Artykuł metodologiczny

Techniki eksperymentalne i obrazowe do badania struktur skrzepów fibryny w stanach prawidłowych i chorobowych

DOI:

10.3791/52019

⸱

1 kwietnia 2015

 ,  ,  , 
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology & Emory University School of Medicine, 2Parker H. Petit Institute for Bioengineering & Bioscience, Georgia Institute of Technology, 3George W. Woodruff School of Mechanical Engineering, Georgia Institute of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym manuskrypcie przedstawiono techniki eksperymentalne, w tym przygotowanie krwi, mikroskopię konfokalną i analizę szybkości lizy, w celu zbadania różnic morfologicznych między normalnymi i nieprawidłowymi strukturami skrzepu spowodowanymi stanami chorobowymi.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fibryna to białko macierzy zewnątrzkomórkowej, które jest odpowiedzialne za utrzymanie integralności strukturalnej skrzepów krwi. W ostatnich latach przeprowadzono wiele badań nad fibryną, w tym badanie syntezy, struktury-funkcji i lizy skrzepów. Jednak nadal nie ma wielu niewiadomych na temat morfologicznych i strukturalnych cech skrzepów, które powstają u pacjentów z chorobą. W niniejszej pracy przedstawiono techniki eksperymentalne, które pozwalają na zbadanie różnic morfologicznych nieprawidłowych struktur skrzepu spowodowanych stanami chorobowymi, takimi jak cukrzyca i niedokrwistość sierpowatokrwinkowa. Nasze badanie koncentruje się na przygotowaniu i ocenie skrzepów fibrynowych w celu oceny różnic morfologicznych za pomocą różnych testów eksperymentalnych i mikroskopii konfokalnej. Ponadto opisano również metodę, która pozwala na ciągłe obliczanie szybkości lizy w czasie rzeczywistym w skrzepach fibryny. Techniki opisane w niniejszym dokumencie są ważne dla badaczy i klinicystów dążących do wyjaśnienia współistniejących patologii zakrzepowych, takich jak zawały mięśnia sercowego, choroba niedokrwienna serca i udary u pacjentów z cukrzycą lub niedokrwistością sierpowatokrwinkową.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uszkodzenie śródbłonka naczynia krwionośnego jest naprawiane poprzez reakcję hemostatyczną, czyli tworzenie się skrzepu krwi. Kiedy krew przenika do macierzy zewnątrzkomórkowej, czynniki tkankowe aktywują płytki krwi w krwiobiegu, co ułatwia zainicjowanie kaskady krzepnięcia. Kluczowym elementem mechanicznym tego procesu gojenia jest matryca fibrynowa, składająca się z włókien fibryny, które są bardzo elastyczne i mogą wytrzymać duże siły 1-4. Wielu badaczy intensywnie badało powstawanie, strukturę i funkcję fibryny w ciągu ostatnich dziesięcioleci 5-13.

Pacjenci z chorobami takimi jak cukrzyca i niedokrwistość sierpowatokrwinkowa mają zwiększone ryzyko wystąpienia powikłań zakrzepowych, takich jak zawały mięśnia sercowego, choroba niedokrwienna serca i udary 14-19. Każdego roku w Stanach Zjednoczonych u ponad 2 milionów osób diagnozuje się cukrzycę. Istnieją dwa rodzaje cukrzycy: typ I, w którym organizm nie jest w stanie wytworzyć odpowiedniej ilości insuliny, oraz typ II, w którym organizm staje się oporny na insulinę. Wśród pacjentów z cukrzycą choroby sercowo-naczyniowe (CVD) są przyczyną 80% zachorowalności i śmiertelności związanej z tą chorobą 20,21.

Niedokrwistość sierpowatokrwinkowa (SCD) to genetyczna choroba krwi, która dotyka ponad 100 000 osób w Stanach Zjednoczonych22. SCD jest chorobą z mutacją punktową, która powoduje, że czerwone krwinki stają się w kształcie półksiężyca, co utrudnia komórkom przejście przez naczynia krwionośne23. Oba te stany chorobowe zwiększają szanse na rozwój stanów miażdżycowych w organizmie. Jedną z przyczyn takiego stanu rzeczy jest zmieniona struktura i funkcja fibryny w stanach chorobowych14,24-26.

Zarówno w cukrzycy, jak i niedokrwistości sierpowatokrwinkowej, występuje aktywność nadkrzepliwości i hipofibrynolizy, która indukuje miażdżycę i choroby sercowo-naczyniowe (CVD) w porównaniu do zdrowych pacjentów 17,27,28. Wiadomo, że hipofibrynoliza sprzyja progresji miażdżycy i powoduje nawracające incydenty niedokrwienne u pacjentów z przedwczesną chorobą wieńcową29. W niniejszym manuskrypcie badaliśmy rolę właściwości fizycznych fibryny w tym konkretnym otoczeniu. Struktury skrzepów fibryny u pacjentów zdrowych składają się z cienkich włókien, większych porów i ogólnie mniej gęstych14,24. Stwierdzono, że zwiększona porowatość i mniej gęste skrzepy fibryny u zdrowych pacjentów ułatwiają fibrynolizę16. W stanach hiperzakrzepowych, takich jak cukrzyca i niedokrwistość sierpowatokrwinkowa, następuje wzrost produkcji fibrynogenu, co powoduje wzrost stężenia fibrynogenu z normalnego poziomu 2,5 mg / ml u zdrowych pacjentów w wieku 30-33 lat. Stwierdzono, że skrzepy fibrynowe powstające u pacjentów z cukrzycą są mniej porowate, sztywniejsze, mają więcej punktów rozgałęzień i są gęstsze w porównaniu ze zdrowymi pacjentami bez cukrzycy14,24,33-35. Zmieniona struktura fibryny jest wynikiem mechanizmów glikacji, które zachodzą w białkach biorących udział w tworzeniu skrzepów. Nieenzymatyczna (nieodwracalna) glikacja zachodzi, gdy cząsteczki glukozy wiążą się z resztą lizyny na cząsteczce fibrynogenu, która hamuje ludzki czynnik XIIIa (FXIIIa) przed prawidłowym sieciowaniem reszt glutaminy i lizyny33,36,37.

Analiza strukturalna sieci fibrynowych była ostatnio intensywnie badana. W szczególności naukowcy wykorzystali mikroskopię elektronową i rekonstrukcję 3D sieci fibrynowych38, zbadali, w jaki sposób zarówno komórki wewnątrznaczyniowe (śródbłonkowe), jak i pozanaczyniowe (fibroblasty i mięśnie gładkie) wpływają na strukturę fibryny39, wykorzystali analizę wiskoelastyczną i spektralną do analizy struktur fibryny40 oraz opracowali korelacje między strukturą fibryny a właściwościami mechanicznymi przy użyciu podejść eksperymentalnych i obliczeniowych41. Celem obecnego badania było sformułowanie struktur skrzepów w symulowanych warunkach zakrzepicy sierpowatokrwinkowej i niedokrwistości sierpowatokrwinkowej oraz zastosowanie mikroskopii konfokalnej do zbadania struktury i funkcji skrzepów w stanach chorobowych. Skrzepy fibryny powstały z ludzkiego fibrynogenu, ludzkiej trombiny i FXIIIa. Skrzepy poddano lizie za pomocą plazminy. Aby symulować stany cukrzycowe, zwiększone stężenie fibrynogenu inkubowano w roztworze glukozy w celu wywołania glikacji fibrynogenu in vitro. Aby symulować warunki krzepnięcia niedokrwistości sierpowatokrwinkowej, zwiększone stężenia fibrynogenu zmieszano z hematokrytem sierpowatokrwinkowym pobranym od pacjentów, jak to wcześniej zrobiła nasza grupa42. Metody te wykorzystano do zbadania struktury i funkcji związanych z tworzeniem skrzepów fibryny i fibrynolizą w warunkach chorobowych, a także mechanizmów indukujących CVD. Opierając się na aktualnych informacjach na temat tych chorób, struktury skrzepów glikowanej fibryny były gęstsze z mniejszą liczbą i mniejszymi porami. Skrzepy fibryny z czerwonymi krwinkami od pacjentów z niedokrwistością sierpowatokrwinkową (RBC) były również gęstsze i wykazywały agregację krwinek czerwonych i aglomerowanych klastrów fibryny. Jest to dobrze ugruntowane zjawisko, które zostało określone wcześniej43. Postawiono również hipotezę, że szybkość fibrynolizy będzie znacznie niższa w skrzepach fibryny glikowanej ze zredukowanym plazminą i bez niej w porównaniu ze zdrową, normalną fibryną. Wyniki wykazały, że w przypadku skrzepów fibryny glikowanej zaobserwowano istotnie różne wyniki szybkości lizy tylko w warunkach zmniejszonego stężenia plazminy. Ta eksperymentalna technika wykorzystująca mikroskopię konfokalną oferuje znaczące korzyści w porównaniu z innymi metodami obrazowania, ponieważ komórki i białka pozostają w swoim naturalnym stanie, co umożliwia rejestrowanie w czasie rzeczywistym aktywności krzepnięcia. Ta metoda syntetycznego wywoływania krzepnięcia jest również tańsza i bardziej efektywna czasowo niż pobieranie próbek od pacjentów i filtrowanie pojedynczych białek i enzymów. Ponadto, dzięki zastosowaniu oddzielonych białek i enzymów do syntezy skrzepów, skrzepy zostały znormalizowane tak, aby nie było zmienności między próbkami w wyniku innych białek w osoczu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Poniższy protokół jest zgodny z wytycznymi ustalonymi przez Institutional Review Board (IRB) w Georgia Tech.

1. Procedura pobierania krwi i izolacji krwinek czerwonych

  1. Pobrać 40-120 ml krwi od dawców do 10 ml heparynizowanych probówek próżniowych. Rozpocznij izolację PBMC (komórek jednojądrzastych krwi obwodowej) w ciągu 4 godzin od pobrania. W tym czasie utrzymuj krew w temperaturze RT.
    UWAGA: Przechowywanie krwi O/N w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C NIE jest zalecane, ponieważ spowoduje to niższą wydajność PBMC.
  2. Rozcieńczyć krew pełną w stosunku 1:1 w lodowato zimnym (4 °C) sterylnym PBS.
  3. Odpipetować 10 ml lodowatego hydrofilowego polisacharydu do pustej, sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Delikatnie przenieś rozcieńczoną krew pełną na hydrofilowy polisacharyd.
  4. Używać pipety o pojemności 25 ml w wolnym ustawieniu i bardzo powoli pipetować krew wzdłuż boku probówki. Upewnij się, że krew nie jest zmieszana z sacharydem przed odwirowaniem, ponieważ hydrofilowy polisacharyd jest toksyczny dla komórek, a w przeciwnym razie wydajność PBMC będzie niższa.
  5. Odwirowywać próbki krwi przez 30 minut w temperaturze 400 x g w temperaturze 4 °C. Jeśli to możliwe, zmniejsz prędkość hamowania wirówki do połowy maksymalnej, aby uzyskać lepszą separację po odwirowaniu.
  6. Odessać frakcję osocza/płytek krwi z odwirowanej próbki krwi. Ostrożnie odessać hydrofilową warstwę polisacharydową bezpośrednio nad wypełnioną warstwą RBC.
  7. Zebrać 8-10 ml zapakowanych erytrocytów i rozcieńczyć 1:1 niesterylnym 0,9% roztworem soli fizjologicznej NaCl.

2. Mikroskopia konfokalna ocena struktur skrzepów glikowanych (symulowane skrzepy cukrzycowe)

  1. Rozmrozić ludzki fibrynogen i fluorescencyjnie znakowany koniugat ludzkiego fibrynogenu w temperaturze 37 °C.
  2. Odpipetować następujące elementy do wyskalowanej probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml.
    1. Aby uzyskać zdrowe, normalne skrzepy fibrynogenu, zmieszaj ludzki fibrynogen z 10% fluorescencyjnie znakowanym ludzkim koniugatem fibrynogenu w buforze 50 mM Tris/100 mM NaCl o stężeniu 5 mg / ml.
    2. W przypadku sztucznie glikowanego fibrynogenu (w celu symulacji skrzepów cukrzycowych) należy inkubować ludzki fibrynogen i 10% fluorescencyjnie znakowany koniugat fibrynogenu w 5 mM roztworze glukozy rozpuszczonym w 50 mM Tris/100 mM NaCl, aby uzyskać otrzymane stężenie 6,8 mg / ml.
  3. Przykryj probówki mikrowirówek nieprzezroczystym materiałem, aby uniknąć ekspozycji na światło. Inkubować probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 48 godzin.
  4. Wykonaj komorę na szklanym szkiełku mikroskopowym, przyklejając cienki klej z 2 stron szkiełka.
  5. Po 48-godzinnym okresie inkubacji przygotować odczynniki do tworzenia fibryny, rozmrażając FXIIIa i ludzką alfa-trombinę w temperaturze pokojowej.
  6. Rozcieńczyć FXIIIa do 80 U/ml w 5 mM buforze CaCl2.
  7. Rozcieńczyć trombinę do 4 j./ml w 5 mM buforze CaCl2.
    1. W przypadku normalnych skrzepów należy upewnić się, że końcowe stężenia fibrynogenu, FXIIIa i trombiny wynoszą odpowiednio 2,5 mg/ml, 20 U/ml i 1 U/ml przy objętości 50 μl.
    2. W przypadku skrzepów glikowanych należy upewnić się, że końcowe stężenia fibrynogenu, FXIIIa i trombiny wynoszą odpowiednio 3,4 mg/ml, 20 U/ml i 1 U/ml przy objętości 50 μl.
  8. Natychmiast odpipetować 30 μl roztworu fibryny do komory utworzonej przez klej.
  9. Na 2 warstwach kleju umieść szklane szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 22 mm i grubości 0,15 mm. Uszczelnij otwarte boki przezroczystym klejem, aby zapobiec wysychaniu skrzepu fibryny. Upewnij się, że klej nie wchodzi w interakcję ze skrzepem fibryny.
  10. Pozostawić skrzepy fibryny do polimeryzacji w temperaturze 21-23 °C przez 2 godziny przed obrazowaniem konfokalnym
    11. .
  11. Wykonaj obrazy skrzepów za pomocą mikroskopu konfokalnego z soczewką 40X/1.30 Oil M27 z laserem argonowym 488 nm.

3. Mikroskopia konfokalna ocena skrzepów fibryny zawierających erytrocyty od pacjentów z niedokrwistością sierpowatokrwinkową

  1. Rozmrozić ludzki fibrynogen i fluorescencyjnie znakowany koniugat ludzkiego fibrynogenu w temperaturze 37 °C.
  2. Odpipetować następujące elementy do wyskalowanej probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml.
    1. Aby uzyskać zdrowy, normalny skrzep fibrynowy, zmieszaj ludzki fibrynogen z 10% fluorescencyjnie znakowanym koniugatem ludzkiego fibrynogenu w buforze 50 mM Tris/100 mM NaCl o stężeniu 5 mg / ml.
    2. W przypadku skrzepów zawierających erytrocyty SCD należy zmieszać ludzki fibrynogen i 10% znakowany fluorescencyjnie koniugatem ludzkiego fibrynogenu w 50 mM Tris/100 mM NaCl tak, aby otrzymane stężenie fibrynogenu wynosiło 10 mg / ml.
  3. Oznacz wyizolowane erytrocyty (zarówno normalne, jak i te od pacjentów z niedokrwistością sierpowatokrwinkową uzyskane z protokołu izolacji krwinek czerwonych) za pomocą roztworu do znakowania komórek.
    1. Zawiesić komórki o gęstości 1 x 10,6 na ml w dowolnie wybranej pożywce hodowlanej bez surowicy.
    2. Dodać 5 μl/ml zawiesiny komórkowej do roztworu znakującego komórki. Dobrze wymieszać, delikatnie pipetując.
    3. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
    4. Odwirować oznakowane probówki zawiesiny z prędkością 1 500 obr./min przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
    5. Usunąć supernatant i delikatnie zawiesić komórki w pożywce o temperaturze 37 °C.
    6. Powtórzyć procedurę mycia (3.3.4 i 3.3.5) jeszcze dwa razy.
  4. Rozcieńczyć FXIIIa do 80 U/ml w 5 mM buforze CaCl2.
  5. Rozcieńczyć trombinę do 4 j./ml w 5 mM buforze CaCl2.
    1. W przypadku normalnych skrzepów należy upewnić się, że końcowe stężenia fibrynogenu, FXIIIa i trombiny wynoszą odpowiednio 2,5 mg/ml, 20 U/ml i 1 U/ml przy objętości 50 μl.
    2. W przypadku skrzepów zawierających erytrocyty SCD należy upewnić się, że końcowe stężenia fibrynogenu, FXIIIa i trombiny wynoszą odpowiednio 5 mg/ml, 20 U/ml i 1 U/ml przy objętości 50 μl.
  6. Odpipetować 10 μl znakowanych krwinek czerwonych do roztworu fibryny. Pobrać pipetą 30 μl fibryny z krwinkami czerwonymi na szkło mikroskopu (patrz przygotowanie szkiełek do skrzepów glikowanych).
  7. Pozostawić fibrynę do polimeryzacji w temperaturze 21-23 °C przez 2 godziny przed obrazowaniem konfokalnym
    8. .
  8. Wykonaj konfokalne obrazy skrzepów za pomocą mikroskopu konfokalnego i wykorzystaj lasery wzbudzające o długościach fal 488 nm i 633 nm do wzbudzenia znakowanej fluorescencyjnie fibryny i erytrocytów.

4. Mikroskopia konfokalna oceniająca szybkość fibrynolizy w glikowanych strukturach skrzepów

  1. Powtórzyć protokół mikroskopii konfokalnej skrzepów glikowanych (Protokół Krok 2) w celu oceny szybkości fibrynolizy w skrzepach glikowanych.
  2. Nie uszczelniaj końców komory przezroczystym klejem. Pozostawić skrzepy fibryny do polimeryzacji przez 1,5 godziny w temperaturze 21-23 °C w szczelnej komorze zawierającej 250 ml wody, aby zapobiec odwodnieniu.
  3. Po polimeryzacji uzyskać obrazy skrzepów za pomocą mikroskopu konfokalnego.
  4. Odpipetować plazminę do otwartego końca komory i rozprowadzić plazminę przez skrzep poprzez działanie kapilarne.
    1. W przypadku eksperymentów z fibrynolizą normalną i fibrynolizą glikowaną o normalnych stężeniach, należy pobrać pipetę 25 μl przy 200 μg/ml plazminy do otworu komory.
    2. W przypadku skrzepów glikowanych o obniżonych stężeniach odpipetować pipetą 25 μl przy 50 μg/ml do otworu komory.
  5. Użyj funkcji szeregów czasowych (patrz rysunek 1) w oprogramowaniu mikroskopu konfokalnego, aby uchwycić w czasie rzeczywistym materiał wideo przedstawiający plazminę lizę skrzepu.
    1. Kliknij tryb akwizycji, a następnie wybierz "Szeregi czasowe". Wybierz liczbę cykli i interwał nagrywania.

5. Obliczanie współczynników fibrynolizy

  1. Określ szybkość lizy, ustawiając obszar (2 500 μm2) i obliczając czas, jaki upłynął do rozpuszczenia ustalonego obszaru skrzepu. Oblicz szybkość lizy, korzystając z następującego równania (rysunek 2):
    figure-protocol-1

6. Analiza statystyczna wskaźników fibrynolizy

  1. Analizuj dane dotyczące lizy za pomocą oprogramowania do analizy statystycznej. Wykonać jednoczynnikową ANOVA i post hoc test Tukeya-Kramera44,45.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia konfokalna Analiza struktur skrzepów glikowanej fibryny

Obrazy z mikroskopii konfokalnej skrzepów normalnych i glikowanych są przedstawione na rysunku 3. Analiza mikroskopii konfokalnej skrzepów normalnych i glikowanych ujawnia, że skrzepy glikowane są gęstsze i mają mniejsze pory niż normalne skrzepy, zarówno z dodatkiem FXIIIa, jak i bez niego podczas polimeryzacji skrzepów. Na rycinach 3A i 3B występuje niższe stężenie fibryny, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby uzyskać miarodajne dane na temat struktury mechanizmów krzepnięcia w stanach chorobowych, ważne jest wyizolowanie czynników zaangażowanych w krzepnięcie w celu określenia wpływu białek i komórek w tych stanach. Protokół ten został opracowany na potrzeby badania struktury skrzepu fibryny w stanach cukrzycowych i SCD in vitro.

Konieczne jest zrozumienie mechanizmów związanych z powstawaniem fibryny i fibrynolizą w stanach chorobowych, ponieważ zmienione warunki powodują nadkrzepliwo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Lam Lab w Georgia Tech za wiele pomocnych dyskusji przy opracowywaniu eksperymentalnych testów. Badania przedstawione w tej publikacji były wspierane przez Narodowy Instytut Serca, Płuc i Krwi Narodowych Instytutów Zdrowia w ramach nagrody numer K01HL115486 oraz przez New Innovator Grant 1DP2OD007433-01 z Biura Dyrektora Narodowych Instytutów Zdrowia. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
PBSLife Technologies10010031
Ficoll-Paque (hydrofilowy polisacharyd)GE Healthcare45-001-749
10 ml heparynizowane probówki próżnioweBD Biosciences366643
Laboratoria BadawczeLudzkich Enzymów FibrynogenuNie dotyczy
Alexa Fluor 488 ludzkie koniugaty fibrynogenuSondy molekularneF13191
Probówka mikrowirówkowa z podziałką 0,5 mlFisher Scientific05-408-120
Glukoza w proszkuLife Technologies15023-02
FXIIIaLaboratoria Badań EnzymatycznychN/A
VIS Mikroskop konfokalnyZeiss LSM 510LSM 510
50 mM TrisLonzaS50-642
Chlorek wapnia (CaCl2)Sigma Aldrich449709-10G
Vybrant DiD roztwór do znakowania komórekLife TechnologiesL7781
Laboratoria Badań EnzymówPlazminowychN/A
Chlorek sodu (5 M NaCl)Life TechnologiesAM9759
Oprogramowanie do modelowania statystycznegoIBMSPSS Statistics 22

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Averett, R. D., et al. A Modular Fibrinogen Model that Captures the Stress-Strain Behavior of Fibers. Biophysical Journal. 103, 1537-1544 (2012).
  2. Carlisle, C. R., et al. The mechanical properties of individual, electrospun fibrinogen fibers. Biomaterials. 30, 1205-1213 (2009).
  3. Falvo, M. R., Gorkun, O. V., Lord, S. T. The molecular origins of the mechanical properties of fibrin. Biophysical Chemistry. 152, 15-20 (2010).
  4. Guthold, M., Cho, S. S. Fibrinogen Unfolding Mechanisms Are Not Too Much of a Stretch. Structure. 19, 1536-1538 (2011).
  5. Gerth, C., Roberts, W. W., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots II: Linear viscoelastic behavior in shear creep. Biophysical Chemistry. 2 (74), 208-217 (1974).
  6. Nelb, G. W., Kamykowski, G. W., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots. v. shear modulus, creep, and creep recovery of fine unligated clots. Biophysical Chemistry. 13 (81), 15-23 (1981).
  7. Roberts, W. W., Kramer, O., Rosser, R. W., Nestler, F. H. M., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots. I.: Dynamic viscoelastic properties and fluid permeation. Biophysical Chemistry. 1, 152-160 (1974).
  8. Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L. Structural Origins of Fibrin Clot Rheology. Biophysical Journal. 77, 2813-2826 (1999).
  9. Weisel, J. W. Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides. Biophysical Journal. 50, 1079-1093 (1986).
  10. Weisel, J. W. The mechanical properties of fibrin for basic scientists and clinicians. Biophysical Chemistry. 112, 267-276 (2004).
  11. Wolberg, A. S. Thrombin generation and fibrin clot structure. Blood Reviews. 21, 131-142 (2007).
  12. Wolberg, A. S., Campbell, R. A. Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis. Transfusion and Apheresis Science. 38, 15-23 (2008).
  13. Yeromonahos, C., Polack, B., Caton, F. Nanostructure of the Fibrin Clot. Biophysical Journal. 99, 2018-2027 (2010).
  14. Dunn, E. J. Fibrinogen and fibrin clot structure in diabetes. Herz. 29, 470-479 (2004).
  15. Gladwin, M. T., Sachdev, V. Cardiovascular abnormalities in sickle cell disease. Journal of the American College of Cardiology. 59, 1123-1133 (2012).
  16. Collet, J. P., et al. Altered Fibrin Architecture Is Associated With Hypofibrinolysis and Premature Coronary Atherothrombosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).
  17. Carr, M. E. Diabetes mellitus: a hypercoagulable state. Journal of Diabetes and its Complications. 15, 44-54 (2001).
  18. Ajjan, R. A., Ariëns, R. A. S. Cardiovascular disease and heritability of the prothrombotic state. Blood Reviews. 23, 67-78 (2009).
  19. Standeven, K. F., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. The molecular physiology and pathology of fibrin structure/function. Blood Reviews. 19, 275-288 (2005).
  20. American Diabetes Association. , Available from: http://www.diabetes.org/ (2014).
  21. Alzahrani, S., Ajjan, R. Review article: Coagulation and fibrinolysis in diabetes. Diabetes and Vascular Disease Research. 7, 260-273 (2010).
  22. Sickle Cell Disease Association of America, Inc. , Available from: http://www.sicklecelldisease.org/ (2014).
  23. Stuart, M. J., Nagel, R. L. Sickle-cell disease. The Lancet. 364, 1343-1360 (2004).
  24. Dunn, E. J., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. The influence of type 2 diabetes on fibrin structure and function. Diabetologia. 48, 1198-1206 (2005).
  25. Dunn, E. J., Philippou, H., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. Molecular mechanisms involved in the resistance of fibrin to clot lysis by plasmin in subjects with type 2 diabetes mellitus. Diabetologia. 49, 1071-1080 (2006).
  26. Famodu, A., Reid, H. Plasma fibrinogen levels in sickle cell disease. Tropical and geographical medicine. 39, 36-38 (1987).
  27. Richardson, S., Matthews, K., Stuart, J., Geddes, A., Wilcox, R. Serial Changes in Coagulation and Viscosity during Sickle-Cell Crisis. British journal of haematology. 41, 95-103 (1979).
  28. Ataga, K. I., Orringer, E. P. Hypercoagulability in sickle cell disease: a curious paradox. The American Journal of Medicine. 115, 721-728 (2003).
  29. Collet, J. P., et al. Altered fibrin architecture is associated with hypofibrinolysis and premature coronary atherothrombosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).
  30. Barazzoni, R., et al. Increased Fibrinogen Production in Type 2 Diabetic Patients without Detectable Vascular Complications: Correlation with Plasma Glucagon Concentrations. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 85, 3121-3125 (2000).
  31. Ceriello, A. Coagulation activation in diabetes mellitus: the role of hyperglycaemia and therapeutic prospects. Diabetologia. 36, 1119-1125 (1993).
  32. Mayne, E. E., Bridges, J. M., Weaver, J. A. Platelet adhesiveness, plasma fibrinogen and factor VIII levels in diabetes mellitus. Diabetologia. 6, 436-440 (1970).
  33. Weisel, J. W. Fibrinogen and fibrin. Advances in protein chemistry. 70, 247-299 (2005).
  34. Collet, J., et al. Influence of Fibrin Network Conformation and Fibrin Fiber Diameter on Fibrinolysis Speed Dynamic and Structural Approaches by Confocal Microscopy. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 20, 1354-1361 (2000).
  35. Jörneskog, G., et al. Altered properties of the fibrin gel structure in patients with IDDM. Diabetologia. 39, 1519-1523 (1996).
  36. Svensson, J., et al. Acetylation and glycation of fibrinogen in vitro occur at specific lysine residues in a concentration dependent manner: A mass spectrometric and isotope labeling study. Biochemical and Biophysical Research Communications. 421, 335-342 (2012).
  37. Pieters, M., et al. Glycation of fibrinogen in uncontrolled diabetic patients and the effects of glycaemic control on fibrinogen glycation. Thrombosis Research. 120, 439-446 (2007).
  38. Baradet, T. C., Haselgrove, J. C., Weisel, J. W. Three-dimensional reconstruction of fibrin clot networks from stereoscopic intermediate voltage electron microscope images and analysis of branching. Biophysical journal. 68, 1551-1560 (1995).
  39. Campbell, R. A., Overmyer, K. A., Selzman, C. H., Sheridan, B. C., Wolberg, A. S. Contributions of extravascular and intravascular cells to fibrin network formation, structure, and stability. Blood. 114, 4886-4896 (2009).
  40. Curtis, D. J., et al. A study of microstructural templating in fibrin-thrombin gel networks by spectral and viscoelastic analysis. Soft Matter. 9, 4883-4889 (2013).
  41. Kim, E., et al. Correlation between fibrin network structure and mechanical properties: an experimental and computational analysis. Soft Matter. 7, 4983-4992 (2011).
  42. Keegan, P. M., Surapaneni, S., Platt, M. O. Sickle cell disease activates peripheral blood mononuclear cells to induce cathepsins k and v activity in endothelial cells. Anemia. 2012, 201781(2012).
  43. Allison, A. Properties of sickle-cell haemoglobin. Biochemical Journal. 65, 212(1957).
  44. Kuehl, R. O. Design of experiments : statistical principles of research design and analysis. , 2nd ed, Cengage Learning. Pacific Grove, CA. (2000).
  45. Lindman, H. R. Analysis of variance in experimental designs. , Springer-Verlag Publishing. New York, N.Y., USA. (1992).
  46. Pan, W., Galkin, O., Filobelo, L., Nagel, R. L., Vekilov, P. G. Metastable Mesoscopic Clusters in Solutions of Sickle-Cell Hemoglobin. Biophysical Journal. 92, 267-277 (2007).
  47. Wootton, D. M., Popel, A. S., Alevriadou, B. R. An experimental and theoretical study on the dissolution of mural fibrin clots by tissue-type plasminogen activator. Biotechnology and bioengineering. 77, 405-419 (2002).
  48. Sazonova, I. Y., et al. 127 Mathematic model of fibrin clot lysis by plasmin. Fibrinolysis and Proteolysis. 12, Suppl 1. 45(1998).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia konfokalnatempo fibrynolizyskrzepy glikowaneanemia sierpowatacukrzycazakrzepicahemostazaobrazowanie w czasie rzeczywistympolimeryzacja skrzepulizis indukowana plazmin

Powiązane artykuły