Aby przeanalizować profile ekspresji genów sercowych podczas rozwoju serca danio pręgowanego, należy wyekstrahować całkowite RNA z izolowanych serc. W tym miejscu przedstawiamy protokół pobierania funkcjonalnych/bijących serc poprzez szybką ręczną sekcję z zarodków danio pręgowanego w celu uzyskania mRNA specyficznego dla serca.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wielkoskalowa sekcja embrionalnego serca danio pręgowanego do analizy transkrypcyjnej
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Serce embrionalne danio pręgowanego składa się tylko z kilkuset komórek, reprezentujących tylko mały ułamek całego zarodka. Dlatego, aby zapobiec maskowaniu transkryptomu serca przez globalny transkryptom embrionalny, konieczne jest zebranie wystarczającej liczby serc do dalszych analiz. Ponadto, ponieważ rozwój serca danio pręgowanego przebiega szybko, metody pobierania serca i ekstrakcji RNA muszą być szybkie, aby zapewnić jednorodność próbek. W tym miejscu przedstawiamy protokół szybkiej ręcznej sekcji do zbierania funkcjonalnych/bijących serc z zarodków danio pręgowanego. Jest to niezbędny warunek wstępny dla późniejszej ekstrakcji RNA specyficznego dla serca w celu określenia poziomów ekspresji genów specyficznych dla serca za pomocą analiz transkryptomu, takich jak ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-qPCR). Metoda opiera się na zróżnicowanych właściwościach adhezyjnych serca zarodka danio pręgowanego w porównaniu z innymi tkankami; Pozwala to na szybkie fizyczne oddzielenie tkanki serca od tkanki pozasercowej poprzez połączenie rozerwania płynnej siły ścinającej, stopniowej filtracji i ręcznego pobierania transgenicznych fluorescencyjnie znakowanych serc.
Wprowadzenie
Danio rerio) jest szeroko stosowany w biologii rozwojowej do badania organogenezy in vivo ze względu na szybki, przejrzysty i pozamaciczny rozwój embrionalny, w połączeniu z niewielkimi rozmiarami i dostępnością transgenicznych linii reporterowych z tkankowo specyficzną ekspresją białek fluorescencyjnych. Ten mały kręgowiec jest szczególnie dobrze przystosowany do badania rozwoju serca, ponieważ natlenienie wczesnego zarodka danio pręgowanego nie zależy od bicia serca i przepływu krwi; Cechy te pozwoliły na scharakteryzowanie dużej liczby mutantów sercowo-naczyniowych1,2, a danio pręgowany jest obecnie powszechnie uznanym organizmem modelowym do badania chorób serca3.
Aby badać ekspresję genów podczas rozwoju embrionalnego, transkrypty są często analizowane za pomocą hybrydyzacji in situ (WISH)4, RT-qPCR5, mikromacierzy6 lub sekwencjonowania nowej generacji (RNA-Seq)7. Podczas gdy WISH pozwala na przestrzenno-czasową analizę ekspresji genów w całym zarodku, poziomy transkryptów są zwykle oceniane za pomocą RT-qPCR, mikromacierzy lub metod sekwencyjnych RNA. Metody te wymagają jednak wzbogacenia tkanek w celu specyficznego profilowania ekspresji genów.
Ponieważ embrionalne serce danio pręgowanego stanowi mały ułamek całego zarodka, badania transkryptomu podczas rozwoju serca wymagają protokołu do sekcji i wzbogacania serc. Ponadto, aby uzyskać fizjologicznie istotne dane, ważne jest, aby utrzymać w pełni funkcjonalną tkankę serca do momentu ekstrakcji RNA. W tym miejscu opisujemy protokół szybkiej izolacji fizjologicznie prawidłowych i bijących serc z setek zarodków danio pręgowanego w celu skutecznego uzyskania wysokiej jakości próbek RNA do dalszych analiz. Obecna metoda opiera się na protokole opisanym przez Burnsa i MacRae, 20068. Do wzbogacania tkanki serca obie metody wykorzystują transgeniczną linię reporterową mięśnia sercowego i wykorzystują zróżnicowane właściwości adhezyjne embrionalnych serc danio pręgowanego w porównaniu z innymi tkankami. Krótko mówiąc, poprzez pipetowanie wielu zarodków w górę i w dół przez wąską końcówkę pipety, serca są jednocześnie uwalniane z ciał embrionalnych, a następnie oddzielane od szczątków embrionalnych w dwóch szybkich etapach filtracji; Serca znakowane fluorescencyjnie są następnie ręcznie sortowane z pozostałych zanieczyszczeń i zbierane do dalszej obróbki.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Ten protokół jest zgodny z wytycznymi niemieckiego i berlińskiego prawa krajowego dotyczącymi opieki nad zwierzętami; postępowanie z danio pręgowanym było monitorowane przez lokalne władze ochrony zwierząt (LaGeSo, Berlin-Brandenburgia).
1. Pozyskiwanie zarodków danio pręgowanego do ekstrakcji serca
- Krzyżówka reporterowa danio pręgowanego, taka jak transgeniczna linia9 Tg(myl7:EGFP)twu34 w celu uzyskania zarodków z ekspresją GFP specyficzną dla serca.
- Utrzymać zarodki w wodzie jajowej w temperaturze 28,5 °C do pożądanego stadium embrionalnego10,11. Należy zapewnić, aby pobrana populacja zarodków była jednorodna zarówno pod względem genetycznym, jak i pod względem etapu rozwoju, aby ograniczyć różnice w ekspresji genów.
- Ręcznie odkorówkować zarodki.
2. Sekcja embrionalnych serc danio pręgowanego
UWAGA: Wszystkie roztwory należy przechowywać na lodzie. Jeśli to możliwe, wykonuj pracę zespołową: jedna osoba preparuje serca z zarodków, podczas gdy inna osoba sortuje serca pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym. Pozwala to na przetworzenie kilkuset zarodków w ciągu kilku godzin.
- Przenieś około 100 zarodków do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Znieczulić zarodki trikainą (0,16 mg/ml w pożywce E3). Kontynuuj, gdy zarodki zostaną wyraźnie znieczulone (nie pływają i osadzają się na dnie rurki, ale ich serca nadal biją).
- Usunąć roztwór tricainy/E3 i raz umyć zarodki 1 ml pożywki L-15/10% FBS i utrzymać na lodzie.
UWAGA: Pożywka L-15/10% FBS jest ważna dla utrzymania narządów i komórek przy życiu podczas całej procedury preparacji, dopóki serca nie zostaną przeniesione do RNAlater lub Trizolu. - Dodaj 1 ml pożywki L-15/10% FBS do zarodków i pipetuj w górę i w dół 5-8 razy za pomocą okrągłej końcówki ładującej żel, aż żółtko zostanie całkowicie rozerwane. Pipetować zarodki kroplami na powierzchnię roztworu, tak aby kropla pękła, a zarodki zostały delikatnie przerwane.
UWAGA: To, jak energicznie i jak często należy pipetować zarodki w górę i w dół, zależy od etapu rozwoju zarodków, tj. w późnych stadiach (np. przy 56 hpf) potrzebne jest większe pipetowanie. - W przypadku pierwszej partii wypreparowanych zarodków należy ocenić integralność zarodków i proporcję wypreparowanych serc pod mikroskopem stereoskopowym, ponieważ niektóre serca mogą pozostać przyczepione do zarodków, jeśli zostaną zbyt delikatnie pipetowane. Odpowiednio dostosować sposób pipetowania do następnych rund sekcji.
UWAGA: Używaj końcówek do pipet o niskiej retencji i probówek do mikrowirówek, aby zminimalizować przywieranie serc do plastiku. - Umieścić próbkę na filtrze 100 μm umieszczonym w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml; przepłukać probówkę o pojemności 1,5 ml 1 ml pożywki L-15/10% FBS, a następnie nałożyć ją na filtr w celu zminimalizowania strat próbki (niektóre serca mogą przyklejać się do ścianek probówki). Umyj filtr dwukrotnie 1 ml L-15/10% FBS. Na tym etapie serca przechodzą przez filtr i są zbierane w probówce o pojemności 50 ml.
- Nanieść przepływowy filtr na filtr 30 μm umieszczony na probówce wirówkowej o pojemności 15 ml i przepłukać filtr raz 1 ml pożywki L-15/10% FBS. W tym drugim etapie filtracji serca są zatrzymywane w filtrze, a mniejsze zanieczyszczenia są zmywane.
- Odwróć filtr do góry nogami i wypłucz serca z filtra do pokrytej 1% agarozą szalki Petriego, stosując trzy kolejne płukania 1 ml L-15/10% FBS.
- Ręcznie oddzielić serca GFP-dodatnie od niefluorescencyjnych szczątków embrionalnych (np. soczewek oczu) za pomocą kleszczy pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym i skoncentrować je w środku naczynia. Zbierz je zgodnie z krokiem 3.
UWAGA: Jeśli zarodki są starsze niż 24 hpf, serca powinny bić, co wskazuje, że tkanki są nadal fizjologicznie normalne.
3. Izolowanie mRNA z wypreparowanych serc
- Zebrać serca w jak najmniejszej objętości (np. 10 μl) i odpipetować do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 0,75 ml RNAlater (na lodzie). Sprawdź, czy w końcówce pipety nie pozostały żadne serca, wyświetlając je pod stereoskopowym mikroskopem fluorescencyjnym.
- Alternatywnie, jeśli w bezpośrednim sąsiedztwie mikroskopu fluorescencyjnego dostępny jest kaptur chemiczny, należy przenieść zebrane serca do Trizolu (UWAGA) pod kapturem chemicznym. Pozwala to uniknąć ewentualnej utraty serc przyklejających się do końcówki pipety, a także podczas wirowania serc (kroki 3.4, 3.5 i 3.7). Zebrać serca z kilku rund izolacji w tej samej probówce z lekiem Trizol i przejść bezpośrednio do kroku 3.8; końcowa objętość nie powinna przekraczać 10% pierwotnej objętości Trizolu.
UWAGA: Przed użyciem należy zapoznać się z Kartą Charakterystyki Substancji Niebezpiecznej (MSDS) firmy Trizol. Odczynnik Trizol należy obchodzić pod kapturem i nosić zalecane środki ochrony osobistej. Unikać kontaktu ze skórą, oczami i odzieżą. Usuń wszystkie źródła zapłonu. - Połącz serca z kilku rund izolacji w tej samej probówce z RNAlater (na lodzie), ponieważ skuteczność izolacji RNA poprawia się wraz z ilością zebranej tkanki. Jeśli całkowita objętość próbki przekracza 10% pierwotnej objętości RNAlater, należy użyć dodatkowej probówki z 0,75 ml RNAlater do przechowywania (na lodzie).
- Odwirować próbki o masie 15 700 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia serc.
- Pod stereoskopowym mikroskopem fluorescencyjnym ostrożnie zebrać jak najwięcej supernatantu na pokrytą 1% agarozą szalkę Petriego, zawierającą 3 ml pożywki L-15/10% FBS, ale nie należy naruszać osadzonych serc na dnie probówki wirówkowej. Ponieważ do 15% serc może pozostać w supernatancie ze względu na wysoką lepkość RNAlater, należy je pobrać w sposób opisany w kroku 3.7.
- Pod kapturem chemicznym dodaj 0,5 ml Trizolu do probówki zawierającej osadzone serca i trzymaj na lodzie.
- Pod mikroskopem fluorescencyjnym przenieść serca (z kroku 3.5) z 1% naczynia pokrytego agarozą zawierającego roztwór RNAlater/L-15/10% FBS do innego naczynia pokrytego 1% agarozą z 3 ml L-15/10% FBS w celu rozcieńczenia RNAlater. Zbierz serca na środku szalki Petriego i przenieś je w małej objętości do probówki z osadzonymi sercami w Trizol pod kapturem chemicznym.
- Wprowadzić wir w probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej serca w leku Trizol w celu rozbicia serc i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Pod kapturem chemicznym dodać 100 μl chloroformu (UWAGA), dokładnie wymieszać i przenieść roztwór Trizol/chloroform do 1,5 ml wstępnie odwirowanej probówki PLG (przed użyciem odwirować 30 sekund z maksymalną prędkością). Inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
UWAGA: Przeczytaj kartę charakterystyki chloroformu przed użyciem. Z odczynnikiem chloroformowym należy obchodzić się pod maską i nosić zalecane środki ochrony osobistej. Unikać kontaktu ze skórą, oczami i odzieżą. Przechowywać z dala od niekompatybilnych substancji, takich jak metale, zasady. - Odwirować próbkę o masie 15 700 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i przenieść fazę wodną do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
- Dodać 5-10 μg glikogenu i 250 μl wstępnie schłodzonego (w temperaturze -20 °C) izopropanolu; dobrze wymieszać i inkubować przez noc w temperaturze -20 °C.
- Odwirować próbkę o masie 15 700 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
- Przemyć osad 1 ml 75% etanolu, odwirować przy 15 700 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
- Pozwól etanolowi odparować, susząc granulkę w temperaturze pokojowej, aż stanie się biała (np. przez 10-15 minut).
- Dodać 20 μl ddH2O wolnych od RNaz do osadu i inkubować przez 10-15 minut w temperaturze 55 °C w celu rozpuszczenia RNA; następnie przechowywać na lodzie.
- Ocenić stężenie i czystość RNA za pomocą pomiaru absorbancji. Oceń integralność RNA, umieszczając próbkę na 1% żelu agarozowym.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W niniejszej pracy opisujemy reprezentatywny eksperyment z wycinania serca z wykorzystaniem transgenicznej linii zebrafish Tg(myl7:GFP)twu349, która wykazuje ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) wyłącznie w mięśniu sercowym (Ryc. 1). Zebraliśmy zarówno wycięte serca, jak i embriony, z których one pochodziły, aby ocenić czystość próbki serca. W skrócie, homozygotyczne zebrafish Tg(myl7:GFP)twu349 krzyżowano z osobnikami typu dzik...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten pozwala na szybkie wzbogacenie embrionalnej tkanki serca danio pręgowanego do analiz ekspresji genów. Ilość i jakość próbki RNA specyficznej dla serca zależy w dużej mierze od kilku kluczowych kroków: po pierwsze, ilość próbki jest znacznie lepsza, jeśli zapobiega się utracie serca na każdym etapie protokołu, ponieważ oczyszczanie RNA będzie działać tylko przy wystarczającej ilości materiału wyjściowego. Po drugie, czystość próbki, która zależy całkowicie od eksperymentatora, jest określana przez sortowanie ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować C. Burnsowi, C. McRae za nakreślenie podstawowej zasady tego protokołu oczyszczania oraz F. Prillerowi za wstępne wdrożenie tej metody w naszym laboratorium. S.A.-S. jest wspierany przez profesurę Heisenberga w Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Prace te były wspierane przez DFG grant SE2016/7-1.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sprzęt do hodowli ryb i zbierania jaj | Szczegółowe informacje można znaleźć w Księdze Zebrafish11 | ||
| Stereoskop | |||
| Mikrowirówka | |||
| Spektrofotometr | UVnp. Thermo Scientific Nanodrop 2000 | ||
| Komora | |||
| do elektroforezy kwasów nukleinowychszalki Petriego 4 cm & Oslash;, pokryte 1% agarozą w pożywce | |||
| Mikropipety i końcówki (P20, P100, P1000) | |||
| Probówki wirówkowe 1,5 ml 15 | |||
| ml i 50 ml Para | |||
| kleszczyków | |||
| Dumont #5ExactaCruz&handel; Okrągłe końcówki do ładowania żelu w sterylnym stojaku, 1-200 i mu; l | Santa Cruz | sc-201732 | |
| 100 μ m filtr (BD Falcon 100 mm Cell Strainer) | BD Biosciences | 352360 | |
| 30 μ m filtr (Filtry wstępnej separacji-30 i mikro; m) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Żel do synchronizacji fazy, ciężki, tubki 1,5 ml | Prime | 2302810 | |
| Podłoże | 60 μ g/ml Rozpuszczalne sól oceaniczna w ddH2O, 0,00001% (w/v) Błękit metylenowy | ||
| E3 średni | 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4 | ||
| Trikaina (kwas 3-aminobenzoesowyetyloester) | Sigma-Aldrich | A-5040 | 4 mg/ml roztwór podstawowy trikainy, pH 7 |
| 1% agarozy (w pożywce E3) | |||
| 1% żelu agarozowym (w buforze TBE) | |||
| Leibovitz´ s L-15 średni | Gibco | 21083-027 | |
| FBS (Surowica bydlęca płodu) | Sigma | F4135 | |
| RNAlater | Ambion | AM7020 | |
| Trizol | Ambion | 1559606 | |
| glikogen | Invitrogen | 10814-010 | 20 &mikro; g/&mikro; l w wodzie wolnej od RNaz |
| chloroform | |||
| izopropanol | |||
| 75% etanolu (w DEPC-ddH2O) | |||
| Woda wolna od nukleaz lub sterylizowana DDH2O | |||
| Bufor | |||
| Bufor TBE (Tris / Boran / EDTA) do elektroforezy |
Bibliografia
- Stainier, D. Y., et al. Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo. Development. 123, 285-292 (1996).
- Chen, J. N., et al. Mutations affecting the cardiovascular system and other internal organs in zebrafish. Development. 123, 293-302 (1996).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc Res. 91, 279-288 (2011).
- Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends Genet. 10, 73-74 (1994).
- Gibson, U. E., Heid, C. A., Williams, P. M. A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res. 6, 995-1001 (1996).
- Epstein, C. B., Butow, R. A. Microarray technology - enhanced versatility, persistent challenge. Curr Opin Biotechnol. 11, 36-41 (2000).
- Qian, X., Ba, Y., Zhuang, Q., Zhong, G. RNA-Seq Technology and Its Application in Fish Transcriptomics. OMICS. 18, 98-110 (2014).
- Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. Biotechniques. 40, 274-278 (2006).
- Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th, University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Veerkamp, J., et al. Unilateral dampening of Bmp activity by nodal generates cardiac left-right asymmetry). Dev Cell. 24, 660-667 (2013).
- Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
- Brownlie, A., et al. Characterization of embryonic globin genes of the zebrafish. Dev Biol. 255, 48-61 (2003).
- Marvin, M., et al. Developmental expression patterns of the zebrafish small heat shock proteins. Dev Dyn. 237, 454-463 (2008).
- Lam, C. S., Marz, M., Strahle, U. gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish brain. Dev Dyn. 238, 475-486 (2009).
- Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
- Heiman, M., et al. A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types. Cell. 135, 738-748 (2008).
- Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish. Genesis. 51, 187-192 (2013).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
