Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie spektrometrii mas MALDI-TOF i niestandardowej bazy danych do scharakteryzowania bakterii występujących w unikalnym środowisku jaskiniowym (Kartchner Caverns, AZ, USA)

DOI:

10.3791/52064

⸱

2 stycznia 2015

 ,  ,  , 
1School of Mathematical and Natural Sciences, Arizona State University, 2Applied Maths NV

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca szczegółowo opisuje procedury szybkiej identyfikacji bakterii za pomocą MALDI-TOF MS. Procedury identyfikacji obejmują akwizycję widma, budowę bazy danych i analizy następcze. Przedstawiono dwie metody identyfikacji: opartą na współczynniku podobieństwa i metodę opartą na biomarkerach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Okazało się, że spektrometria mas

Spektrometria mas MALDI-TOF jest szybkim i niezawodnym narzędziem do identyfikacji bakterii na poziomie rodzaju i gatunku, a w niektórych przypadkach także szczepu. W celu ułatwienia identyfikacji opracowano dostępne na rynku narzędzia programowe typu open source; W literaturze nie opisano jednak uniwersalnego/ustandaryzowanego potoku analizy danych. W tym miejscu zapewniamy kompleksową i szczegółową demonstrację procedur identyfikacji bakterii przy użyciu spektrometru mas MALDI-TOF. Widma masowe pobrano od 15 różnych bakterii wyizolowanych z Kartchner Caverns, AZ, USA i zidentyfikowano za pomocą sekwencjonowania 16S rDNA. Bazy danych zostały skonstruowane w BioNumerics 7.1. Przeprowadzono dalsze analizy widm masowych, w tym analizy skupień, dopasowanie pików i analizy statystyczne. Identyfikację przeprowadzono przy użyciu ślepo zakodowanych próbek losowo wybranych z tych 15 bakterii. Przedstawiono dwie metody identyfikacji: oparte na współczynniku podobieństwa i metody oparte na biomarkerach. Wyniki pokazują, że obie metody identyfikacji mogą identyfikować bakterie na poziomie gatunku.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spektrometria mas (MS) wspomagana laserową desorpcją/jonizacją (MALDI-TOF) wspomagana matrycą okazała się szybkim i niezawodnym narzędziem do identyfikacji bakterii na poziomie rodzaju, gatunku, a w niektórych przypadkach szczepu1-4. MALDI-TOF MS jonizuje cząsteczki biologiczne (zwykle białka), które pochodzą z powierzchni komórek, błon wewnątrzkomórkowych i rybosomów z całych komórek bakteryjnych lub ekstraktów białkowych1,5. Powstałe piki tworzą charakterystyczne wzory lub "odciski palców" analizowanych bakterii1. Identyfikacja bakterii opiera się na tych "odciskach palców" od masy do ładunku.

Dwie z najczęściej używanych strategii identyfikacji to strategie oparte na bibliotece i bioinformatyce:1. Podejścia oparte na bibliotekach polegają na porównywaniu widm masowych niewiadomych z wcześniej zebranymi widmami masowymi znanych bakterii w bazach danych/bibliotekach w celu identyfikacji. Dostępne na rynku oprogramowanie, takie jak pakiety oprogramowania BioNumerics, Biotyper i SARAMIS, a także narzędzia oprogramowania typu open source, takie jak SpectraBank6, ułatwiają porównywanie i kwantyfikację podobieństwa między widmami masowymi nieznanych i bakterii referencyjnych. Podejścia oparte na bioinformatyce zwykle opierają się na w pełni zsekwencjonowanych genomach bakterii w celu identyfikacji. W przeciwieństwie do podejść bibliotecznych, które nie obejmują identyfikacji biologicznej natury poszczególnych pików, podejścia oparte na bioinformatyce obejmują identyfikację białek1.

Większość ostatnich badań MALDI opartych na odciskach palców wykorzystywała metody oparte na bibliotece do identyfikacji bakterii1. Podejścia oparte na bibliotekach wymagają budowy baz danych i porównywania podobieństwa między widmami masowymi. Badania pokazują, że wiele procedur eksperymentalnych, takich jak podłoże3,7, czashodowli8, metoda przygotowaniapróbki3 i zastosowanamatryca9, wpływa na uzyskane widma masowe. Co więcej, niektóre blisko spokrewnione gatunki i szczepy generują widma z jedynie subtelnymi różnicami. W związku z tym podejścia oparte na bibliotekach wymagają rygorystycznie ustandaryzowanych procedur w celu generowania wysoce powtarzalnych widm masowych między powtórzeniami. Niewielkie różnice w protokołach mogą zagrozić skuteczności identyfikacji, zwłaszcza na poziomie podgatunku i szczepu1,3,10. Jednak ani referencyjne bazy danych dostarczone przez producenta, ani raportowane niestandardowe bazy danych nie zawierają wizualnie udokumentowanych procedur budowy bazy danych i/lub zastosowania potoku analizy danych. Z tego powodu celem niniejszej pracy było opracowanie, zastosowanie i zademonstrowanie kompleksowej i szczegółowej procedury identyfikacji bakterii w oparciu o bibliotekę za pomocą MALDI-TOF MS.

W tej demonstracji, widma masowe 15 bakterii wyizolowanych ze środowiska krasowego (Kartchner Cavern, AZ, USA) zostały zebrane i zaimportowane do oprogramowania w celu skonstruowania modelowej bazy danych. Przetwarzanie danych i potok analizy zostały szczegółowo opisane przy użyciu bazy danych modelu. Na koniec ponownie zebrano widma masowe ślepo zakodowanych bakterii, które zostały losowo wybrane z tych 15 bakterii, i porównano je z widmami referencyjnymi w bazie danych modelu w celu identyfikacji. Wyniki pokazują, że bakterie można prawidłowo identyfikować na podstawie współczynników podobieństwa lub potencjalnych biomarkerów/klas pików.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uwaga: Niezidentyfikowane bakterie z dowolnego środowiska mogą być chorobotwórcze i muszą być traktowane ostrożnie, stosując odpowiednie protokoły bezpieczeństwa biologicznego. Praca z żywymi kulturami musi być wykonywana w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II przy użyciu procedur poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2). Więcej informacji na temat procedur BSL-2 można znaleźć w podręczniku CDC/NIH zatytułowanym "Bezpieczeństwo biologiczne w laboratoriach mikrobiologicznych i biomedycznych", strony 33-38. Dokument jest dostępny online pod adresem http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf. Należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE), w tym fartuchy laboratoryjne, okulary ochronne oraz rękawice nitrylowe lub lateksowe. Należy przestrzegać standardowych praktyk mikrobiologicznych i środków ostrożności, a odpady niebezpieczne biologicznie muszą być odpowiednio usuwane.

Bakterie użyte w tej demonstracji zostały wyizolowane z Kartchner Caverns, AZ, USA, z czterech środowisk, w tym suchego nacieku, kamienia przepływowego, wilgotnego nacieku i kroplówki stalaktytowej (Tabela 1). Wszystkie izolaty zidentyfikowano za pomocą sekwencjonowania 16S rDNA i utrzymywano w temperaturze -80 °C w 25% pożywce glicerolu-R2 B. Wszystkie eksperymenty zostały zakończone w RT.

Uwaga: Zalecamy użycie tej samej metody przygotowania próbki do uzyskania widm masowych do budowy bazy danych i widm masowych niewiadomych. Wykazano wcześniej, że metoda przygotowania próbki wpływa na jakość widma i odtwarzalność3. Zastosowanie innej metody przygotowania próbki może spowodować nieprawidłową identyfikację niewiadomych, zwłaszcza gdy pożądana jest wyższa rozdzielczość taksonomiczna (np. na poziomie odkształcenia).

1. Osadzanie na tarczy MALDI

Uwaga: Kilka protokołów do uzyskania ekstraktów białkowych wymaga użycia kwasów i rozpuszczalników organicznych, które muszą być używane zgodnie z wytycznymi i informacjami zawartymi w ich odpowiednich Kartach Charakterystyki Substancji Niebezpiecznej (MSDS). Należy nosić odpowiednie środki ochrony indywidualnej, które będą się różnić w zależności od rodzaju i ilości użytych chemikaliów (np. fartuchy laboratoryjne, rękawice, okulary ochronne i środki ochrony dróg oddechowych muszą być używane podczas pracy ze znacznymi ilościami toksycznych, łatwopalnych rozpuszczalników, takich jak acetonitryl, oraz kwasów, takich jak kwas mrówkowy i trifluorooctowy).

  1. Umieść 1 μl ekstraktu białkowego niezawierającego żadnych żywotnych komórek (uzyskanego przy użyciu odpowiednich, wcześniej opisanych protokołów11-13) na płytce tarczowej MALDI ze stali nierdzewnej i pozostaw do wyschnięcia. Nałożyć wysuszony ekstrakt białkowy na 1 μl roztworu matrycowego (roztwór kwasu α-cyjano-4-hydroksy-cynamonowego) i pozostawić do wyschnięcia.
  2. Dla każdej kontrpróby biologicznej należy zauważyć odpowiednią liczbę kontrprób technicznych (od 5 do 20 kontrprób technicznych). W tym przypadku przygotowano 10 powtórzeń technicznych dla każdej kontrpróby biologicznej i przygotowano 3 powtórzenia biologiczne.
    Uwaga: Zalecamy użycie tarczy tarczowej z polerowanej stali MALDI podczas korzystania z metody przygotowania próbki do ekstrakcji białka. Użycie szlifowanych stalowych płyt docelowych może spowodować rozprowadzenie i niezamierzone wymieszanie różnych próbek poza poszczególnymi dołkami na próbki.
  3. Nałóż 1 μl wzorca kalibru na tarczę celowniczą i pozostaw do wyschnięcia. Nałożyć 1 μl roztworu matrycowego i pozostawić do wyschnięcia.
  4. Umieścić 2 μl roztworu matrycowego na płytce docelowej jako kontrolę ujemną.

2. Akwizycja widm masowych

  1. Użyć spektrometru mas MALDI-TOF wyposażonego w laser azotowy (λ = 337 nm) i obsługiwanego za pomocą oprogramowania Bruker FlexControl.
  2. Zbierz każde widmo masy w dodatnim trybie liniowym, gromadząc 500 strzałów laserowych w przyrostach co 100 strzałów. Ustaw napięcie źródła jonów 1 na 20 kV; napięcie źródła jonów 2 do 18,15 kV; i napięcie soczewki do 9,05 kV. Należy pamiętać, że te parametry są specyficzne dla danego instrumentu i mogą wymagać regulacji na innych instrumentach w celu uzyskania optymalnych wyników.
  3. Ustaw zakres masy do ładunku dla automatycznej oceny widma od 2 do 20 kDa na ładowanie. Użyj algorytmu wykrywania pików środka ciężkości. Ustaw minimalny próg rozdzielczości na 100 Da. Ustaw próg stosunku sygnału do szumu (S:N) na 2. Ustaw minimalny próg intensywności na 100.

3. Budowa bazy danych

  1. Projektowanie baz danych
    1. Utwórz nową bazę danych w BioNumerics 7.1 za pomocą "Kreatora nowej bazy danych".
    2. Utwórz typ eksperymentu widma, np. Maldi, za pomocą poleceń w panelu "Typy eksperymentów".
    3. Utwórz poziomy za pomocą "Panelu projektu bazy danych". Dodaj nowe poziomy za pomocą polecenia "Poziom > Dodaj nowy poziom..." w menu "Baza danych". W tym miejscu utwórz odpowiednio poziom "Gatunek", poziom "Duplikat biologiczny" i poziom "Duplikat techniczny".
  2. Importowanie i wstępne przetwarzanie widm masy surowej
    1. Eksportuj surowe widma masowe jako pliki .txt za pomocą FlexAnalysis, klikając polecenie "Eksportuj widmo masy" > menu "Plik".
    2. Zaimportuj surowe widma masowe (pliki .txt) do bazy danych na poziomie kontrprób technicznych.
    3. Wstępnie przetworzyć surowe widma masowe.
      1. Importowanie i ponowne próbkowanie (przy użyciu algorytmu dopasowania kwadratowego).
      2. Wykonaj odejmowanie linii bazowej (za pomocą tarczy tocznej o rozmiarze 50 punktów).
      3. Oblicz szum [Continuous Wavelet Transformation (CWT)], gładki (okno Kaisera o rozmiarze okna 20 punktów i beta 10 punktów) i wykonaj drugie odejmowanie linii bazowej (tocząca się tarcza o rozmiarze 200 punktów).
      4. Wykrywanie pików [CWT przy minimalnym stosunku sygnału do szumu (S:N) wynoszącym 10].
    4. Po wstępnym przetworzeniu zapisz w bazie danych charakterystyczne wzorce każdego widma masowego, takie jak listy pików zawierające rozmiary pików, intensywności pików, S:N itp.
  3. Tworzenie widm mas kompozytowych
    1. Utwórz widma kompozytowe ze wstępnie przetworzonych widm za pomocą polecenia "Podsumowaj..." w menu "Analiza". Jako poziom docelowy należy wybrać "Replika biologiczna".
    2. W tym miejscu połącz widma masowe 10 technicznych powtórzeń tej samej kolonii, aby uzyskać złożone widmo masowe dla tej kolonii, co daje trzy złożone widma masowe dla tego izolatu na poziomie "kontrpróby biologicznej".
    3. W tym miejscu podsumuj trzy widma złożone, aby utworzyć jedno widmo złożone dla tego izolatu na poziomie "Gatunek".
      Uwaga: Widmo złożone jest średnią punkt po punkcie z kontrprób technicznych. Powtórzenia o podobieństwie (korelacja Pearsona) do średniej mniejszej niż 95% (ustawienie domyślne) są wykluczane z kompozytu. Piki w widmach złożonych są wywoływane tylko wtedy, gdy są obecne w 75% (ustawienie domyślne) uwzględnionych powtórzeń. W przypadku kontrprób biologicznych ustawienia te wynosiły odpowiednio 90 i 60%.

4. Analiza danych widma masowego

  1. Zaznacz wpisy w bazie danych i utwórz porównanie, klikając polecenie "Utwórz nowe porównanie" w panelu "Porównania".
  2. W tym miejscu należy użyć widm mas na poziomie "kontrpróby technicznej" i/lub "kontrpróby biologicznej", aby pokazać porównania i analizy.
  3. Analiza skupień oparta na podobieństwie i skalowanie wielowymiarowe (MDS)
    1. Twórz grupy z kolorami. Wybierz trzy biologiczne widma mas złożonych i kliknij polecenie "Utwórz nową grupę z wyboru" w menu "Grupy", aby utworzyć grupę dla odpowiedniego izolatu. Wyznacz kolor automatycznie używany dla tych trzech widm masowych.
    2. Alternatywnie można zdefiniować stany pól z odpowiadającymi im kolorami za pomocą poleceń w panelu "Wpisy bazy danych" w taki sposób, aby każde grupowanie oparte na tym zdefiniowanym polu używało tego samego koloru zdefiniowanego dla tej grupy.
    3. Wykonaj analizę skupień. Kliknij polecenie "Oblicz analizę skupień" w menu "Grupowanie". Na stronie 1 Ustawienia porównania wybierz opcję "Korelacja Pearsona" i pozostaw inne parametry jako domyślne. Na stronie 2 wybierz "UPGMA". Następnie kliknij "Zakończ".
    4. Uzyskaj wykres MDS za pomocą polecenia "Skalowanie wielowymiarowe..." w menu "Statystyki".
  4. Dopasowanie szczytowe
    1. Kliknij typ widma "Maldi" w panelu "Eksperymenty". Następnie wybierz "Układ > Pokaż obraz". Widma są pokazane jako opaski żelowe.
    2. Wykonaj dopasowywanie pików za pomocą polecenia "Do peak matching" w menu "Spectra".
  5. Identyfikacja klas szczytów
    1. Wykonaj analizę głównych składowych (PCA). Zaznacz typ eksperymentu "Maldi" w panelu "Eksperymentalny" i użyj polecenia "Analiza głównych składowych..." w menu "Statystyczny", aby wykonać PCA.
    2. Wykonaj klastrowanie dwukierunkowe. Kliknij przycisk "Statystyki > Eksploracja macierzowa"... w oknie "Porównanie". Intensywność szczytów dopasowanych do klas pików jest reprezentowana za pomocą różnych kolorów (mapa cieplna).

5. Identyfikacja bakterii za pomocą niestandardowej bazy danych

  1. Metoda oparta na współczynniku podobieństwa
    1. Utwórz porównanie i wygeneruj dendrogram na podstawie widm masowych na poziomie "Repliki technicznej", jak opisano w kroku 4.3.3. Zachowaj dendrogram do porównania podobieństwa.
    2. Wybierz nieznane widmo mas i kliknij przycisk "Analiza > Zidentyfikuj wybrane wpisy". Pojawi się okno dialogowe identyfikacji.
    3. Wybierz typ klasyfikatora "Oparty na porównaniu" (lub zapisany klasyfikator) i kliknij "dalej". Na następnej stronie wybierz zapisany dendrogram jako porównanie referencyjne, a następnie kliknij "dalej".
    4. Wybierz "Podstawowe podobieństwo" jako metodę identyfikacji, a następnie kliknij "dalej".
    5. Wybierz "Maksymalne podobieństwo" jako metodę oceniania. Wpisz odpowiednie wartości progowe i minimalne wartości różnicy dla każdego parametru, a następnie kliknij "dalej".
    6. Po zakończeniu obliczeń pojawi się okno identyfikacji. W panelu "Wyniki" znajdują się członkowie bazy danych, którzy najlepiej pasują do nieznanego.
    7. Zapisz projekt identyfikacji i zweryfikuj identyfikację za pomocą polecenia "analiza krzyżowej walidacji" w panelu "Projekt identyfikacyjny".
  2. Potencjalna metoda oparta na biomarkerach
    1. Definiowanie klas szczytowych. W oknie "Matrix Mining" wybierz zestawy pików o wspólnych cechach i zdefiniuj te piki jako określone klasy pików (potencjalne biomarkery) za pomocą opcji "Spectra > Manage peak class types..." w oknie "Porównanie".
    2. W tym miejscu zdefiniuj klasy pików specyficzne dla każdego izolatu dla wszystkich 15 izolatów.
    3. Wybierz widma masowe niewiadomych i dopasuj piki tych widm do zdefiniowanych klas pików, jak opisano wcześniej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bazy danych skonstruowane w tej demonstracji miały cztery poziomy, od najwyższego do najniższego poziomu, w tym odpowiednio "Wszystkie poziomy", "Gatunki", "Replikacja biologiczna" i "Techniczna replikacja" (Rysunek 1A). Poziom "Replika techniczna" zawierał wszystkie wstępnie przetworzone widma kontrprób technicznych. Poziomy "Replikacji biologicznej" i "Gatunków" zawierały widma złożone (podsumowujące). "Wszystkie poziomy" zawierały wszystkie widma replik technicznych, jak również wszystkie widma złożon...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Demonstracja ta pokazała szczegółowe procedury charakterystyki i identyfikacji bakterii przy użyciu MALDI-TOF MS i niestandardowej bazy danych. W porównaniu z tradycyjnymi metodami molekularnymi, na przykład sekwencjonowaniem 16S rDNA, metody odcisków palców oparte na MS MALDI-TOF ułatwiają szybszą identyfikację różnych bakterii. Ze względu na swoją wytrzymałość, technika ta jest szeroko stosowana do charakteryzowania bakterii, wirusów, grzybów i drożdży w środowisku i w warunkach klinicznych1,14-16. Ponadto d...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy, Vranckx i Janssens, są pracownikami firmy Applied Maths NV, producenta oprogramowania do analizy danych użytego w tym filmie. Firma Applied Maths NV dostarczyła wybrane moduły oprogramowania wyróżnione w tym filmie, a także część kosztów publikacji związanych z tym filmem.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez New College of Interdisciplinary Arts and Sciences na Uniwersytecie Stanowym Arizony, Applied Maths NV, oraz przez National Science Foundation (ROA Supplement to Award No. MCB0604300). Wszelkie opinie, ustalenia, wnioski lub zalecenia wyrażone w tym materiale są opiniami autora (autorów) i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy National Science Foundation.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas &alfa;-cyjano-4-hydroksy-cynamonowyACROS Organics163440050≥ 97%, CAS 28168-41-8
Oprogramowanie BrukerFlexControl Bruker Daltonicswersja 3.0
Oprogramowanie Bruker FlexAnalysisBruker Daltonicswersja 3.0
Oprogramowanie bionumeryczneMatematykawersja 7.1
stosowana

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review. Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).
  2. Siegrist, T. J., et al. Discrimination and characterization of environmental strains of Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). J Microbiol Meth. 68 (3), 554-562 (2007).
  3. Goldstein, J. E., Zhang, L., Borror, C. M., Rago, J. V., Sandrin, T. R. Culture conditions and sample preparation methods affect spectrum quality and reproducibility during profiling of Staphylococcus aureus with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Lett Appl Microbiol. 57 (2), 144-150 (2013).
  4. Benagli, C., et al. A rapid MALDI-TOF MS identification database at genospecies level for clinical and environmental Aeromonas strains. Plos One. 7 (10), (2012).
  5. Sauer, S., Kliem, M. Mass spectrometry tools for the classification and identification of bacteria. Nat Rev Microbiol. 8 (1), 74-82 (2010).
  6. Bohme, K., et al. SpectraBank: An open access tool for rapid microbial identification by MALDI-TOF MS fingerprinting. Electrophoresis. 33 (14), 2138-2142 (2012).
  7. Walker, J., Fox, A. J., Edwards-Jones, V., Gordon, D. B. Intact cell mass spectrometry (ICMS) used to type methicillin-resistant Staphylococcus aureus: media effects and inter-laboratory reproducibility. J Microbiol Meth. 48 (2-3), 117-126 (2002).
  8. Ruelle, V., El Moualij, B., Zorzi, W., Ledent, P., De Pauw, E. Rapid identification of environmental bacterial strains by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun Mass Sp. 18 (18), 2013-2019 (2004).
  9. Sedo, O., Sedlacek, I., Zdrahal, Z. Sample Preparation Methods for Maldi-MS Profiling of Bacteria. Mass Spectrom Rev. 30 (3), 417-434 (2011).
  10. Swatkoski, S., Russell, S., Edwards, N., Fenselau, C. Analysis of a model virus using residue-specific chemical cleavage and MALDI-TOF mass spectrometry. Anal Chem. 79 (2), 654-658 (2007).
  11. Freiwald, A., Sauer, S. Phylogenetic classification and identification of bacteria by mass spectrometry. Nat Protoc. 4 (5), 732-742 (2009).
  12. Drevinek, M., Dresler, J., Klimentova, J., Pisa, L., Hubalek, M. Evaluation of sample preparation methods for MALDI-TOF MS identification of highly dangerous bacteria. Lett Appl Microbiol. 55 (1), 40-46 (2012).
  13. Lasch, P., et al. MALDI-TOF mass spectrometry compatible inactivation method for highly pathogenic microbial cells and spores. Anal Chem. 80 (6), 2026-2034 (2008).
  14. Usbeck, J. C., Kern, C. C., Vogel, R. F., Behr, J. Optimization of experimental and modelling parameters for the differentiation of beverage spoiling yeasts by Matrix-Assisted-Laser-Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) in response to varying growth conditions. Food Microbiol. 36 (2), 379-387 (2013).
  15. Del Chierico, F., et al. MALDI-TOF MS proteomic phenotyping of filamentous and other fungi from clinical origin. J Proteomics. 75 (11), 3314-3330 (2012).
  16. Vitale, R., Roine, E., Bamford, D. H., Corcelli, A. Lipid fingerprints of intact viruses by MALDI-TOF/mass spectrometry. Bba-Mol Cell Biol L. 1831 (4), 872-879 (2013).
  17. Zhang, L., Borror, C. M., Sandrin, T. R. A designed experiments approach to optimization of automated data acquisition during characterization of bacteria with MALDI-TOF mass spectrometry. Plos One. 9 (3), (2014).
  18. Christner, M., Rohde, H., Wolters, M., Sobottka, I., Wegscheider, K., Aepfelbacher, M. Rapid identification of bacteria from positive blood culture bottles by use of matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry fingerprinting. J ClinMicrobiol. 48 (5), 1584-1591 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Identyfikacja bakteriiBioNumerics 7 1metoda wsp czynnika podobie stwametoda oparta na biomarkerachanaliza skupiedopasowanie pikuanaliza widm masowychpr bki zakodowane w spos b lepy

Powiązane artykuły