
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Normalna kozia surowica | Technologie życia | PCN500 | |
| Szkiełka mikroskopowe | VWR | 16004-430 | |
| Tabela przeciwciał pierwotnych | |||
| Przeciwciało przeciwko NCAM | Millipore | AB5032 | poliklonalne |
| przeciwciało przeciwko aktywowany & beta; 1 połknięcie | Millipore | MAB19294 | monoklonalne |
| Tabela przeciwciał wtórnych | |||
| Goat anty-mysie IgG Alexa 488 | Life technologies | A11001 | |
| Kozia anty-królicza IgG Alexa 548 | Technologie życiowe | A11036 | |
Bibliografia
- Millet, L. J., Gillette, M. U. Over a century of neuron culture: from the hanging drop to microfluidic devices. The Yale journal of biology and medicine. 85, 501-521 (2012).
- Guan, W., Puthenveedu, M. A., Condic, M. L.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
