Artykuł metodologiczny

Charakterystyka składu silników molekularnych na ruchomym ładunku aksonalnym za pomocą analizy "mapowania ładunku"

DOI:

10.3791/52029

⸱

30 października 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Experimental Medicine, Dorris Neuroscience Center, The Scripps Research Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California San Diego, 3Department of Bioengineering, University of California San Diego, 4Department of Neurosciences, University of California San Diego School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wewnątrzkomórkowy transport ładunków, takich jak pęcherzyki czy organelle, odbywa się za pomocą molekularnych białek motorycznych, które śledzą na spolaryzowanych mikrotubulach. Protokół ten opisuje korelację kierunkowości transportu pojedynczych cząstek ładunku poruszających się wewnątrz neuronów, do względnej ilości i rodzaju związanych z nimi białek motorycznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie mechanizmów, za pomocą których silniki molekularne koordynują swoje działania w celu transportu pęcherzykowych ładunków wewnątrz neuronów, wymaga ilościowej analizy powiązań motoryka/ładunek na poziomie pojedynczego pęcherzyka. Celem tego protokołu jest wykorzystanie ilościowej mikroskopii fluorescencyjnej do skorelowania ("zmapowania") położenia i kierunkowości ruchu żywego ładunku ze składem i względną ilością silników związanych z tym samym ładunkiem. "Mapowanie ładunku" polega na obrazowaniu w czasie rzeczywistym znakowanych fluorescencyjnie ładunków poruszających się w aksonach hodowanych na urządzeniach mikroprzepływowych, a następnie na utrwalaniu chemicznym podczas rejestrowania ruchu w czasie rzeczywistym, a następnie na barwieniu immunofluorescencyjnym (IF) dokładnie tych samych obszarów aksonów przeciwciałami przeciwko silnikom. Kolokalizacja między ładunkami i powiązanymi z nimi silnikami jest oceniana poprzez przypisanie współrzędnych położenia subpikseli do kanałów motorycznych i ładunkowych, poprzez dopasowanie funkcji Gaussa do ograniczonych dyfrakcją funkcji rozrzutu punktów reprezentujących poszczególne fluorescencyjne źródła punktowe. Stałe obrazy ładunku i silnika są następnie nakładane na wykresy ruchu ładunków, aby "odwzorować" je na ich śledzone trajektorie. Mocną stroną tego protokołu jest połączenie danych na żywo i danych IF w celu zarejestrowania zarówno transportu ładunków pęcherzykowych w żywych komórkach, jak i określenia silników związanych z tymi samymi pęcherzykami. Technika ta pozwala przezwyciężyć wcześniejsze wyzwania, które polegały na wykorzystaniu metod biochemicznych do określenia średniego składu motorycznego oczyszczonych heterogenicznych populacji pęcherzyków masowych, ponieważ metody te nie ujawniają składu na pojedynczych ruchomych ładunkach. Ponadto protokół ten można dostosować do analizy innych szlaków transportu i/lub transportu w innych typach komórek w celu skorelowania ruchu poszczególnych struktur wewnątrzkomórkowych z ich składem białkowym. Ograniczeniami tego protokołu są stosunkowo niska przepustowość spowodowana niską wydajnością transfekcji hodowanych neuronów pierwotnych oraz ograniczone pole widzenia dostępne dla obrazowania w wysokiej rozdzielczości. Przyszłe zastosowania mogą obejmować metody zwiększania liczby neuronów wyrażających fluorescencyjnie znakowane ładunki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transport wewnątrzkomórkowy jest krytyczny we wszystkich typach komórek dla dostarczania białek, błon, organelli i cząsteczek sygnałowych do różnych domen komórkowych1. Neurony to wysoce wyspecjalizowane komórki z długimi, spolaryzowanymi projekcjami, które krytycznie zależą od wewnątrzkomórkowego transportu niezbędnych ładunków do ich dostarczania na duże odległości do różnych mikrodomen aksonalnych. W transporcie tym pośredniczą kinezyny i dyneiny – dwie duże rodziny molekularnych białek motorycznych – które wiążą się z ładunkami i podążają wzdłuż spolaryzowanych mikrotubul odpowiednio w kierunku następczym i wstecznym. Podczas gdy ruch wsteczny jest głównie zapośredniczony przez dyneinę, ruch w kierunku następczym jest ułatwiony przez dużą, funkcjonalnie zróżnicowaną rodzinę silników kinezynowych. W związku z tym w następczym transporcie ładunków aksonalnych mogą pośredniczyć różni członkowie rodziny nadrodziny kinezyn1-5. Chociaż niektóre ładunki poruszają się stale w obu kierunkach, większość ładunków porusza się dwukierunkowo i często cofa się w drodze do miejsc docelowych1,5-13. Ponadto wykazano, że silniki o przeciwnej kierunkowości kojarzą się jednocześnie z ładunkami, co rodzi pytanie, w jaki sposób regulowany ruch ładunków jest koordynowany przez silniki o przeciwnej polaryzacji5-7. Łącznie transport ładunków aksonalnych jest skoordynowanym procesem, który jest regulowany przez skład silników i ich specyficzne działania biochemiczne, które z kolei są zależne od różnych adapterów i regulacyjnych partnerów wiążących14.

Aby wiernie opisać mechanizm transportu aksonalnego dla konkretnego ładunku i odkryć podstawową regulację tego transportu, najważniejsze jest określenie składu białek motorycznych i ich regulatorowych partnerów wiążących związanych z poszczególnymi ładunkami podczas ich transportu na żywo. Inne metody, na przykład podejścia biochemiczne, dostarczają szacunków średniego składu motorycznego w oczyszczonych heterogenicznych populacjach pęcherzyków, ale szacunki te nie ujawniają rodzaju ani ilości silników związanych z pojedynczymi poruszającymi się pęcherzykami. Ponadto odtworzenie transportu pęcherzyków wzdłuż wstępnie zmontowanych mikrotubul in vitro umożliwiło zmierzenie ilości jednego typu silnika na poziomie pojedynczego pęcherzyka15. Jednak eksperymenty te nie korelowały bezpośrednio liczby silników z charakterystyką transportową tych pęcherzyków i mierzyły transport przy braku komórkowych czynników regulacyjnych.

A przedstawiono tutaj protokół, który określa skład motoryczny (typ i względną ilość silników) poszczególnych poruszających się pęcherzyków na podstawie danych immunofluorescencyjnych (IF) mierzących endogennie wyrażane białka motoryczne i koreluje te parametry z żywym transportem dokładnie tych samych pęcherzyków w neuronach16. Metoda ta polega na precyzyjnym mapowaniu danych o ruchu ładunku IF-to-live. Osiąga się to poprzez hodowlę neuronów myszy hipokampa w urządzeniach mikroprzepływowych zgodnie z ustalonymi protokołami17-19. Urządzenia te pozwalają na identyfikację i korelację ("mapowanie") aksonów i pojedynczych ruchomych ładunków w mikroskopii w świetle stałym i na żywo (ryc. 1). Hodowane neurony są transfekowane fluorescencyjnie znakowanymi białkami ładunkowymi, których transport jest obrazowany w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej w celu uzyskania szczegółowych informacji o ruchu, które są wykreślane na kimografach. W trakcie obrazowania neurony są utrwalane paraformaldehydem, a następnie barwione przeciwciałami przeciwko endogennym białkom ruchowym. Stałe obrazy ładunku i silnika są nakładane na kimografy ruchu na żywo w celu "zmapowania" (kolokalizacji) ich do trajektorii ruchu ładunku na żywo16. Aby skorelować żywy ruch ładunków z asocjacją białek motorycznych, kolokalizacja jest analizowana za pomocą specjalnie przygotowanego pakietu oprogramowania MATLAB o nazwie "Kolokalizacja motoryczna"16,20. Fluorescencyjnie znakowane ładunki i silniki generują punktowe cechy ograniczone dyfrakcją, które mogą częściowo się na siebie nakładać. Aby określić położenie nakładających się punktów punktowych, oprogramowanie najpierw automatycznie dopasowuje funkcje Gaussa do każdej funkcji rozproszenia punktów, reprezentujących poszczególne punkty fluorescencyjne, w celu określenia ich dokładnych współrzędnych położenia subpikseli X-Y i amplitudintensywności 21-23. Pozycje silników i ładunków są następnie porównywane ze sobą w celu określenia kolokalizacji16,20. W związku z tym metoda ta dokładniej przypisuje kolokalizację między punktami fluorescencyjnymi w porównaniu z innymi metodami24.

Mocną stroną tej metody jest możliwość oceny kolokalizacji silników z pojedynczym ładunkiem w stałych komórkach, dla których zarejestrowano trajektorie ruchu na żywo (np. kierunek, w którym poruszały się w momencie fiksacji). Dzięki tej metodzie stwierdzono, że kinezyny i dyneiny łączą się jednocześnie z pęcherzykami, które przenoszą normalne białko prionowe (PrPC-komórkowe), neuronalnie wzbogacony ładunek, który porusza się dwukierunkowo lub pozostaje nieruchomy w aksonach16. Analiza ta pozwoliła na sformułowanie roboczego modelu regulacji ruchu pęcherzyków PrPC, w którym silniki następcze (kinezyna) i wsteczne (dyneina) koordynują swoje działania w celu poruszania pęcherzykami w dowolnym kierunku lub pozostawania nieruchomymi podczas łączenia z ładunkiem. Kolejną mocną stroną tej metody jest jej potencjalne szerokie zastosowanie do charakteryzowania kolokalizacji/asocjacji wielu fluorescencyjnie znakowanych ładunków, które przemieszczają się w praktycznie każdym typie komórki, z dowolnymi innymi białkami będącymi przedmiotem zainteresowania. W związku z tym korelacja między żywym a stałym ładunkiem może potencjalnie pozwolić na wykrycie przejściowych interakcji białko-ładunek, ponieważ wiele pojedynczych, znakowanych fluorescencyjnie poruszających się cząstek może być analizowanych w pożądanym okresie czasu. Biorąc pod uwagę szerokie zastosowanie i rodzaj pytań, na które może odpowiedzieć ta metoda, protokół ten będzie interesujący dla szerokiego grona biologów komórkowych, w tym osób badających transport i transport w neuronach lub w innych typach komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi protokołami i zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi humanitarnej opieki nad zwierzętami badawczymi. Nowonarodzone myszy zostały poddane eutanazji przez dekapitację.

1. Przygotowanie urządzeń mikroprzepływowych do hodowli komórkowej

  1. Przygotuj urządzenia mikroprzepływowe z polidimetylosiloksanu (PDMS) do wzrostu neuronów hipokampa, jak opisano przez Harrisa i współpracowników17-19. Poniżej znajduje się kilka modyfikacji, które zostały dostosowane do protokołu mapowania ładunków.
    UWAGA: Urządzenia mikroprzepływowe są również dostępne na rynku (Lista materiałów), dlatego dostęp do zakładu produkcyjnego nie jest konieczny.
  2. Przygotować okulary nakrywkowe nr 11/2 (24 x 40 mm), myjąc je trzykrotnie acetonem, a następnie trzykrotnie myjąc 100% etanolem i trzykrotnie przemywając wodą. Szkiełka nakrywkowe przechowywać w wodzie o temperaturze 4 °C do czasu użycia. Zabiegi te pomagają zapewnić, że szkiełka nakrywkowe są oczyszczone z zanieczyszczeń, które mogłyby zakłócać powlekanie komórek, zanieczyszczenie i przetrwanie.
    UWAGA: Aceton i etanol są łatwopalne i niebezpieczne w przypadku kontaktu ze skórą (działanie drażniące), kontaktu z oczami (działanie drażniące), spożycia, wdychania. Utylizować zgodnie z oficjalnymi przepisami.
  3. Gdy produkt jest gotowy do użycia, umieść jedną szklankę nakrywkową w naczyniu do hodowli komórkowych o średnicy 60 mm na urządzenie mikroprzepływowe i pozostaw do wyschnięcia bez przykrycia przez 45 minut w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby uniknąć zanieczyszczenia.
  4. Po wycięciu urządzeń z wzorców i przecięciu stempli w celu utworzenia zbiorników (Rysunek 1A, B), umieść je kanałami mikroprzepływowymi stroną do góry w komorze bezpieczeństwa biologicznego wyposażonej w lampę UV na 45 minut w celu sterylizacji.
    UWAGA: Pozostawienie urządzeń poddanych działaniu promieniowania UV na dłużej niż 2 godziny może wpłynąć na integralność PDMS.
  5. Zmontuj urządzenia, umieszczając po jednym urządzeniu na każdym szkle nakrywkowym wewnątrz plastikowej naczynia do hodowli komórek o średnicy 60 mm, tak aby kanały mikroprzepływowe były skierowane w dół. Delikatnie dociśnij górną część urządzenia (unikaj dotykania mikrokanałów), aby zapewnić nietrwałe uszczelnienie urządzenia do szkła nakrywkowego. Przykryj każde naczynie do hodowli komórkowych o średnicy 60 mm pokrywką.
  6. Za pomocą mikropipety nawodnić urządzenia, dodając wodę klasy do hodowli komórkowych do dwóch górnych zbiorników mikroprzepływowych (1 i 2 na rysunku 1A), umożliwiając przepływ wody. Usunąć wodę za pomocą mikropipety i dodać 1 mg/ml poli-L-lizyny do zbiornika mikroprzepływowego 1 (200 μl) i 2 (100 μl). Różnica objętości pozwoli poli-L-lizynie przepływać przez mikrokanały (ryc. 1A, B).
  7. W celu zapewnienia, że urządzenia znajdujące się wewnątrz naczyń do hodowli komórkowych o średnicy 60 mm nie przewrócą się w inkubatorze o temperaturze 37 °C, należy umieścić trzy szalki do hodowli komórkowych o średnicy 60 mm zawierające urządzenia w plastikowym naczyniu do hodowli komórkowych o średnicy 150 mm i przykryć naczynie pokrywką. Inkubować O/N w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Zazwyczaj ponad 90% kanałów nadaje się do użytku na urządzenie i nie zawiera żadnych pęcherzyków powietrza ani fizycznej blokady.
  8. Następnego dnia zastąp poli-L-lizynę wodą i pozostaw urządzenie w inkubatorze na co najmniej 1 godzinę. Powtórz to mycie trzy razy. Usuń wodę i dodaj pożywkę wzrostową Neurobasal-A (zawierającą 2% suplementu B-27 i 500 μM GlutaMAX) do każdego urządzenia. Pozostawić O/N w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  9. Następnego dnia ułóż płytki na komórkach hipokampa, jak opisano poniżej.

2. Posiewanie pierwotnych neuronów hipokampa myszy w urządzeniach mikroprzepływowych

UWAGA: Przygotowanie hodowanych neuronów hipokampa od nowonarodzonych szczurów zostało wcześniej opublikowane w JoVE25. Poniżej znajduje się kilka modyfikacji, które zostały zaadaptowane do płytki neuronów hipokampa myszy w urządzeniach mikroprzepływowych i które były optymalne dla transfekcji.

  1. Przed sekcją mózgu myszy należy wstępnie ogrzać zmodyfikowaną pożywkę Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS; bez antybiotyków), mieszaninę A (125 mg DL-cysteiny, 125 mg albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 3,125 g D-glukozy w 500 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS); przefiltrować wysterylizować przez filtr 0,22 μm) i roztwór dezoksyrybonukleazy I (DNaza I: 50 mg DNazy I i 0,5 ml roztworu 1,2 MMgSO4 w 100 ml filtra Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) sterylizować przez filtr 0,22 μm) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    1. Wstępnie ogrzej pożywkę wzrostową Neurobasal-A w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 w celu zrównoważenia pH.
  2. Wypreparuj hipokampy od 1-3 dniowych nowonarodzonych myszy zgodnie z ustalonymi protokołami26. Hipokampy należy przechowywać w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml buforu do rozwarstwiania (HBSS zawierającej 10 mM HEPES pH 7,4, 50 mM glukozy, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny) na lodzie. Umieść do 4 hipokampów w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
  3. Wykonaj pozostały protokół w sterylnych warunkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  4. Rozcieńczyć 45 jednostek papainy w 5 ml mieszaniny A, odwirować i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C, aż do rozpuszczenia proszku papainy. Dodać 1 ml roztworu DNazy I. Przefiltrować mieszaninę przez strzykawkowy filtr strzykawkowy 0,22 μm.
  5. Ostrożnie odessać HBSS z 15 ml stożkowej probówki zawierającej hipokampy. Dodać 10 ml zimnego (4 °C) HBSS do hipokampów i pozostawić im na dnie probówki. Ostrożnie odessać HBSS z 15 ml stożkowej probówki.
  6. Dodać 1 ml papainy/DNazy I wymieszać do 4 hipokampów i inkubować przez 20-30 minut w temperaturze 37 °C. Przechylać stożkową rurkę co 5 minut, aby kąpać hipokampy z mieszanką. Alternatywnie umieść hipokampy w shakerze do kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C z delikatnym potrząsaniem (~100 obr./min).
  7. Odessaj papainę/DNazę I i dwukrotnie umyj hipokampy wstępnie podgrzanym DMEM (37 °C) zawierającym 10% FBS.
  8. Po drugim myciu dodaj 2 ml wstępnie podgrzanego DMEM zawierającego 10% FBS do hipokampów i ręcznie rozcieraj hipokampy, pipetując w górę iw dół ~10-12 razy za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml w celu dysocjacji neuronów.
  9. Pozwól triturate osiąść na ~ 1 minutę, ponieważ pozwoli to niezdysocjowanym neuronom osiąść na dnie stożkowej rurki. Przenieść supernatant zawierający zdysocjowane neurony do nowej stożkowej rurki o pojemności 15 ml, unikając przenoszenia większej tkanki, która osiadła na dnie probówki.
  10. Wiruj komórki w temperaturze 1 000 x g przez 2 minuty i ostrożnie usuń supernatant, nie naruszając osadu komórkowego. Zawiesić komórki w pożywce wzrostowej Neurobasal-A o objętości 80 μl, delikatnie pipetując.
  11. Usunąć pożywkę ze zbiornika mikroprzepływowego 1 i 1'. Nałóż 20 μl komórek (~275 000) do zbiornika mikroprzepływowego 1 i pozwól im przepłynąć. Umieścić urządzenie w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 na 20 minut.
  12. Spójrz pod mikroskop, aby upewnić się, że komórki przylegają do szkła nakrywkowego. Dodaj pożywkę wzrostową Neurobasal-A, aby uzupełnić wszystkie zbiorniki. Umieścić urządzenie z komórkami w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  13. Sprawdzaj urządzenia co ~2-3 dni i uzupełniaj zbiorniki Neurobasal-A zawierającym 2% suplementu B-27 (bez GlutaMAX), aby uniknąć parowania. Neurony zaczynają rozszerzać swoje aksony przez kanały mikroprzepływowe ~2-3 dni po posiewaniu. Poddaj neurony transfekcji zwykle 7-10 dni po posiewie.

3. Transfekcja neuronów hipokampa wyhodowanych w urządzeniu mikroprzepływowym

  1. Na każde urządzenie przygotuj mieszaninę 1,2 μl Lipofectamine 2000 w 30 μl Neurobasal-A i mieszaniny 0,5 μg fluorescencyjnego plazmidu fuzyjnego ładunku w 30 μl Neurobasel-A i inkubuj 5 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj mieszaninę lipofektaminy do mieszanki DNA i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj 60 μl Neurobasal-A zawierającego 4% suplementu B-27 do mieszanki DNA/Lipofectaminy i wymieszaj, przesuwając probówkę.
  2. Usuń wszystkie podłoża ze zbiornika mikroprzepływowego 2 i 2' i ostrożnie napełnij studzienki Neurobaseal-A zawierającym 2% suplementu B-27 bez rozlewania pożywki do innych komór.
  3. Usuń media ze zbiornika mikroprzepływowego 1 i 1'. Dodać 120 μl mieszaniny DNA/lipofektaminy do zbiornika mikroprzepływowego 1 i pozwolić mu płynąć. Umieścić urządzenie z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 na 3-4 godziny.
  4. Usuń wszystkie pożywki ze zbiornika mikroprzepływowego 1 i 1' i zastąp Neurobaseal-A zawierającym 2% suplementu B-27 na 24 godziny (lub do momentu, gdy będzie gotowy do obrazowania). Zazwyczaj 5-7 aksonów, które rosną przez mikrokanały, jest transfekowanych w tych warunkach, co stanowi około 1-3% skuteczności transfekcji zgodnej z wydajnością opublikowaną dla komórek hodowanych w hipokampie 26.

4. Analizy "Mapowanie ładunków"

  1. Obrazowanie ruchu ładunku na żywo
    1. Obrazowanie należy wykonać na mikroskopie świetlnym z odwróconą epifluorescencją wyposażonym w inkubator o temperaturze 37 °C i komorę kontrolnąCO2
      2. .
    2. Zamontuj szkiełko nakrywkowe z neuronami hipokampa wyhodowanymi w urządzeniu mikroprzepływowym na stoliku mikroskopu. Aby uniknąć śmierci neuronów, należy szybko utrzymywać próbki pod mikroskopem nie dłużej niż 1 godzinę.
    3. Korzystając z obiektywu o wysokiej rozdzielczości (100X), znajdź aksony transfekowanych komórek, które rozciągają się przez kanały komór mikroprzepływowych i zapisz liczbę kanałów, w których znaleziono transfekowany akson. Policz liczbę kanałów za pomocą ręcznego licznika zliczeń.
      1. Aby uzyskać optymalne rejestrowanie ruchu na żywo i późniejszą analizę kolokalizacji, wybierz aksony, które rosną stosunkowo płasko przez kanały, tak aby obrazowanie większości pęcherzyków mogło być wykonane w ostrości.
    4. Usuń większość pożywki ze zbiorników 2 i 2' za pomocą plastikowej pipety transferowej o pojemności 1 ml. Aby ułatwić późniejsze wyrównanie nieruchomych obrazów z trajektoriami ruchu na kinografach, należy wyrównać prawą krawędź mikrokanałów z polem widzenia podczas obrazowania (ryc. 1B, C).
    5. Aby ułatwić utrwalanie próbek podczas obrazowania, należy wykonać obrazowanie na żywo w dwóch osobach. Alternatywnie, jeśli obrazowanie na żywo jest wykonywane przez jedną osobę, należy użyć systemu mikroskopowego wyposażonego w korekcję dryftu.
    6. Rozpocznij obrazowanie ruchu ładunku na żywo od specyfikacji poklatkowych specyficznych dla dynamiki transportu analizowanego ładunku (specyfikacje mikroskopu i ustawienia obrazowania YFP-PrPC są określone w legendzie na rysunku 2 i liście materiałów).
    7. Po zebraniu wystarczających danych o ruchu na żywo, poproś jedną osobę, aby napełniła zbiorniki 2 i 2' wstępnie podgrzanym 4% paraformaldehydem w PBS zawierającym 0,04 g / ml sacharozy w celu utrwalenia komórek. Unikaj dotykania urządzenia mikroprzepływowego, ponieważ zakłóci to ostrość obrazowania na żywo. Poproś drugą osobę, aby dostosowała ostrość podczas dodawania utrwalacza. Fiksacja jest skuteczna, gdy obserwuje się natychmiastowe zatrzymanie ruchu. Następnie dodać utrwalacz do zbiornika 1 i 1'.
      UWAGA: Można również zaobserwować tymczasowe fotowybielanie fluorescencji ładunku, ale fluorescencja utrzymuje się po zakończeniu barwienia IF białek motorycznych (następny krok).
      UWAGA: Paraformaldehyd jest szkodliwy przez drogi oddechowe, w kontakcie ze skórą i po połknięciu. Działa drażniąco na oczy, drogi oddechowe i skórę. Utylizować zgodnie z oficjalnymi przepisami.
  2. Barwienie IF białek motorycznych do analizy kolokalizacji
    UWAGA: W celu ilościowego określenia względnych poziomów białek motorycznych (określonych przez barwienie przeciwciałami), związanych z poszczególnymi ruchomymi ładunkami, należy zwalidować i miareczkować przeciwciała, aby upewnić się, że wiązanie przeciwciało-antygen jest nasycone. Odbywa się to poprzez określenie swoistości przeciwciała za pomocą neuronów, w których interesujące białko zostało znokautowane lub powalone, oraz poprzez przeprowadzenie analizy IF przy rosnących stężeniach przeciwciał. W przypadku kontroli ujemnych neurony są barwione przeciwciałami drugorzędowymi przy braku przeciwciał pierwszorzędowych. Bardziej szczegółowy opis walidacji przeciwciał można znaleźć w Encalada i wsp.16 oraz Szpankowski i wsp.Lokal mieszkalny 20.
    1. Usuń szkiełko nakrywkowe z neuronami hipokampa wyhodowanymi w urządzeniu mikroprzepływowym ze sceny mikroskopu. Nie należy odłączać urządzenia mikroprzepływowego od szkiełka nakrywkowego, ponieważ mikrokanaliki muszą pozostać nienaruszone, aby można było nałożyć na siebie obrazy na żywo i nieruchome. Wykonaj następujące czynności w komorze wilgotnościowej.
    2. Aby zapewnić przepływ roztworów do mikrokanałów, należy utrzymywać różnicę objętości bufora między zbiornikami 1, 1' i 2, 2' wynoszącą co najmniej 30 μl we wszystkich kolejnych etapach. Na przykład dodaj 100 μl objętości pożywki do zbiornika mikroprzepływowego 2, 2' i objętość pożywki 70 μl do zbiornika mikroprzepływowego 1, 1'.
    3. Usunąć utrwalacz z komór urządzenia mikroprzepływowego i umyć komórki trzykrotnie PBS, odczekując 10 minut między płukaniami.
    4. Przepuszczalność komórek poprzez dodanie 0,1% Triton X-100 rozcieńczonego w PBS przez 5 minut do wszystkich zbiorników.
    5. Usunąć roztwór ze wszystkich zbiorników i przemyć PBS. Powtórz mycie trzy razy, odczekując 10 minut między praniami.
    6. Usunąć roztwór ze wszystkich zbiorników i zastosować bufor blokujący zawierający 10% normalnej surowicy osła i 3% BSA wolnego od proteazy i immunoglobuliny G (IgG) w PBS i inkubować przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej.
    7. Wirować roztwór podstawowy przeciwciała pierwszorzędowego o sile 20 000 x g przez 5 minut, aby usunąć osady. Rozcieńczyć przeciwciało do odpowiedniego stężenia w buforze blokującym. Zastąp bufor blokujący z urządzenia mikroprzepływowego roztworem przeciwciała. Próbki inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub O/N w temperaturze 4 °C.
    8. Usuń roztwór ze wszystkich zbiorników i przemyj trzykrotnie PBS, odczekując 10 minut między myciami.
    9. Wirować wtórny roztwór podstawowy przeciwciała przy 20 000 x g przez 5 minut, aby usunąć osady. Rozcieńczyć przeciwciało do odpowiedniego stężenia w buforze blokującym. Zastąp PBS wtórnym roztworem przeciwciała. Próbki należy inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    10. Usuń roztwór ze wszystkich zbiorników i przemyj trzykrotnie PBS, odczekując 10 minut między myciami.
    11. Zastąp PBS medium montażowym o pojemności ~10-20 μl, bezpośrednio pipetując pożywkę montażową do otworu kanałów łączących zbiorniki. Pozostaw nośniki montażowe do wyschnięcia na ~20 min – 1 godzinę w temperaturze RT.
    12. Przechowuj urządzenia w temperaturze 4 °C, chroniąc je przed światłem, aby uniknąć fotowybielania, a aksony obrazu w ciągu dwóch dni (maksymalnie jednego tygodnia) od barwienia.
    13. Po zakończeniu barwienia zamontuj szkiełko nakrywkowe z neuronami hipokampa wyhodowanymi w urządzeniu mikroprzepływowym na stoliku mikroskopu. Zlokalizuj obszar transfekowanego aksonu zobrazowany w kroku 4.1.1-4.1.7.
    14. Rejestruj obrazy stosu Z (co 300 nm) dla każdego z trzech kanałów: ładunek, silnik 1, silnik 2, używając obiektywu o wysokiej rozdzielczości (np. obiektywu olejowego lub wodnego o dużej aperturze numerycznej).
      UWAGA: Akwizycja stosów Z jest ważna, ponieważ aksony często nie rosną idealnie płasko w mikrokanałach, a zatem nie wszystkie fluorescencyjne punkty znajdują się w tej samej płaszczyźnie ogniskowej.
  3. Mapowanie ładunków
    1. Wygeneruj kimograf ruchu ładunku za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Wtyczka ImageJ opracowana przez Rietdorf and Seitz (EMBL) jest zalecana do generowania kymogramów (do pobrania patrz Lista materiałów).
      UWAGA: ImageJ to program do przetwarzania obrazów oparty na Javie należący do domeny publicznej, opracowany w National Institutes of Health27,28 (do pobrania patrz Lista materiałów).
    2. Nieruchome obrazy ładunku fluorescencyjnego (wygenerowane w kroku 4.2.14) należy wyrównać ręcznie, nakładając je na położenie trajektorii w kimografie w punkcie mocowania (rysunek 2A, B), za pomocą dostępnego w handlu programu do tworzenia wykresów (wykaz materiałów). Wyrównaj ręcznie, najpierw nakładając stały obraz ładunku na kimograf i ręcznie wybierając puncta ładunku, który odpowiada określonej trajektorii na kimografie. Aby uzyskać najlepsze wyniki wyrównania, należy użyć wycinka Z, który jest najlepiej ostry dla zmapowanego ładunku. Można użyć kilku plasterków Z.
    3. Dla każdego obrazu w stosie Z (ładunek, silnik 1 i silnik 2; wygenerowany w kroku 4.2.14) wyznacz współrzędne X-Y i amplitudy intensywności dla każdej punkcji fluorescencyjnej przy użyciu ustalonego algorytmu w celu dopasowania gaussianów 2D do funkcji rozpiętości punktów, która reprezentuje każde źródło punktowe w każdym z trzech kanałów16,20,21 (Rysunek 2D).
      UWAGA: Aby uzyskać współrzędne X-Y, opracowano niestandardowy pakiet oprogramowania MATLAB o nazwie "Kolokalizacja silnika"16,20, który zawiera algorytm dopasowania Gaussa opracowany przez Jaqamana, Danusera i współpracowników21-23. Pakiet oprogramowania i szczegółowe instrukcje jego użytkowania można uzyskać na życzenie.
    4. Dla każdej z indywidualnie wyznaczonych punktów ładunku, które zostały odwzorowane na trajektoriach ruchomych lub stacjonarnych na kimografie, należy wybrać współrzędne X-Y i amplitudy intensywności z wyników programu "Kolokalizacja silnikowa" (ładunki te są indywidualnie oznaczone na rysunku 2B). Użyj kilku obrazów stosu Z uzyskanych w kroku 4.2.14), aby zmapować więcej ładunków, które znajdują się na różnych płaszczyznach ogniskowych.
    5. Porównaj indywidualne współrzędne X-Y dla zmapowanego ładunku z współrzędnymi uzyskanymi dla każdego z kanałów silnika w odpowiednim przekroju Z (rysunek 2D). Określ i wybierz współrzędne silnika X-Y, które znajdują się w promieniu 300 mil morskich od ładunku. W przypadku ładunków i silników, które mają sygnał w tej samej płaszczyźnie ogniskowej, należy użyć pakietu oprogramowania "Kolokalizacja silnika", aby określić punkty, które znajdują się w promieniu 300 nm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 pokazuje przegląd urządzenia mikroprzepływowego używanego do hodowli neuronów hipokampa (Rysunek 1A, B). Neurony są posiane w zbiorniku 1. Wielkość mikrokanalików zapobiega dyfuzji ciał komórkowych (soma) do przedziału aksonalnego, podczas gdy długość kanałów zapobiega przechodzeniu projekcji dendrytycznych aż do przedziału aksonalnego. Po ~ 2-3 dniach w hodowli neurony zaczynają rozszerzać swoje aksony przez mikrokanały do przedziału aksonalnego (ryc. 1B, C). ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tu protokół umożliwia korelację kierunkowości ruchu poszczególnych fluorescencyjnych cząstek ładunku ruchomego na bazie mikrotubul ze względnym typem i ilością związanych z nimi białek ruchowych w żywych neuronach. Wcześniej całkowity skład motoryczny aksonalnych ładunków pęcherzykowych oznaczano na niejednorodnych populacjach biochemicznie oczyszczonych pęcherzyków i organelli9,15. Jednak scharakteryzowanie składu silnika dla pojedynczego rodzaju ładunku wewnątrz komór...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Ge Yangowi, Gaudenzowi Danuserowi, Khuloudowi Jaqamanowi i Danielowi Whislerowi za pomoc w adaptacji i rozwoju oprogramowania do ilościowego mapowania ładunków, a także Emily Niederst za pomoc w tworzeniu urządzeń mikroprzepływowych. Praca ta była częściowo wspierana przez AG032180 grantów NIH-NIA dla L.S.B.G. oraz Instytutu Medycznego Howarda Hughesa. L.S. był częściowo wspierany przez NIH Bioinformatics Training Grant T32 GM008806, SEE był wspierany przez stypendium Damon Runyon Cancer Research Foundation Fellowship, NIH Neuroplasticity Training Grant AG000216 oraz przez grant z The Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award, GEC był wspierany przez NIH / NCATS 1 TL1 award TR001114 oraz przez fundację Achievement Rewards for College Scientists.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
poli-L-lizynaSigmaP5899-20mg
D-MEM (Dulbecco' s Modified Eagle Medium) Wysoka glukoza, z L-glutaminą, bez pirogronianu sodu (1x)Life Technologies11965092
FBS (Płodowa surowica bydlęca)Life Technologies10082147
Neurobasal-A Medium (1x)Life Technologies10888022
B-27 Serum Free SuplementLife Technologies10888022
Suplement GlutaMAX I (100x)Life Technologie35050061
HBSS (1x) (Hank' s Zrównoważony roztwór soli)Life Technologies24020117
DPBS (Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, bez magnezu, bez wapnia (1x)Life Technologies14190250
Penicylina/Streptomycyna (100x)Life Technologies15140122
Corning cellgro Woda do hodowli komórkowych Fisher ScientificMT46000CM
PapainaUSB Corporation19925
DL-cysteina HClSigma-AldrichC9768
BSA (albumina surowicy bydlęcej)Sigma-AldrichA7906
D-glukozaSigma-AldrichG6152
DNAse I stopień IIRoche Applied Sciences10104159001
Lipofectamine 2000Life Technologies 
Roztwór formaldehydu 16% EM GradeFisher Scientific50980487Uwaga: Działa szkodliwie przez drogi oddechowe, w kontakcie ze skórą i po połknięciu. Działa drażniąco na oczy, drogi oddechowe i skórę. Utylizować zgodnie z oficjalnymi przepisami.
SacharozaFisher ScientificS5-500
HEPESSigmaH-3375
Normalna surowica osłaJackson Immuno Research017-000-0121
Bez kwasów tłuszczowych BSA i IgGJackson Immuno Research001-000-162
AcetonFisher ScientificBP2403-4
EtanolFisher ScientificBP2818-100
Odczynnik przeciwblaknięcie ProLong GoldLife TechnologiesP36934
Szkło osłonowe 1 1/2. 24 x 40 mmCorning2980-244
Osiowe urządzenie mikroprzepływowe, 450 i mikro; mMilliporeAX450
Adobe PhotoshopAdobe
Nikon Eclipse TE2000-U Aparat Nikon
Coolsnap HQ Roper Scientific
60 mmFisher Scientific12-565-95
Naczynie do hodowli komórkowych 150 mmFisher Scientific12-565-100
Zastosowane przeciwciała:
Łańcuch lekki antykinezyny, V-17Santa Cruz swoistość sc-13362zweryfikowana za pomocą neuronów KLC1-/- (Ref. 16), zalecane rozcieńczenie 1:100.
Ciężki łańcuch Anti Dynein 1, R-325Santa Cruz swoistość sc-9115zweryfikowana przy użyciu shRNA przeciwko DYN1HC1 (Ref. 16), zalecane rozcieńczenie 1:100
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Anti-RabbitAntibody Life TechnologiesA10042  Zalecane rozcieńczenie 1:200.
Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) PrzeciwciałoLife TechnologiesA31573  Zalecane rozcieńczenie 1:200.
Alexa Fluor 568 Donkey Przeciwciało anty-kozie IgG (H+L) Przeciwciało IgGLife TechnologiesA11057  Zalecane rozcieńczenie 1:200.
Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) PrzeciwciałoLife TechnologiesA21447  Zalecane rozcieńczenie 1:200.
Wtyczki i makra
ImageJ  http://imagej.nih.gov/ij/index.html. 
ImageJ Kymograph Pluginhttp://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html.
11668027Naczynie do hodowli komórkowych

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goldstein, A. Y. N., Wang, X., Schwarz, T. L. Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components. Curr. Opin. Neurobiol. 18, 495-503 (2008).
  2. Hirokawa, N. Kinesin and dynein superfamily proteins and the mechanism of organelle transport. Science. 279, 519-526 (1998).
  3. Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68, 610-638 (2010).
  4. Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 682-696 (2009).
  5. Welte, M. A. Bidirectional transport along microtubules. Curr. Biol. 14, 525-537 (2004).
  6. Bryantseva, S. A., Zhapparova, O. N. Bidirectional transport of organelles: unity and struggle of opposing motors. Cell. Biol. Int. 36, 1-6 (2011).
  7. Gross, S. P. Hither and yon: a review of bi-directional microtubule-based transport. Phys. Biol. 1, 1-11 (2004).
  8. Gross, S. P., et al. Interactions and regulation of molecular motors in Xenopus melanophores. J. Cell. Biol. 156, 855-865 (2002).
  9. Gross, S. P., Welte, M. A., Block, S. M., Wieschaus, E. F. Coordination of opposite-polarity microtubule motors. J. Cell. Biol. 156, 715-724 (2002).
  10. Kural, C., et al. Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement. Science. 308, 1469-1472 (2005).
  11. Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
  12. Shubeita, G. T., et al. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1107 (2008).
  13. Soppina, V., Rai, A. K., Ramaiya, A. J., Barak, P., Mallik, R. Tug-of-war between dissimilar teams of microtubule motors regulates transport and fission of endosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 19381-19386 (2009).
  14. Verhey, K. J., Hammond, J. W. Traffic control: regulation of kinesin motors. Nat Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 765-777 (2009).
  15. Hendricks, A. G., et al. Motor Coordination via a Tug-of-War Mechanism Drives Bidirectional Vesicle Transport. Current Biol. 20, 697-702 (2010).
  16. Encalada, S. E., Szpankowski, L., Xia, C. -h, Goldstein, L. S. B. Stable kinesin and dynein assemblies drive the axonal transport of mammalian prion protein vesicles. Cell. 144, 551-565 (2011).
  17. Harris, J., et al. Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. 9 (410), (2007).
  18. Harris, J., et al. Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons. J Vis. Exp. 7 (261), (2007).
  19. Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat. Methods. 2, 599-605 (2005).
  20. Szpankowski, L., Encalada, S. E., Goldstein, L. S. B. Subpixel colocalization reveals amyloid precursor protein-dependent kinesin-1 and dynein association with axonal vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 8582-8587 (2012).
  21. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat. Methods. 5, 695-702 (2008).
  22. Thomann, D., Dorn, J., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag localization II: Improvement in super-resolution by relative tracking. J. Microsc. 211, 230-248 (2003).
  23. Thomann, D., Rines, D. R., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag detection in 3D with super-resolution: application to the analysis of chromosome movement. J. Microsc. 208, 49-64 (2002).
  24. Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224, 213-232 (2006).
  25. Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. J. Vis. Exp. 29 (19), (2008).
  26. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  27. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
  28. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  29. Moore, D. S., McCabe, G. P. Introduction to the Practice of Statistics. , 5th edition, W.H. Freeman. New York, NY. (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia fluorescencyjnaobrazowanie ywych kom rekbarwienie immunofluorescencyjneurz dzenia mikroprzep ywowekolokalizacja podpikselowadopasowanie gaussowskiekolokalizacja motor wtransport aksonalny

Powiązane artykuły