Analiza profilu metabolicznego w czasie rzeczywistym w hodowlach organoidów ex vivo w krypcie jelitowej myszy

Podsumowanie

Organoidy kryptowe jelita cienkiego hodowane ex vivo dostarczają system hodowli tkankowej, który podsumowuje wzrost krypt zależny od komórek macierzystych i ich niszy. Opracowaliśmy metodę oznaczania profilu metabolicznego w czasie rzeczywistym w pierwotnych organoidach krypt myszy. Odkryliśmy, że organoidy zachowują właściwości fizjologiczne określone przez ich źródło.

Streszczenie

Błona śluzowa jelita cienkiego wykazuje powtarzalną architekturę zorganizowaną w dwie podstawowe struktury: kosmki, wystające do światła jelita i składające się z dojrzałych enterocytów, komórek kubkowych i komórek enteroendokrynnych; oraz krypt, rezydujących bliżej błony podśluzowej i mięśniowej, zawierających dorosłe komórki macierzyste i progenitorowe oraz dojrzałe komórki Panetha, a także komórki zrębu i odporności mikrośrodowiska krypty. Do ostatnich kilku lat badania in vitro jelita cienkiego ograniczały się do linii komórkowych pochodzących z łagodnych lub złośliwych nowotworów i nie reprezentowały fizjologii prawidłowego nabłonka jelitowego i wpływu mikrośrodowiska, w którym się znajdują. Tutaj demonstrujemy metodę zaadaptowaną z Sato et al. (2009) do hodowli pierwotnych organoidów krypty jelit myszy pochodzących od myszy C57BL / 6. Ponadto przedstawiono wykorzystanie kultur organoidów kryptowych do oznaczania profilu metabolicznego krypty w czasie rzeczywistym poprzez pomiar podstawowego zużycia tlenu, szybkości glikolitycznej, produkcji ATP i wydolności oddechowej. Organoidy zachowują właściwości określone przez ich źródło i zachowują aspekty swojej adaptacji metabolicznej odzwierciedlone w zużyciu tlenu i tempie zakwaszenia zewnątrzkomórkowego. Badania metaboliczne w czasie rzeczywistym w tym systemie hodowli organoidów kryptowych są potężnym narzędziem do badania metabolizmu energetycznego organoidów kryptowych oraz tego, jak można go modulować za pomocą czynników odżywczych i farmakologicznych.

Wprowadzenie

Rak jelita grubego (CRC) jest trzecią najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem w Stanach Zjednoczonych. Sporadyczny rak jelita grubego – tj. pojawiający się w późniejszym okresie życia (>50 roku życia) i bez wyraźnych predysponujących czynników genetycznych – stanowi ~80% wszystkich przypadków, przy czym częstość występowania jest silnie uzależniona od długoterminowych wzorców żywieniowych^1,2. Guzy te wykazują przesunięcie metaboliczne w kierunku zależności od oksydacyjnej glikolizy, znanej jako efekt Warburga, który może częściowo powodować wyższe stężenia komórkowych elementów budulcowych i energii (poprzez glutaminolizę), aby umożliwić i być może napędzać wysokie tempo proliferacji komórek nowotworowych^3-5. Badania nad rakiem jelita grubego, a także innymi nowotworami przewodu pokarmowego, w tym rakiem jelita cienkiego, dostarczają ważnych informacji na temat przyczyny powstawania nowotworów. Badanie różnic metabolicznych między normalnym, pronowotworowym i nowotworowym stanem układów narządów przewodu pokarmowego może pomóc w określeniu względnego ryzyka rozwoju nowotworu, a także we wczesnym wykryciu nowotworu. Co więcej, zrozumienie metabolizmu bioenergetycznego obejmującego oddychanie mitochondrialne i glikolizę dostarczy fundamentalnych informacji na temat tego, w jaki sposób fizjologia komórki, starzenie się i stan chorobowy zaburzają homeostazę jelit. Wykorzystanie technologii testów bioenergetycznych do analizy strumienia zewnątrzkomórkowego może ocenić tempo oddychania mitochondrialnego i glikolizy jednocześnie w komórkach rosnących w kulturze w czasie rzeczywistym^6,7.

Do niedawna badania in vitro jelita cienkiego ograniczały się do linii komórkowych pochodzących z łagodnych lub złośliwych nowotworów^8,9 i nie reprezentowały fizjologii normalnego nabłonka jelitowego i wpływu mikrośrodowiska, w którym się znajdują. W 2009 roku Sato i wsp. ¹⁰ wprowadzili system hodowli ex vivo w celu wyhodowania trójwymiarowych (3D) organoidów nabłonka jelitowego myszy lub nabłonkowych "mini-jelit", odpowiednich do badań eksperymentalnych, diagnostycznych i terapeutycznych^10,11. Co więcej, krypty wyizolowane od myszy o ograniczonej kaloryczności zachowują swoje zmienione właściwości wzrostu jako organoidy w takich kulturach¹². W porównaniu z transformowanymi liniami komórkowymi, kryptowe hodowle organoidów mogą być wykorzystywane do generowania fizjologicznie istotnych danych, stanowiąc znacznie lepszy model do zrozumienia stanu in vivo.

Dostosowaliśmy technologię analizy bioenergetycznej do badania metabolizmu energetycznego organoidów krypt jelitowych. Organoidy krypt jelit myszy hodowano ex vivo w celu opracowania przedstawionych badań metabolizmu energetycznego organoidów kryptowych. Wskaźnik zużycia tlenu (OCR) i wskaźnik zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) organoidów krypt mierzono przy braku i obecności dwóch różnych inhibitorów metabolicznych (oligomycyny, rotenonu) i nośnika jonów (cyjanek karbonylu-p-trifluorometoksyfenylohydrazon). Odpowiedź metaboliczna organoidów kryptowych na te związki chemiczne została z powodzeniem odzwierciedlona poprzez zmianę wartości ECAR i OCR.

Badania bioenergetyczne komórek wyjaśnią wzajemne interakcje między stanem metabolicznym a ryzykiem choroby i fenotypem w raku, otyłości, cukrzycy, zaburzeniach metabolicznych i chorobach mitochondrialnych oraz pomogą w rozwoju metod badań przesiewowych z bezpośrednim wpływem na medycynę translacyjną. Tutaj opisujemy szczegółowy protokół izolacji krypt jelita cienkiego i hodowli organoidów kryptowych. Ponadto wprowadzamy nowatorską metodę wykorzystania krypt kultur organoidowych do testów metabolicznych.

Protokół

To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych National Institutes of Health. Protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Etyki Eksperymentów na Zwierzętach Albert Einstein College of Medicine.

1. Izolacja i kultura krypty

1. Izolacja krypt z jelita cienkiego:
   1. Odizoluj krypty jelitowe od dowolnego modelu myszy, który Cię interesuje. Poddaj myszy eutanazji za pomocą CO₂ , a następnie zwichnięciu szyjki macicy.
   2. Otwórz brzuch wzdłużnie i napełnij jelito cienkie (SI) lodowatym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem, PBS (-Ca²⁺; -Mg²⁺) z 2x antybiotykiem przeciwgrzybiczym (anty-anty). Szybko wyizoluj jelito cienkie.
   3. Dokładnie wypreparować tłuszcz krezkowy za pomocą skalpela. Uważaj, aby nie przebić tkanki – przez cały czas utrzymuj tkankę wilgotną lodowatym PBS. Otwórz jelito wzdłużnie i dokładnie umyj lodowatym PBS.
   4. Przetnij jelito cienkie na dwie części i spłaszcz za pomocą mokrej bawełnianej końcówki, delikatnie zeskrob kosmki za pomocą wstępnie schłodzonego szkiełka. Kilkakrotnie energicznie umyć w lodowatym PBS.
   5. Inkubować przez 3 minuty w 20 ml 1x PBS na 3 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)/0,5 mM ditiotreitol (DTT) w celu nieenzymatycznej dysocjacji tkanki.
   6. Pokrój tkankę na małe kawałki (2-4 mm) za pomocą żyletki na wstępnie schłodzonym szkiełku. Przenieś kawałki do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 20 ml lodowatego PBS.
   7. Delikatnie pipetować w górę i w dół 10 razy za pomocą sterylnej jednorazowej pipety o pojemności 10 ml. Niech fragmenty tkanki osadzają się grawitacyjnie. Usunąć supernatant za pomocą pipety. Powtórz jeszcze trzy razy; Upewnij się, że supernatant jest klarowny.
   8. Dodać 20 ml PBS na 2 mM EDTA. Obracać i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut, delikatnie kołysząc.
   9. Pozostawić tkankę do osadu i odrzucić supernatant. Dodaj 15 ml lodowatego PBS i pipetuj 5 razy w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Pozwól fragmentom tkanki osiąść i zebrać supernatant jako frakcję 1 (F1). Powtórz zbieranie F2-F5, każda frakcja utrzymywana oddzielnie.
   10. Dodaj 15 ml lodowatego PBS i tym razem energicznie potrząsaj ręcznie przez 15 sekund. Zbierz F6 i powtórz dla F7, F8. Jeśli kawałki tkanki zaczną unosić się na wodzie, dotknij, aby pomóc im się uspokoić.
   11. Zbadać podwielokrotność każdej frakcji pod mikroskopem. Zbierz te frakcje, które zawierają krypty.
   12. Przepuść zebrane frakcje przez nylonowe sitko o średnicy 70 μm, zbierając krypty w probówce o pojemności 50 ml.
   13. Wirować przy 100 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml lodowatego PBS z 2 kryptami anty-anty i transferowymi do probówki o pojemności 15 ml. Powtórz pranie jeszcze raz.
   14. Umyj krypty raz za pomocą 10 ml lodowatego ADF, Advanced DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham"s F-12) – 2x anty-anty.
   15. Umyj krypty raz za pomocą 10 ml ADF – 1x anti–anti.
   16. Policz krypty za pomocą hemocytometru. Dostosuj objętość roztworu krypty i przenieś do probówki o pojemności 1,5 ml tak, aby końcowe stężenie krypty po ponownym zawieszeniu wynosiło 100-500 krypt na 50 μl galaretowatej mieszaniny białek (Matrigel). Wirować przy 100 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić krypty w galaretowatej mieszaninie białek.
   17. Płytka 50 μl zawiesiny krypty – galaretowatej mieszaniny białek na basenie w 24-dołkowej płytce (obszar wzrostu: 2 cm²), ostrożnie umieszczając kroplę zawiesiny na środku każdej studzienki. Przechowywać płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C CO₂ przez ~30 minut, aż zawiesina zastygnie.
   18. Dodać 500 μl lodowatej pożywki (Advanced DMEM/F12 z 1x anty – anty, 10 mM kwasem 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowym (HEPES), 1x GlutaMAX, 1x Suplement B27, 1x Suplement N2, 1 mM N-acetylo-L-Cysteina (NAC), 50 ng/ml Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-Spondyna).
       1. Rozpuść czynniki wzrostu w 0,1% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) w PBS.
2. Kultura i przejście organoidów w krypcie:
   1. Organoidy krypty pasażowe 14-21 dni po wysiewie (lub w razie potrzeby) w następujący sposób:
      1. Zmieniaj media w każdy piątek i poniedziałek. W środy zastąp połowę mediów świeżymi mediami.
   2. Usuń pożywkę hodowlaną. Przemyć próbkę dwukrotnie 500 μl PBS w odstępach 5-minutowych.
   3. Usuń PBS i delikatnie rozdrobnij galaretowatą mieszaninę białek za pomocą sterylnej końcówki mikropipety P1000.
   4. Dodać 1 ml kompletnej pożywki hodowlanej do jednego dołka i ponownie zawiesić organoidy w pożywce o objętości 1 ml.
   5. Delikatnie rozerwać organoidy za pomocą P1000, pipetując w górę iw dół 20-30x (sprawdź pod mikroskopem prawidłową dysocjację organoidów z dobrą wydajnością krypty, aż do opracowania spójnej techniki).
   6. Przenieść krypty do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml; odwirować przy 100 x g w temperaturze 4 °C, 5 min.
   7. Przepłukać osad dwukrotnie 1 ml kompletnej pożywki hodowlanej.
   8. Rozłupać w proporcji 1:3 lub 1:6 w zależności od potrzeb, ponownie zawieszając krypty w 50 μl Matrigel na studzienkę. Postępuj zgodnie z powyższym opisem (sekcja 1.1.16-18).
3. Zamrażanie organoidów w krypcie:
   1. Usuń pożywkę hodowlaną. Przemyć próbkę w 500 μl PBS.
   2. Rozproszyć galaretowatą mieszaninę białek za pomocą końcówki pipety P1000.
   3. Dodać 1 ml pożywki do pojedynczego dołka i ponownie zawiesić organoidy w pożywce o objętości 1 ml.
   4. Delikatnie rozdrobnij organoidy za pomocą P1000, pipetując w górę iw dół 20-30x.
   5. Przenieść organoidy do probówki o pojemności 1,5 ml. Odwirować przy 100 x g w temperaturze 4 °C, 5 min.
   6. Przepłukać osad dwukrotnie 1 ml kompletnej pożywki hodowlanej.
   7. Zawieś krypty w pożywce zamrażającej o pojemności 500 μl.
   8. Przenieś krypty do krioprobówki, umieść probówkę w pojemniku do zamrażania i przechowuj przez noc w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
   9. Przenieś krypty do zbiornika z cieczą N₂.
      1. Odzyskać zamrożone organoidy kryptowe poprzez szybkie rozmrażanie w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Przemyć 500 μl kompletnej pożywki hodowlanej, odwirować przy 100 x g, 5 minut i ponownie zawiesić w galaretowatej mieszaninie białek i kulturze, jak opisano powyżej. Aby uzyskać lepszą regenerację, dodaj inhibitor ROCK (Y-27632) do pożywki zamrażającej.

2. Test metabolizmu organoidów w krypcie

1. Przygotowanie płytki 24-dołkowej:
   1. Izoluj i policz krypty zgodnie z protokołem (patrz sekcja 1.1 dla izolacji krypt i sekcja 1.2 dla przejścia krypty).
   2. Ponownie zawiesić krypty w galaretowatej mieszaninie białek (100-200 krypt na 20 μl).
   3. Zawiesina mieszaniny białek kryptowo-galaretowatych na 24-dołkowej płytce testowej (upewnić się, że na każdą próbkę przypada co najmniej trzy próbki) i pozostawić zawiesinę do zestalenia się w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO₂ ; następnie dodać 500 μl kompletnej pożywki hodowlanej.
   4. Hoduj krypty (jak opisano w sekcji 1.1) i obserwuj pod mikroskopem, aż krypty wyrosną na w pełni rozwinięte organoidy.
2. Test strumienia zewnątrzkomórkowego:
   1. Wkład hydratować przez noc w inkubatorze bez emisji_CO2 (0% CO_{2) w} temperaturze 37 °C.
   2. Usunąć pożywkę hodowlaną i dwukrotnie przemyć organoidy 500 μl DMEM (bez: glukozy, L-glutaminy, pirogronianu sodu i wodorowęglanu sodu oraz czerwieni fenolowej). Odczekaj 5 min.
   3. Dodaj 675 μl na pożywkę testową (DMEM z 2 mM L-glutaminą i 5 mM D-glukozą) do każdego dołka.
   4. Sprawdź mikroskopijną morfologię organoidów kryptowych, aby upewnić się, że organoidy i galaretowata mieszanina białek są nienaruszone po płukaniu. Inkubować przez 1 godzinę w inkubatorze bez emisji_CO2 w temperaturze 37 °C.
   5. Przygotować 10 μM związków do wstrzykiwań (oligomycyna, cyjanek karbonylu-p-trifluoro-metoksy-fenylo-hydrazon (FCCP), rotenon) w pożywce do oznaczania.
   6. Ustaw wkład, ładując kolejno 75 μl 10 μM związków do wstrzykiwań do portów wkładu: Port A - oligomycyna; Port B - FCCP; i Port C - rotenon (końcowe stężenia podczas testu wyniosą 1 μM).
   7. Inkubować wkład 30 min – 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze bez emisji_CO2
   .
   8. Jednocześnie włącz XF Analyzer i utwórz szablon protokołu testu.
   9. Umieść kasetę i płytkę narzędziową w analizatorze XF Analyzer i uruchom "kalibrację" wkładu.
   10. Sprawdź organoidy krypt pod mikroskopem, aby upewnić się, że są przyłączone do galaretowatej mieszaniny białek.
   11. Załaduj płytkę do hodowli komórek do instrumentu i uruchom protokół testu.

Wyniki

Organoidy krypt zostały utworzone z 8-miesięcznych myszy C57BL/6 karmionych oczyszczoną dietą dla gryzoni American Institute of Nutrition 76A (AIN76A). Jelitowe organoidy krypt mogą być hodowane w kulturze przez dłuższy czas z pojedynczej krypty (Rysunek 1A, pojedyncza czerwona strzałka). Organoidy wykształcają struktury przypominające krypty w 18-20 dniu hodowli (Rysunek 1B, czerwone strzałki). Krypty były pasażowane co 3 tygodnie, a organoidy skutecznie odzyskiwano po każdym pasażu.

Dyskusja

Przetestowaliśmy wskaźnik zużycia tlenu (OCR) i wskaźnik zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) krypt wyizolowanych od 8-miesięcznych myszy i wyhodowanych do organoidów ex vivo. Po zmierzeniu szybkości podstawowej, metabolizm krypty oceniano poprzez dodawanie kolejno oligomycyny, cyjanku karbonylu-p-trifluorometoksyfenylohydrazonu (FCCP) i rotenonu.

Podstawowy OCR i podstawowy ECAR rejestrowano od 0 do 29 min (ryc. 2A i 2B). W 29^minucie oli...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
BD Matrigel Matryca membrany podstawnej, GFR, bez czerwieni fenolu, bez LDEV	BD Biosciences	356231
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami), bez magnezu, bez wapnia, pH 7,2	Life Technologies	20012-027
Zaawansowany DMEM/F-12 (1x)	Life Technologies	12634-028
Dulbecco′ s Zmodyfikowany Orzeł i liczba pierwsza; s Podłoże bez glukozy, L-glutaminy, czerwieni fenolowej, pirogronianu sodu i wodorowęglanu sodu	Sigma-Aldrich	D5030
Sól sodowa czerwieni fenolowej	Sigma-Aldrich	P4758	Stężenie końcowe 15 mg/l w DMEM (D5030) - step 2.2.2
Antybiotyk-Antybiotyk-Antybiotyk, 100x, 100 ml	Life Technologies	15240-062	Stężenie końcowe 1x lub 2x
Penicylina-Streptomycyna, płyn	Life Technologies	15140-122	Stężenie końcowe 1x
Gibco® GlutaMAX&handel; suplement	Life Technologies	35050061	Stężenie końcowe 1x
Gibco® HEPES (Kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N-2-etanosulfonowy), 1 M	Life Technologies	15630-080	Stężenie końcowe 10 mM
N-acetylo-L-cysteina, 25 g	Sigma-Aldrich	A9165-25G	Stężenie końcowe 1 mM
100x suplement N-2, płyn	Invitrogen	17502-048	Stężenie końcowe 1x
50x B-27® suplement minus Witamina A, płyn	Invitrogen	12587-010	Stężenie końcowe 1x
Rekombinowana mysia R-Spondyna 1, CF, 50 μ g	R& D Systems	3474-RS-050	Stężenie końcowe 500 ng/ml
Rekombinowany mysi EGF, 100 μ g	Peprotech	315-09	Stężenie końcowe 50 ng/ml
Rekombinowany mysi Noggin, 20 μ g	Peprotech	250-38	Stężenie końcowe 100 ng/ml
Gibco® L-glutamina, 200 mM	Life Technologies	25030-081	Stężenie końcowe 2 mM
Gibco® glukoza w proszku	Life Technologies	15023-021	Stężenie końcowe 5
mM Ambion® 0,5 M EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy), pH 8,0	Life Technologies	AM9260G	Stężenie końcowe 3 mM dla krok 1.1.5; 2 mM dla krok 1.1.8
[nagłówek]
DTT (ditiotreitol), 1M	Life Technologies	P2325	Stężenie końcowe 3 mM
Albumina z surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich	A2058	0,1% w PBS
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Life Technologies	16000-044	1% w PBS
Recovery™ Zamrażanie kultur komórkowych Technologie średniego	życia	12648-010
Inhibitor ROCK (Y-27632)	Sigma-Aldrich	Y0503	Stężenie końcowe 10 μ M
Oligomycyna	Sigma-Aldrich	O4876	Stężenie końcowe 1 μ M
Cyjanek karbonylu-p-trifluoro-metoksy-fenylo-hydrazon (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920	Stężenie końcowe 1 μ M
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	Stężenie końcowe 1 μ M
Wodorotlenek sodu	Sigma-Aldrich	221465	Stężenie końcowe 0,1 N w PBS
XF24 Zewnątrzkomórkowy analizator strumienia (analizator XF)	Seahorse Bioscience