Artykuł metodologiczny

Oczyszczanie nieczystości: sekwencjonowanie metagenomów i metatranskryptomów ze złożonych próbek związanych ze zwierzętami

DOI:

10.3791/52117

⸱

22 grudnia 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, San Diego State University, 2DOE Joint Genome Institute, 3Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, University of Colorado, 4Department of Pediatrics, School of Medicine, University of Colorado

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z przykładu dróg oddechowych mukowiscydozy, manuskrypt przedstawia kompleksowy przepływ pracy obejmujący kombinację podejść metagenomicznych i metatranskryptomicznych w celu scharakteryzowania społeczności mikrobiologicznych i wirusowych w próbkach związanych ze zwierzętami.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dostępność sekwencjonowania o wysokiej przepustowości zrewolucjonizowała wiele dziedzin biologii. Aby lepiej zrozumieć społeczności wirusowe i mikrobiologiczne związane z gospodarzem, opracowano kompleksowy proces ekstrakcji DNA i RNA. Przepływ pracy jednocześnie generuje metagenomy wirusowe i mikrobiologiczne, a także metatranskryptomy, z pojedynczej próbki do sekwencjonowania nowej generacji. Sprzężenie tych podejść zapewnia przegląd zarówno cech taksonomicznych, jak i funkcji kodowanych w społeczności. W prezentowanych metodach wykorzystuje się plwocinę mukowiscydozy (CF), która jest problematycznym typem próbki, ponieważ jest wyjątkowo lepka i zawiera dużą ilość mucyn, wolnego DNA neutrofili i innych nieznanych zanieczyszczeń. Opisane tutaj protokoły są ukierunkowane na te problemy i skutecznie odzyskują wirusowe i mikrobiologiczne DNA przy minimalnym zanieczyszczeniu ludzkiego DNA. Aby uzupełnić badania metagenomiczne, zoptymalizowano protokół metatranskryptomiczny w celu odzyskania mRNA zarówno drobnoustrojów, jak i gospodarza, które zawiera stosunkowo niewiele sekwencji rybosomalnego RNA (rRNA). Przedstawiono przegląd charakterystyki danych, który ma służyć jako punkt odniesienia do oceny skuteczności metod. Pobrano również dodatkowe próbki plwociny CF w celu (i) oceny spójności profili mikrobiomu przez siedem kolejnych dni w obrębie jednego pacjenta oraz (ii) porównania spójności podejścia metagenomicznego z sekwencjonowaniem opartym na genie rybosomalnego RNA 16S. Wyniki wykazały, że dzienne wahania profili mikrobiologicznych bez zaburzeń antybiotyków były minimalne, a profile taksonomiczne powszechnych bakterii związanych z mukowiscydozą były bardzo podobne między bibliotekami 16S rDNA a metagenomami wygenerowanymi z DNA pochodzącego z lizy hipotonicznej (HL). Jednak różnice między profilami taksonomicznymi 16S rDNA wygenerowanymi z całkowitego DNA i DNA pochodzącego z HL sugerują, że hipotoniczna liza i etapy płukania korzystnie wpływają nie tylko na usunięcie DNA pochodzącego od człowieka, ale także zewnątrzkomórkowego DNA pochodzącego z drobnoustrojów, które może fałszywie przedstawiać rzeczywiste profile mikrobiologiczne.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wirusowe i mikrobiologiczne społeczności związane z ludzkim ciałem były intensywnie badane w ciągu ostatniej dekady za pomocą technologii sekwencjonowania1,2. Wyniki doprowadziły do uznania znaczenia mikroorganizmów w zdrowiu i chorobach człowieka. Główna inicjatywa pochodzi z projektu Human Microbiome Project, który opisuje bakterie (i niektóre archeony) żyjące na ludzkiej skórze oraz w jamach ustnych, drogach oddechowych, drogach moczowych i przewodzie pokarmowym3. Dalsze badania mikrobiomu zdrowych ludzkich dróg oddechowych poprzez płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL)4,5 i wymazy z nosogardzieli4 wykazały, że płuca mogą służyć jako urządzenie do pobierania próbek środowiskowych, powodując przejściową kolonizację mikrobiologiczną dróg oddechowych. Jednak wpływ kolonizacji mikrobiologicznej na upośledzone powierzchnie dróg oddechowych może prowadzić do ciężkich i przewlekłych infekcji płuc, takich jak te obserwowane u pacjentów z mukowiscydozą (CF).

mukowiscydoza jest śmiertelną chorobą genetyczną spowodowaną mutacją w genie6 regulatora transbłonowego mukowiscydozy (CFTR). Mutacje te powodują powstawanie wadliwych białek CFTR, które z kolei wpływają na transepiteliczny transport jonów przez wierzchołkową powierzchnię nabłonka. Choroba atakuje wiele układów narządowych, ale większość śmiertelności i zachorowalności można przypisać chorobie płuc związanej z mukowiscydozą7. Płuco mukowiscydozy zapewnia unikalny ekosystem do kolonizacji drobnoustrojów. Defekt transportu jonów powoduje gromadzenie się śluzu w drogach oddechowych mukowiscydozy, tworząc mikrośrodowiska składające się z przedziałów tlenowych, mikroaerofilowych i beztlenowych zakotwiczonych w statycznej, bogatej w składniki odżywcze powierzchni błony śluzowej. Środowisko to ułatwia kolonizację i namnażanie drobnoustrojów, w tym wirusów, bakterii i grzybów. Ostre i przewlekłe infekcje bakteryjne płuc prowadzą do stałych, ale nieskutecznych odpowiedzi immunologicznych, co skutkuje rozległą przebudową dróg oddechowych, utratą pojemności płuc i ostatecznie niewydolnością płuc.

Społeczności bakteryjne związane z płucami z mukowiscydozą zostały dobrze opisane przy użyciu zarówno metod zależnych, jak i niezależnych od hodowli, które obejmują sekwencjonowanie genu 16S rybosomalnego RNA (rRNA)8 i metagenomikę shotgun9,10. Podejście oparte na 16S rRNA jest w stanie scharakteryzować szeroki zakres gatunków drobnoustrojów i uchwycić szerokie zmiany w różnorodności społeczności. Jest jednak ograniczony w swojej rozdzielczości w definiowaniu zbiorowisk (podsumowany w Claesson et al. 201011), a przewidywania potencjałów metabolicznych są ograniczone do tych ogólnych funkcji znanych dla zidentyfikowanych taksonów. W związku z tym metody sekwencjonowania genu 16S rRNA są niewystarczające do uzyskania niezbędnej taksonomicznej i funkcjonalnej dokładności analitycznej różnych społeczności drobnoustrojów obecnych w płucach mukowiscydozy. Opisane tutaj podejście metagenomiczne uzupełnia podejście oparte na 16S rRNA, pokonuje jego ograniczenia i umożliwia stosunkowo skuteczny sposób analizy zarówno taksonomii społeczności drobnoustrojów, jak i zawartości genetycznej w płucach z mukowiscydozą.

Mikrobiologiczne DNA wyizolowane z próbek zwierzęcych często zawiera dużą ilość DNA gospodarza. Próbki plwociny lub tkanki płucnej mukowiscydozy zwykle zawierają dużą ilość ludzkiego DNA uwalnianego przez neutrofile w odpowiedzi immunologicznej, często większą niż 99% całkowitego DNA12-14. Chociaż niektóre nienaruszone komórki ludzkie mogą być obecne, większość tego DNA jest wolna w roztworze lub zaadsorbowana na powierzchni drobnoustrojów. Ponadto obecność wyjątkowo lepkich czopów śluzowych, szczątków komórkowych i innych nieznanych zanieczyszczeń dodatkowo komplikuje izolację komórek drobnoustrojów. Przetestowano kilka metod w celu zubożenia tych próbek ludzkiego DNA, w tym gradienty Percoll do oddzielania komórek ludzkich od mikrobiologicznych15, leczenie DNazą I, monoazydkiem bromku etydyny w celu selektywnej degradacji ludzkiego DNA16 oraz zestaw MolYsis, wszystkie z ograniczonym sukcesem. Do tej pory najskuteczniejszą procedurą oczyszczania mikrobiologicznego DNA z plwociny z mukowiscydozą była modyfikacja procesu opisanego przez Breitensteina i in. (1995)17. Podejście to, znane tutaj jako metoda lizy hipotonicznej (HL), wykorzystuje kombinację β-merkaptoetanolu w celu zmniejszenia wiązań dwusiarczkowych mucyny, hipotonicznej lizy komórek eukariotycznych i leczenia rozpuszczalnego DNA za pomocą DNazyI 9. Pomimo braku alternatyw, metoda HL wzbudziła pewne obawy ze względu na (i) możliwe błędy systematyczne wynikające z niepożądanej lizy drobnoustrojów oraz (ii) to, czy zaobserwowane fluktuacje w składzie społeczności9,10 są artefaktem zmian związanych z przetwarzaniem próbki. Oprócz generowania metagenomów typu shotgun, rozwiązujemy te problemy, porównując profile genów 16S rRNA całkowitego DNA i DNA drobnoustrojów wyekstrahowanych metodą HL przy użyciu tego samego zestawu próbek plwociny pobranych od jednego pacjenta przez siedem kolejnych dni.

W porównaniu do społeczności mikroorganizmów, charakterystyka społeczności wirusowych związanych ze zwierzętami jest ograniczona18,19. Społeczności wirusowe w drogach oddechowych mukowiscydozy zostały scharakteryzowane tylko minimalnie20–22. Pierwsze badanie metagenomiczne charakteryzujące DNA społeczności wirusów w drogach oddechowych mukowiscydozy wykazało, że większość wirusów związanych z płucami mukowiscydozy to fagi20. Potencjał metaboliczny faga u osób z mukowiscydozą i bez mukowiscydozy był znacząco różny. W szczególności społeczności fagów u osób z mukowiscydozą były nosicielami genów odzwierciedlających adaptacje gospodarza bakteryjnego do fizjologii dróg oddechowych mukowiscydozy i zjadliwość bakterii20. Późniejsze badania metagenomiczne wirusów w tkance płucnej mukowiscydozy wykazały wyraźną niejednorodność przestrzenną społeczności wirusowych między regionami anatomicznymi22. Ponadto tkanka płucna mukowiscydozy zawierała najmniejszą różnorodność wirusową zaobserwowaną do tej pory w jakimkolwiek ekosystemie22. Większość zidentyfikowanych wirusów to fagi, które mogą infekować patogeny mukowiscydozy. Jednak wykryto również wirusy eukariotyczne, takie jak herpeswirusy, adenowirusy i wirusy brodawczaka ludzkiego (HPV). W jednym przypadku, w którym podczas sekcji zaobserwowano torbiele w tkance płucnej, odzyskano ponad 99% genomu wirusa brodawczaka ludzkiego, mimo że u pacjenta nigdy nie zdiagnozowano brodawczaka płucnego ani raka. Wskazuje to, że obecna różnorodność wirusów nie tylko odzwierciedla stopień uszkodzenia tkanek, ale może również ujawniać i wyjaśniać leżącą u podstaw niescharakteryzowaną chorobę. Opisane tutaj protokoły zapewniają prosty, ale skuteczny sposób izolowania cząstek wirusopodobnych (VLP) z próbek składających się z dużych ilości gęstego śluzu, komórek gospodarza i drobnoustrojów, wolnego DNA, a także szczątków komórkowych.

Uzupełniając metagenomikę, metatranskryptomika służy do monitorowania dynamiki ekspresji genów w społeczności mikrobiologicznej i gospodarzu9,23. W takim przypadku należy preferencyjnie wybrać mRNA drobnoustrojów, jak i gospodarza. Ponieważ bakteryjne mRNA nie są poliadenylowane, nie można zastosować metody ściągania mRNA opartej na oligo-dT. Amplifikacja RNA zależna od poliadenylacji nie może być stosowana w próbkach związanych z gospodarzem, jeśli wiadomo, że próbki zawierają duże ilości eukariotycznego mRNA. Wiele próbek związanych ze zwierzętami, w tym plwocina mukowiscydoza, zawiera dużą gęstość komórek, a także duże ilości szczątków komórkowych i nukleaz, które zawierają RNazy. Dlatego kolejnym trudnym zadaniem jest zapobieganie nadmiernej degradacji RNA podczas przetwarzania metatranskryptomu. W większości przypadków całkowite RNA wyekstrahowane z plwociny mukowiscydozy ulega częściowej degradacji, co ogranicza dalsze zastosowania i użyteczność uzyskanego RNA. W ostatnich latach opracowano kilka podejść do zubożenia rRNA, które zaadaptowano do dostępnych na rynku zestawów. Skuteczność tych podejść jest jednak ograniczona, zwłaszcza w przypadku pracy z częściowo zdegradowanym rRNA9,24. Zastosowane tu metody pozwoliły na odzyskanie częściowo zdegradowanego całkowitego RNA, nadającego się do skutecznego usuwania całkowitego rRNA w dalszej części procesu. Bezpośrednie porównanie skuteczności usuwania rRNA z częściowo zdegradowanego całkowitego RNA porównującego dwa różne zestawy zostało zilustrowane przez Lim i wsp. (2012)Rozdział 9.

Ogólnie rzecz biorąc, celem tego manuskryptu jest dostarczenie kompletnego zestawu protokołów (Rysunek 1) do generowania wirusowych i mikrobiologicznych metagenomów typu shotgun oraz metatranskryptomu z pojedynczej próbki związanej ze zwierzęciem, na przykładzie próbki indukowanej plwociny. Przepływ pracy w laboratorium molekularnym powinien obejmować oddzielne obszary przed i po amplifikacji, aby zminimalizować zanieczyszczenie krzyżowe. Metody te można łatwo dostosować do innych typów próbek, takich jak tkanki22, wymazy z nosogardzieli i jamy ustneji gardła 25, płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL) i koralowce (dane niepublikowane). Każda próbka powinna być przetworzona natychmiast po pobraniu, zwłaszcza gdy pożądane są badania metagenomiki drobnoustrojów i metatranskryptomiki. Jeśli próbki zostały zamrożone, ogranicza to izolację nienaruszonych komórek drobnoustrojów dla metagenomów drobnoustrojów, ponieważ zamrożenie potencjalnie zakłóciłoby integralność komórki. Zamrażanie nie wyklucza jednak metatranskryptomiki i izolacji wirusa, ale proces zamrażania i rozmrażania może mieć wpływ na jakość RNA i ilość odzyskanych cząstek wirusa. Ważne jest, aby zauważyć, że indukowana plwocina służyła jako główne źródło próbek w wielu badaniach związanych z dorosłymi pacjentami z mukowiscydozą i innymi przewlekłymi chorobami płuc26,27, ponieważ BAL może być zbyt inwazyjny. W naszych badaniach próbki plwociny pobrano staranną i spójną metodą pobierania próbek, tj. po płukaniu jamy ustnej i płukaniu jamy ustnej sterylnym roztworem soli fizjologicznej, aby ograniczyć do minimum zanieczyszczenie mikroorganizmami jamy ustnej w próbkach plwociny.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Próbki indukowanej plwociny zostały pobrane zgodnie z Instytucjonalną Komisją Rewizyjną Uniwersytetu Kalifornijskiego (HRPP 081500) i Instytucjonalną Komisją Rewizyjną Uniwersytetu Stanowego San Diego (SDSU IRB#2121), przez koordynatora badań kliniki mukowiscydozy dla dorosłych Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Diego (UCSD).

1. Pobieranie próbek i obróbka wstępna (wstępna obróbka próbek w ciągu 30 minut po pobraniu)

  1. Przed pobraniem próbki oznacz cztery probówki o pojemności 15 ml jako: (i) metagenom wirusa, (ii) metagenom drobnoustrojów, (iii) metatranskryptom i (iv) dodatkowa plwocina. Powtórzyć te czynności dla każdej próbki. Dodać 2 ml kulek krzemionki o średnicy 0,1 mm do probówki z napisem "Metatranskryptom", a następnie 6 ml buforu do lizy RNA na bazie izotiocyjanianu guanidyny (bufor do lizy GITC).
  2. Podczas pobierania próbek należy używać sterylnego roztworu soli fizjologicznej (60 ml) jako płynu do płukania jamy ustnej, aby zminimalizować zanieczyszczenie drobnoustrojami jamy ustnej. Próbki plwociny pobierać w ciągu 30 minut po wdychaniu 4 ml 7% hipertonicznego roztworu soli fizjologicznej za pomocą nebulizatora. Próbki należy przetwarzać natychmiast, jak opisano poniżej.
  3. Rozcieńczyć próbkę do całkowitej objętości 8 ml.
    1. Oszacuj objętość próbki, ważąc pusty kubek na plwocinę przed i po pobraniu próbki.
    2. Jeżeli objętość próbki jest mniejsza niż 8 ml, należy dodać odpowiednią ilość 1 PBS z filtrem 0,02 μm, aby uzyskać całkowitą objętość próbki wynoszącą co najmniej 8 ml.
    3. Natychmiast homogenizować próbkę za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml do momentu, aż w plwocinie nie pozostaną żadne widoczne grudki
    4. Za pomocą tej samej strzykawki pobrać 2 ml plwociny i natychmiast przejść do kroku 1.4.
  4. Zachowanie całkowitego RNA z próbki plwociny
    1. Wstrzyknąć 2 ml próbki plwociny z kroku 1.3.4 do probówki "metatranskryptomu" zawierającej kulki krzemionkowe i bufor do lizy GITC.
    2. Zamknij pokrywę i szczelnie uszczelnij tubę za pomocą Parafilm, aby uniknąć wycieku.
    3. Natychmiast homogenizować plwocinę ze średnią prędkością przez 10 minut. W zależności od dostępnego wirownika, umieść rurkę poziomo i w razie potrzeby zabezpiecz taśmą.
    4. Przechowywać probówkę w temperaturze 4 °C lub w pojemniku na lód i w razie potrzeby przetransportować do laboratorium.
  5. Za pomocą tej samej strzykawki wlej po 2 ml plwociny do probówek oznaczonych jako "metagenom wirusa" i "metagenom drobnoustrojów" i przenieś pozostałą plwocinę z kubka na plwocinę do probówki z napisem "dodatkowa plwocina".
  6. Przechowywać wszystkie probówki w temperaturze 4 °C lub w pojemniku na lód i w razie potrzeby przetransportować do laboratorium.

2. Generowanie metagenomu wirusowego

  1. Przygotowanie i roztworów
    1. Przygotować wcześniej 50 mM ditiotreitolu (DTT) i przechowywać w temperaturze 4 °C. Jest to stabilne przez 2 tygodnie.
    2. Przygotować bufor soli fizjologicznej i magnezowej (SM) (250 ml): 1 M NaCl, 10 mM MgSO4, 50 mM Tris-HCl; dostosować pH do 7,4. Filtrować, sterylizować (pory o wielkości 0,02 μm) i przechowywać w temperaturze pokojowej.
    3. Przygotować enzym DNazę I do 100 U/μl (w wodzie o czystości cząsteczkowej) z liofilizowanej trzustki bydlęcej DNazy I zgodnie z aktywnością określoną jednostką Dornazy/mg suchej masy.
    4. Przygotować 10x bufor DNazy I (50 ml): 100 mM MgCl2, 20 mM CaCl2; dostosować pH do 6,5. Filtrować, sterylizować (pory o wielkości 0,02 μm) i przechowywać w temperaturze pokojowej.
    5. Przygotować 4% paraformaldehydu.
    6. Przygotuj 200x bufor TE: 2 M Tris-HCl (pH 8,5), 0,2 M EDTA. Filtrować, sterylizować (pory o wielkości 0,02 μm) i przechowywać w temperaturze pokojowej.
    7. Przygotuj 10 ml 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS) przy użyciu wody molekularnej.
    8. Przygotować 50 ml CTAB/NaCl (10% CTAB. 700 mM NaCl) używając wody molekularnej. Rozpuść CTAB przez noc. Jeśli osady utrzymują się, podgrzać roztwór w temperaturze 65 °C. Roztwór ma wysoką lepkość w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Filtracja za pomocą filtra 0,02 μm pozwala na usunięcie cząstek wirusopodobnych w roztworze, ale nie zanieczyszczenia wolnymi kwasami nukleinowymi.
  2. Obróbka wstępna próbki
    1. Przygotuj odpowiednią ilość świeżego 6,5 mM ditiotreitolu (DTT).
    2. Rozcieńczyć homogenat przez dodanie buforu SM przefiltrowanego przez 0,02 μm, aby uzyskać całkowitą objętość 6 ml.
    3. Aby wspomóc rozpuszczanie śluzu, dodać równą objętość (6 ml) 6,5 mM ditiotreitolu (DTT) do próbki, energicznie wirować w celu wymieszania i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    4. Energicznie wirować badaną próbkę i wirować w temperaturze 10 °C, 3,056 x g przez 15-20 minut.
    5. Zebrać sklarowany osad do nowej probówki o pojemności 15 ml.
    6. Powtórzyć kroki 2.2.3 i 2.2.5 dla następnej próbki.
    7. Przenieść i przefiltrować supernatant za pomocą filtra 0,45 μm zamontowanego na strzykawce do nowej probówki o pojemności 15 ml.
      UWAGA: Jeśli filtr się zatka, wyjmij próbki ze strzykawki i pomiń etap filtracji.
    8. Pobrać podpróbkę o objętości 100 μl z próbki przefiltrowanej 0,45 μm, przeprowadzić obróbkę chloroformem i DNazą I (patrz sekcja 2.3.12-2.3.15) i dodać równą objętość 4% paraformaldehydu w celu utrwalenia próbki do mikroskopii epifluorescencyjnej (rysunek 2A).
    9. Aby zapoznać się z kompleksowym podejściem do wzbogacania cząstek wirusa (patrz Dyskusja), przejdź do kroku 2.3.12, aby pominąć selekcję cząstek wirusa na podstawie ultrawirowania w gradiacji chlorku cezu. Może to jednak skutkować zanieczyszczeniem bakteryjnym odpornym na chloroform i większą ilością DNA gospodarza w lizacie wirusa.
  3. Wzbogacanie i oczyszczanie cząstek wirusopodobnych (VLP)
    1. Przygotować poszczególne roztwory chlorku cezu (CsCl), rozpuszczając odpowiednią ilość CsCl w niefiltrowanym buforze SM do pożądanej gęstości (1,7 g/ml, 1,5 g/ml, 1,35 g/ml i 1,2 g/ml). Przed użyciem przefiltruj każdy roztwór przez filtr 0,02 μm.
    2. Ustaw gradient CsCl, jak pokazano na rysunku 2B.
    3. Załaduj 1 ml 1,7 g/ml do każdej probówki, załaduj 1 ml 1,5 g/ml do każdej probówki, załaduj 1 ml 1,35 g/ml do każdej probówki, załaduj 1,2 g/ml do każdej probówki (opcjonalnie), a na koniec załaduj 6-8 ml próbki do odpowiedniej probówki. Zaznacz poszczególne warstwy, aby wskazać położenie każdej frakcji.
    4. Zrównoważyć każdą przeciwstawną parę probówek z dokładnością do 1 mg.
    5. Ostrożnie załaduj każdą rurkę do wiadra wirowego. Zakręć wszystkie wiadra, nawet jeśli są puste. Załaduj wiadro wirowe na wirnik.
    6. Wirować przy 82,844 x g w temperaturze 4 °C przez 2 godziny.
    7. Po odwirowaniu ostrożnie wyjmij probówki z uchwytu, nie naruszając gradientów gęstości.
    8. Za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml z igłą 18 G przekłuć probówkę tuż poniżej warstwy o gęstości 1,5 g/ml (Rysunek 2, czerwona strzałka) i wciągnąć ~1,5 ml do strzykawki.
    9. Zebrać górną frakcję, powoli wyjmując igłę i pozwalając, aby pozostała frakcja w probówce spłynęła do nowej probówki o pojemności 15 ml przez nakłucie. Oznacz to jako "odpad górnej frakcji".
    10. Pobrać frakcję 1,5 g/ml (zawierającą VLP) ze strzykawki, wyrzucając zawartość do dwóch nowych probówek do mikrofuge.
    11. Powtórzyć kroki 2.3.8-2.3.10 dla wszystkich próbek.
    12. Dodać 0,2 objętości chloroformu do koncentratu wirusowego, energicznie wstrząsnąć, inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, wirować z maksymalną prędkością przez 5 minut i zebrać fazę wodną.
    13. Dodać 10x bufor DNazy i DNazę I (stężenie końcowe = 2,5 U/μl) do koncentratu wirusa potraktowanego chloroformem i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1,5-2 godziny.
    14. Dezaktywować aktywność DNazy w temperaturze 65 °C przez 15 min.
    15. Usunąć 15 μl frakcji wirusowej poddanej działaniu chloroformu i DNazy I do nowej probówki i dodać 15 μl 4% paraformaldehydu w celu utrwalenia próbki do mikroskopii epifluorescencyjnej.
  4. Ekstrakcja DNA
    1. Koncentraty wirusowe z każdej próbki należy umieścić w oczyszczonej i autoklawizowanej probówce wirówki o pojemności 50 ml Oak Ridge.
    2. Dodać następujące elementy: 0,1 objętości 200x bufor TE, 10 μl 0,5 M EDTA na ml próbki, 1 objętość formamidu i 10 μl glikogenu. Dobrze wymieszaj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
    3. Korzystając z nowych objętości, dodaj 2 objętości 100% etanolu o temperaturze pokojowej. Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 4 °C przez co najmniej 30 minut.
    4. Osadzać DNA, obracając probówkę o masie 17,226 x g przez 20 minut, w temperaturze 4 °C przy użyciu rotora SS-34.
    5. Szwadron należy ostrożnie wyrzucić za pomocą pipety serologicznej. Umyj granulat dwukrotnie lodowatym 70% etanolem.
    6. Usuń jak najwięcej płynu i pozostaw granulkę do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
    7. Zawiesić osad DNA w 567 μl 1x buforu TE (pH 8,0).
      UWAGA: Odczekać co najmniej 15 minut do całkowitego zamieszania w temperaturze pokojowej. Zawieszone DNA należy przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C do czasu dalszego przetwarzania.
    8. Przenieś całe 567 μl zawieszonego roztworu DNA do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 30 μl wstępnie podgrzanego 10% SDS i 3 μl proteinazy K (20 μg/ml), dokładnie wymieszać i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 56 °C. Wstępnie podgrzać CTAB/NaCl w temperaturze 65 °C.
    9. Dodać 100 μl 5 M NaCl i dokładnie wymieszać. Dodać 80 μl wstępnie podgrzanego roztworu CTAB/NaCl, odwirować i inkubować przez 10 minut w temperaturze 65 °C.
    10. Dodać równą objętość chloroformu, zmieszać i wirować w temperaturze 16 100 x g przez 5 minut.
    11. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrofiltrów o pojemności 1,5 ml. Dodać równą objętość fenolu/chloroformu, wirować do wymieszania i wirować w temperaturze 16 100 x g przez 5 minut.
    12. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrofiltrów o pojemności 1,5 ml. Dodać równą objętość chloroformu, wymieszać i wirować w temperaturze 16 100 x g przez 5 minut.
    13. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrofiltrów o pojemności 1,5 ml. Dodać równą objętość izopropanolu do frakcji sklarowanej nad osadem, wymieszać i inkubować w temperaturze -20 °C przez co najmniej 30 minut.
    14. Osadzać DNA, wirować w temperaturze 16 100 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odpipetować supernatant i dwukrotnie przemyć osad lodowatym 70% etanolem.
    15. Wykonaj krótkie wirowanie i usuń pozostały etanol z rurki. Suszyć pelety na powietrzu przez 15 minut.
    16. Zawiesić osad DNA za pomocą 50 μl buforu elucyjnego (5 mM Tris, pH 8,5). Pozostaw granulkę do ponownego nawodnienia przez co najmniej 5 minut w temperaturze pokojowej.
    17. Określ ilościowo DNA za pomocą testu opartego na fluorescencji o wysokiej czułości.
  5. Amplifikacja przy użyciu polimerazy Phi29 (opcjonalnie)
    1. Przygotować 2x bufor do wyżarzania: 80 mM Tris-HCl (pH 8,0), 20 mM MgCl2.
    2. Rozcieńczyć polimerazę DNA Phi29 do 5 U/μl.
    3. Bufor próbki do wstępnego mieszania, składający się z 50 μl losowego startera heksamerowego (100 μM), 125 μl 2x buforu do wyżarzania i 25 μl wody. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    4. Bufor reakcyjny do wstępnego mieszania, składający się ze 100 μl 10-krotnego buforu Phi29, 40 μl 10 mM dNTP i 560 μl wody. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    5. Dodać 1 μl matrycy DNA do 4 μl buforu próbki.
    6. Inkubować mieszaninę w temperaturze 95 °C przez 3 minuty i schłodzić na lodzie.
    7. Dodać 14 μl buforu reakcyjnego do mieszaniny z 2.4.4, mieszać pipetując w górę i w dół.
    8. Dodać 1 μl polimerazy DNA Phi29, mieszać pipetując w górę i w dół, i inkubować w temperaturze 30 °C przez 18 godzin, a następnie w temperaturze 65 °C przez 10 minut.
    9. Oczyść reakcje za pomocą kolumn genomowego DNA lub wytrącania fenolu/chloroformu i etanolu.
  6. Mikroskopia epifluorescencyjna (patrz Haas i wsp. 201428 do konfiguracji systemu filtracji)
    UWAGA: Po izolacji i oczyszczeniu, mikroskopia epifluorescencyjna z barwnikami kwasów nukleinowych może być wykorzystana do sprawdzenia obecności i czystości cząstek wirusa w próbkach (ryc. 2A i 2C). Wolne DNA w próbce może powodować wysoką fluorescencję tła. Dlatego próbka powinna być poddana działaniu DNazy I przed utrwaleniem i barwieniem w celu uzyskania mikrofotografii.
    1. Przygotować roztwór montażowy (0,1% kwas askorbinowy, 50% glicerol). Dodać 100 μl 10% kwasu askorbinowego do 4,9 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), dokładnie wymieszać. Dodać 5 ml 100% glicerolu do mieszanki, dokładnie wymieszać i oznaczyć probówkę jako "mount".
    2. Zamontuj filtr za pomocą jednorazowego filtra strzykawkowego z matrycą tlenku glinu 0,02 μm, podziel na porcję do probówek do mikrofuge i przechowuj w temperaturze -20 °C.
    3. Podzielić 100 μl próbki do nowej probówki do mikrofuge i dodać równą objętość 4% paraformaldehydu w celu utrwalenia VLPs. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez co najmniej 10 minut.
    4. Uzupełnić objętość do objętości 1 ml, dodając 800 μl przefiltrowanej wody o stężeniu 0,02 μm. Dodać 1 μl barwnika SYBR Gold do probówki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
    5. Skonfiguruj system filtracji, włączając pompę próżniową w zakresie od -9 do -10 psi (od -62,1 do -68,9 kPa).
    6. Umyj cokół wodą i umieść w cokole filtra filtr z tlenku glinu 0,02 μm z pierścieniowym polipropylenowym pierścieniem nośnym.
    7. Umieść wieżę filtracyjną na szczycie cokołu filtra z filtrem i zabezpiecz zaciskiem.
    8. Odpipetować zawartość z probówki o pojemności 1,5 ml do mikrofugi do wieży filtracyjnej i odczekać kilka minut, aż próbka zostanie przefiltrowana.
    9. Oznaczyć etykietą i odpipetować 10 μl odczynnika do mikroskopijnego szkiełka.
    10. Pozostaw odkurzacz włączony podczas wyjmowania wieży filtra i clamp.
    11. Ostrożnie zdejmij filtr z cokołu filtra i osusz spód filtra chusteczką Kimwipe, a następnie umieść filtr bezpośrednio na uchwycie na szkiełku mikroskopijnym.
    12. Odpipetować kolejne 10 μl odczynnika do montażu na filtrze i nałożyć szkiełko nakrywkowe na filtr.

3. Generowanie metagenomu mikrobiologicznego

  1. Przygotowanie i roztworów
    1. Przygotować 50 ml 1x buforu DNazy: 50 mM NaAc, 10 mM MgCl2, 2 mM CaCl2; dostosować pH do 6,5. Filtr, sterylizować (0,22 μm) i przechowywać w temperaturze pokojowej.
    2. Przygotować enzym DNazy I do 1000 U/μl (w wodzie o czystości cząsteczkowej) z liofilizowanej trzustki bydlęcej DNazy I zgodnie z aktywnością określoną jednostką Dornazy/mg suchej masy.
    3. Przygotować 100 ml buforu SE: 75 mM NaCl, 25 mM EDTA; dostosować pH do 7,5. Filtr, sterylizować (0,22 μm) i przechowywać w temperaturze pokojowej.
  2. Wstępna obróbka próbki przed ekstrakcją DNA
    1. Rozcieńczyć homogenat, dodając 5 objętości 1x PBS przefiltrowanych przez 0,22 μm. Na przykład dodać 10 ml 1x PBS do 2 ml próbki.
    2. Dodać β-merkaptoetanol do końcowego stężenia 2% (v/v). Ubijaj mieszaninę (w kapturze chemicznym) w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
    3. Wirować próbkę w temperaturze 10 °C i 3,056 x g przez 15 minut i odrzucić supernatant.
    4. Zawiesić osad w 10 ml wody molekularnej (lub 0,22 μm przefiltrowanej wody) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
    5. Powtórz kroki 3.2.3 i 3.2.4 jeden raz.
    6. Wirować w temperaturze 10 °C i ciśnieniu 3,056 x g przez 15 minut i odrzucić supernatant.
    7. Zawiesić osad w 5 ml 1x bufor DNazy i dodać 15 μl DNazy I (1,000 U/μl) na ml próbki.
    8. Inkubować w temperaturze 37 °C z wielokrotnym mieszaniem przez 2 godziny.
    9. Dezaktywować aktywność DNazy w temperaturze 65 °C przez 15 min.
    10. Wirować w temperaturze 10 °C i ciśnieniu 3,056 x g przez 15 minut i odrzucić supernatant. Zawiesić osad w 10 ml buforu SE.
    11. Powtórz krok 3.2.10.
    12. Wirować w temperaturze 10 °C i ciśnieniu 3,056 x g przez 15 minut i odrzucić supernatant.
    13. Zawiesić osad w 2 ml buforu SE i przenieść do dwóch probówek do mikrofuge.
    14. Granuluj komórki w probówkach do mikrofuge. Wirować probówki o wymiarach 16 100 x g w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
    15. Usuń supernatant i wyekstrahuj DNA z granulowanych komórek za pomocą zestawu do ekstrakcji genomowego DNA, protokół zmienności Gram-dodatniej.

4. Generowanie metatranskryptomu

  1. Obróbka wstępna próbki
    1. Przeprowadzić mechaniczną lizę komórek poprzez ubijanie kulek w buforze do lizy GITC natychmiast po pobraniu próbki i homogenizacji. Patrz krok 1.4.
    2. Wirować mieszaninę w temperaturze 4 °C i 600 x g przez 5 minut, aby osadzać kulki krzemionkowe.
    3. Przenieść supernatant do nowej probówki.
    4. Dodać 200 μl chloroformu na każde 750 μl użytego buforu do lizy GITC, energicznie wstrząsać ręcznie przez 15 sekund, inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut i wirować w temperaturze 4 °C i 3,056 x g przez 15 min. Podczas tego 15-minutowego wirowania przygotuj się do kroku 4.2.
    5. Po 15 minutowym wirowaniu (wyraźne oddzielenie form fazy wodnej-interfazy-fazy organicznej), wyekstrahuj fazę wodną (bez przerywania interfazy) do nowej probówki (probówek) wolnej od RNaz.
      UWAGA: Faza wodna zawiera RNA. Trzymaj probówki na lodzie do następnego kroku.
  2. Przeprowadzić ekstrakcję i oczyszczanie całkowitego RNA przy użyciu dostępnych na rynku zestawów do oczyszczania RNA opartych na kolumnach lub konwencjonalnego wytrącania RNA na bazie izopropanolu.
    1. Oczyszczanie RNA za pomocą kolumny krzemionkowej
      1. Zmierzyć całkowitą objętość otrzymanej frakcji wodnej.
      2. Dodać odpowiednią objętość buforu wiążącego RNA do próbki i dobrze wymieszać.
      3. Dostosować mieszaninę do odpowiednich warunków wiązania zgodnie z protokołem producenta. Dobrze wymieszaj i zrób krótki wir.
      4. Załaduj mieszaninę do kolumny RNA. W przypadku próbki o dużej objętości należy użyć wielokrotnego ładowania i załadować każdą kolumnę do 4 razy. W przeciwnym razie rozważ użycie wielu kolumn dla każdej próbki.
      5. Odpowiednio umyć kolumnę zgodnie z protokołem producenta.
      6. Eluować RNA za pomocą co najmniej 30 μl wody wolnej od RNaz. Podwójna elucja nieznacznie zwiększy wydajność RNA. Spowoduje to jednak rozcieńczenie stężenia RNA.
      7. Zmierz stężenie RNA i przejdź bezpośrednio do leczenia DNazą I. Użyj Bioanalyzera, aby sprawdzić jakość RNA (zalecane).
    2. Wytrącanie RNA
      1. Dodać równą objętość izopropanolu (np. 500 μl izopropanolu do 500 μl frakcji wodnej) i 2 μl 10 μg/μl glikogenu wolnego od RNaz do próbki.
      2. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
      3. Wirować w temperaturze 12 000 x g i temperaturze 4 °C przez 15 min.
      4. Ostrożnie usunąć supernatant, dodać 1 ml 75% etanolu wolnego od RNaz. Wirować mieszaninę w temperaturze 7 500 x g i 4 °C przez 5 minut, aby upewnić się, że granulka jest nienaruszona.
      5. Ostrożnie usuń etanol.
      6. Powtórz kroki 4.2.2.4 i 4.2.2.5 jeden raz.
      7. Suszyć pellet na powietrzu przez 10 minut.
      8. Ponownie uwodnić osad w 50 μl wody wolnej od RNaz, inkubować w temperaturze 55 °C przez 5 minut i przejść bezpośrednio do obróbki DNazą. Użyj Bioanalyzera, aby sprawdzić jakość RNA (zalecane).
      9. Przechowywać RNA w podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C lub -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metagenomy wirusowe

CF plwocina jest wyjątkowo lepka i zawiera dużą ilość mucyny i wolnego DNA (Rysunek 2A); ultrawirowanie gradientu gęstości ułatwia eliminację DNA pochodzącego od gospodarza (Rysunek 2B). Wyniki poprzedniego badania9 pokazujące osiem wiromów wygenerowanych w wyniku przedstawionego przepływu pracy podsumowano tutaj (Tabela 1). Siedem próbek (CF1-D, CF1-E, CF1-F, CF4-B, CF4-C, CF5-A i CF5-B; Tabela 1) zostały przetworzone w sposób opisany w sekcji 2. Wygenerowane wiromy zawierały niewiele (0,02%-3,7%) sekwencji pochodzących od człowieka, z tylko jednym wyjątkiem (70%). CF4-A pominięto na etapie ultrawirowania w gradiencie gęstości (CF4-A), a wirom wygenerowany z tej konkretnej próbki zawierał >97% sekwencji pochodzenia ludzkiego (Tabela 1). Rysunek 2 przedstawia przykład obrazu z mikroskopii epifluorescencyjnej typowej próbki plwociny CF przed (ryc. 2A) i po (ryc. 2C) ultrawirowaniu w gradimencie gęstości. Na mikrofotografiach zaobserwowano przezroczyste cząstki wirusopodobne (VLP) bez dużych cząstek po separacji gradientu gęstości. Po ekstrakcji DNA VLP zanieczyszczenie bakteryjne jest często testowane przy użyciu amplifikacji 16S rDNA przed sekwencjonowaniem DNA VLP.

Metagenomy mikrobiologiczne

Siedem próbek plwociny prezentowanych tutaj zostało pobranych od jednego pacjenta z mukowiscydozą przez siedem kolejnych dni. Pacjent rozpoczął przyjmowanie doustnego antybiotyku (cyprofloksacyny i doksycykliny) w 3. dniu po pobraniu plwociny. Objętość każdej próbki plwociny pobranej od tego pacjenta wynosiła 15 ml przez 7 dni; w związku z tym do próby nie dodano PBS. Celem tego zdarzenia pobierania próbek była ocena protokołów przedstawionych w tym przepływie pracy poprzez (i) ocenę dziennych wahań struktury społeczności drobnoustrojów oraz (ii) porównanie struktury społeczności drobnoustrojów i rozdzielczości między metagenomiką a sekwencjonowaniem 16S rDNA. W związku z tym z każdej próbki wyekstrahowano całkowite DNA i HL-DNA.

Stężenie HL-DNA w każdej próbce plwociny po ekstrakcji DNA jest przedstawione w Tabeli 2. Całkowita wydajność HL-DNA wahała się od 210 ng do >5 μg. Biblioteki sekwencjonowania Illumina zostały wygenerowane z całkowitym materiałem wyjściowym wynoszącym 1 ng dla każdej próbki (rysunek 3). Charakterystykę danych metagenomicznych przedstawiono w tabeli 2. Wszystkie, z wyjątkiem jednej, biblioteki dały ponad 1 milion sekwencji, a ponad 85% sekwencji wysokiej jakości zostało zachowanych po wstępnym przetworzeniu danych za pomocą oprogramowania PRINSEQ29. Wszystkie zestawy danych zostały najpierw wstępnie przetworzone w celu usunięcia duplikatów i sekwencji o niskiej jakości (minimalny wynik jakości 25), a następnie przeprowadzono dalsze badania przesiewowe i usunięto sekwencje pochodzące od ludzi przy użyciu DeconSeq30. Stopień zanieczyszczenia sekwencji pochodzenia ludzkiego w dużym stopniu zależy od właściwości próbki. W tym przypadku całkowita ilość sekwencji pochodzących od człowieka wahała się od 14 do 46% (Tabela 2). Wstępnie przetworzone sekwencje zostały następnie oznaczone adnotacjami przy użyciu potoku Metaphlan31, a także serwera MG-RAST32.

Oprócz metagenomów, biblioteki amplikonów 16S rDNA zostały wygenerowane zarówno z całkowitego DNA, jak i HL-DNA za pomocą starterów ukierunkowanych na około 300 pz regionu zmiennego V1-V2 w genie 16S rRNA33,34. Produkty PCR z pojedynczych próbek znormalizowano i połączono w celu sekwencjonowania przy użyciu sekwencjonowania sparowanych końców Illumina 500-cyklowego wykonanego na platformie MiSeq. Sekwencje amplikonów rDNA 16S o sparowanych końcach posortowano według próbki za pomocą kodów kreskowych za pomocą skryptu Pythona, a sparowane odczyty zmontowano za pomocą phrap35,36. Zmontowane końce sekwencji były przycinane, aż średni wynik jakości wynosił ≥20 przy użyciu okna 5 nt. Potencjalne chimery zostały następnie usunięte za pomocą Uchime37 przeciwko wolnemu od chimery podzbiorowi sekwencji referencyjnych SILVA38. Taksonomia została przypisana do wysokiej jakości odczytów z SINA39 (wersja 1.2.11) przy użyciu 418 497 sekwencji bakteryjnych z bazy danych SILVA38. Sekwencje o identycznych przypisaniach taksonomicznych zostały zgrupowane w celu wytworzenia operacyjnych jednostek taksonomicznych (OTU). W procesie tym wygenerowano 1 655 278 sekwencji dla 16 próbek (średnia wielkość: 103 455 sekwencji/próbkę; min: 72 603; maksimum: 127 113). Mediana wyniku pokrycia towarami, miara kompletności sekwencjonowania, wyniosła ≥ 99,9%. Do analizy i generowania rysunków wykorzystano pakiet oprogramowania Explicet40 (v2.9.4, www.explicet.org). Różnorodność alfa (wewnątrzpróbka) i różnorodność beta (między próbkami) zostały obliczone w Explicet w punkcie rozrzedzenia 72 603 sekwencji z 100 ponownymi próbkami bootstrap.

Pierwszym pytaniem, na które skierowano to badanie, było to, czy hipotoniczna liza preferencyjnie selekcjonuje (tj. preferencyjnie zatrzymuje lub lizuje) określone grupy drobnoustrojów. Po pierwszej hipotonicznej lizie, ponownie zawieszone granulowane komórki zostały podpróbkowane z pierwszych dwóch próbek (CF1-1A* i CF1-2A*) w celu porównania z tymi samymi próbkami po drugiej lizie hipotonicznej (CF1-1 i CF1-2). Wszystkie próbki poddano równej obróbce, tj. przed ekstrakcją DNA poddano działaniu DNazy I, a następnie ekstrakcji DNA i sekwencjonowania. Jak pokazano na rysunku 4, profile mikrobiologiczne podpróbek są bardzo podobne do próbek po dwóch zabiegach lizy hipotonicznej. Ponadto druga liza hipotoniczna zwiększa frakcję sekwencji innych niż ludzkie o 6-17% w metagenomach (Tabela 2).

Aby przetestować różnice w składzie mikrobiologicznym między profilowaniem metagenomicznym a profilowaniem opartym na 16S rDNA, oraz pod kątem zmian przed i po hipotonicznej lizie, które mogą wyjaśnić różnice wcześniej obserwowane między naszymi badaniami a innymi, biblioteki sekwencjonowania bakteryjnego 16S rDNA zostały wygenerowane zarówno z całkowitego DNA, jak i DNA pochodzącego z HL (Figura 4B). Na poziomie rodzaju profile taksonomiczne powszechnych bakterii związanych z mukowiscydozą, takich jak Pseudomonas, Stenotrophomonas, Prevotella, Veillonella i Streptococcus, były bardzo podobne między bibliotekami 16S rDNA a metagenomami wygenerowanymi z DNA pochodzącego z HL. Jednak detekcja Rothia w bibliotekach 16S rDNA nie była tak obfita, jak w przypadku bibliotek metagenomicznych. Porównując profile taksonomiczne 16S rDNA wygenerowane z całkowitego DNA i DNA pochodzącego z HL, Pseudomonas był inaczej reprezentowany w całkowitym DNA w porównaniu z DNA pochodzącym z HL, począwszy od dnia 3.

Metatranskryptomy

Zazwyczaj całkowite RNA wyekstrahowane z plwociny CF jest częściowo zdegradowane, a jego rozmiar waha się od 25 do 4 000 bps (Rysunki 5A i 5C). W tym przypadku przedstawione reprezentatywne wyniki zostały wcześniej opublikowane w Lim et al. 20129. Frakcja rRNA w niezubożonych metatranskryptomach waha się od 27-83%, a względna obfitość rRNA różniła się w zależności od próbki (Tabela 3; dane wyodrębnione z Lim i wsp.9). Jednak zubożenie zestawu Ribo-Zero zmniejszyło względną obfitość rRNA rRNA do 1-5%, z wyjątkiem próbki CF1-F. Różnice w skuteczności usuwania rRNA mogą odzwierciedlać jakość wyekstrahowanego RNA lub różnice w obecnej społeczności drobnoustrojów, a tym samym dostępność rRNA do hybrydyzacji sond9. Elektroferogramy udanej (Figura 5B) i nieudanej (Figura 5D) procedury usuwania rRNA przy użyciu zestawu do usuwania rRNA Ribo-Zero różnią się, przy których pikach rRNA są widoczne w nieudanym usunięciu.

Zakres rozmiarów generowanych bibliotek cDNA często odzwierciedla zakres rozmiarów początkowej próbki RNA. Przedstawione tutaj biblioteki cDNA zostały wygenerowane za pomocą całego zestawu do amplifikacji transkryptomu (WTA2) po wyczerpaniu rRNA, a następnie przygotowaniu biblioteki sekwencjonowania Roche-4549. Wygenerowane cDNA zawiera fragmenty w zakresie od 50 do 4000 bps (ryc. 5E i 5F) i jest wysoce spójne we wszystkich próbkach (Lim i wsp. 2012)9. Dostępność innych zestawów do przygotowywania bibliotek RNA-Seq specyficznych dla platformy zapewnia obecnie więcej alternatywnych opcji łączenia syntezy cDNA i przygotowania biblioteki sekwencjonowania w optymalnych warunkach. Jedną z zalecanych do tej pory opcji jest ScriptSeq Complete Gold Kit łączący zalecane powyżej odczynniki do usuwania rRNA oraz zestaw do przygotowania biblioteki RNA-Seq.

figure-results-1
Rysunek 1: Przebieg pracy w celu przygotowania próbek związanych z gospodarzem, takich jak próbka plwociny, do sekwencjonowania wiromu, mikrobiomu i metatranskryptomu.

figure-results-2
Rysunek 2: Ultrawirowanie gradientów gęstości chlorku cezu ułatwia eliminację zewnątrzkomórkowego DNA i dużych cząstek (A) oraz pozwala na optymalną izolację cząstek wirusopodobnych z plwociny CF. Jeden mililitr każdego gradientu nakłada się warstwami jeden na drugi przed załadowaniem próbki poddanej wstępnej obróbce (B). Po izolacji i oczyszczeniu cząstek, mikroskopia epifluorescencyjna z barwnikami kwasów nukleinowych, takimi jak SYBR Gold, jest stosowana do weryfikacji obecności i czystości cząstek wirusa w próbkach. Przezroczyste cząstki wirusopodobne (C; biała strzałka) zaobserwowano po oddzieleniu próbki plwociny CF w gradinie gęstości.

figure-results-3
Rysunek 3: Przykład rozkładu wielkości bibliotek Nextera XT wygenerowanych z 1 ng HL-DNA, który spowodował mikrobiomy plwociny mukowiscydozy. Normalizacja biblioteki, pooling i ilość ładowania zostały wykonane zgodnie z opisem w protokole producenta bez żadnych odchyleń.

figure-results-4
Rycina 4: Analiza taksonomiczna zbiorowisk drobnoustrojów w dziewięciu próbkach pobranych wzdłużnie od jednego pacjenta z mukowiscydozą. (A) Profile mikrobiologiczne oparte na bibliotekach metagenomicznych wygenerowanych z DNA opartego na metodzie lizy hipotonicznej. Przypisanie gatunków opierało się na potoku Metaphlan po wstępnym przetworzeniu danych, które usuwa duplikaty i sekwencje o niskiej jakości i homologii sekwencji ludzkich. W celu wykazania, że dwuetapowa liza hipotoniczna nie wybiera preferencyjnie poszczególnych grup drobnoustrojów, włączono podpróbki (*) po pierwszej lizie hipotonicznej. (B) Profile mikrobiologiczne oparte na regionie V1V2 sekwencjonowania genu 16S rRNA z całkowitego DNA (T) i DNA opartego na metodzie lizy hipotonicznej (HL). Dane te nie były wcześniej publikowane.

figure-results-5
Rysunek 5: Przykłady elektroferogramów RNA (A-D) i cDNA (E-F) za pomocą bioanalizatora Agilent 2100 wygenerowanych dla bibliotek metatranskryptomicznych, przy użyciu odpowiednio chipów RNA pico i dsDNA o wysokiej czułości. (A) i (C) pokazują przykłady elektroferogramów przed procedurami usuwania rRNA. Elektroferogramy udanej (B) i nieudanej (D) procedury usuwania rRNA przy użyciu zestawu do całkowitego usuwania rRNA różnią się nieznacznie, przy których pikach rRNA są widoczne w nieudanym usunięciu. Zakres wielkości cDNA (E-F) wygenerowany przy użyciu zestawu do amplifikacji całego transkryptomu (Sigma-Aldrich) jest podobny do zakresu rozmiarów początkowego RNA zubożonego w rRNA i wysoce spójny w dwóch różnych próbkach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

osób osób osób osób szt. osób osób osób osób osób osób osób osób osób osób TGL osób osób osób osób osób osób osób osób TGL szt. szt. szt. TGL osób TGLI TGL osób osób osób szt. TGLI osób osób osób osób osób osób szt. TGL osób
Płyta CF1-DCF1-ECF1-FSterownik CF4-APłyta CF4-BPłyta CF4-CZobacz materiał CF5-APłyta CF5-B
Łączna liczba odczytów224 85987 891106 18993 301140 0201 558272 552217 438
Wstępnie przetworzone odczytujeplik109 38973 62467 07082 01168 6171 137215 808158 432
49%84%63%88%49%73%79%73%
Ilość podstaw47 239 57333 351 52528 922 47927 667 69529 386 841243 98695 205 80569 581 811
Średnia długość odczytuZ numerem 432Z numerem 453Z numerem 431Okręg wyborczy 337Z numerem 428Rozdział 215441439
Sekwencje hostówb240Okręg wyborczy 5262879 77413797Okręg wyborczy 5855 859
0.21%0.71%0,04%97,27%0,02%70,10%0.27%3,70%
Wirusowe hityc7 21423 5504 0707374 642 jedyniec22 Rozdział 226 4665 981
6,59%31,99%6,07%0,90%6,77%1,93%3,00%3,78%
Nieprzypisane odczytyd103 88860 49032 7801 93568 440Rozdział 311105 612119 551
94,97%82,16%48,87%2,36%99,74%27,35%48,94%75,46%
a Odczytuje dane po wstępnym przetworzeniu przez PRINSEQ29.
b Odczyty ludzkie zidentyfikowane przez DeconSeq30 plus odczytują z najlepszym trafieniem BLASTn (baza danych nukleotydów NCBI) do gromady Chordata.
c tBLASTx uderza w wewnętrzną bazę danych genomu wirusa. Wartość procentowa została obliczona na podstawie całkowitej liczby wstępnie przetworzonych odczytów.
d Odczytuje bez trafienia BLASTn w bazę danych nukleotydów NCBI. Wartość procentowa została obliczona na podstawie całkowitej liczby wstępnie przetworzonych odczytów. Niektóre odczyty bez trafienia BLASTn w bazę danych nukleotydów NCBI zostały zidentyfikowane jako wirusowe na poziomie białka w analizie tBLASTx.

Tabela 1: Charakterystyka biblioteki ośmiu wiromów wygenerowanych z próbek plwociny przy użyciu przedstawionego przepływu pracy. Ta tabela została zaczerpnięta z Lim et al. (2012)9. Siedem próbek (CF1-D, CF1-E, CF1-F, CF4-B, CF4-C, CF5-A i CF5-B) przetworzono zgodnie z opisem w sekcji 2 i wygenerowano wiromy, które zawierały niewiele (0,02% - 3,7%) sekwencji pochodzenia ludzkiego, z jednym wyjątkiem (70%). CF4-A pominięto w etapie ultrawirowania w gradiencie gęstości (CF4-A) i wygenerowano wirom, który zawierał > 97% sekwencji pochodzenia ludzkiego.

osób osób osób osób osób osób osób osób osób
PróbkakoncentracjaŁączny plonOgółem nie. OdczytujeCałkowita liczba. Odczyty (przetworzone b)Sekwencje inne niż ludzkie
(ng/μl)Panie przewodniczący, panie i panowie!(Surowya)(%)
CF1-1A*2.32301 098 454 937 688691 541
74%
CF1-1131,3002 212 7561 958 9101 574 520
80%
CF1-2A*2.1210 672 878588,106407 530
69%
CF1-25.25201 944 0121 697 0101 455 174
86%
CF1-328.82,8801 048 304896 756560 852
63%
CF1-424.12 4101 154 922984 702621 098
63%
CF1-533.63,3601 029 622 888,630481 548
54%
CF1-643.24,3201 434 0161 256 504725 858
58%
CF1-757.85,7801 000 174 872 036565 376
65%
* 1 ml próbki pobrano z CF1-1 i CF1-2 po pierwszym etapie lizy hipotonicznej (Krok 3.1.5) przed drugą procedurą lizy hipotonicznej. Komórki zostały odwirowane zgodnie z opisem w 3.1.7 i przeszły przez pozostały protokół bez żadnych modyfikacji.
a Nieprzetworzona Illumina odczytuje z sekwencjonowania MiSeq 2 x 300 bp.
b Odczyty były oceniane, przycinane i usuwane na podstawie jakości i długości, jak opisano w dyskusji.

Tabela 2: Charakterystyka mikrobiomów generowanych z próbek plwociny przy użyciu przedstawionego przepływu pracy. Przedstawiono stężenie DNA każdej próbki w 100 μl buforze elucyjnym (5 mM Tris/HCl, pH 8,5) oraz charakterystykę danych sekwencyjnych. Łącznie 1 ng zostało użyte do wygenerowania indywidualnej biblioteki za pomocą zestawu do przygotowania biblioteki Nextera XT.

osób TGL osób osób osób osób osób jedn. LAT Rozdział szt. szt. szt. Rozdział osób SZT. osób osób osób szt. osób TGL osób TGL osób Rozdział osób szt. Rozdział osób jedn. jedynek osób TGLI TGL szt. TGL TGLI osób jedn. osób szt. szt. osób jedyniec
próbkaCF1-DCF1-FCF4-BCF4-C
leczenieżadenRybo-ZerożadenRybo-ZerożadenRybo-ZerożadenRybo-Zero
Wstępnie przetworzone odczyty2 0881 99140 87625 23819 72832 73731 79136 172
Średnia długość odczytuZ dnia 275245Rozdział 262270Rozdział 233259240267
Całkowita liczba odczytów rRNA1 7379129 49917 2675 28529116 3711 761
83,20%4,60%72,20%68,40%26,80%0,90%51,50%4,90%
Mikrobiologiczny rRNA1 414Rozdział 3219 97812 035232276 9161 076
67,70%1,60%48,90%47,70%0,10%0,70%21,80%3,00%
rRNA Eukaryota32359 Rozdział 599 5205 2325 262Rozdział 649 455683
15,50%3,00%23,30%20,70%26,70%0,20%29,70%1,90%
% usuniętych rRNA*0%95%0%5 proc.0%97%0%91%
Odczyty inne niż rRNA351 (16,8%)1 900 (95,4%)11 377 (27,8%)7 971 (31,6%)14 443 (73,2%)32 446 (99,1%)15 420 (48,5%)34 411 (95,1%)
Łączna liczba trafień NR102 (4,9%)691 (34,7%)3 327 (8,1%)2 857 (11,3%)4 938 (25,0%)10 751 (32,8%)5 905 (18,6%)15 766 (43,6%)
Eukariotyczne74 Rozdział 74Okręg wyborczy 4072 7902 5244 61410 2274 5538 274
bakteryjny26Rozdział 283520Rozdział 312Rozdział 2874711 3267 442
Nieprzypisane odczyty249 (11,9%)1 209 (60,7%)8 050 (19,7%)5 114 (20,3%)9 505 (48,2%)21 695 (66,3%)9 515 (29,9%)18 645 (51,5%)
*Ilość usuniętego rRNA wyrażona jako procent ilości obecnej w niezubożonej porcji.

Tabela 3: Charakterystyka biblioteczna metatranskryptomów z i bez wyczerpania rRNA. Dane pochodzą z Lim et al. (2012)9, który zawiera dodatkowe porównanie innych zestawów do usuwania rRNA i efektu nebulizacji cDNA przed przygotowaniem biblioteki sekwencjonowania.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metagenomika wirusowa

Cząsteczki wirusa są zagęszczane za pomocą wytrącania glikolu polietylenowego (PEG) lub koncentratorów o małej objętości. W niektórych przypadkach zatężanie może nie być potrzebne, ale do usunięcia komórek eukariotycznych i drobnoustrojów stosuje się etapy filtracji wstępnej lub wirowania z niską prędkością. Lizaty wirusowe będą dalej wzbogacane i oczyszczane za pomocą ultrawirowania w gradiencie gęstości9,41 lub filtrów o małych rozmiarach (np. 0,45 μm) w celu usunięcia komórek eukariotycznych i dużych komórek drobnoustrojów25. Ultrawirowanie w gradiencie gęstości jest zwykle wykonywane przy użyciu gęstych, ale obojętnych roztworów, takich jak sacharoza lub chlorek cezu, w celu wyizolowania i zagęszczenia cząstek wirusa41. Separacja fizyczna opiera się na wielkości i gęstości wyporu cząstek wirusa. W związku z tym właściwy dobór wielkości porów filtra i rygorystyczne przygotowanie gradientów są niezbędne do wyizolowania określonych społeczności wirusów, ponieważ powodzenie fizycznego odzyskania VLP określa społeczność wyizolowaną41 (tj. cząsteczki wirusa, które nie przechodzą przez filtr lub nie mieszczą się w gęstości ekstrakcji, nie zostaną wykryte w metagenomie). Po wyizolowaniu i zagęszczeniu wirusa w próbce może znajdować się zanieczyszczający niewirusowy materiał genomowy zarówno w postaci wolnych kwasów nukleinowych, jak i komórek drobnoustrojów i komórek eukariotycznych. Dlatego tak ważne jest sprawdzenie czystości cząstek wirusa w próbkach (ryc. 1A i 1B). Leczenie chloroformem jest powszechnie stosowane do lizy pozostałych komórek, a następnie traktowanie nukleazą w celu degradacji wolnych kwasów nukleinowych przed ekstrakcją kwasów nukleinowych.

Zastrzeżeniem do przedstawionego przepływu pracy było zastosowanie separacji gradientu gęstości do izolacji cząstek wirusa, ponieważ może to wykluczyć otoczkowe cząstki wirusa, które mogą być zbyt wyporne, aby dostać się do gradientu CsCl. Alternatywną metodą typu "catch-all" jest pominięcie separacji gradientu gęstości i wyizolowanie DNA zbiorowiska z 0,45 μm – filtratów potraktowanych chloroformem i DNazą I. Takie podejście jest również odpowiednie do uwzględnienia małych objętości próbek, takich jak te z wymazów lub osocza krwi. Może to jednak skutkować zanieczyszczeniem bakteryjnym odpornym na chloroform i większą ilością zewnątrzkomórkowego DNA opornego na DNazę I.

Obecne protokoły sekwencjonowania wymagają od 1 ng do 1 μg kwasów nukleinowych do przygotowania biblioteki sekwencjonowania, przy czym wyższa wydajność DNA zapewnia szerszy wybór opcji sekwencjonowania. Stężenie DNA w generowanych wiromach często waha się od poniżej granicy wykrywalności do ponad 200 ng/μl. Ilość odzyskanych wirusowych kwasów nukleinowych może być niewystarczająca do przygotowania biblioteki sekwencjonowania bezpośredniego. W takich przypadkach niezbędna jest amplifikacja kwasów nukleinowych. Biblioteki amplifikacji linkerowej (LASL)2,42,43 i amplifikacja całego genomu oparta na amplifikacji z wielokrotnym przemieszczeniem (MDA) to dwie metody najczęściej stosowane do generowania wystarczającej ilości DNA do sekwencjonowania. Wiadomo, że metody MDA, takie jak te oparte na polimerazie DNA Phi29, cierpią na błędy amplifikacji i mogą preferencyjnie amplifikować ssDNA i koliste DNA, co skutkuje nieilościową charakterystyką taksonomiczną i funkcjonalną44,45. Wykazano, że zoptymalizowana wersja podejścia LASL wprowadza jedynie minimalne odchylenia, promuje wyższą czułość (dla niewielkich ilości materiału wyjściowego) i jest łatwa do dostosowania do różnych platform sekwencjonowania43. Jednak podejście to składa się z wielu etapów, wymaga specjalistycznego sprzętu w celu zminimalizowania utraty DNA i ogranicza się do matryc dsDNA. W naszym laboratorium podejście to zostało z powodzeniem zaadaptowane do amplifikacji wykrywalnej i niewykrywalnej ilości DNA wyekstrahowanego z VLP pochodzących z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, koralowców i wody morskiej (niepublikowane i Hurwitz i wsp.Tamże, s. 46).

Opracowywanie potoków analizy danych było klasycznie jednym z najtrudniejszych aspektów analizy metagenomiki wirusów ze względu na bardzo zróżnicowany i w dużej mierze nieznany charakter społeczności wirusowych. Chociaż szacuje się, że w biosferze występuje 108 genotypów wirusów, do tej pory obecne bazy danych wirusów zawierają ~ 4 000 genomów wirusowych, co stanowi około 1/100 000 tej przybliżonej całkowitej różnorodności wirusów. W związku z tym poszukiwania oparte na podobieństwie (takie jak BLAST47) w celu przypisania taksonomicznego i funkcjonalnego w metagenomach wirusowych wiążą się z nieodłącznymi wyzwaniami. Wiele sekwencji nie wykazuje znaczących podobieństw do genomów w bazie danych i dlatego są klasyfikowane jako nieznane. Mimo że wyszukiwania oparte na homologii są najważniejszymi zastosowaniami do przypisywania taksonomii i funkcji do danych sekwencji, opracowano alternatywne podejścia oparte na analizie niezależnej od bazy danych48-50. Fancello i wsp.51 zawierają pełny przegląd narzędzi obliczeniowych i algorytmów stosowanych w metagenomice wirusów.

Metagenomika mikrobiologiczna

Zazwyczaj całkowita ilość DNA wyekstrahowanego ze zbiorowisk drobnoustrojów poddanych hipotonicznej lizie (HL-DNA) waha się od 20 ng do 5 μg. Wydajność jest w dużym stopniu zależna od stanu zdrowia pacjenta i ilości pobranej próbki plwociny, co wyjaśnia różnice obserwowane w całkowitej wydajności HL-DNA wyekstrahowanego w tym badaniu (Tabela 2). Krytyczne kroki generowania dobrej jakości danych sekwencyjnych zależą od jakości generowanych bibliotek sekwencjonowania. Rysunek 2 przedstawia typowy zakres rozmiarów bibliotek sekwencjonowania wygenerowanych z DNA drobnoustrojów pochodzących z plwociny CF przy użyciu procedury fragmentacji DNA opartej na enzymatyce. Optymalna wielkość biblioteki zależy od wyboru platformy sekwencjonowania i aplikacji, dlatego procedurę fragmentacji można w razie potrzeby zoptymalizować za pomocą alternatywnych podejść, takich jak sonikacja i nebulizacja. Oprócz przedstawionych reprezentatywnych wyników, sukces przedstawionej metody na plwocinie mukowiscydozy pobranej od wielu pacjentów w wielu punktach czasowych zilustrowano również w Lim i wsp. (2012)9 oraz Lim i wsp. (2014)Rozdział 10.

Poprzednie badania9,10 sugerują, że każdy pacjent jest nosicielem unikalnego zestawu społeczności drobnoustrojów, który zmienia się w czasie, odzwierciedlając w ten sposób trwałość głównych graczy w społeczności, podczas gdy wahania są prawdopodobnie spowodowane zaburzeniami, takimi jak leczenie antybiotykami. To, czy fluktuacje te występują codziennie, nawet bez zewnętrznych zakłóceń, czy też z powodu procedury pobierania próbek i przetwarzania próbek, jest nadal wątpliwe. Na podstawie analizy metagenomicznej HL-DNA i amplikonu 16S rDNA, 7-dniowe pobieranie próbek podłużnych pokazuje, że dzienne wahania profili mikrobiologicznych bez zaburzeń antybiotykowych (dzień 1, 2 i 3) były minimalne (ryc. 3A i 3B). Po wprowadzeniu doustnych antybiotyków natychmiast po pobraniu próbek w dniu 3, zmiany w profilu społeczności stały się widoczne w dniu 4. Podczas gdy antybiotyk cyprofloksacyna jest ukierunkowany na szerokie spektrum znanych patogenów bakteryjnych, takich jak P. aeruginosa, Staphylococcus aureus i Streptococcus pneumonia, leczenie zwiększyło względną liczebność P. aeruginosa, jednocześnie zmniejszając Streptococcus spp. i P. melaninogenica. Do dnia 6 społeczność powoli wracała do początkowej struktury społeczności. Wyniki sugerują, że wahania profili mikrobiologicznych u jednego pacjenta są bardziej prawdopodobne z powodu zaburzeń środowiskowych w drogach oddechowych.

Biorąc pod uwagę spójność między profilami mikrobiologicznymi bibliotek 16S rDNA a metagenomami z DNA pochodzącego z HL, wykluczyliśmy odchylenia pochodzące ze starterów 16S rRNA użytych w tym badaniu. Jednym z możliwych wyjaśnień różnic obserwowanych w profilach taksonomicznych 16S rDNA wygenerowanych z całkowitego DNA i DNA pochodzącego z HL (Figura 3B) może być obecność dużych ilości zewnątrzkomórkowego DNA Pseudomonas spp. po leczeniu antybiotykami. Potwierdzają to wyniki, że różnice te były najbardziej widoczne w dniu 7, trzy dni po leczeniu antybiotykami, które są skierowane przeciwko Pseudomonas spp. oprócz innych. Ciprofloksacyna jest powszechnie stosowana jako lek pierwszego rzutu u pacjentów z mukowiscydozą i przewlekłym zakażeniem P. aeruginosa, mimo że jej spektrum działania obejmuje większość patogenów związanych z mukowiscydozą. Postawiliśmy hipotezę, że antybiotykoterapia eliminuje podatne społeczności, w tym Streptococcus spp., tworząc w ten sposób niszę wypełnioną przez oporny P. aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa może uzyskać odporność poprzez zwiększenie swoich zbiorowisk biofilmu, a zewnątrzkomórkowe DNA okazało się być głównym wsparciem strukturalnym architektury biofilmu52. Nawet gdy struktura społeczności się odbudowała, zewnątrzkomórkowe DNA mogło pozostać w plwocinie mukowiscydozy. Dlatego dane te sugerują, że hipotoniczna liza i etapy mycia przedstawione w tym przepływie pracy potencjalnie przynoszą korzyści nie tylko w usuwaniu DNA pochodzącego od człowieka, ale także zewnątrzkomórkowego DNA pochodzącego z drobnoustrojów, które może błędnie przedstawiać rzeczywiste profile mikrobiologiczne.

Metatranskryptomika

Metatranskryptom wysokiej jakości powinien zawierać stosunkowo niewiele sekwencji rybosomalnego RNA (rRNA) i reprezentować bezstronną próbkę transkryptów społeczności (mRNA). Ze względu na krótki okres półtrwania i ograniczoną ilość mRNA, bardzo ważne jest, aby przedstawiony tutaj protokół minimalizował obsługę próbek, aby zmaksymalizować liczbę odzyskanych transkryptów.

W ostatnich latach opracowano kilka podejść do zubożenia rRNA, które zaadaptowano do dostępnych na rynku zestawów. Należą do nich MICROBEnrich, Ribo-Zero i specyficzne dla próbki hybrydyzacjesubtraktywne 53 , które są oparte na hybrydyzacji oligonukleotydowej, oraz zestaw mRNA-ONLY, który opiera się na aktywności enzymatycznej egzonukleazy ukierunkowanej na RNA zawierającą monofosforan 5'. Ponadto dostępnych jest również kilka podejść do wzbogacania mRNA, takich jak zestaw MessageAmp II-Bacteria Kit, który preferencyjnie poliadenyluje i amplifikuje liniowe RNA. Niektóre z tych metod (np. mRNA-ONLY, MICROBExpress i MessageAmp) są stosowane jednocześnie w celu uzyskania optymalnej wydajności. Jednak skuteczność wszystkich tych podejść jest ograniczona, zwłaszcza podczas pracy z częściowo zdegradowanym rRNA, co często obserwuje się w całkowitym RNA wyekstrahowanym z próbek mukowiscydozy. Amplifikacja RNA zależna od poliadenylacji nie może być stosowana do generowania metatranskryptomów składających się zarówno z eukariotycznego, jak i prokariotycznego mRNA. Ponadto, ogon poli(A) dodany do sekwencji może zmniejszyć ilość użytecznych danych sekwencji. Regiony z rozciągnięciem homopolimeru będą miały tendencję do uzyskiwania niższych wyników jakości, co spowoduje, że znaczna liczba odczytów zostanie odfiltrowana przez oprogramowanie do sekwencjonowania i sekwencjonowania, a średnia użyteczna długość odczytu po odcięciu ogonów poli (A) zostanie znacznie zmniejszona54.

Mając do czynienia ze złożonymi zbiorowiskami drobnoustrojów mukowiscydozy i częściowo zdegradowanym RNA (ryc. 4A i 4C), nasze poprzednie badanie wykazało, że metoda hybrydyzacji-wychwytywania za pomocą zestawu Ribo-Zero Gold była bardziej skuteczna w usuwaniu zarówno ludzkiego, jak i mikrobiologicznego rRNA w porównaniu z łączonymi zabiegami przy użyciu innych zestawów9 (Tabela 3). Uzyskane w ten sposób dane pozwalają na jednoczesną analizę zarówno transkryptów ludzkiego gospodarza, jak i mikrobiologicznych. W zależności od wydajności i jakości RNA, a także ostatecznego wyboru platformy sekwencjonowania, wiele z tych procesów, w tym etap syntezy cDNA, można usprawnić dzięki generowaniu biblioteki sekwencjonowania. Na przykład RNA traktowane Ribo-Zero można wykorzystać do tworzenia bibliotek sekwencjonowania metatranskryptomu przy użyciu zestawu ScriptSeq RNA-Seq Library Preparation Kit.

Analiza metagenomiczna społeczności związanych ze zwierzętami zapewnia kompleksową reprezentację ogólnej jednostki funkcjonalnej, która obejmuje gospodarza i powiązane z nim społeczności. Przedstawiony tutaj przepływ pracy można dostosować do różnych złożonych próbek związanych ze zwierzętami, zwłaszcza tych, które zawierają gęsty śluz, duże ilości szczątków komórkowych, zewnątrzkomórkowe DNA, kompleksy białkowe i glikoproteinowe, a także komórki gospodarza oprócz pożądanych cząstek wirusowych i mikrobiologicznych. Mimo że cząsteczki wirusów i drobnoustrojów mogą zostać utracone na każdym kroku, izolacja i oczyszczanie cząstek są niezbędne, aby zminimalizować ilość DNA gospodarza. Podczas gdy dane metagenomiczne dostarczają potencjałów metabolicznych badanych społeczności, metatranskryptomika uzupełnia je, ujawniając różnicową ekspresję zakodowanych funkcji9. Kompleksowa ocena danych genomicznych i transkryptów dostarczyła nowych informacji na temat dynamiki interakcji społeczności i ułatwia opracowanie ulepszonych terapii9,10,55.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta przez Narodowy Instytut Zdrowia (1 R01 GM095384-01) przyznany Forestowi Rohwerowi. Dziękujemy Epicentre, firmie należącej do Illumina, za zapewnienie wczesnego dostępu do zestawów epidemiologicznych Ribo-Zero. Dziękujemy Markowi Hatayowi za zaprojektowanie i wyprodukowanie uchwytu na probówkę do ultrawirówki. Dziękujemy Andreasowi Haasowi i Benjaminowi Knowlesowi za krytyczną lekturę i dyskusję na temat rękopisu, a także Lauren Paul za pomoc w procesie filmowania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bufor do lizy RNA na bazie izotiocyjanianu guanidynyLife Technologies10296-028TRIzol LS Odczynnik został użyty w tym badaniu
Kulki krzemionkowe; 0,1 do 0,15 mmCole-ParmerYO-36270-62W tym badaniu użyto kulek cyrkonowo-krzemianowych
Ditiothreitol, klasa cząsteczkowa (suchy proszek)PromegaV3155Można kupić w dowolnej innej firmie
Sterylny filtr strzykawkowy; 0,45 &mikro; m wielkość porów hydrofilowa membrana PVDFMiliporeSLHV033RS
enzym DNazy I Calbiochem260913
Sterylny filtr strzykawkowy; 0,02 &mikro; m wielkość porówFisherScientific09-926-13Średnica: 25 mm
Ultra-przezroczyste probówki wirówkoweBeckman3440599/16 x 3 & frac12; in. (14 x 90 mm), nadaje się do wirnika SW41 Ti i ultrawirowania gradientu gęstości VLP
SW41 Ti RotorBeckman333790
SS-34 wirnik o stałym kącieThermo Scientific28020
Phi29 polimeraza DNAMonserate Biotech400110 U/µ l
Phi29 Losowy heksamerThermo ScientificS0181Wcześniej zakupiony od Fidelity Systems
Filtr matrycowy z tlenku glinu z pierścieniowym polipropylenowym pierścieniem nośnym; 0,02 i mikro; m wielkość porówFisherScientific09-926-34W pracy wykorzystano membrany filtracyjne Whatman Anodisc; średnica 25 mm
SYBR Złota plama w żelu kwasu nukleinowegoLife TechnologiesS-11494
2-merkaptoetanolSigma-AldrichM6250-100ML
DNaza wolna od RNaz I NEBM0303SMożna kupić w dowolnej innej firmie
Glikogen, klasa RNAFisherScientificFERR0551Można kupić w dowolnej innej firmie
Szybkie probówki wirówkowe Oak RidgeFisherScientific05-562-16BDo procedury ekstrakcji DNA o dużej objętości, odpowiednia do wirnika SS-34 o stałym kącie działania
Zestaw do usuwania całkowitego rRNAEpicentrumMRZE724ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiologia) może być używany do łączenia usuwania rRNA z przygotowaniem biblioteki sekwencjonowania
Chlorek cezu FisherScientificBP1595-500
Bromek heksadecytrimetyloamoniowy (CTAB)Sigma-AldrichH5882-100G

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Suau, A., et al. Direct analysis of genes encoding 16S rRNA from complex communities reveals many novel molecular species within the human gut. Applied and Environmental Microbiology. 65 (11), 4799-4807 (1999).
  2. Breitbart, M., et al. Genomic analysis of uncultured marine viral communities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (22), 14250-14255 (2002).
  3. Proctor, L. M. The human microbiome project in 2011 and beyond. Cell Hos., & Microbe. 10 (4), 287-291 (2011).
  4. Charlson, E. S., et al. Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 184 (8), 957-963 (2011).
  5. Pragman, A. A., Kim, H. B., Reilly, C. S., Wendt, C., Isaacson, R. E. The lung microbiome in moderate and severe chronic obstructive pulmonary disease. PLoS ONE. 7 (10), e47305(2012).
  6. Kerem, B., et al. Identification of the Cystic Fibrosis gene: Genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
  7. Kleven, D., McCudden, C., Willis, M. Cystic Fibrosis: Newborn screening in America. Medical Laboratory Observer. 40 (7), 16-27 (2008).
  8. Fodor, A. A., et al. The adult cystic fibrosis airway microbiota is stable over time and infection type, and highly resilient to antibiotic treatment of exacerbations. PLoS ONE. 7 (9), e45001(2012).
  9. Lim, Y. W., et al. Metagenomics and metatranscriptomics: Windows on CF-associated viral and microbial communities. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 12 (2), 154-164 (2012).
  10. Lim, Y. W., et al. Clinical insights from metagenomic analysis of sputum samples from patients with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 52 (2), 425-437 (2014).
  11. Claesson, M. J., et al. Comparison of two next-generation sequencing technologies for resolving highly complex microbiota composition using tandem variable 16S rRNA gene regions. Nucleic Acids Research. 38 (22), e200(2010).
  12. Breitenstein, S., Tümmler, B., Römling, U. Pulsed field gel electrophoresis of bacterial DNA isolated directly from patients’ sputa. Nucleic Acids Research. 23 (4), 722-723 (1995).
  13. Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. Recombinant human DNase I reduces the viscosity of Cystic Fibrosis sputum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 87 (23), 9188-9192 (1990).
  14. Lethem, M., James, S., Marriott, C., Burke, J. The origin of DNA associated with mucus glycoproteins in Cystic Fibrosis sputum. European Respiratory Journal. 3 (1), 19-23 (1990).
  15. Childs, W. C., Gibbons, R. J. Use of percoll density gradients for studying the attachment of bacteria to oral epithelial cells. Journal of Dental Research. 67 (5), 826-830 (1988).
  16. Lee, J. -L., Levin, R. E. Use of ethidium bromide monoazide for quantification of viable and dead mixed bacterial flora from fish fillets by polymerase chain reaction. Journal of Microbiological Methods. 67 (3), 456-462 (2006).
  17. Breitenstein, S., Tümmler, B., Römling, U. Pulsed field gel electrophoresis of bacterial DNA isolated directly from patients’ sputa. Nucleic Acids Research. 23 (4), 722-723 (1995).
  18. Mokili, J. L., Rohwer, F., Dutilh, B. E. Metagenomics and future perspectives in virus discovery. Current Opinion in Virology. 2 (1), 63-77 (2012).
  19. Bibby, K. Improved bacteriophage genome data is necessary for integrating viral and bacterial ecology. Microbial Ecology. 67 (2), 242-244 (2014).
  20. Willner, D., et al. Metagenomic analysis of respiratory tract DNA viral communities in Cystic Fibrosis and non-Cystic Fibrosis individuals. PloS One. 4 (10), e7370(2009).
  21. Willner, D., Furlan, M. Deciphering the role of phage in the cystic fibrosis airway. Virulence. 1 (4), 309-313 (2010).
  22. Willner, D., et al. Case studies of the spatial heterogeneity of DNA viruses in the cystic fibrosis lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46 (2), 127-131 (2012).
  23. Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics. mBio. 2 (2), e00012-e00011 (2011).
  24. He, S., et al. Metatranscriptomic array analysis of “Candidatus Accumulibacter phosphatis”-enriched enhanced biological phosphorus removal sludge. Environmental Microbiology. 12 (5), 1205-1217 (2010).
  25. Mokili, J. L., et al. Identification of a novel Human Papillomavirus by metagenomic analysis of samples from patients with febrile respiratory illness. PLOS ONE. 8 (3), e58404(2013).
  26. Henig, N. R., Tonelli, M. R., Pier, M. V., Burns, J. L., Aitken, M. L. Sputum induction as a research tool for sampling the airways of subjects with Cystic Fibrosis. Thorax. 56 (4), 306-311 (2001).
  27. Rogers, G. B., et al. Use of 16S rRNA gene profiling by terminal restriction fragment length polymorphism analysis to compare bacterial communities in sputum and mouthwash samples from patients with Cystic Fibrosis. J. Clin. Microbiol. 44 (7), 2601-2604 (2006).
  28. Haas, A., et al. Unraveling the unseen players in the ocean - a field guide to water chemistry and marine microbiology. Journal of Visualized Experiments. In press, Forthcoming.
  29. Schmieder, R., Edwards, R. Quality control and preprocessing of metagenomic datasets. Bioinformatics. 27 (6), 863-864 (2011).
  30. Schmieder, R., Edwards, R. Fast identification and removal of sequence contamination from genomic and metagenomic datasets. PLOS ONE. 6 (3), e17288(2011).
  31. Segata, N., et al. Metagenomic microbial community profiling using unique clade-specific marker genes. Nature Methods. 9 (8), 811-814 (2012).
  32. Meyer, F., et al. The metagenomics RAST server - a public resource for the automatic phylogenetic and functional analysis of metagenomes. BMC Bioinformatics. 9 (1), 386(2008).
  33. Hara, N., et al. Prevention of virus-induced type 1 diabetes with antibiotic therapy. Journal of Immunology (Baltimore, Md.: 1950). 189 (8), 3805-3814 (2012).
  34. Markle, J. G. M., et al. Sex differences in the gut microbiome drive hormone-dependent regulation of autoimmunity. Science (New York, N.Y.). 339 (6123), 1084-1088 (2013).
  35. Ewing, B., Green, P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Research. 8 (3), 186-194 (1998).
  36. Ewing, B., Hillier, L., Wendl, M. C., Green, P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. I. Accuracy assessment. Genome Research. 8 (3), 175-185 (1998).
  37. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics (Oxford, England). 27 (16), 2194-2200 (2011).
  38. Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).
  39. Pruesse, E., Peplies, J., Glöckner, F. O. SINA: accurate high-throughput multiple sequence alignment of ribosomal RNA genes. Bioinformatics (Oxford, England). 28 (14), 1823-1829 (2012).
  40. Robertson, C. E., et al. Explicet: graphical user interface software for metadata-driven management, analysis and visualization of microbiome data. Bioinformatics (Oxford, England). 29 (23), 3100-3101 (2013).
  41. Thurber, R. V., Haynes, M., Breitbart, M., Wegley, L., Rohwer, F. Laboratory procedures to generate viral metagenomes. Nat. Protocols. 4 (4), 470-483 (2009).
  42. Henn, M. R., et al. Analysis of high-throughput sequencing and annotation strategies for phage genomes. PLoS ONE. 5 (2), e9083(2010).
  43. Duhaime, M. B., Deng, L., Poulos, B. T., Sullivan, M. B. Towards quantitative metagenomics of wild viruses and other ultra-low concentration DNA samples: a rigorous assessment and optimization of the linker amplification method. Environmental Microbiology. 14 (9), 2526-2537 (2012).
  44. Yilmaz, S., Allgaier, M., Hugenholtz, P. Multiple displacement amplification compromises quantitative analysis of metagenomes. Nat Meth. 7 (12), 943-944 (2010).
  45. Kim, K. -H., Bae, J. -W. Amplification methods bias metagenomic libraries of uncultured single-stranded and double-stranded DNA viruses. Applied and Environmental Microbiology. 77 (21), 7663-7668 (2011).
  46. Hurwitz, B. L., Deng, L., Poulos, B. T., Sullivan, M. B. Evaluation of methods to concentrate and purify ocean virus communities through comparative, replicated metagenomics. Environmental Microbiology. 15 (5), 1428-1440 (2013).
  47. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology. 215, 403-410 (1990).
  48. Angly, F., et al. PHACCS, an online tool for estimating the structure and diversity of uncultured viral communities using metagenomic information. BMC Bioinformatics. 6 (1), 41(2005).
  49. Angly, F. E., et al. The GAAS Metagenomic Tool and Its Estimations of Viral and Microbial Average Genome Size in Four Major Biomes. PLoS Comput Biol. 5 (12), (2009).
  50. Dutilh, B. E., et al. Reference-independent comparative metagenomics using cross-assembly: crAss. Bioinformatics (Oxford, England). 28 (24), 3225-3231 (2012).
  51. Fancello, L., Raoult, D., Desnues, C. Computational tools for viral metagenomics and their application in clinical research. Virology. 434 (2), 162-174 (2012).
  52. Allesen-Holm, M., et al. A characterization of DNA release in Pseudomonas aeruginosa cultures and biofilms. Molecular Microbiology. 59 (4), 1114-1128 (2006).
  53. Stewart, F. J., Ottesen, E. A., DeLong, E. F. Development and quantitative analyses of a universal rRNA-subtraction protocol for microbial metatranscriptomics. ISME J. 4 (7), 896-907 (2010).
  54. Frias-Lopez, J., et al. Microbial community gene expression in ocean surface waters. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (10), 3805-3810 (2008).
  55. Lim, Y. W., et al. Mechanistic model of Rothia mucilaginosa adaptation toward persistence in the CF lung, based on a genome reconstructed from metagenomic data. PLOS ONE. 8 (5), e64285(2013).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sekwencjonowanie metagenomiczneanaliza metatranskrypomicznaplwocina w mukowiscydoziemetagenom wirusowymetagenom mikrobiologicznyliza hipotonicznaultracentryfugacja w gradiencie g sto cigradient chlorku cezubufor do lizy RNAkulki krzemionkowe

Powiązane artykuły