Metody in vitro Test metylacji do badania metylacji białek argininy

Podsumowanie

Metylacja argininy białek, katalizowana przez klasę enzymów, tj. metylotransferazy białkowe argininy (PRMT), to proces enzymatycznego dodawania grup metylowych do arginin w białkach. Test metylacji in vitro jest najbardziej wiarygodnym narzędziem do oceny stanu metylacji znanych lub nowych substratów PRMT.

Streszczenie

Metylacja argininy białka jest jedną z najpowszechniejszych modyfikacji potranslacyjnych w jądrze. Metylację białka argininy można zidentyfikować i/lub określić za pomocą podejść proteomicznych i/lub immunoblottingu za pomocą przeciwciał specyficznych dla metylo-argininy. Jednak techniki te czasami mogą być mylące i często dają fałszywie dodatnie wyniki. Co najważniejsze, techniki te nie mogą dostarczyć bezpośrednich dowodów na poparcie specyficzności substratu PRMT. Z drugiej strony testy metylacji in vitro są użytecznymi testami biochemicznymi, które są czułe i konsekwentnie ujawniają, czy zidentyfikowane białka są rzeczywiście substratami PRMT. Typowy test metylacji in vitro obejmuje oczyszczone, aktywne PRMT, oczyszczony substrat i znakowany radioizotopem donor metylu (S-adenozylo-L-[metylo-3 H] metioninę). Tutaj opisujemy krok po kroku protokół izolacji katalitycznie aktywnego PRMT1, wszechobecnego członka rodziny PRMT. Aktywność metylotransferazy oczyszczonego PRMT1 została później przetestowana na białku wiążącym białko aktywujące Ras-GTPazę 1 (G3BP1), znanym substraencie PRMT, w obecności S-adenozylo-L-[metylo-3 H] metioniny jako donora metylu. Protokół ten może być wykorzystany nie tylko do ustalenia stanu metylacji nowych fizjologicznych substratów PRMT1, ale także do zrozumienia podstawowego mechanizmu metylacji białek argininy.

Wprowadzenie

Metylacja białek została po raz pierwszy opisana w 1968 roku¹. Dopiero pierwsze sklonowanie PRMT1 w 1996 roku sprawiło, że naukowcy zaczęli doceniać znaczenie tej potranslacyjnej modyfikacji². Co ciekawe, około 2% reszt argininy w białkach ekstraktów jądrowych jest metylowanych³, co wskazuje na obfitość tej modyfikacji. Arginina jest dodatnio naładowanym aminokwasem z zasadowym łańcuchem bocznym, a azot / azot w łańcuchach bocznych argininy może być modyfikowany potranslacyjnie poprzez dodanie grupy metylowej, proces znany jako metylacja argininy^4-6. Metylacja argininy jest katalizowana przez klasę enzymów, a mianowicie metylotransferazy białkowe argininy (PRMT). Argininy mogą być monometylowane lub dimetylowane, przy czym te ostatnie mogą być symetryczne lub asymetryczne w zależności od rodzaju PRMT katalizujących proces^4-6.

Białka, które wykazują motywy bogate w argininę i glicynę, są potencjalnymi celami dla katalizy za pośrednictwem PRMT. Wykazano, że metylacja substratów za pośrednictwem PRMT moduluje interakcję białko-białko, interakcję białko-kwas nukleinowy, funkcję białka, ekspresję genów i / lub sygnalizację komórkową, z których wszystkie mają kluczowe znaczenie dla normalnej homeostazy komórkowej^7-9. Aby zrozumieć biologiczną rolę metylacji argininy białek, wymagane są precyzyjne, wydajne i powtarzalne testy w celu ustalenia stanu metylacji zidentyfikowanych substratów PRMT.

Test metylacji in vitro, który ocenia zdolności oczyszczonych PRMT do katalizowania metylacji ich substratów, jest dobrze akceptowanym testem do badania metylacji argininy^10-12. Ogólny sukces tego testu zależy w dużej mierze od aktywności oczyszczonych PRMT. PRMT mogą być eksprymowane i oczyszczane z komórek bakterii lub ssaków^10,11. Ten test metylacji in vitro, jak szczegółowo opisano w sekcji protokołu, opiera się na metodzie pierwotnie opisanej przez Tini i współpracowników¹⁰. W tym protokole szczegółowo pokazujemy etapy związane z ekspresją i oczyszczaniem PRMT1 w komórkach ssaków. Zdolność oczyszczonego PRMT1 do katalizowania metylacji białka wiążącego białko aktywujące Ras-GTPazę 1 (G3BP1), znanego substratu PRMT⁸, oceniono później w obecności S-adenozylo-L-[metylo-3 H] metioniny jako donora metylu. Korzystając z tego testu, możemy wiarygodnie określić zdolność PRMT do metylacji nowych lub znanych substratów, co jest podstawowym krokiem w badaniu metylacji białek argininy.

Protokół

1. Przygotowanie konstrukcji wyrażeń

1. Przed rozpoczęciem protokołu należy sklonować PRMT do wektorów ekspresyjnych ssaków z N-końcowym znacznikiem epitopu (Myc lub HA) oraz substratem w ramce z S-transferazą glutationu (GST) w celu ekspresji białek na wysokim poziomie i oczyszczenia z lizatów komórek bakteryjnych, przy użyciu standardowych technik biologii molekularnej.

2. Oczyszczanie PRMT

1. Użyj naczyń hodowlanych o średnicy 100 mm, aby utrzymać ludzkie komórki nabłonka oskrzeli (Beas2B). Przechodź komórki co 3 dni i nie pozwól im rosnąć do zgrywania.
2. W dniu poprzedzającym transfekcję wysiewać 7,5 x 10⁵ komórek w 10 ml pożywki hodowlanej w naczyniu hodowlanym o średnicy 100 mm. Obracać w celu równomiernego rozproszenia komórek i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% nawilżonym roztworem CO₂ .
3. Następnego dnia odessać pożywkę i dodać 5 ml pożywki hodowlanej bez surowicy i antybiotyków. Zawirować i zassać pożywkę. Powtórz ten krok jeszcze raz, a na koniec dodaj 5 ml surowicy/pożywki wolnej od antybiotyków i przystąp do transfekcji.
4. Rozcieńczyć 6 μg plazmidowego DNA w 750 μl pożywki wolnej od surowicy w sterylnej probówce wirówkowej z tworzywa sztucznego o pojemności 1,5 ml.
5. W innej plastikowej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml rozcieńczyć 30 μl odczynnika do transfekcji w 750 μl pożywki wolnej od surowicy.
6. Przenieść rozcieńczony roztwór odczynnika do transfekcji (krok 2.5) do probówki zawierającej rozcieńczone DNA (krok 2.4). Delikatnie wymieszać, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół.
7. Mieszaninę transfekcji inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
8. Po 15 minutach delikatnie odpipetować mieszaninę transfekcji na komórki, zamieszać do równomiernego wymieszania i inkubować w temperaturze 37 °C w 5% wilgotnym inkubatorze CO₂ .
9. Po 3 godzinach odessać pożywkę zawierającą mieszaniny transfekcji z komórek. Dodaj świeżą pożywkę do hodowli komórkowych uzupełnioną surowicą i antybiotykami.
10. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% nawilżonym roztworem CO₂ przez 48 godzin.
11. Po 48 godzinach poddać komórki lizie w 1 ml buforu do lizy (1x sól fizjologiczna buforowana fosforanem, 1% Nonidet P-40, 0,5% deoksycholan sodu, 0,1% dodecylosiarczan sodu i 1 μg/ml fluorku fenlymetylosulfonylu). Zebrać lizaty do plastikowej probówki wirówkowej z podnośnikiem do komórek i inkubować lizaty na lodzie przez 30 minut.
12. Odwirować lizaty przy 15 000 x g przez 10 minut na wirówce stołowej, aby usunąć lizaty z resztek komórkowych. [* Zdecydowanie zaleca się potwierdzenie ekspresji HA-PRMT1 poprzez immunoblotting podwielokrotności lizatów przeciwciałami anty-HA, przed przystąpieniem do oczyszczania enzymów do testu metylacji.]
13. W celu oczyszczenia PRMT inkubować 3 mg lizatów komórkowych z 30 μl zawiesiny matrycy powinowactwa anty-HA w proporcji 50:50 w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i obracać przez noc w temperaturze 4 °C w rotatorze probówkowym.
14. Następnego dnia wiruj probówki o masie 14 000 x g na wirówce stołowej przez 2 minuty, aby zebrać kulki. Odrzucić supernatant i przepłukać kulki 3x 1 ml buforu RIPA [20 mM Tris (pH 8,0), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA i 1% Triton-X-100] w każdym płukaniu, a następnie odwirować przy 14 000 x g przez 2 min. Po trzecim płukaniu przemyć kulki raz 100 μl buforu metylacyjnego (50 mM Tris pH 8,5, 20 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM β-merkaptoetanolu, 100 mM sacharozy). Po odwirowaniu usunąć supernatant. Kulki zawierające unieruchomione PRMT są gotowe do użycia w teście metylacji. [* Zdecydowanie zaleca się użycie unieruchomionych PRMT natychmiast w teście metylacji.]

3. Oczyszczanie podłoża

1. Zaszczepić pojedynczą kolonię GST-G3BP1 przekształconą BL21 w 5 ml pożywki Luria-Bertani (LB) zawierającej 100 μg/ml ampicyliny. Hodować kultury przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 250 obr./min.
2. Następnego dnia przenieś kulturę na noc do 50 ml świeżej pożywki LB i kontynuuj wzrost do OD₆₀₀ 0,5-0,7 (zajmuje to około 2 godzin).
3. Gdy OD₆₀₀ osiągnie 0,5-0,7, dodać izopropylo-β-D-tiogalaktozyd (IPTG) do końcowego stężenia 1 mM i kontynuować hodowlę przez dodatkowe 4 godziny w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 250 obr./min.
4. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 1 500 x g przez 10 minut i przetworzyć granulki do oczyszczenia GST lub przechowywać w temperaturze -80 °C.
5. Ponownie zawiesić osad bakteryjny w 5 ml buforu do lizy (1x PBS z inhibitorami proteazy, 100 μg/ml lizozymu i 0,1% Triton-X-100) i inkubować lizaty w temperaturze 37 °C przez 30 min. W tym czasie lizaty będą wydawać się mętne i lepkie z powodu uwalniania bakteryjnego genomowego DNA.
6. Ścinanie genomowego DNA metodą sonikacji (10 impulsów po 1 sekundę każdy, o amplitudzie 30%).
7. Oczyścić lizaty przez odwirowanie przy 15 000 x g przez 10 minut i przenieść klarowny supernatant do probówki o pojemności 15 ml. Jeśli supernatant nie jest klarowny, powtórzyć proces wirowania jeszcze raz.
8. W międzyczasie umyj koraliki sefarozy GST dwukrotnie lodowatym PBS i przygotuj zawiesinę sefarozy GST w stosunku 50:50 w PBS. Dodać 200 μl zawiesiny sefarozy GST do oczyszczonego lizatu komórek bakteryjnych i obracać w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
9. Po 1 godzinie odwirować probówki o sile 500 x g przez 3 minuty, aby zebrać kulki. Umyj koraliki 3x lodowatym PBS.
10. Po ostatnim płukaniu ponownie zawiesić kulki w 100 μl buforu elucyjnego (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 30 mM glutationu) i obracać w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
11. Odwirować probówki o masie 15 000 x g przez 2 minuty i przenieść supernatant zawierający oczyszczone białko do innej probówki wirówkowej z tworzywa sztucznego. Przeprowadzić analizę elektroforezy w żelu poliakrylamidowym SDS (SDS-PAGE) na 5 μl oczyszczonego białka wraz ze znanymi ilościami albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w celu oszacowania stężenia oczyszczonego białka.

4. Test metylacji

UWAGA: Wykonaj następujące kroki w oddzielnym obszarze przeznaczonym do pracy z radioizotopami i zgodnie z protokołami instytucji dotyczącymi przeprowadzania eksperymentów z izotopami promieniotwórczymi.

1. Dodać 2 μg oczyszczonego substratu GST i mieszaninę główną zawierającą 1x bufor metylacyjny (50 mM Tris pH 8,5, 20 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM β-merkaptoetanolu, 100 mM sacharozy), 1 μCi S-adenozylo-L-[metylo-3 H] metioniny i wodę do końcowej objętości 10 μl do unieruchomionych PRMT (etap 2.13) i inkubować reakcję w temperaturze 30 °C przez 1 godzinę.
2. Po 1 godzinie zatrzymać reakcję, dodając 10 μl 2x buforu próbki SDS. Po denaturacji próbek w temperaturze 95 °C przez 10 minut, należy rozdzielić próbki na żelu SDS-PAGE.
3. Następnie przenieś oddzielone białka z żelu SDS na membranę nitrocelulozową za pomocą półsuchego transferu elektroforetycznego.
4. Po transferze przykryj membranę autofluorem (wzmacniaczem obrazu autoradiograficznego) i delikatnie kołysz przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Po 2 godzinach odlej autofluor i zachowaj do późniejszego wykorzystania. [*Oznacz rurkę jako materiał radioaktywny]
5. Szybko wysuszyć membranę na bibule filtracyjnej, zamknąć ją w plastikowej torbie i naświetlić membranę na kliszy rentgenowskiej w temperaturze -20 °C. Wystarczający czas ekspozycji wynosi od 5 do 30 dni.

5. Potwierdzenie ekspresji PRMT i równego obciążenia substratu

1. Po osiągnięciu wystarczającej ekspozycji przenieś membranę do plastikowego pudełka zawierającego bufor blokujący [sól fizjologiczna buforowana Tris z Tween-20 (TBST + 3% beztłuszczowego mleka)] i delikatnie kołysaj przez 1 godzinę.
2. Usunąć bufor blokujący wraz z odpadami promieniotwórczymi. Inkubować błonę z przeciwciałem anty-HA (rozcieńczenie 1:1 000) w TBST przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie kołysząc.
3. Przemyć membranę TBST 3x i inkubować membranę z wtórnym przeciwciałem anty-mysim znakowanym HRP (rozcieńczenie 1:5 000) w TBST w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z delikatnym kołysaniem.
4. Po 1 godzinie przemyć membranę TBST 3x i przeprowadzić detekcję chemiluminescencyjną białek za pomocą substratu HRP.
5. Po wykryciu PRMT znakowanych HA należy inkubować membranę z roztworem barwiącym Ponseau-S przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Szybko umyj membranę 3x wodą, aby wykryć podłoża oznaczone GST. Zeskanuj obraz.

Wyniki

Zdolność HA-PRMT1 do metylowania GST-G3BP1 określono za pomocą testu metylacji in vitro. W reakcji metylacji, w której jako donor grup metylowych zastosowano GST-G3BP1 oraz 1 μCi S-adenozylo-L-[metyl-³H]metioniny, wykorzystano HA-PRMT1 oczyszczone z lizatów komórek Beas2B. PRMT1 efektywnie katalizowało metylację GST-G3BP1 (Rycyna 1, panel górny). Reakcje metylacji z wykorzystaniem pull-down przeprowadzonych na lizatach komórek Beas2B przetransfekowanych pustym wektorem posłużyły jako ...

Dyskusja

Protokół opisany w niniejszym dokumencie jest rutynowo stosowany do ustalenia statusu metylacji zidentyfikowanych substratów PRMT. Ten solidny i spójny test dostarczy również ostatecznych dowodów na specyficzność PRMT w odniesieniu do ich substratów. Kluczowymi elementami sukcesu tego testu są: 1. Ekspresja PRMT w komórkach ssaków, 2. Aktywność oczyszczonych PRMT, 3. Ekspresja i oczyszczanie substratu oraz 4. Całkowity zachodni transfer białek do błony nitrocelulozowej.

Rekombinowane PRMT wyra...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
S-adenozylo-L-[metylo-3H] metionina	Perkin Elmer
Ecoscint ultra	National Diagnostics	LS-270
Dozownik butelkowy	National Diagnostics	LS-900
AutoFluor	National Diagnostics	LS-315
6 ml Fiolki scyntylacyjne	National Diagnostics	SKU:SVC-06
GST-sepharoza	GE Life Sciences
L-Glutation Reduced	Sigma	G4251
Lipofectamine	Invitrogen		Odczynnik do transfekcji
Beas2B	ATCC
Optimem	Invitrogen
NP-40	US-Biologicals
SDS	Sigma
Deoksycholan sodu	Sigma
PMSF	Sigma
matryca powinowactwa anty-HA	Roche
Tris	Sigma
Nacl	Sigma
Bio-rad żel doc	Bio Rad
przeciwciało anty-HA	roche
Ponseau S	Fisher Scientific