Artykuł metodologiczny

Pobieranie próbek z gleby i izolacja nicieni entomopatogenicznych (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

DOI:

10.3791/52083

⸱

11 lipca 2014

 ,  , 
1Department of Entomology, University of Arizona

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nicienie entomopatogeniczne to glisty zamieszkujące glebę, które pasożytują na szerokiej gamie owadów. Pokazujemy metody pobierania próbek stosowane do izolacji tych nicieni z gleby przy użyciu dwóch technik: przynęty na owady i zmodyfikowanej białej pułapki, do odzyskiwania nicieni odpowiednio z próbek gleby i zakażonych zwłok owadów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nicienie entomopatogeniczne (znane również jako EPN) reprezentują grupę nicieni zamieszkujących glebę, które pasożytują na szerokiej gamie owadów. Nicienie te należą do dwóch rodzin: Steinernematidae i Heterorhabditidae. Do tej pory w Steinernematidae opisano ponad 70 gatunków, a w Heterorhabditidae jest około 20 gatunków. Nicienie mają wzajemne partnerstwo z bakteriami Enterobacteriaceae i razem działają jako silny kompleks owadobójczy, który zabija szeroką gamę gatunków owadów.

Tutaj skupiamy się na najczęstszych technikach branych pod uwagę przy zbieraniu EPN z gleby. Druga część tej prezentacji skupia się na technice nęcenia owadów, szeroko stosowanym podejściu do izolacji EPN z próbek gleby, oraz na zmodyfikowanej technice białej pułapki, która jest stosowana do odzyskiwania tych nicieni od zakażonych owadów. Te metody i techniki są kluczowymi krokami do pomyślnego ustanowienia kultur EPN w laboratorium, a także stanowią podstawę dla innych testów biologicznych, które traktują te nicienie jako organizmy modelowe do badań w innych dyscyplinach biologicznych. Techniki przedstawione w tej prezentacji odpowiadają technikom wykonywanym i/lub zaprojektowanym przez członków laboratorium S. P. Stock, jak również tym opisanym przez różnych autorów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele nicieni jest związanych z owadami, a ich interakcje z gospodarzami wahają się od korzystnych do szkodliwych. W tym miejscu skupimy się na grupie nicieni, które są patogenami owadów, znanych również jako nicienie entomopatogeniczne (lub EPN). Do tej grupy nicieni należą dwie rodziny nicieni: Steinernematidae i Heterorhabditidae11,13. Ich działanie chorobotwórcze jest w rzeczywistości zapewnione przez interakcję z fakultatywnymi beztlenowymi bakteriami jelitowymi (bakterie Xenorhabdus wiążą się ze steinernematidami, a bakterie Photorhabdus z heterorhabditidami)2. Bakterie są przenoszone z jednego żywiciela owada na drugiego przez jedyne wolno żyjące stadium nicienia, zakaźny młodociany trzeci stopień (znany również jako młody dauer, młodociany zakaźny lub IJ), który żyje w glebie. Po dostaniu się do owada nicienie uwalniają bakterie do hemolimfy owada, które zabijają owada gospodarza przez masywną posocznicę. Bakterie degradują również tkanki owadów i stają się źródłem pożywienia nicieni, umożliwiając im dojrzewanie i rozmnażanie się. Zwykle w zwłokach owadów wytwarza się jedno lub dwa pokolenia dorosłych nicieni. Potomstwo ostatniego dorosłego pokolenia ponownie kojarzy się z kilkoma komórkami bakteryjnymi w bardziej wyspecjalizowany sposób niż ich poprzedni związek żywieniowy i pielęgnuje te komórki w swoich jelitach, gdy przemieszczają się z tuszy owada do gleby, gdzie będą czekać na innego owada, który zaaplikuje się6,11,14 (ryc. 1).

Od czasu ich odkrycia w 1927 roku, EPN są uważane za wartościową alternatywę dla chemicznych pestycydów, ponieważ mogą pasożytować na szerokiej gamie owadów, które są szkodnikami rolniczymi3,4,5. Jednak w ciągu ostatnich dwóch dekad nicienie te i ich symbiotyczne bakterie zostały uznane za plastyczny system modelowy do badania biologicznych, ekologicznych i ewolucyjnych aspektów interakcji gospodarz-mikroorganizm

.

Celem tej prezentacji jest pokazanie metod i technik najczęściej używanych do pobierania próbek gleby i izolowania EPN. Dostępnych jest wiele narzędzi, które mogą być używane do pobierania próbek gleby, w tym między innymi: rdzenie glebowe, kielnie, koparki do otworów po słupach, świdry, rurki do pobierania próbek, łopaty ręczne (rysunek 2).

W zależności od celu badania, można rozważyć dwie strategie doboru próby: a) warstwowe, b) losowe próbkowanie (Rysunek 3). Próbkowanie warstwowe jest zwykle stosowane jako część intensywnego badania na określonym lub oznaczonym obszarze w danym okresie czasu. Ogólnie rzecz biorąc, transekt jest oznaczany, a próbki gleby są pobierane w określonych odstępach czasu w transekcie przez pewien okres czasu (rysunek 3A)15. Losowe pobieranie próbek jest zwykle stosowane, gdy skupiamy się na rozległym obszarze. Ta strategia pobierania próbek została wykorzystana do zbadania różnorodności EPN z dużego obszaru geograficznego lub regionu (rysunek 3B)12. W zależności od przedmiotu badania można wziąć pod uwagę szereg czynników, w tym zróżnicowany zakres wysokości, teksturę gleby i siedliska (np. pola uprawne, lasy, pastwiska, parki, wybrzeża morskie, obszary nadbrzeżne itp.).

Pokazujemy technikę nęcenia owadów, która została pierwotnie opisana przez Beddinga i Akhursta1 i stanowi prostą i selektywną alternatywę dla odzyskiwania EPN z próbek gleby. Jest to selektywna procedura, która opiera się na założeniu, że nicienie (stadium IJ) zostaną przyciągnięte do owada żywiciela i pasożytują na nim. Technika ta może być również brana pod uwagę w przypadku izolacji innych patogenów owadzich, takich jak grzyby i bakterie8,10.

Pokazujemy również zmodyfikowaną technikę białej pułapki, która jest używana do pobierania potomstwa nicieni od zakażonych gospodarzyowadów 7,14. Jest to bezproblemowa metoda, która ma tę zaletę, że pozwala na odzyskanie "czystego" potomstwa nicieni wolnego od szczątków z rozkładających się zwłok owadów.

Na koniec, techniki opisane i pokazane w tym artykule odpowiadają tym wymyślonym i/lub wykonanym w naszym laboratorium, jak również tym opisanym przez różnych kolegów i współpracowników.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Pobieranie próbek gleby

  1. Należy rozważyć pokrycie minimalnej powierzchni 2–4m2 dla każdego miejsca pobierania próbek.
  2. Próbki gleby należy pobrać na głębokości co najmniej 15 cm (rysunek 4).
  3. Pobrać co najmniej 5 losowych próbek w tym obszarze.
  4. Pobrać 3 podpróbki na próbkę. W zależności od celu badania, należy połączyć podpróbki lub zachować je oddzielnie.
  5. Umieść każdą próbkę w plastikowej torbie. Rozważ podwójne pakowanie, aby uniknąć wycieku próbek (rysunek 4).
  6. Oznacz próbki wodoodpornym markerem. Należy uwzględnić następujące informacje z każdego miejsca pobierania próbek: informacje o miejscu (w tym miejscowość/obszar/nazwę miejsca i informacje o współrzędnych GPS), datę, siedlisko, powiązaną roślinność, temperaturę, wysokość nad poziomem morza itp.
    UWAGA: W stosownych przypadkach należy pobrać i/lub zarejestrować obecność owadów lub innych bezkręgowców pobranych wraz z próbką w celu późniejszej identyfikacji. Mogą one reprezentować potencjalnych naturalnych gospodarzy EPN.
  7. Narzędzia do pobierania próbek należy czyścić między próbkami, dokładnie myjąc je wodą i/lub dezynfekując 70% etanolem lub 0,5% roztworem wybielacza.
  8. Próbki należy przechowywać w chłodni (8–15 °C) podczas transportu do laboratorium.
  9. Pobrać część próbki gleby do analizy, aby uzyskać informacje na temat składu gleby, tekstury, wilgotności, przewodności elektrycznej lub innych pożądanych parametrów gleby.

2. Izolacja nicieni z próbek gleby: technika przynęty na owady

  1. Usuń wszelkie zanieczyszczenia (tj. kamienie, kawałki drewna lub kory, liście itp.) zebrane wraz z próbkami, aby uniknąć zanieczyszczenia mikroorganizmami sapamicznymi.
  2. Dodaj wodę, aby zwilżyć glebę i ułatwić przemieszczanie się nicieni.
    UWAGA: Użyj butelki z rozpylaczem, aby powoli zwiększać poziom wilgotności gleby.
  3. Umieść około 200 do 250 ml wilgotnej gleby w czystym plastikowym pojemniku z pokrywką.
  4. Dodaj przynęty na owady. Rozważ od 5 do 10 owadów na powierzchni gleby w każdej próbce (ryc. 5).
  5. Przykryj pojemnik pokrywką i odwróć pojemniki do góry nogami.
  6. Pojemniki należy przechowywać w ciemności i w temperaturze pokojowej (zwykle 22 - 25 °C).
  7. Sprawdzaj pojemniki co 2-3 dni i usuwaj martwe owady.
    UWAGA: dodaj dodatkowe zdrowe owady do każdego pojemnika w celu dalszego nęcenia próbki gleby.
  8. Usuń martwe owady z pojemników. UWAGA: Zwłoki o brązowym lub ochrowym zabarwieniu są zwykle pasożytowane przez steinernematydy, podczas gdy zwłoki od ceglastoczerwonych do ciemnofioletowych są pasożytowane przez heterorhabditidae.
  9. Opłucz zwłoki w sterylnej wodzie.
  10. Umieścić zwłoki w zmodyfikowanej białej pułapce w celu odzyskania potomstwa nicieni (patrz procedura poniżej).

3. Odzyskiwanie nicieni z zainfekowanych zwłok: Zmodyfikowana biała pułapka

  1. Umieść górną część szalki Petriego o średnicy 50 (lub 60) mm w większym naczyniu (100 mm).
  2. Umieść jedną pojedynczą okrągłą bibułę filtracyjną (Whatman #1) w mniejszym naczyniu.
  3. Umieść zwłoki na bibule filtracyjnej mniejszego naczynia, upewniając się, że zwłoki nie stykają się ze sobą, aby uniknąć zanieczyszczenia.
  4. Zewnętrzną (większą) szalkę Petriego napełnić ok. 20 ml sterylnej wody destylowanej. Nie dolewaj wody do naczynia, w którym znajdują się zwłoki.
  5. Przykryj dużą szalkę Petriego i jej zawartość pokrywką (Rysunek 6).
  6. Odpowiednio oznacz potrawy. Dodać następujące informacje: nazwę nicienia (gatunek/izolat), datę zakażenia (datę ustaloną infekcję) i datę pułapki (jest to data założenia pułapki).
  7. Trzymaj pułapkę w RT do momentu pojawienia się zakaźnych stadiów młodocianych (IJ). Proces ten może trwać od 10 do 25 dni, w zależności od rozważanego gatunku i/lub szczepu nicieni.
  8. Zbieraj wodę za pomocą IJ, wyjmując większe naczynie z pułapki i wlewając wodę z nicieniami do zlewki.
  9. Pozwól nicieniom zdekantować się na dno zlewki. Ten proces może potrwać kilka minut.
  10. Ostrożnie zalej wodą, upewniając się, że nicienie pozostały na dnie zlewki.
  11. Opłucz nicienie, dodając więcej wody i pozwalając nicieniom zdekantować. Ten krok można powtórzyć 2-3 razy, aż woda będzie czysta.
  12. Umieścić zawiesinę nicieni w kolbie do hodowli tkankowej (250 ml). Stężenie zawiesiny należy utrzymać na poziomie 1 000 - 3 000 nicieni/ml.
  13. Kolbę z zawiesiną nicieni przechowywać w chłodni lub w inkubatorze w temperaturze 10 - 20 °C.
    UWAGA: Przechowywać kolby należy okresowo sprawdzać, ponieważ okres trwałości EPN jest zmienny. Zwykle steinernematydy mogą być przechowywane przez 6 - 12 miesięcy bez konieczności hodowli, podczas gdy heterorhabditidae mogą wymagać bardziej okresowych badań kontrolnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pobieranie próbek gleby

Trzecie stadium zakaźnych młodych osobników EPN to jedyne wolno żyjące stadia w cyklu życiowym tych nicieni, które żyją w glebie (Rysunek 1). Dlatego pobieranie próbek gleby jest bardzo skuteczną metodą odzyskiwania tych nicieni. Na rysunku 4 przedstawiono profil glebowy wskazujący głębokość, z której należy pobrać próbki. Zachowanie wilgotności próbki jest kluczowym czynnikiem przetrwania nicieni. W związku z tym ważne jest, aby przech...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta demonstracja jest pierwszą z dwóch prezentacji, które opisują szereg technik, które są powszechnie stosowane do badania EPN i ich symbiotycznych bakterii. Techniki te stanowią kluczowe kroki na drodze do pomyślnego ustanowienia kultur EPN w laboratorium, a także stanowią podstawę dla innych testów biologicznych, które wykorzystują EPN jako organizmy modelowe do badań.

Różne badania glebowe EPN wykazały, że ich obfitość i rozmieszczenie mogą się różnić w zależności od pory roku, siedlisk i r...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować byłym członkom laboratorium Stock: Sam-Kyu Kim, Kathryn Plichta i Victorii Miranda-Thompson za ich wkład w ulepszenie wielu z tych protokołów. Dziękujemy za wsparcie Narodowej Fundacji Nauki (granty IOS-0840932 i IOS-0724978) dla S. P. Stock.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Galleria mellonellaTimberlinehttp://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLGDo techniki nęcenia owadów
Bibuła filtracyjna, 55 mm Celuloza klasy 1Whatman/VWR28450-048Komora infekcyjna i zespół białej pułapki
60 x 15 mm Szalki PetriegoVWR25384-092Zespół komory infekcyjnej i białej pułapki
Szalki Petriego 100 x 15 mmVWR25384-088Komora infekcyjna i zespół białej pułapki
Worki plastikowe ZIPlocAce Hardware lub lokalny sklepPobieranie próbek gleby
Pipeta mechaniczna P1000, P200 mlVWR89130-562; 89130-566 Zespół komory infekcyjnej i białej pułapki
Końcówki do pipetorów 1000ml, 200 mlVWR16466-004 ; 53510Komora infekcyjna i zespół białej pułapki
BleachAce Hardware lub lokalny sklepPobieranie próbek gleby, dezynfekcja
Podchloryn soduAce Hardware lub lokalny sklepPobieranie próbek gleby, dezynfekcja
70% alochol etylowyAAPER17212945Pobieranie próbek gleby, dezynfekcja
ŁopatyAce Hardware lub lokalny sklep z narzędziamiNie dotyczyPobieranie próbek gleby
Próbnik rurowyAccuproductsPobieranie próbek gleby
Sonda gleby, długa rękojeśćNupla PRB4T 69401 KlasycznyPobieranie próbek gleby
Taśma mierniczaAce Hardware lub lokalny sklepPobieranie próbek gleby
Taśma flagująca, różne koloryAce Hardware lub lokalny sklepPobieranie próbek gleby
Kolby do hodowli tkankowychVWRFalcon, 29185-304 Biała pułapka, kolekcja EPN
Butelki do mycia, polietylenowe, szerokie otworyVWR16650-107Biała syfon, kolekcja EPN
z narzędziami z narzędziami z narzędziami z narzędziami z narzędziami

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bedding, R. A., Akhurst, R. J. A simple technique for the detection of insect parasitic rhabditid nematodes in soil. Nematologica. 21, 109-110 (1975).
  2. Boemare, N. E., Akhurst, R. A. The Genera Photorhabdus and Xenorhabdus. In The Prokaryotes. Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. -H., Stackebrandt, E. , Springer. New York, N.Y. 473-488 (2007).
  3. Gaugler, R. Entomopathogenic Nematology. , CABI Publishing. Wallingford, UK. (2002).
  4. Gaugler, R., Kaya, H. K. Entomopathogenic Nematode s in Biological Control. , CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida. (1990).
  5. Hazir, S., Keskin, N., Stock, S. P., Kaya, H. K., Özcan, S. Diversity and distribution of entomopathogenic nematodes (Rhabditida: Steinernematidae and Heterorhabditidae) in Turkey. Biodiversit., & Conservation. 12, 375-386 (2003).
  6. Kaya, H. K., Gaugler, R. Entomopathogenic nematodes. Annual Review of Entomology. 38, 181-206 (1993).
  7. Kaya, H. K., Stock, S. P. Techniques in insect nematology. In Manual of techniques in insect pathology. , Academic Press. London. 281-324 (1997).
  8. Lacey, L. A. Manual of techniques in invertebrate pathology. , Academic Press. London. (2012).
  9. McCoy, C. W., Shapiro-Ilan, D., Duncan, L., Nguyen, K. Entomopathogenic nematodes and other natural enemies as mortality factors for larvae of Diaprepes abbreviatus (Coleoptera: Curculionidae). Biological Control. 19, 182-190 (2000).
  10. Meyling, N. V., Eilenberg, J. Occurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, ecosystem., & environment. 113, 336-341 (2006).
  11. Poinar, G. O. Taxonomy and biology of Steinernematidae and Heterorhabditidae. In: Entomopathogenic Nemtaodes in Biological. , CRC Press. Boca Raton. 23-61 (1990).
  12. Stock, S. P., Gress, J. C. Diversity and phylogenetic relationships of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae) from the Sky Islands of southern Arizona. Journal of invertebrate pathology. 92, 66-72 (2006).
  13. Stock, S. P., Hunt, D. J. Nematode morphology and systematics. Nematodes as biological control agents. CAB International Publishing. Grewal, P. S., Ehlers, R. U., Shapiro-Ilan, D. I. , CAB International Publishing. Wallingford, UK. 3-43 (2005).
  14. Stock, S. P., Goodrich–Blair, H. Entomopathogenic nematodes and their bacterial symbionts: The inside out of a mutualistic association. Symbiosis. 46, 65-75 (2008).
  15. Stuart, R. J., Gaugler, R. Patchiness in populations of entomopathogenic nematodes. Journal of Invertebrate Pathology. 64, 39-45 (1994).
  16. White, G. F. A method for obtaining infective nematode larvae from cultures. Science. 66, 302-303 (1927).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Technika wabienia owad wzmodyfikowana pu apka White aizolacja nicieniustanawianie hodowli nicienimetoda rozcie cze seryjnychszacowanie populacji nicieniodzysk martwych owad w

Powiązane artykuły