Organoidy kryptowe jelita cienkiego hodowane ex vivo dostarczają system hodowli tkankowej, który podsumowuje wzrost krypt zależny od komórek macierzystych i ich niszy. Opracowaliśmy metodę oznaczania profilu metabolicznego w czasie rzeczywistym w pierwotnych organoidach krypt myszy. Odkryliśmy, że organoidy zachowują właściwości fizjologiczne określone przez ich źródło.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Analiza profilu metabolicznego w czasie rzeczywistym w hodowlach organoidów ex vivo w krypcie jelitowej myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Błona śluzowa jelita cienkiego wykazuje powtarzalną architekturę zorganizowaną w dwie podstawowe struktury: kosmki, wystające do światła jelita i składające się z dojrzałych enterocytów, komórek kubkowych i komórek enteroendokrynnych; oraz krypt, rezydujących bliżej błony podśluzowej i mięśniowej, zawierających dorosłe komórki macierzyste i progenitorowe oraz dojrzałe komórki Panetha, a także komórki zrębu i odporności mikrośrodowiska krypty. Do ostatnich kilku lat badania in vitro jelita cienkiego ograniczały się do linii komórkowych pochodzących z łagodnych lub złośliwych nowotworów i nie reprezentowały fizjologii prawidłowego nabłonka jelitowego i wpływu mikrośrodowiska, w którym się znajdują. Tutaj demonstrujemy metodę zaadaptowaną z Sato et al. (2009) do hodowli pierwotnych organoidów krypty jelit myszy pochodzących od myszy C57BL / 6. Ponadto przedstawiono wykorzystanie kultur organoidów kryptowych do oznaczania profilu metabolicznego krypty w czasie rzeczywistym poprzez pomiar podstawowego zużycia tlenu, szybkości glikolitycznej, produkcji ATP i wydolności oddechowej. Organoidy zachowują właściwości określone przez ich źródło i zachowują aspekty swojej adaptacji metabolicznej odzwierciedlone w zużyciu tlenu i tempie zakwaszenia zewnątrzkomórkowego. Badania metaboliczne w czasie rzeczywistym w tym systemie hodowli organoidów kryptowych są potężnym narzędziem do badania metabolizmu energetycznego organoidów kryptowych oraz tego, jak można go modulować za pomocą czynników odżywczych i farmakologicznych.
Wprowadzenie
Rak jelita grubego (CRC) jest trzecią najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem w Stanach Zjednoczonych. Sporadyczny rak jelita grubego – tj. pojawiający się w późniejszym okresie życia (>50 roku życia) i bez wyraźnych predysponujących czynników genetycznych – stanowi ~80% wszystkich przypadków, przy czym częstość występowania jest silnie uzależniona od długoterminowych wzorców żywieniowych1,2. Guzy te wykazują przesunięcie metaboliczne w kierunku zależności od oksydacyjnej glikolizy, znanej jako efekt Warburga, który może częściowo powodować wyższe stężenia komórkowych elementów budulcowych i energii (poprzez glutaminolizę), aby umożliwić i....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych National Institutes of Health. Protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Etyki Eksperymentów na Zwierzętach Albert Einstein College of Medicine.
1. Izolacja i kultura krypty
- Izolacja krypt z jelita cienkiego:
- Odizoluj krypty jelitowe od dowolnego modelu myszy, który Cię interesuje. Poddaj myszy eutanazji za pomocą CO2 , a następnie zwichnięciu szyjki macicy.
- Otwórz brzuch wzdłużnie i napełnij jelito cienkie (SI) lodowatym roztworem soli fizjologicznej bufo....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Organoidy krypt zostały utworzone z 8-miesięcznych myszy C57BL/6 karmionych oczyszczoną dietą dla gryzoni American Institute of Nutrition 76A (AIN76A). Jelitowe organoidy krypt mogą być hodowane w kulturze przez dłuższy czas z pojedynczej krypty (Rysunek 1A, pojedyncza czerwona strzałka). Organoidy wykształcają struktury przypominające krypty w 18-20 dniu hodowli (Rysunek 1B, czerwone strzałki). Krypty były pasażowane co 3 tygodnie, a organoidy skutecznie odzyskiwano po każdym pasażu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przetestowaliśmy wskaźnik zużycia tlenu (OCR) i wskaźnik zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) krypt wyizolowanych od 8-miesięcznych myszy i wyhodowanych do organoidów ex vivo. Po zmierzeniu szybkości podstawowej, metabolizm krypty oceniano poprzez dodawanie kolejno oligomycyny, cyjanku karbonylu-p-trifluorometoksyfenylohydrazonu (FCCP) i rotenonu.
Podstawowy OCR i podstawowy ECAR rejestrowano od 0 do 29 min (ryc. 2A i 2B). W 29minucie oli.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie ma żadnych ujawnień.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez granty RO1 CA 135561, R01 CA151494, R01 CA174432 oraz P3013330 z National Institutes of Health.
Chcielibyśmy podziękować Michele Houston, Elenie Dhimie i dr Annie Velcich za ich cenne uwagi dotyczące opracowania protokołu izolacji krypty.
Dziękujemy również Centrum Szkolenia i Badań nad Cukrzycą Albert Einstein College of Medicine, wspieranemu przez NIH P60DK20541, oraz Dr. Michaelowi Brownlee i Dr. Xue-Liang Du, którzy odpowiednio kierują i prowadzą placówkę Seahorse.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| BD Matrigel Matryca membrany podstawnej, GFR, bez czerwieni fenolu, bez LDEV | BD Biosciences | 356231 | |
| PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami), bez magnezu, bez wapnia, pH 7,2 | Life Technologies | 20012-027 | |
| Zaawansowany DMEM/F-12 (1x) | Life Technologies | 12634-028 | |
| Dulbecco′ s Zmodyfikowany Orzeł i liczba pierwsza; s Podłoże bez glukozy, L-glutaminy, czerwieni fenolowej, pirogronianu sodu i wodorowęglanu sodu | Sigma-Aldrich | D5030 | |
| Sól sodowa czerwieni fenolowej | Sigma-Aldrich | P4758 | Stężenie końcowe 15 mg/l w DMEM (D5030) - step 2.2.2 |
| Antybiotyk-Antybiotyk-Antybiotyk, 100x, 100 ml | Life Technologies | 15240-062 | Stężenie końcowe 1x lub 2x |
| Penicylina-Streptomycyna, płyn | Life Technologies | 15140-122 | Stężenie końcowe 1x |
| Gibco® GlutaMAX&handel; suplement | Life Technologies | 35050061 | Stężenie końcowe 1x |
| Gibco® HEPES (Kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N-2-etanosulfonowy), 1 M | Life Technologies | 15630-080 | Stężenie końcowe 10 mM |
| N-acetylo-L-cysteina, 25 g | Sigma-Aldrich | A9165-25G | Stężenie końcowe 1 mM |
| 100x suplement N-2, płyn | Invitrogen | 17502-048 | Stężenie końcowe 1x |
| 50x B-27® suplement minus Witamina A, płyn | Invitrogen | 12587-010 | Stężenie końcowe 1x |
| Rekombinowana mysia R-Spondyna 1, CF, 50 μ g | R& D Systems | 3474-RS-050 | Stężenie końcowe 500 ng/ml |
| Rekombinowany mysi EGF, 100 μ g | Peprotech | 315-09 | Stężenie końcowe 50 ng/ml |
| Rekombinowany mysi Noggin, 20 μ g | Peprotech | 250-38 | Stężenie końcowe 100 ng/ml |
| Gibco® L-glutamina, 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | Stężenie końcowe 2 mM |
| Gibco® glukoza w proszku | Life Technologies | 15023-021 | Stężenie końcowe 5 |
| mM Ambion® 0,5 M EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy), pH 8,0 | Life Technologies | AM9260G | Stężenie końcowe 3 mM dla krok 1.1.5; 2 mM dla krok 1.1.8 |
| [nagłówek] | |||
| DTT (ditiotreitol), 1M | Life Technologies | P2325 | Stężenie końcowe 3 mM |
| Albumina z surowicy bydlęcej (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | 0,1% w PBS |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | 1% w PBS |
| Recovery™ Zamrażanie kultur komórkowych Technologie średniego | życia | 12648-010 | |
| Inhibitor ROCK (Y-27632) | Sigma-Aldrich | Y0503 | Stężenie końcowe 10 μ M |
| Oligomycyna | Sigma-Aldrich | O4876 | Stężenie końcowe 1 μ M |
| Cyjanek karbonylu-p-trifluoro-metoksy-fenylo-hydrazon (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | Stężenie końcowe 1 μ M |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Stężenie końcowe 1 μ M |
| Wodorotlenek sodu | Sigma-Aldrich | 221465 | Stężenie końcowe 0,1 N w PBS |
| XF24 Zewnątrzkomórkowy analizator strumienia (analizator XF) | Seahorse Bioscience |
Bibliografia
- Jemal, A., et al. CA Cancer J Clin. 58, 71-96 (2008).
- Slattery, M. L., Boucher, K. M., Caan, B. J., Potter, J. D., Ma, K. N. Eating patterns and risk of colon cancer. Am J Epidemiol. 148, 4-16 (1998).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
