Artykuł metodologiczny

Identyfikacja miejsc interakcji białko-białko za pomocą macierzy peptydowych

DOI:

10.3791/52097

⸱

18 listopada 2014

 ,  , 
1Institute of Chemistry, The Hebrew University of Jerusalem

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie przesiewowe macierzy peptydowej to wysokoprzepustowy test do identyfikacji miejsc interakcji białko-białko. Pozwala to na mapowanie wielu interakcji białka docelowego i może służyć jako metoda identyfikacji miejsc dla inhibitorów, które celują w białko. Tutaj opisujemy protokół badania przesiewowego i analizy macierzy peptydowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interakcje białko-białko pośredniczą w większości procesów zachodzących w żywej komórce i kontrolują homeostazę organizmu. Upośledzone interakcje białkowe mogą prowadzić do choroby, co sprawia, że interakcje białkowe są ważnymi celami leków. Dlatego bardzo ważne jest zrozumienie tych interakcji na poziomie molekularnym. Interakcje białek są badane przy użyciu różnych technik, od testów komórkowych i biochemicznych po ilościowe testy biofizyczne, które można przeprowadzać zarówno z białkami o pełnej długości, z domenami białkowymi, jak i z peptydami. Peptydy służą jako doskonałe narzędzia do badania interakcji białek, ponieważ peptydy mogą być łatwo syntetyzowane i pozwalają skupić się na określonych miejscach interakcji. Macierze peptydowe umożliwiają identyfikację miejsc interakcji między dwoma białkami, a także badania przesiewowe w kierunku peptydów, które wiążą białko docelowe w celach terapeutycznych. Umożliwiają również wysokoprzepustowe badania SAR. W celu identyfikacji miejsc wiązania, typowa matryca peptydowa zwykle zawiera częściowo nakładające się na siebie peptydy o reszcie 10-20 pochodzące z pełnych sekwencji jednego lub więcej białek partnerskich pożądanego białka docelowego. Badania przesiewowe macierzy pod kątem wiązania białka docelowego ujawniają peptydy wiążące, odpowiadające miejscom wiązania w białkach partnerskich, w łatwy i szybki sposób przy użyciu tylko niewielkiej ilości białka.

W tym artykule opisujemy protokół do badania macierzy peptydowych w celu mapowania miejsc interakcji między docelowym białkiem a jego partnerami. Układ peptydowy został zaprojektowany w oparciu o sekwencje białek partnerskich z uwzględnieniem ich struktur drugorzędowych. Macierze użyte w tym protokole to matryce Celluspots przygotowane przez INTAVIS Bioanalytical Instruments. Macierz jest blokowana, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu, a następnie inkubowana z badanym białkiem. Wykrywanie za pomocą przeciwciała ujawnia peptydy wiążące odpowiadające specyficznym miejscom interakcji między białkami.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interakcje białko-białko pośredniczą w większości procesów zachodzących w żywej komórce. Upośledzone interakcje białkowe mogą prowadzić do choroby, co sprawia, że interakcje białkowe są ważnymi celami leków. Dlatego bardzo ważne jest zrozumienie tych interakcji na poziomie molekularnym. Interakcje białek są badane przy użyciu różnych technik, od testów komórkowych i biochemicznych po ilościowe testy biofizyczne, które można przeprowadzać zarówno z białkami o pełnej długości, z domenami białkowymi, jak i z peptydami. Peptydy służą jako doskonałe narzędzia do badania interakcji białek. Dzieje się tak dlatego, że peptydy mogą być łatwo syntetyzowane i pozwalają z jednej strony skupić się na określonym miejscu interakcji, a z drugiej strony na wielu celach białkowych w sposób wysokoprzepustowy1,2. Badania przesiewowe macierzy peptydowej to szybka i łatwa do wykonania metoda uzyskiwania dużej ilości danych na temat interakcji białka docelowego z wieloma partnerami w krótkim czasie3. W przeciwieństwie do innych biochemicznych lub biofizycznych metod wykrywania i analizowania interakcji białko-białko, badania przesiewowe macierzy peptydowej wymagają bardzo niskiego stężenia białka i mogą wykryć bardzo słabe wiązanie. Macierze peptydowe mogą być wykorzystywane do wielu zastosowań w interakcjach peptyd-białko, takich jak mapowanie miejsc interakcji białko-białko lub receptor-ligand4, interfejsy homo- lub heterooligomeryzacji, charakteryzowanie epitopów przeciwciał5, badanie aktywności enzymatycznej6 i wysokoprzepustowe badania zależności struktura-aktywność (SAR)7. Aby uzyskać dogłębny przegląd badań przesiewowych macierzy peptydowych, patrz Katz i wsp. 4

Obecnie istnieje kilka typów tablic peptydowych. Istnieją dwie główne strategie syntezy matryc peptydowych: synteza peptydów przed przyłączeniem ich do stałego nośnika lub synteza peptydów bezpośrednio na stałym nośniku, głównie przy użyciu techniki SPOT4,8. Peptydy są syntetyzowane na stałym podłożu, zwykle przez chemię 9-fluorenylometylokoksykarbonylową (Fmoc)8. Do powszechnych schematów syntetycznych należą przyłączanie peptydów przez koniec N (np. Tablice pepstarJPT 9) i przyłączanie peptydów przez koniec C (np. Tablice pepchip PEPSCAN10, tablice pepspot JPT9 i tablice celuloweINTAVIS 11)4. Stałe podłoże może się różnić, podobnie jak chemia sprzęgającego się z nim peptydu. Peptydy zakończone cysem mogą być przyłączane do szkiełek podstawowych za pośrednictwem grupy tiolowej12. Koniec N peptydu może być kowalencyjnie związany z grupą hydroksylową na błonie celulozowej poprzez estryfikację przyłączonego aminokwasu8.

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół badania macierzy peptydowych jako metody badania oddziaływań białko-białko. Tablica, której użyliśmy, to tablica Celluspots, która jest mikromacierzą zawierającą dużą ilość plamek (duplikatów do 384 plamek) na małej membranie celulozowej wspartej na szklanym szkiełku. Umożliwia to pracę z małymi ilościami białka i przeciwciał oraz uzyskanie znacznej ilości danych na pojedynczy eksperyment. Ta tablica zawiera również wysoką gęstość peptydów, która umożliwia wykrycie wiązania o niskim powinowactwie. Matryca została wykorzystana do mapowania interakcji STIL-CHFR, która jest bardzo ważna dla kontrolowania normalnej proliferacji komórek13. Niekontrolowana interakcja między tymi dwoma białkami może prowadzić do rozwoju raka. Mapując tę interakcję, znaleźliśmy specyficzne miejsce wiązania i reszty wiązania14. Otwiera to drogę do zaprojektowania racjonalnych inhibitorów, które hamują tę interakcję białko-białko.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projektowanie tablicy peptydowej

  1. Podziel sekwencję białka docelowego na częściowo nakładające się peptydy o reszcie 10-20. Róż stopień nakładania się na siebie w konkretnym eksperymencie i zasoby laboratorium, ale zasadniczo im dłuższe nakładanie się, tym lepiej. Projektując peptydy, należy wziąć pod uwagę znane drugorzędowe elementy struktury białka, które mogą być odpowiedzialne za interakcję.
  2. Zamów zaprojektowaną macierz peptydową za pośrednictwem komercyjnych dostawców. Tutaj użyj peptydów kowalencyjnie związanych z tablicą przez C-koniec.

2. Blokowanie niespecyficznego wiązania

  1. Przygotować 50 mM roztworu buforowego Tris lub fosforanu zawierającego 0,05% Tween 20 (TBST/PBST) i dostosować do żądanego pH za pomocą odmierzonej ilości HCl lub NaOH (w celu poznania dokładnej siły jonowej) i pożądanej siły jonowej za pomocą NaCl. Tutaj użyj pH 7,5 i siły jonowej 150 mM.
  2. Przygotować roztwór blokujący z 2,5% (w/v) odtłuszczonego mleka w proszku w TBST/PBST.
  3. Aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu, zanurzyć matrycę w 5 ml roztworu blokującego. Inkubować matrycę przez 2-4 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce.

3. Inkubacja z białkiem

  1. Przemyć układ najpierw 5 ml roztworu blokującego przez 30 sekund, a następnie dwukrotnie 5 ml TBST/PBST przez 5 minut na wytrząsarce w temperaturze pokojowej.
  2. Inkubować przemyty układ z 5 ml roztworu białka znakowanego His, zawierającego 2,5% (w/v) odtłuszczonego mleka w proszku, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu. W tym przypadku należy użyć 4,5 μM roztworu białkowego (STIL 500-650) rozpuszczonego w opisanym roztworze blokującym.
    UWAGA: Zwykle do badań przesiewowych używa się białka 5-10 μM, ale stężenie białka może wynosić nawet 2-3 μM, w zależności od powinowactwa wiązania i lokalnych stężeń peptydów, które wiążą się na macierzy (wydajność syntezy). Bufor do rozpuszczenia białka może się różnić, ale często rozcieńcza się białko przy użyciu tego samego roztworu blokującego, który opisano powyżej.
  3. Inkubować matrycę w roztworze białkowym przez 3-8 godzin w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.

4. Inkubacja z przeciwciałem

  1. Przemyć matrycę trzykrotnie 5 ml TBST/PBST. Pierwsze pranie trwa 30 sekund, a następnie dwa 5-minutowe prania na shakerze w temperaturze pokojowej.
  2. Inkubować przemytą matrycę z 5 ml rozcieńczonego przeciwciała sprzężonego z HRP (1:1,500) w buforze inkubacyjnym, który zawiera te same składniki w tych samych stężeniach co roztwór blokujący, przez 1 godzinę na wytrząsarce w temperaturze pokojowej. Przeciwciało może wiązać się zarówno z białkiem docelowym, jak i ze znacznikiem.
  3. Przeprowadzić eksperymenty kontrolne testujące oddziaływanie przeciwciała z peptydami na matrycy, zwłaszcza jeśli tablica zawiera peptydy z białka docelowego (np. do badań oligomeryzacji), powtarzając ten sam protokół bez kroku 3, inkubując z białkiem.
  4. Przemyć matrycę trzykrotnie 5 ml TBST/PBST. Pierwsze pranie trwa 30 sekund, a następnie dwa 5-minutowe prania na shakerze w temperaturze pokojowej.

5. Odczytywanie tablicy

  1. Przeprowadzaj rozwój chemiluminescencji za pomocą zestawu substratu do blotów ECL.
  2. Wykonaj detekcję za pomocą luminescencyjnego analizatora obrazu.
  3. Przeanalizuj wyniki. Upewnij się, że oba duplikaty na tablicy pokazują te same sygnały, aby wyniki były wiarygodne. Jeśli struktura partnera białkowego jest znana, należy poszukać w strukturze peptydów wiążących i poszukać miejsc wiązania. Nawet peptydy, które znajdują się daleko w sekwencji, mogą znajdować się blisko siebie w strukturze trzeciorzędowej i tworzyć miejsce wiązania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

STIL jest bardzo ważnym białkiem centrosomalnym. Kontroluje prawidłowy podział komórek i proliferację komórek13,15–19. STIL oddziałuje z kilkoma białkami 18,20,21, a większość interakcji zachodzi przez jego centralną część, która jest wewnętrznie nieuporządkowanym regionem (IDR)14. Zaprojektowaliśmy macierz złożoną z peptydów pochodzących z białka wiążącego STIL CHFR. CHFR jest supresorem guza, który jest indukowany w odpowiedzi na stres mitotyczny22. Poni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania przesiewowe macierzy peptydowej są doskonałym narzędziem do identyfikacji miejsc wiązania białka docelowego u jego partnerów. Ten test jest szybki i łatwy do wykonania, a wyniki można uzyskać w ciągu jednego lub dwóch dni roboczych. Badania przesiewowe z użyciem macierzy peptydowej są wszechstronne i mogą być wykorzystywane do wielu celów. Może być stosowany do charakteryzowania modyfikacji potranslacyjnych, takich jak fosforylacja i identyfikacji substratów kinaz. Na przykład: kinaza FLT3, która jest związana z ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AF było wspierane przez grant początkowy Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych w ramach Siódmego Programu Ramowego Wspólnoty Europejskiej (FP7/2007-2013) / Umowa o grant ERBN nr 203413 oraz przez Minerva Center for Bio-hybrid complex systems.HA i AI są wspierane przez stypendium Dalia and Dan Maydan dla zaawansowanych studentów na Uniwersytecie Hebrajskim w Jerozolimie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tablica peptydowaINTAVIS Instrumenty
His-probe Przeciwciało (H-3) HRPSanta Cruz Biotechnologysc-8036 Zestaw HRP
EZ-ECL Przemysłbiologiczny20-500-120
Mleko odtłuszczoneBecton, Dickinson and Company232100
LAS-3000 kamera FUJI
bioanalityczneFilm

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Benyamini, H., Friedler, A. Using peptides to study protein–protein interactions. Future Medicinal Chemistry. 2 (6), 989-1003 (2010).
  2. Geysen, H. M., Wagner, C. D. Isotope or mass encoding of combinatorial libraries. Chemistry & Biology. 3 (8), 679-688 (1996).
  3. Frank, R. Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support. Tetrahedron. 48 (42), 9217-9232 (1992).
  4. Katz, C., Levy-Beladev, L., Rotem-Bamberger, S., Rito, T., Rudiger, S. G., Friedler, A. Studying protein-protein interactions using peptide arrays. Chem Soc Rev. 40 (5), 2131-2145 (2011).
  5. Hansen, L. B., Buus, S., Schafer-Nielsen, C. Identification and Mapping of Linear Antibody Epitopes in Human Serum Albumin Using High-Density Peptide Arrays. PLoS ONE. 8 (7), (2013).
  6. Uecker, A. A substrate peptide for the FLT3 receptor tyrosine kinase. British Journal of Haematology. 144 (1), 127-130 (2009).
  7. Gabizon, R., Faust, O., Benyamini, H., Nir, S., Loyter, A., Friedler, A. Structure-activity relationship studies using peptide arrays: the example of HIV-1 Rev-integrase interaction. Med. Chem. Commun. 4 (1), 252-259 (2013).
  8. Frank, R. The SPOT-synthesis technique: Synthetic peptide arrays on membrane supports—principles and applications. Journal of Immunological Methods. 267 (1), 13-26 (2002).
  9. Innovative Peptide Solutions. , http://www.jpt.com (2014).
  10. PEPSCAN shaping peptides to perfection. , http://www.pepscan.com (2014).
  11. Intavis Bioanalytical Instruments. , http://www.intavis.com (2014).
  12. Falsey, J. R., Renil, M., Park, S., Li, S., Lam, K. S. Peptide and Small Molecule Microarray for High Throughput Cell Adhesion and Functional Assays. Bioconjugate Chemistry. 12 (3), 346-353 (2001).
  13. Castiel, A., Danieli, M. M. The Stil protein regulates centrosome integrity and mitosis through suppression of Chfr. Journal of Cell Science. 124 (4), 532-539 (2011).
  14. Amartely, H., David, A., Lebendiker, M., Benyamini, H., Izraeli, S., Friedler, A. The STIL protein contains intrinsically disordered regions that mediate its protein-protein interactions. Chemical Communications. 50, Cambridge, England. 5245-5247 (2013).
  15. Izraeli, S., Lowe, L. A. The SIL gene is required for mouse embryonic axial development and left-right specification. Nature. 399 (6737), 691-694 (1999).
  16. Izraeli, S., Colaizzo-Anas, T., Bertness, V. L., Mani, K., Aplan, P. D., Kirsch, I. R. Expression of the SIL gene is correlated with growth induction and cellular proliferation. Cell Growth Differ. 8 (11), 1171-1179 (1997).
  17. Arquint, C., Sonnen, K. F., Stierhof, Y. -D., Nigg, E. a Cell-cycle-regulated expression of STIL controls centriole number in human cells. Journal of Cell Science. 125 (5), 1342-1352 (2012).
  18. Tang, C. J., Lin, S. Y. The human microcephaly protein STIL interacts with CPAP and is required for procentriole formation. Embo J. 30 (23), 4790-4804 (2011).
  19. Vulprecht, J., David, A. STIL is required for centriole duplication in human cells. Journal of Cell Science. 125 (5), 1353-1362 (2012).
  20. Campaner, S., Kaldis, P., Izraeli, S., Kirsch, I. R. Sil phosphorylation in a Pin1 binding domain affects the duration of the spindle checkpoint. Mol Cell Biol. 25 (15), 6660-6672 (2005).
  21. Kasai, K., Inaguma, S., Yoneyama, A., Yoshikawa, K., Ikeda, H. SCL/TAL1 interrupting locus derepresses GLI1 from the negative control of suppressor-of-fused in pancreatic cancer cell. Cancer Res. 68 (19), 7723-7729 (2008).
  22. Chaturvedi, P., Sudakin, V. Chfr regulates a mitotic stress pathway through its RING-finger domain with ubiquitin ligase activity. Cancer Res. 62 (6), 1797-1801 (2002).
  23. Olaussen, K. a, Commo, F. Synergistic proapoptotic effects of the two tyrosine kinase inhibitors pazopanib and lapatinib on multiple carcinoma cell lines. Oncogene. 28 (48), 4249-4260 (2009).
  24. Reingewertz, T. H., Britan-Rosich, E. Mapping the Vif–A3G interaction using peptide arrays: A basis for anti-HIV lead peptides. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (12), 3523-3532 (2013).
  25. Katz, C., Benyamini, H. Molecular basis of the interaction between the antiapoptotic Bcl-2 family proteins and the proapoptotic protein ASPP2. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12277-12282 (2008).
  26. Katz, C., Zaltsman-Amir, Y., Mostizky, Y., Kollet, N., Gross, A., Friedler, A. Molecular Basis of the Interaction between Proapoptotic Truncated BID (tBID) Protein and Mitochondrial Carrier Homologue 2 (MTCH2) Protein: KEY PLAYERS IN MITOCHONDRIAL DEATH PATHWAY. Journal of Biological Chemistry. 287 (18), 15016-15023 (2012).
  27. Rosenberg, M. M., Ronen, D., Lahav, N., Nazirov, E., Ravid, S., Friedler, A. High resolution characterization of myosin IIC tailpiece and its effect on filament assembly. Journal of Biological Chemistry. 288 (14), 9779-9789 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Macierz peptydowamapowanie miejsca wi zaniabia ko CHFRbia ko Stilldetekcja chemiluminescencyjnablokowanie macierzyinkubacja bia kadetekcja przeciwciaanaliza wynik w

Powiązane artykuły