Test tworzenia kolonii miękkiego agaru

Podsumowanie

Test tworzenia miękkiego kolonii agaru jest metodą używaną do potwierdzania wzrostu in vitro niezależnego od zakotwiczenia komórkowego. Celem tego protokołu jest zilustrowanie rygorystycznej metody wykrywania potencjału rakotwórczego transformowanych komórek oraz supresyjnego wpływu białek na transformowane komórki.

Streszczenie

Wzrost niezależny od zakotwiczenia to zdolność przekształconych komórek do wzrostu niezależnie od stałej powierzchni i jest cechą charakterystyczną kancerogenezy. Test tworzenia miękkich kolonii agaru jest dobrze ugruntowaną metodą charakteryzowania tej zdolności in vitro i jest uważany za jeden z najbardziej rygorystycznych testów na złośliwą transformację w komórkach. Test ten pozwala również na półilościową ocenę tej zdolności w odpowiedzi na różne warunki leczenia. Tutaj zademonstrujemy test tworzenia miękkiego kolonii agaru przy użyciu mysiej linii komórkowej raka płuc, CMT167, aby zademonstrować supresyjne działanie guza dwóch członków szlaku sygnałowego Wnt, Wnt7A i Frizzled-9 (Fzd-9). Jednoczesna nadekspresja Wnt7a i Fzd-9 spowodowała zahamowanie tworzenia kolonii w komórkach CMT167. Pokazuje to, że ekspresja liganda Wnt7a i jego receptora Frizzled-9 jest wystarczająca do zahamowania wzrostu guza w mysim modelu raka płuca.

Wprowadzenie

Test tworzenia kolonii miękkiego agaru jest techniką powszechnie używaną do oceny transformacji komórkowej in vitro. Historycznie rzecz biorąc, inny test, test klonogenny, opisany przez Pucka i wsp. w 1956 roku, został wykorzystany do oceny zdolności komórek do tworzenia kolonii¹. W tej technice komórki zostały rozproszone na płytce hodowlanej i hodowane w obecności komórek "karmiących" lub kondycjonowanej pożywki w celu dostarczenia niezbędnych czynników wzrostu. Ograniczeniem tej techniki było to, że dostarczała ona tylko informacji dotyczących tworzenia kolonii. Normalne komórki nie mogą rosnąć niezależnie od zakotwiczenia, ze względu na szczególny rodzaj śmierci apoptotycznej, zwany anoikis². Jednak przekształcone komórki mają zdolność wzrostu i podziału bez wiązania się z substratem. Aby wykorzystać tę koncepcję, naukowcy opracowali test tworzenia miękkich kolonii agaru. Od tego czasu test tworzenia miękkich kolonii agarów został zmodyfikowany w ostatnich latach w celu zaspokojenia konkretnych potrzeb. Jedna z odmian polega na włączeniu barwnika fluorometrycznego, aby umożliwić wysokoprzepustowe zliczanie kolonii. Inna odmiana polega na użyciu specjalistycznego roztworu agaru, aby umożliwić pobranie żywych komórek po utworzeniu kolonii, gdy potrzebne są próbki białek lub DNA.

W tradycyjnym teście tworzenia kolonii miękkiego agaru, komórki są hodowane w warstwie miękkiego agaru zmieszanego z podłożem do hodowli komórkowych, które spoczywa na innej warstwie miękkiego agaru, również zmieszanego z podłożem do hodowli komórkowych, ale zawierającego wyższe stężenie agaru. Zapobiega to przyleganiu komórek do płytki hodowlanej, a jednocześnie umożliwia przekształconym komórkom tworzenie widocznych kolonii. Uzasadnieniem tej techniki jest to, że normalne komórki są zależne od kontaktu komórki z macierzą zewnątrzkomórkową, aby móc rosnąć i dzielić się. I odwrotnie, przekształcone komórki mają zdolność wzrostu i podziału niezależnie od otaczającego środowiska. W związku z tym komórki zdolne do tworzenia kolonii w sposób niezależny od zakotwiczenia uznano za przekształcone i rakotwórcze. Ogólnym celem tej metody jest zmierzenie tej zdolności w komórkach w sposób półilościowy i rygorystyczny.

Szlak sygnałowy Wnt jest krytyczny w embriogenezie i często ulega deregulacji w nowotworzeniu^3-6. Istnieje wiele ścieżek związanych z sygnalizacją Wnt. Szlak kanoniczny obejmuje sygnalizację Wnt i regulację transkrypcji genów w dalszej części strumienia poprzez jego wpływ na koaktywator transkrypcji beta-kateninę. Wnt sygnalizują również przez kilka niekanonicznych szlaków, na przykład szlak polaryzacji komórek płaskich, który reguluje elementy zaangażowane w strukturę cytoszkieletu⁷, oraz szlak Wnt-wapń, który reguluje uwalnianie wapnia z retikulum endoplazmatycznego⁸. Ligandy Wnt wywierają swoją aktywność poprzez wiązanie receptorów Frizzled. Chociaż wykazano, że kilka Wnt jest regulowanych w górę w raku płuc, wykazano, że Wnt7a jest regulowany w dół w niedrobnokomórkowym raku płuc poprzez metylację promotora⁹. Wnt7a wiąże Fzd9 i działa jako supresor guza poprzez szlak niekanoniczny. Przywrócenie Wnt-7a i Fzd-9 hamuje wzrost komórek niedrobnokomórkowego raka płuc¹⁰. Działanie Wnt7a/Fzd9 odbywa się poprzez aktywację ERK-5, który z kolei aktywuje receptor γ aktywowany przez proliferatory peroksysomów (PPARγ)^11,12. Tutaj pokazujemy, że nadekspresja Wnt7a i Fzd9 powoduje zahamowanie niezależnego od zakotwiczenia wzrostu linii komórkowej mysiego raka płuca. Mysie komórki CMT167 pochodziły z raka płuc u myszy C57BL / lcrf¹³ i były stabilnie transfekowane Wnt7A i Fzd9. Nadekspresję Wnt7A i Fzd9 potwierdzono ilościowo PCR (Q-PCR), a funkcjonalność nadekspresji Wnt7A i Fzd9 potwierdzono poprzez dalszą aktywację PPARγ.

Protokół

1. Przygotowanie materiałów i odczynników

1. Oznaczyć każdą studzienkę na 6-dołkowej płytce poddanej działaniu hodowli tkankowej odpowiednio dla każdej badanej linii komórkowej lub stanu.
2. Przygotuj 2x pożywkę do hodowli komórkowych, rozpuszczając 1 g pożywki w proszku i 0,2 g wodorowęglanu sodu w wodzie dejonizowanej do końcowej objętości 50 ml.
3. Przepuść to medium przez filtr 0,2 μm w celu sterylizacji.
4. Dodaj dodatkowe składniki potrzebne do normalnej hodowli interesującej nas linii komórkowej. Na przykład hoduj linię komórkową CMT 167 w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej 10% FBS i 1% roztworem penicyliny/streptomycyny. Przed użyciem podgrzać podłoże do 37 °C w gorącej kąpieli wodnej.
5. Przygotuj 1x pożywkę do hodowli komórkowych oddzielnie, tak jak w przypadku normalnej hodowli komórkowej interesującej Cię linii komórkowej.
6. Przygotuj 1% szlachetnego agaru, dodając 1 g szlachetnego agaru do 100 ml wody dejonizowanej.
   UWAGA: Szlachetny agar nie rozpuści się całkowicie przy samym mieszaniu.
7. Przygotuj agar szlachetny 0,6%, dodając 0,6 g szlachetnego agaru do 100 ml wody dejonizowanej. Oba roztwory agaru można przygotować w szklanych butelkach o pojemności 100 ml z zamykanymi pokrywkami do długotrwałego przechowywania.
8. Autoklaw szlachetnych mieszanin agarowych w celu sterylizacji. Mieszaniny te mogą być przygotowane z wyprzedzeniem i przechowywane w temperaturze 4 °C, ale powinny być ponownie podgrzane w czasie eksperymentu, aż do całkowitego rozpuszczenia się agaru.
9. Przygotować roztwór chlorku tetrazolu nitroniebieskiego, sporządzając roztwór podstawowy o stężeniu 1 mg/ml w 1x PBS (8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na₂HPO₄ i 0,24 g KH₂PO₄ w H₂O do końcowej objętości 1 000 ml). Zostanie to wykorzystane pod koniec eksperymentu do zabarwienia kolonii.

2. Poszycie dolnej warstwy agaru

1. Poluzuj nakrętkę na butelce z 1% szlachetnym agarem i wstaw do kuchenki mikrofalowej na około 1-2 minuty. Podczas podgrzewania w kuchence mikrofalowej uważnie monitoruj roztwór, aby uniknąć wykipienia. Kontynuuj podgrzewanie, mieszając z przerwami, aż agar całkowicie się rozpuści, a roztwór będzie klarowny.
   UWAGA: Do obsługi kolby po podgrzaniu należy używać rękawic żaroodpornych. Niezastosowanie się do tego może spowodować oparzenia lub poważne obrażenia.
2. Umieść stopiony roztwór agaru i wstępnie podgrzaną pożywkę 2x w wiadrze z lodem wypełnionym gorącą wodą z kranu (42 °C). Umieść również stożkową probówkę o pojemności 50 ml w uchwycie na probówkę w wiaderku z gorącą wodą. Przenieś wiadro do okapu do hodowli komórkowej w celu wykonania kolejnych kroków.
3. Do dolnej warstwy agaru potrzebne będzie 1,5 ml mieszanki agaru i pożywki na dołek płytki 6-dołkowej.
4. Aby zapewnić odpowiednią ilość mieszanki, należy przygotować łącznie 12 ml na każdą płytkę 6-dołkową.
5. Rozpocząć od dodania 6 ml pożywki hodowlanej do stożkowej probówki o pojemności 50 ml, a następnie 6 ml 1% szlachetnego roztworu agaru.
6. Odwróć stożkową rurkę kilka razy, aby wymieszać. Praca w szybkim tempie zapobiegnie przedwczesnemu stwardnieniu miękkiego agaru.
7. Pobrać około 5,5 ml mieszaniny do pipety serologicznej o pojemności 5 ml.
8. Pozwolić, aby pęcherzyki powietrza uniosły się do górnej części kolumny pipety przed wlaniem 1,5 ml tej mieszaniny do każdej studzienki. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć osadzania się pęcherzyków powietrza w dołkach płytowych.
9. Przykryj płytki i pozwól mieszaninie agaru zestalić się w temperaturze pokojowej, w kapturze do hodowli komórkowych, przez 30 minut.

3. Posiewanie górnej warstwy komórek zawierających agar

1. Gdy dolna warstwa agaru zastygnie, rozpocznij przygotowanie górnej warstwy.
2. Najpierw należy zebrać komórki przez trypsynizację i rozcieńczyć je w stosunku 1:5 w pożywce hodowlanej (np. na 1 ml trypsyny dodać 4 ml pożywki) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
3. Policz komórki i oblicz liczbę komórek potrzebnych na studzienkę, aby przygotować ostateczną zawiesinę komórek w tym czasie. Liczba ta będzie się różnić w zależności od typu komórki. Użyj 5,000 komórek / studnię jako punktu wyjścia i dostosuj w razie potrzeby. Dla tej liczby komórek należy przygotować zawiesinę komórek o stężeniu 6,667 komórek/ml (tj. każda studzienka otrzyma 0,75 ml tej zawiesiny i 0,75 ml agaru na całkowitą objętość 1,5 ml; stężenie komórek zostanie również rozcieńczone w stosunku 1:2, aby uzyskać końcową całkowitą liczbę komórek wynoszącą 5,000).
4. Objętość zawiesiny komórek potrzebna na studzienkę płytki 6-dołkowej ponownie wyniesie 1,5 ml. Przygotować dodatkową zawiesinę komórek w łącznej objętości 12 ml na płytkę 6-dołkową.
5. Rozpuść 0,6% roztwór agaru w kuchence mikrofalowej, jak powyżej, i umieść w pojemniku na lód zawierającym gorącą wodę wraz z 50 ml stożkową probówką w uchwycie na probówkę i końcową zawiesiną komórek z kroku 3.3.
6. Przenieś wiadro z lodem ze stopionym 0,6% agarem do okapu do hodowli komórkowych w celu wykonania kolejnych czynności.
7. Wymieszać 0,6% agaru i zawiesinę komórek w stosunku 1:1, przygotowując łączną objętość 12 ml na płytkę 6-dołkową. Wymagane będzie 1,5 ml na studzienkę, ale należy zrobić więcej, jak powyżej.
8. Odpipetować 6 ml zawiesiny komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
9. Następnie dodaj 6 ml 0,6% agaru do probówki.
   UWAGA: Temperatura tej mieszaniny musi być utrzymywana na poziomie około 42 °C, aby uniknąć przedwczesnego twardnienia i zmaksymalizować przeżywalność komórek.
10. Pracując szybko, odpipetuj tę mieszaninę 2-3 razy, aby rozprowadzić komórki, a następnie nabierz 5,5 ml mieszaniny do pipety serologicznej o pojemności 5 ml.
11. Pozwól, aby pęcherzyki powietrza uniosły się do górnej części kolumny pipety przed wlaniem 1,5 ml tej mieszaniny do każdej studzienki. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć osadzania się pęcherzyków powietrza w dołkach płytowych.
12. Pozostawić mieszaninę komórek/agarów do zestalenia się w temperaturze pokojowej, w kapturze do hodowli komórkowych, przez 30 minut przed umieszczeniem w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 °C.
13. Czas potrzebny do odpowiedniego utworzenia kolonii różni się dla każdej linii komórkowej, zwykle około 21 dni.
14. Na górnej warstwie agaru należy utrzymać warstwę pożywki wzrostowej, aby zapobiec wysuszeniu. W tym celu wystarczy 100 μl pożywki dodawanej dwa razy w tygodniu.

4. Barwienie płytek i liczenie kolonii

1. Wybarwić komórki, dodając 200 μl roztworu chlorku tetrazolu nitroniebieskiego do studzienki i inkubując płytki przez noc w temperaturze 37 °C.
2. Po zabarwieniu kolonii zrób zdjęcia studni za pomocą imagera i policz kolonie za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.

Wyniki

Ekspresja Wnt7A i Fzd9 w komórkach CMT167 jest skuteczna w tłumieniu nowotworów, co ilustruje nasz test tworzenia miękkich kolonii agarowych. Wstępnie użyliśmy Q-PCR, aby pokazać, że mRNA Wnt7A i Fzd9 ulegają ekspresji w niskich poziomach w komórkach CMT167. Komórki CMT167 wykazywały niski poziom endogennych Wnt7A i Fzd9 w porównaniu z komórkami MLE-12, mysią linią komórkową nabłonka płuc przekształconą przez SV40 (Figura 1). Następnie transfekowaliśmy komórki CMT167 dwoma retrowirusowymi wektorami nadek...

Dyskusja

Potwierdzenie in vitro supresyjnej funkcji białek sygnałowych jest trudne. Jednym z najbardziej rygorystycznych testów dostępnych do zbadania tej właściwości jest test tworzenia miękkich kolonii agaru. Tutaj zilustrowaliśmy test tworzenia miękkiej kolonii agaru przy użyciu mysiej linii komórkowej raka płuc stabilnie wykazującej nadekspresję Wnt7a i Fzd9 w porównaniu z jej rodzicielską linią komórkową CMT167.

Istnieje kilka ważnych punktów, które należy wziąć pod uwagę w odniesieniu do...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Interesująca linia komórek rakowych	Sigma-Aldrich	10032302	CMT-167
Sproszkowane RPMI 1640 Medium	Gibco	31800-089	Służy do przygotowania 2x pożywki do hodowli komórkowych.
Liquid RPMI 1650 Medium	Cellgro	10-040-CV	Określany jako 1x pożywka do hodowli komórkowych.
Hyklon płodowej surowicy bydlęcej		SH30910.03	Służy do uzupełniania pożywki do hodowli komórkowych.
Penicylina/Streptomycyna	CellGro	30-002-Cl	Stosowany w pożywce do hodowli komórkowych.
Difco Noble Agar	BD Biosciences	214230	Służy do przygotowania agaru 1,0% i 0,6%.
Wodorowęglan sodu	Fisher	BP-328-1	Stosowany w 2x pożywce do hodowli komórkowych.
Trypsin	Cellgro	25-050-Cl
Sterylne filtry butelkowe	Fisher	09-761-126	Służy do sterylnego filtrowania 2x pożywka.
Odczynnik lipofekctaminy	Invitrogen	18324-020	Stosowany w teście lucyferazy PPAR-RE.
Płytki 6-dołkowe poddane działaniu
37 ° C/5% CO2 Inkubator
Chemi-Doc Imager	Bio-Rad		Służy do fotografowania kolonii.
Ilość Jedna Oprogramowanie	Bio-Rad		Służy do liczenia kolonii komórek.
Probówki stożkowe 15 ml Probówki
stożkowe 50 ml Termosy Erlenmeyera
Kuchenka mikrofalowa
5 ml Pipety
Pipety pomocnicze
Mikropipety
Hemacytometr z pokrywą
Poślizgowe końcówki
Mikroskop z odwróconym światłem
Wirówka
Rękawice
Saran Wrap
Wiadro na