Test tworzenia miękkiego kolonii agaru jest metodą używaną do potwierdzania wzrostu in vitro niezależnego od zakotwiczenia komórkowego. Celem tego protokołu jest zilustrowanie rygorystycznej metody wykrywania potencjału rakotwórczego transformowanych komórek oraz supresyjnego wpływu białek na transformowane komórki.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Test tworzenia kolonii miękkiego agaru
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wzrost niezależny od zakotwiczenia to zdolność przekształconych komórek do wzrostu niezależnie od stałej powierzchni i jest cechą charakterystyczną kancerogenezy. Test tworzenia miękkich kolonii agaru jest dobrze ugruntowaną metodą charakteryzowania tej zdolności in vitro i jest uważany za jeden z najbardziej rygorystycznych testów na złośliwą transformację w komórkach. Test ten pozwala również na półilościową ocenę tej zdolności w odpowiedzi na różne warunki leczenia. Tutaj zademonstrujemy test tworzenia miękkiego kolonii agaru przy użyciu mysiej linii komórkowej raka płuc, CMT167, aby zademonstrować supresyjne działanie guza dwóch członków szlaku sygnałowego Wnt, Wnt7A i Frizzled-9 (Fzd-9). Jednoczesna nadekspresja Wnt7a i Fzd-9 spowodowała zahamowanie tworzenia kolonii w komórkach CMT167. Pokazuje to, że ekspresja liganda Wnt7a i jego receptora Frizzled-9 jest wystarczająca do zahamowania wzrostu guza w mysim modelu raka płuca.
Wprowadzenie
Test tworzenia kolonii miękkiego agaru jest techniką powszechnie używaną do oceny transformacji komórkowej in vitro. Historycznie rzecz biorąc, inny test, test klonogenny, opisany przez Pucka i wsp. w 1956 roku, został wykorzystany do oceny zdolności komórek do tworzenia kolonii1. W tej technice komórki zostały rozproszone na płytce hodowlanej i hodowane w obecności komórek "karmiących" lub kondycjonowanej pożywki w celu dostarczenia niezbędnych czynników wzrostu. Ograniczeniem tej techniki było to, że dostarczała ona tylko informacji dotyczących tworzenia kolonii. Normalne komórki nie mogą rosnąć niezależnie od zakotwiczenia, ze względu n....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie materiałów i odczynników
- Oznaczyć każdą studzienkę na 6-dołkowej płytce poddanej działaniu hodowli tkankowej odpowiednio dla każdej badanej linii komórkowej lub stanu.
- Przygotuj 2x pożywkę do hodowli komórkowych, rozpuszczając 1 g pożywki w proszku i 0,2 g wodorowęglanu sodu w wodzie dejonizowanej do końcowej objętości 50 ml.
- Przepuść to medium przez filtr 0,2 μm w celu sterylizacji.
- Dodaj dodatkowe składniki potrzebne do normalnej hodowli interesującej nas linii komórkowej. Na przykład hoduj linię komórkową CMT 167 w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej 10% FBS i 1% roztworem penicyliny/streptomycyny. Przed użyciem....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Ekspresja Wnt7A i Fzd9 w komórkach CMT167 jest skuteczna w supresji nowotworu, co wykazano w naszym teście tworzenia kolonii w miękkim agarze. Wstępnie wykorzystano Q-PCR, aby wykazać, że mRNA Wnt7A i Fzd9 wykazują niski poziom ekspresji w komórkach CMT167. Komórki CMT167 wykazywały niski poziom endogennego Wnt7A i Fzd9 w porównaniu z komórkami MLE-12, linią epitelialną płuc myszy przekształconą przez SV40 (Rycina 1). Następnie przeprowadzono transfekcję komórek CMT167 dwoma retrowirusowymi wektorami nad.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Potwierdzenie in vitro supresyjnej funkcji białek sygnałowych jest trudne. Jednym z najbardziej rygorystycznych testów dostępnych do zbadania tej właściwości jest test tworzenia miękkich kolonii agaru. Tutaj zilustrowaliśmy test tworzenia miękkiej kolonii agaru przy użyciu mysiej linii komórkowej raka płuc stabilnie wykazującej nadekspresję Wnt7a i Fzd9 w porównaniu z jej rodzicielską linią komórkową CMT167.
Istnieje kilka ważnych punktów, które należy wziąć pod uwagę w odniesieniu do.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez Merit Award od U.S. Department of Veterans Affairs oraz grant NIH R01CA1385282522717 dla RW.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Interesująca linia komórek rakowych | Sigma-Aldrich | 10032302 | CMT-167 |
| Sproszkowane RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-089 | Służy do przygotowania 2x pożywki do hodowli komórkowych. |
| Liquid RPMI 1650 Medium | Cellgro | 10-040-CV | Określany jako 1x pożywka do hodowli komórkowych. |
| Hyklon płodowej surowicy bydlęcej | SH30910.03 | Służy do uzupełniania pożywki do hodowli komórkowych. | |
| Penicylina/Streptomycyna | CellGro | 30-002-Cl | Stosowany w pożywce do hodowli komórkowych. |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | 214230 | Służy do przygotowania agaru 1,0% i 0,6%. |
| Wodorowęglan sodu | Fisher | BP-328-1 | Stosowany w 2x pożywce do hodowli komórkowych. |
| Trypsin | Cellgro | 25-050-Cl | |
| Sterylne filtry butelkowe | Fisher | 09-761-126 | Służy do sterylnego filtrowania 2x pożywka. |
| Odczynnik lipofekctaminy | Invitrogen | 18324-020 | Stosowany w teście lucyferazy PPAR-RE. |
| Płytki 6-dołkowe poddane działaniu | |||
| 37 ° C/5% CO2 Inkubator | |||
| Chemi-Doc Imager | Bio-Rad | Służy do fotografowania kolonii. | |
| Ilość Jedna Oprogramowanie | Bio-Rad | Służy do liczenia kolonii komórek. | |
| Probówki stożkowe 15 ml Probówki | |||
| stożkowe 50 ml Termosy Erlenmeyera | |||
| Kuchenka mikrofalowa | |||
| 5 ml Pipety | |||
| Pipety pomocnicze | |||
| Mikropipety | |||
| Hemacytometr z pokrywą | |||
| Poślizgowe końcówki | |||
| Mikroskop z odwróconym światłem | |||
| Wirówka | |||
| Rękawice | |||
| Saran Wrap | |||
| Wiadro na |
Bibliografia
- Puck, T. T., Marcus, P. I., Cieciura, S. J. Clonal growth of mammalian cells in vitro; growth characteristics of colonies from single HeLa cells with and without a feeder layer. J Exp Med. 103, 273-283 (1956).
- Taddei, M. L., Giannoni, E., Fiaschi, T., Chiarugi, P.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
