Synteza immunoukierunkowanych magnetoplazmonicznych nanoklastrów

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokół syntezy magneto-plazmonicznych nanocząstek o silnym momencie magnetycznym i silnej absorbancji bliskiej podczerwieni (NIR). Protokół obejmuje również koniugację przeciwciał z nanocząstkami za pomocą ugrupowania Fc do różnych zastosowań biomedycznych, które wymagają specyficznego celowania molekularnego.

Streszczenie

Właściwości magnetyczne i plazmoniczne połączone w jednej nanocząsteczce zapewniają synergię, która jest korzystna w wielu zastosowaniach biomedycznych, w tym w zwiększaniu kontrastu w nowatorskich metodach obrazowania magnetomotorycznego, jednoczesnym wychwytywaniu i wykrywaniu krążących komórek nowotworowych (CTC) oraz multimodalnym obrazowaniu molekularnym połączonym z terapią fototermiczną komórek nowotworowych. Zastosowania te wzbudziły duże zainteresowanie opracowaniem protokołów syntezy nanocząstek magnetoplazmonicznych o absorbancji optycznej w zakresie bliskiej podczerwieni (NIR) i silnym momencie magnetycznym. W tym miejscu przedstawiamy nowatorski protokół syntezy takich hybrydowych nanocząstek, który opiera się na metodzie mikroemulsji typu olej w wodzie. Unikalną cechą opisanego w niniejszym dokumencie protokołu jest synteza magnetoplazmonicznych nanocząstek o różnych rozmiarach z bloków pierwotnych, które również mają charakterystykę magnetoplazmoniczną. W wyniku tego podejścia uzyskuje się nanocząstki o dużej gęstości funkcji magnetycznych i plazmonicznych, które są równomiernie rozmieszczone w całej objętości nanocząstki. Hybrydowe nanocząstki można łatwo funkcjonalizować poprzez przyłączanie przeciwciał przez ugrupowanie Fc, pozostawiając część Fab odpowiedzialną za wiązanie antygenu dostępną do celowania.

Wprowadzenie

Hybrydowe nanocząstki składające się z różnych materiałów o różnych właściwościach fizykochemicznych mogą otworzyć nowe możliwości w zastosowaniach biomedycznych, w tym w multimodalnym obrazowaniu molekularnym, dostarczaniu i monitorowaniu terapii, nowych badaniach przesiewowych i testach diagnostycznych^1-3. Połączenie właściwości plazmonicznych i magnetycznych w pojedynczej nanocząstce jest szczególnie interesujące, ponieważ zapewnia bardzo silne przekroje czynne rozpraszania i absorpcji światła związane z rezonansami plazmonów i reakcją na pole magnetyczne. Na przykład nanocząstki magnetoplazmoniczne wykorzystano do zwiększenia kontrastu w obrazowaniu znakowanych komórek w ciemnym polu poprzez zastosowanie czasowej modulacji sygnału za pomocą zewnętrznego elektromagnesu^3-5. Niedawno podobną zasadę zastosowano przy opracowywaniu nowej metody obrazowania – obrazowania magnetofotoakustycznego, w którym magnetoplazmoniczne nanocząstki umożliwiają znaczną poprawę kontrastu i stosunku sygnału do tła^6,7. Wykazano również, że hybrydowe nanocząstki mogą być wykorzystywane do jednoczesnego wychwytywania i wykrywania krążących komórek nowotworowych we krwi pełnej i in vivo^8,9. Ponadto nanocząstki magnetoplazmoniczne są obiecującymi środkami teranostycznymi, które mogą być stosowane do molekularnego obrazowania optycznego i MR w połączeniu z terapią fototermiczną komórek nowotworowych¹⁰.

Rozważano kilka podejść do syntezy magneto-plazmonicznych nanocząstek. Na przykład Yu i in. wykorzystali rozkład i utlenianie Fe(CO)₅ na nanocząstkach złota, aby utworzyć podobne do hantli dwufunkcyjne nanocząstki Au-Fe₃O₄ ¹¹. Wang i in. zsyntetyzowali pokrytą złotem nanocząstkę tlenku żelaza przy użyciu metody rozkładu termicznego¹². Niektóre inne podejścia polegają na powlekaniu funkcjonalnych cząsteczek polimerowych lub aminowych nanocząstkach rdzenia magnetycznego, a następnie osadzaniu złotej powłoki na powierzchni polimeru w celu wytworzenia cząstek hybrydowych^7,13. Ponadto nanocząstki tlenku żelaza przyłączono do nanoprętów złota poprzez oddziaływania elektrostatyczne lub reakcję chemiczną^14,15. Chociaż podejścia te prowadzą do powstania magneto-plazmonicznych nanostruktur, w pewnym stopniu pogarszają one właściwości kombinacji magneto-plazmonicznej, takie jak absorbancja optyczna w oknie bliskiej podczerwieni (NIR) lub silny moment magnetyczny, które są bardzo pożądane w zastosowaniach biomedycznych. Na przykład nanocząstki hantli Au-Fe₃O₄ mają pik rezonansu plazmonowego przy 520 nm, co ogranicza ich użyteczność in vivo ze względu na wysokie zmętnienie tkanek w tym zakresie widmowym. Co więcej, magnetoplazmoniczne nanocząstki wytwarzane przez obecne protokoły są ograniczone do zaledwie jednej¹¹ lub kilku (mniej niż 10)^14,15 cząstek superparaparamagnetycznych (np. nanocząstek tlenku żelaza), co jest znacznie mniejszą liczbą niż można osiągnąć w gęsto upakowanej nanostrukturze. Na przykład gęsto upakowana sferyczna nanocząstka o średnicy 60 nm może zawierać około tysiąca superparaparamagnetycznych nanocząstek o długości 6 nm. W związku z tym istnieje duże pole do poprawy właściwości magnetycznych hybrydowych nanocząstek. Co więcej, niektóre z wcześniej opisanych protokołów są stosunkowo złożone i wymagają starannej optymalizacji w celu uniknięcia agregacji cząstek podczas syntezy^14,15.

Tutaj opisujemy protokół syntezy magneto-plazmonicznych nanocząstek o silnym momencie magnetycznym i silnej absorbancji NIR, który rozwiązuje główne ograniczenia obecnej techniki. Synteza ma swoje początki w metodzie mikroemulsji olej^{w wodzie 16}. Opiera się na składaniu nanocząstek o pożądanej wielkości ze znacznie mniejszych cząstek pierwotnych. Podejście to zostało z powodzeniem wykorzystane do wytworzenia nanostruktur z pojedynczego materiału, takiego jak złoto, tlenek żelaza i półprzewodnikowe cząstki pierwotne¹⁶. Rozszerzyliśmy go o syntezę nanocząstek magnetoplazmonicznych, najpierw wytwarzając cząstki złotej powłoki / rdzenia z tlenku żelaza o średnicy 6 nm, a następnie łącząc pierwotne cząstki hybrydowe w ostateczną sferyczną nanostrukturę. Łączenie cząstek pierwotnych w nanoklastry nie tylko pozwala na poprawę właściwości nanocząstek składowych, takich jak osiągnięcie silniejszego momentu magnetycznego przy zachowaniu właściwości superparamagnetycznych, ale także wykorzystuje interakcje między poszczególnymi nanocząstkami, tworząc w ten sposób nowe cechy nieobecne w nanocząstkach składowych, takie jak silna absorbancja optyczna w oknie NIR. W wyniku tego protokołu powstają hybrydowe nanocząstki o dużej gęstości funkcji magnetycznych i plazmonicznych. Po zsyntetyzowaniu cząstek pierwotnych nasza metoda jest zasadniczo prostą reakcją jednogarnkową. Ogólna siła rezonansu plazmonu i moment magnetyczny są określane przez szereg cząstek pierwotnych i dlatego można je łatwo zoptymalizować w zależności od zastosowania. Ponadto opracowaliśmy również procedurę koniugacji przeciwciał z hybrydowymi nanocząstkami do różnych zastosowań biomedycznych, które wymagają specyficznego celowania molekularnego. Przeciwciała są przyłączane przez ugrupowanie Fc, pozostawiając część Fab, która jest odpowiedzialna za wiązanie antygenu, dostępną do celowania.

Protokół

1. Oprzyrządowanie i przygotowanie szkła

1. Nosić odpowiedni sprzęt ochronny, tj. fartuch laboratoryjny, rękawice jednorazowe i okulary ochronne.
2. Podłączyć kolbę okrągłodenną do skraplacza i zanurzyć ją w kąpieli oleju silikonowego z monitorowaniem temperatury za pomocą termometru. Umieść źródło ciepła (np. płytę grzejną) pod kąpielą olejową (Rysunek 1). Użyć termometru zdolnego do pomiaru temperatury wyższej niż 260 °C.

2. Synteza pierwotnych hybrydowych magneto-plazmonicznych nanocząstek

1. Wytwarzanie nanocząstek rdzenia magnetycznego
   1. Do kolby okrągłodennej dodać 353,2 mg (1 mmol) acetyloacetonianu żelaza(III), 1 ml (2 mmol) kwasu oleinowego, 1 ml (2 mmol) oleylaminy, 1,292 g (5 mmol) 1,2-heksadekanodiolu i 10 ml eteru fenylowego.
   2. Mieszaninę energicznie wymieszać za pomocą mieszadła magnetycznego i podgrzewać do temperatury 250-260 °C przez 1 godzinę pod chłodnicą zwrotną. Następnie poczekaj, aż roztwór ostygnie do temperatury pokojowej. Upewnij się, że temperatura jest niższa niż 260 °C, aby zapobiec wrzeniu eteru fenylowego i zapobiec pęknięciu mieszaniny reakcyjnej z kolby okrągłodennej do skraplacza.
      ostrożność: Mieszanina reakcyjna jest bardzo gorąca, a chemikalia mogą powodować podrażnienie. Musi pracować pod wyciągiem i nosić odpowiednie środki ochrony osobistej. Zapewnić odpowiednią wentylację kąpieli olejowej.
      UWAGA: Kąpiel olejowa jest utrzymywana w temperaturze 250-260 ºC przez 1 godzinę podczas syntezy nanocząstek magnetycznych. Zasadniczo do tego celu można użyć szklanego naczynia Pyrex. Jednak maksymalna ciągła temperatura dla szkła Pyrex wynosi ~260 ºC zgodnie z informacjami od dostawcy. Dlatego metalowy pojemnik stanowi bezpieczniejszą opcję dla reakcji, ponieważ może wytrzymać wyższą temperaturę i trwać dłużej podczas wielu przebiegów.
2. Osadzanie złotej powłoki na nanocząstkach rdzenia magnetycznego
   1. Do kolby okrągłodennej dodać 411,5 mg (1,1 mmol) octanu złota, 0,25 ml (0,75 mmol) kwasu oleinowego, 1,5 ml (3,0 mmol) oleyloaminy, 775,3 mg (3 mmol) 1,2-heksadekanodiolu i 15 ml eteru fenylowego.
   2. Dodać 5 ml zawiesiny nanocząstek magnetycznych z kroku 2.1. Podgrzać mieszaninę reakcyjną do temperatury 180 °C i przechowywać pod chłodnicą zwrotną przez 1 godzinę. Poczekaj, aż roztwór ostygnie do RT.
   3. Dodać 50 ml etanolu w celu wytrącenia pierwotnych nanocząstek hybrydowych, a następnie odwirować w stężeniu 3 250 × g przez 15 minut.
   4. Zawiesić osad w 25 ml heksanu za pomocą sonografu do kąpieli. Dodać 25 ml etanolu, aby wytrącić pierwotne nanocząstki hybrydowe. Odwirować przy 3 250 x g przez 15 minut i ponownie zawiesić osad w heksanie. Powtórz ten krok trzy razy.
   5. Wysuszyć wytrącone pierwotne nanocząstki hybrydowe w eksykatorze próżniowym O/N. Upewnić się, że cząstki są całkowicie suche.

3. Hybrydowe magneto-plazmoniczne nanoklastry synteza i separacja wielkości

1. Zawiesić 5 mg suchych pierwotnych nanocząstek hybrydowych w 1 ml heksanu za pomocą sonografu do kąpieli. Sonikować zawiesinę nanocząstek, aż nie będzie widoczny osad.
2. Dodać roztwór z kroku 3.1 do 10 ml wodnego roztworu dodecylosiarczanu sodu (2,8 mg/ml) do szklanej fiolki o pojemności 20 ml z dołączonymi nakrętkami. Dodawać zawiesinę pierwotnych nanocząstek hybrydowych kropla po kropli, aby uniknąć mieszania się dwóch faz przed następnym krokiem.
3. Sonikować roztwór dwufazowy w sonikatorze kąpielowym przez 2 godziny, a następnie ogrzewać w łaźni wodnej w temperaturze 80 °C przez 10 minut. Poczekaj, aż roztwór ostygnie do temperatury pokojowej.
   1. Napełnij wodę do linii poziomu roboczego kąpieli sonikacyjnej. Wyśrodkuj szklaną fiolkę w kąpieli sonikacyjnej. Bezpośrednio pomiędzy dwiema fazami tworzy się emulsja. Po rozpoczęciu sonikacji wstrząsnąć roztworem dwufazowym ręcznie; Ułatwia to mieszanie się fazy zawierającej pierwotne nanocząstki hybrydowe z dolną fazą wodną.
      UWAGA: Należy pamiętać, że sonikator nagrzeje się po 2 godzinach pracy.
4. Odwirować zawiesinę hybrydowego nanoklastra o sile 100 x g przez 30 minut. Zebrać zarówno osad, jak i supernatant. Zawiesić osad w 0,1 mM cytrynianu sodu w ciągu 10 minut sonikacji. Przewidywana wielkość nanoklastrów to średnica ~180 nm.
5. Przenieść supernatant z kroku 3.3 do nowej stożkowej probówki.
6. Odwirować zawiesinę z kroku 3.4 przy 400 x g przez 30 minut. Zebrać zarówno osad, jak i supernatant. Zawiesić osad w 0,1 mM cytrynianu sodu w ciągu 10 minut sonikacji. Przewidywana wielkość nanoklastrów to średnica ~130 nm.
7. Przenieść supernatant z kroku 3.5 do nowej stożkowej probówki.
8. Odwirować zawiesinę z kroku 3.6 przy 1,500 x g przez 30 minut. Zebrać osad i ponownie zawiesić w 0,1 mM cytrynianu sodu w ciągu 10 minut sonikacji. Przewidywana wielkość nanoklastrów to średnica ~90 nm.
9. Dodać zawiesinę nanoklastra o objętości 300 μl do 96-dołkowego czytnika mikropłytek w celu pomiaru widma absorpcyjnego UV-Vis-NIR. Upuść zawiesinę nanoklastra o objętości 10 μl na miedzianą siatkę pokrytą węglem w celu obrazowania TEM.

4. Koniugacja przeciwciał monoklonalnych z nanoklastrami

1. Przygotować 100 μl roztworu przeciwciał monoklonalnych (1 mg/ml) w PBS o pH 7,2, np. przeciwciała przeciwko receptorowi naskórkowego czynnika wzrostu 2 (HER2) lub przeciwciała przeciwko receptorowi naskórkowego czynnika wzrostu 1 (EGFR).
2. Dodać roztwór przeciwciała z kroku 4.1 do 3,9 ml 4 mM HEPES, pH 7.2. Odwirować roztwór przez filtr odśrodkowy 10 k MWCO przy 3 250 x g przez 20 minut w temperaturze 8 °C. Zawiesić przeciwciało w 4 mM HEPES, pH 7,2, do końcowej objętości 100 μl.
   UWAGA: Ten krok jest wykonywany w celu zastąpienia oryginalnych pożywek w roztworze przeciwciała HEPES.
3. Dodać 10 μl 100 mM NaIO₄ do 100 μl roztworu przeciwciał. Przykryj fiolkę reakcyjną folią aluminiową w temperaturze pokojowej i mieszaj przez 30 minut za pomocą wytrząsarki orbitalnej.
4. Ugasić reakcję, dodając 500 μl 1x PBS.
5. Dodać 2 μl 46,5 mM roztworu łącznikowego (ditiolaromatycznego PEG6-CONHNH₂) do roztworu przeciwciała z kroku 4.4 i wstrząsać przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
6. Przefiltrować roztwór za pomocą 10 k filtra wirówkowego MWCO przy 3,250 x g przez 20 minut w temperaturze 8 °C. Zawiesić przeciwciało w 1x PBS do końcowej objętości 100 μl, co prowadzi do stężenia przeciwciał ~1 mg/ml.
7. Mieszać 100 μl zawiesiny nanoklastrów przy średnicy zewnętrznej ~1,0 z 1 μl zmodyfikowanych przeciwciał z kroku 4.6 (1 mg / ml) przez 120 minut w temperaturze pokojowej.
8. Dodać 10 μl ^10-3 M 5 kDa tiolu PEG i wstrząsać przez 15 minut w temperaturze smojnej.
9. Odwirować roztwór o stężeniu 830 x g przez 3 minuty. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 μl 2% w/v 5 kDa PEG w PBS, pH 7,2.
10. Zmierz widmo absorbancji nanoklastrów sprzężonych z przeciwciałami i porównaj je z widmem absorbancji nagich nanoklastrów. Spodziewaj się przesunięcia ku czerwieni o kilka nanometrów po koniugacji.
11. Jeśli nanocząstki agregują się, jak pokazano na znacznym przesunięciu ze wzrostem średnicy zewnętrznej w obszarze czerwonego NIR, zwiększ stężenie tiolu PEG do 5 x ^10-3 M. Zwiększ również czas inkubacji z tiolem PEG do 30 minut i zmniejsz prędkość odśrodkową w krokach co 200 x g.
12. Do testu znakowania komórek rakowych dodaj sprzężone z przeciwciałami nanocząstki z kroku 4.9 do zawiesiny komórek rakowych w pożywce lub 1x PBS (1 ml ~ 10⁶ komórek) i mieszaj przez 60 minut.

Wyniki

Schemat syntezy immunotargetowanych nanogrup magnetyczno-plazmonicznych przedstawiono na Rysunku 2. W pierwszej kolejności, za pomocą metody rozkładu termicznego, syntetyzowane są magnetyczne nanocząstki tlenku żelaza Fe₃O₄. Następnie, poprzez rozkład termiczny, na rdzeniach z tlenku żelaza osadza się cienką powłokę złota o grubości ok. 1 nm. Pierwotne hybrydowe nanocząstki o rozmiarze ok. 6 nm służą jako zarodki do tworzenia nanogrup magnetyczno-plazmonicznych z w...

Dyskusja

Kluczowe kroki w udanej syntezie nanoklastrów magnetoplazmonicznych obejmują wytwarzanie wysoce monorozproszonych pierwotnych nanocząstek ze złotej powłoki/rdzenia tlenku żelaza oraz kierowanie samoorganizacją cząstek pierwotnych w nanoklastry. Stosunek molowy między cząstkami pierwotnymi a środkami powierzchniowo czynnymi odgrywa ważną rolę w określaniu rozkładu wielkości nanoklastrów. Niejednorodny rozkład wielkości pierwotnych nanocząstek może powodować powstawanie dużych agregatów podczas składania magnetoplazmoniczn...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kolba warzelna okrągłodenna PYREX 50 ml z krótką szyjką i jointem 24/40 [ST]	Corning	4320A-50	Reakcja rozkładu termicznego
PYREX 41 x 300 mm 5-żarówkowy skraplacz Allihn z 24/40 [ST] złączami zewnętrznymi/wewnętrznymi	Corning	2480-300	Reakcja rozkładu termicznego
Olej silikonowy	Fisher	S159-500	Kąpiel olejowa
Mieszadło z płytą grzejną	Corning	PC-351	Podgrzej reakton z funkcją mieszania
Termometr	ThermoWorks	221-092	Pomiar temperatury
Octan żelaza(III)	Fisher	AC11913-0250	Materiał do pierwotnej syntezy nanocząstek hybrydowych
Kwas oleinowy 99%	Fisher	A195-500	Materiał do pierwotnej syntezy nanocząstek hybrydowych
Octan złota(III)	Fisher	AA3974206	Materiał do pierwotnej syntezy nanocząstek hybrydowych
Hexane	Fisher	H292-1	Materiał do pierwotnej syntezy nanocząstek hybrydowych
Eter fenylowy 99%	Fisher	AC13060-0025	Materiał do syntezy pierwotnych nanocząstek hybrydowych
1,2-heksadekanodiol 90%	Sigma	213748-50G	Materiał do syntezy
pierwotnych nanocząstek hybrydowychOleiloamina 70%	Sigma	O7805-100G	Materiał do pierwotnej syntezy nanocząstek hybrydowych
Dodecylosiarczan sodu	Fisher	BP166-100	Synteza klastrowa
Cytrynian sodu dwuwodny	Sigma	W302600	Synteza klastrowa
Monoklonalne przeciwciało przeciwko receptorowi anty-EGF	Sigma	E2156	Test swoistości znakowania komórek
Monoklonalny anty-HER2 przeciwciało	Sigma	AMAB90627	Test swoistości znakowania komórek
Periodynian sodu	Sigma	311448	Oksydat Fc region przeciwciał
Ditiolaromatic PEG6-CONHNH2	SensoPath Technologies	SPT-0014B	Heterofunkcjonalny łącznik do koniugacji przeciwciał z nanoklastrami
Metoksy-PEG-tiol, 5 k	Creative PEGworks	PLS-604	Pasywacja pozostałej powierzchni złota po koniugacji przeciwciał
Jednostka filtra odśrodkowego Amicon Ultra-4 z membraną Ultracel-10	Millipore	UFC801008	Oczyszczanie białek
HEPES	Sigma	H3375	Bufor
PBS, 1x roztwór	Fisher	BP2438-20	Bufor
Spektroskopia UV-Vis	BioTek	Synergy HT	Wirówka do uzyskiwania widma
	Eppendorf	5810R	Separacja
Transmisja Mikroskop elektronowy	FEI	TECNAI G2 F20 X-TWIN	Uzyskaj morfologię nanostruktur
Mikroskop pionowy	Leica	DM6000	Uzyskaj obrazy ciemnego pola
Sonicator	Branson	1510	Sonikacja
Folia węglowa 300 mesh siatka	EMS	CF300-Cu	Obrazowanie TEM
96-dołkowa płytka	Corning	09-761-145	Płytka odczytowa UV-Vis