Wygaszanie fluorescencji fluoroforu bliskiej podczerwieni w obudowie liposomalnej jako narzędzie do obrazowania optycznego in vivo

Liposomy zostały intensywnie zbadane i służą jako jeden z najbardziej biokompatybilnych systemów dostarczania leków biomedycznych do zastosowań klinicznych^1,2. Składają się głównie z fosfolipidów i cholesterolu, z których oba są biokompatybilnymi związkami naśladującymi części naturalnych błon komórkowych. Podczas gdy substancje hydrofilowe mogą być uwięzione we wnętrzu wodnym, czynniki lipofilowe mogą być włączane do liposomalnej dwuwarstwy fosfolipidowej³. Enkapsulacja substancji w wodnym wnętrzu liposomów zapewnia ochronę przed degradacją in vivo, a także zapobiega toksycznemu działaniu układu gospodarza przed toksycznym działaniem leków cytotoksycznych stosowanych w terapii chorób, na przykład chemioterapeutyków mających na celu niszczenie komórek nowotworowych. Modyfikacja powierzchni liposomalnej za pomocą polimerów, takich jak glikol polietylenowy (PEGylacja), dodatkowo wydłuża czas liposomalnego krążenia krwi in vivo dzięki stabilizacji sterycznej⁴. Ponadto liposomy mogą sekwestrować wysokie stężenia kilku substancji, takich jak białka^5,6, substancje hydrofilowe^7,8 i enzymy⁹. W związku z tym służą jako wiarygodne narzędzia kliniczne, terapeutyczne i diagnostyczne, które zasługują na ich dopuszczenie do stosowania leków cytotoksycznych, takich jak doksorubicyna, w terapii nowotworów⁴. Ze względu na swoją elastyczność liposomy mogą być również ładowane fluorochromami do celów diagnostycznych i chirurgicznych pod kontrolą obrazu.

Obrazowanie fluorescencyjne dostarcza opłacalnego i nieinwazyjnego narzędzia diagnostycznego in vivo, które jednak wymaga pewnych podstawowych wymagań. Można wykazać, że fluorochromy, które najlepiej nadają się do obrazowania in vivo, mają charakterystyczne maksima absorpcji i emisji w zakresie, w którym dyspersja i rozpraszanie światła, a także autofluorescencja tkanek pochodzących z wody i hemoglobiny są niskie. Tak więc takie sondy mają swoje maksima abs/em między 650 a 900 nm¹⁰. Poza tym stabilność fluorochromów zarówno in vitro, jak i in vivo ma kluczowe znaczenie, ponieważ opsonizacja i szybki klirens mogą znacznie ograniczyć ich zastosowanie w obrazowaniu in vivo ¹¹. Inne skutki, takie jak słaba stabilność i niska czułość lub działanie cytotoksyczne na narządy docelowe, jak obserwowane w przypadku zieleni indocyjaninowej (ICG)^12-16, są niepożądane i muszą być brane pod uwagę przy projektowaniu sond do obrazowania in vivo. Obserwacje te doprowadziły do aktywnego rozwoju kilku przedklinicznych fluorochromów NIR, nanocząstek, a także nowych technik obrazowania in vivo procesów zapalnych, nowotworów oraz chirurgii sterowanej obrazem^17-20. Pomimo stabilności większości przedklinicznych barwników NIRF (fluorescencja bliskiej podczerwieni) in vitro, ich szybka perfuzja i klirens przez wątrobę i nerki utrudniają ich zastosowanie w obrazowaniu optycznym in vivo chorób i procesów zapalnych.

Dlatego prezentujemy protokół enkapsulacji fluorochromów, takich jak dobrze scharakteryzowany barwnik fluorescencyjny bliskiej podczerwieni DY-676-COOH, znany ze swojej tendencji do samoczynnego gaszenia przy stosunkowo wysokich stężeniach²¹ w liposomach. Przy wysokich stężeniach tworzenie H-dimerów i/lub oddziaływania pi-stacking między cząsteczkami fluoroforu znajdującymi się w promieniu Förstera powodują transfer energii rezonansu Förstera (FRET) między cząsteczkami fluorochromu. Przy niskim stężeniu zwiększa się przestrzeń między cząsteczkami fluoroforu, zapobiegając w ten sposób interakcji pi-stacking i tworzeniu się H-dimerów, co skutkuje wysoką emisją fluorescencji. Przełączanie między wysokim i niskim stężeniem oraz towarzyszące mu wygaszanie i aktywacja fluorescencji jest obiecującą strategią, którą można wykorzystać do obrazowania optycznego²². Pod tym względem enkapsulacja wysokich stężeń barwnika NIRF DY-676-COOH w wodnym wnętrzu liposomów jest korzystniejsza do obrazowania in vivo niż wolny barwnik. Wyzwanie związane z tą metodą polega po pierwsze na prawidłowej enkapsulacji, a po drugie, na walidacji korzyści wynikających z kapsułkowania wysokich stężeń barwnika. Niezbędne jest porównanie właściwości obrazowania wygaszonych liposomów z właściwościami wolnego barwnika, a także z niegaszonym preparatem liposomowym o niskich stężeniach barwnika. Za pomocą prostego, ale bardzo skutecznego protokołu hydratacji i ekstruzji folii w połączeniu z naprzemiennymi cyklami zamrażania i rozmrażania pokazujemy, że enkapsulacja stężeń hartujących DY-676-COOH w liposomach jest możliwa. Inne metody stosowane do przygotowania liposomów, takie jak metoda odparowywania z odwróconymi fazami²³, a także metoda wstrzykiwania etanolu²⁴, umożliwiają przygotowanie liposomów o wysokiej skuteczności enkapsulacji dla wielu substancji hydrofilowych. Jednak charakter substancji, która ma być kapsułkowana, może mieć wpływ na skuteczność kapsułkowania. W efekcie, przedstawiony tutaj protokół hydratacji i ekstruzji folii wykazał najwyższą skuteczność enkapsulacji DY-676-COOH. Aby zilustrować korzyści płynące z liposomalnej enkapsulacji DY-676-COOH, wykorzystano model obrzęku wywołany zymosanem, który pozwala na badanie procesów zapalnych w ciągu kilku godzin. W tym miejscu wykazano, że liposomy o wysokich stężeniach kapsułkowanego DY-676-COOH są bardziej odpowiednie do optycznego obrazowania procesów zapalnych całego ciała in vivo niż wolny barwnik lub niegaszona formuła liposomalna o niskich stężeniach barwnika. W ten sposób podstawowy protokół zapewnia prostą i szybką metodę wytwarzania wygaszonych liposomów fluorescencyjnych oraz walidacji ich potencjału aktywacji i obrazowania zarówno in vitro, jak i in vivo.

UWAGA: Wszystkie procedury są zatwierdzone przez regionalny komitet ds. zwierząt i zgodne z międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi etycznego wykorzystywania zwierząt.

1. Przygotowanie materiałów i instrumentów

1. Przygotowanie spontanicznie powstałej dyspersji pęcherzykowej (SFV)
   1. Rozpuścić i przygotować roztwory podstawowe następujących fosfolipidów: 214 mg/ml fosfatydylocholiny jaj (EPC), 134 mg/ml cholesterolu, 122 mg/ml 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminy-N-[metoksy(glikol polietylenowy)-2000] (sól amonowa) (mPEG_2000-DSPE) i 2 mg/ml 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-(7-nitro-2-1,3-benzoksadiazol-4-ylo) (sól amonowa) (NBD-DOPE) w chloroformie i przechowywać w szklanych fiolkach.
   2. Dostarczyć około 3 ml chloroformu do kolby okrągłodennej i przenieść odpowiednią objętość roztworu podstawowego fosfolipidów do kolby okrągłodennej w celu przygotowania liposomów złożonych z EPC:Chol:mPEG_2000-DSPE w stosunku molowym 6,5:3:0,5. W celu podwójnego znakowania fluorescencyjnego liposomów dodać 0,3% mol NBD-DOPE do roztworu lipidowego.
   3. Odparować chloroform z organicznego roztworu fosfolipidów pod zmniejszonym ciśnieniem (300 mbar) w temperaturze 55 °C za pomocą wyparki obrotowej.
   4. Po utworzeniu jednorodnego filmu fosfolipidowego należy zmniejszyć ciśnienie do 10 mbar na 1-2 godziny, aby usunąć resztki osadu chloroformu.
   5. Podczas parowania chloroformu rozpuść DY-676-COOH (6,181 μM) w 10 mM buforze Tris o pH 7,4 i napełnij naczynie Dewara ciekłym azotem. Włączyć łaźnię ultradźwiękową i ustawić na 50 °C.
   6. Przenieść odpowiednią objętość (0,5–1 ml) roztworu DY-676-COOH (6,181 μM) do kolby okrągłodennej w celu uwodnienia suchego filmu fosfolipidowego i energicznie wirować, aż utworzy się spontanicznie utworzona dyspersja pęcherzykowa (SFV). Upewnij się, że wszystkie fosfolipidy są rozproszone, aby uniknąć utraty lipidów.
   7. Ostrożnie przenieść kolbę okrągłodenną zawierającą dyspersję SFV do ciekłego azotu i zamrozić dyspersję na 3–5 minut. Umieścić kolbę okrągłodenną w łaźni ultradźwiękowej o temperaturze 50 °C w celu rozmrożenia dyspersji, a następnie energicznie wirować dyspersję przez 1–2 minuty. Powtórz tę procedurę sześć razy, co daje w sumie siedem cykli zamrażania i rozmrażania.
2. Wytłaczanie SFV w celu utworzenia jednorodnych pęcherzyków liposomowych
   1. Przenieść dyspersję SFV do strzykawki o pojemności 1 ml (strzykawka-a) i wytłaczać dyspersję przez membranę poliwęglanową 100 nm za pomocą ekstrudera LiposoFast-Basic do strzykawki-b.
   2. Wyciśnij dyspersję ze strzykawki b z powrotem do strzykawki a, a następnie powtórz cykl dziesięć razy. Na skutek wytłaczania roztwór w strzykawce z czasem zmienia się z zamglonego wyglądu w wyraźną dyspersję. Po dziesięciu cyklach (dwadzieścia pojedynczych etapów wytłaczania) wyjmij strzykawkę b z urządzenia i po raz ostatni wyciśnij dyspersję ze strzykawki a bezpośrednio do sterylnej probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 ml.
3. Oczyszczanie liposomalnego kapsułkowanego DY-676-COOH z wolnego barwnika
   1. Przygotować kolumnę do chromatografii żelowej przy użyciu kulek G25 nasączonych 10 mM buforem Tris o pH 7,4 (długość kolumny 28 cm, średnica 0,8 cm).
   2. Przenieść 0,5 ml wytłaczanej dyspersji pęcherzykowej na złoże żelowe i pozwolić próbce spłynąć do matrycy żelowej.
   3. Eluować liposomy za pomocą 10 mM buforu Tris o pH 7,4 (Rysunek 1A) i myć kolumnę, aż wolny barwnik całkowicie spłynie z kolumny. W razie potrzeby zbierz i poddaj recyklingowi wolny barwnik poprzez odsalanie i odwadnianie zgodnie z instrukcjami producenta.
   4. Zagęścić eluowane liposomy przez ultrawirowanie (200 000 x g, 2 godziny w temperaturze 8 °C), a następnie rozproszyć je w odpowiedniej objętości sterylnego 10 mM buforu Tris o pH 7,4.
4. Kwantyfikacja stężenia DY-676-COOH w kapsułkach
   1. Przygotować krzywą kalibracyjną, rozpuszczając DY-676-COOH (0, 82, 124, 247, 494, 988 nM) w 10 mM buforze Tris o pH 7,4 zawierającym 0,1% Triton X100.
   2. Rozpuścić 2 μl (100 nmol końcowego lipidu z 50 mmol/l podstawy) liposomów przez 5 minut w temperaturze pokojowej w 100 μl buforu Tris zawierającego 1% Triton X100 w celu zniszczenia pęcherzyków i uwolnienia kapsułkowanego barwnika. Następnie rozcieńczyć próbki 10 mM buforem Tris o pH 7,4 do końcowego stężenia Triton-X100 wynoszącego 0,1% (v/v), uzyskując całkowitą objętość 1 ml. Przygotować wszystkie próbki w dwóch egzemplarzach.
   3. Zmierzyć absorpcję i emisję wszystkich próbek (wolne liposomy poddane działaniu DY-676-COOH i Triton-X100) przy wzbudzeniu λ=645 nm i emisji λ = 700 nm. Ustalić i użyć krzywej kalibracyjnej wolnego barwnika w celu określenia stężenia barwnika w kapsułkach.
5. Charakterystyka liposomów
   1. Określ rozmiary i potencjał zeta liposomów za pomocą dynamicznego rozpraszania światła. Próbki liposomalne rozcieńczyć wysterylizowanym filtrem (0,2 μm) 10 mM buforem Tris o pH 7,4 do stężenia 100–300 μM (lipid). Rozcieńczone próbki należy przenieść do jednorazowej kuwety o małej objętości i zmierzyć próbkę zgodnie z instrukcjami producenta.
   2. Scharakteryzuj liposomy za pomocą mikroskopii elektronowej, aby uzasadnić wielkość, integralność i jednorodność pęcherzyków liposomalnych zgodnie ze standardowymi protokołami.

2. Walidacja wygaszania fluorescencji i aktywacji przygotowanych liposomów

1. Analiza fizykochemiczna wygaszania i aktywacji fluorescencji
   1. Przygotuj dwie probówki o pojemności 1,5 ml dla Lip-Q i 2 probówki dla wolnego DY-676-COOH. Przenieść 100 nmol lipidów całkowitych (2,38 μl roztworu podstawowego Lip-Q o stężeniu 42 mmol/l, zawierającego 138 μg/ml kapsułkowanego DY-676-COOH) do odpowiednich probówek. Transfer wolny DY-676-COOH odpowiadający zawartości barwnika w Lip-Q (0,38 μg, co wynika np. z 138 μg/1 000 μl x 2,38 μl użytego Lip-Q). Inkubować jedną probówkę każdej sondy w temperaturze 4 °C i zamrażać drugą probówkę w temperaturze -80 °C przez noc (16 godzin).
   2. Podgrzać blok grzewczy do temperatury 30 °C. Napełnić komorę chłodzącą kruszonym lodem i zrównoważyć podwielokrotność 10 mM buforu Tris o pH 7,4 do temperatury pokojowej.
   3. Wyjąć sondy z 4 °C i zrównoważyć w temperaturze pokojowej (owinięte folią aluminiową w celu ochrony przed światłem) i szybko rozmrozić sondy od -80 °C w temperaturze 30 °C przez 5 minut. Schłodzić rozmrożone sondy na lodzie przez 1 minutę przed przeniesieniem ich do temperatury pokojowej (również owinięte folią aluminiową w celu ochrony przed światłem).
   4. Dodać 10 mM buforu Tris (pH 7,4) do każdej z sond do 100 μl końcowej objętości i równoważyć wszystkie sondy w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
   5. Pobrać pipetę po 80 μl z każdej sondy do szklanej kuwety o małej objętości i zmierzyć absorpcję każdej sondy w zakresie 400–900 nm na spektrometrze. Umieść sondę z powrotem w odpowiednich rurkach.
   6. Przenieść 80 μl każdej sondy do odpowiedniej szklanej kuwety i zmierzyć emisję fluorescencji na spektrofluorometrze, wzbudzając sondy przy 674 nm i mierząc fluorescencję w zakresie 694–800 nm.
2. Wychwyt komórkowy i aktywacja fluorescencji
   1. Pobrać i wyhodować następujące linie komórkowe w odpowiednich pożywkach hodowlanych zgodnie ze standardowymi warunkami (37 °C, 5% CO₂ i 95% wilgotnej atmosfery). W tym przypadku użyj mysiej linii komórkowej makrofagów J774A.1 (zmodyfikowana pożywka Eagle's firmy Dulbecco uzupełniona 10% (v/v) płodową surowicą cielęcą), ludzką linię komórkową glejaka, U-118MG (MEM zawierającą niezbędne witaminy i 10% (v/v) płodową surowicę cielęcą) oraz ludzką linię komórkową włókniakomięsaka, HT-1080 (RPMI z 5% FCS).
   2. Pokryj szkiełka 8-dołkowe poli-L-lizyną (dodać 100 μl 0,001% poli-L-lizyny do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Odessać roztwór i pozostawić komorę do wyschnięcia przez co najmniej 4 godziny w temperaturze pokojowej na sterylnym stole warsztatowym. Przepłukać szkiełka komory 3 razy 200 μl buforowanego roztworu soli Hanka, a następnie zamknąć je parafiną i folią aluminiową i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będą potrzebne.
   3. Podczas gdy szkiełka komory wysychają, przefiltruj i wysterylizuj liposomy i roztwór barwnika i przechowuj w temperaturze 4 °C do czasu, aż będą potrzebne.
   4. Do analizy wychwytu sondy za pomocą systemu obrazowania fluorescencyjnego NIR in vivo należy przygotować 5 małych kolb hodowlanych dla każdej z 3 linii komórek testowych (łącznie 15 kolb). Wysiewaj 2 x 10⁶ komórek J774A.1, U-118MG i HT-1080 w kolbie hodowlanej z 5 ml odpowiedniej pożywki hodowlanej (w pięciokrotkach) i hoduj przez 16-24 godziny. Równolegle do kolb hodowlanych należy zasiać 30 000 komórek z każdej linii komórkowej (J774A.1 i HT-1080) lub 20 000 komórek (U-118MG) odpowiednio do 2 dołków szkiełka komorowego i hodować w pożywce hodowlanej o objętości 500 μl przez 16-24 godziny.
   5. Następnego dnia dodać 100 nmol (końcowa ilość lipidów) Lip-Q do 2 kolb na linię komórkową i do jednego dołka każdej linii komórkowej na szkiełku komorowym. Natychmiast przenieść 1 kolbę na linię komórkową do temperatury 4 °C, a drugą kolbę z powrotem do inkubatora.
      UWAGA: Objętość sond dodawanych do kolb i szkiełek komorowych jest taka sama, co sprawia, że stężenie na szkiełkach komory jest 10-krotnie wyższe (5 ml to na 500 μl pożywki hodowlanej). Jest to konieczne, ponieważ detekcja mikroskopowa jest mniej czuła niż system obrazowania fluorescencyjnego NIR, w którym obrazowane są osady komórek z kolb.
   6. Dodać wolny DY-676-COOH o stężeniu równoważnym zawartości barwnika w Lip-Q do komórek w 2 kolbach na linię komórkową i do jednego dołka każdej linii komórkowej na szkiełku komorowym, a następnie natychmiast przenieść 1 kolbę na linię komórkową do temperatury 4 °C (wyczerpanie energii), a drugą kolbę wraz ze szkiełkiem komorowym z powrotem do inkubatora. Inkubować wszystkie komórki przez 24 godziny w odpowiednich warunkach. Komórki w kolbie bez sondy służą jako kontrola niepoddana działaniu substancji.
3. Obrazowanie NIRF i analiza półilościowa
   1. Po 24 godzinach inkubacji zebrać komórki do kolb, myjąc komórki 2 razy buforowym roztworem soli Hanksa (HBSS), a następnie zeskrobać komórki w 500 μl HBSS i osadzać przez odwirowanie (5 min przy 200 x g) w probówkach o pojemności 500 μl.
   2. Umieść probówki z granulkami ogniw (i HBSS) w kamerze NIRF i zobrazuj za pomocą filtrów do wzbudzenia (615–665 nm) i emisji (cięcia w >700 nm).
   3. Odejmij autofluorescencję i oceń intensywność celu w porównaniu z autofluorescencją zgodnie z instrukcjami producenta. W ten sposób uzyskane zostaną półilościowe poziomy intensywności fluorescencji jako średni sygnał (skalowane liczby/s), który reprezentuje poziomy zliczania po przeskalowaniu dla czasu ekspozycji, wzmocnienia kamery, binningu i głębi bitowej, tak aby pomiary były porównywalne między sobą.
4. Konfokalna analiza mikroskopowa
   1. Po 24 godzinnej inkubacji zebrać komórki na szkiełkach komorowych, przemłukując je 2 razy 500 μl HBSS.
   2. Utrwalić komórki za pomocą 200 μl HBSS zawierającego 3,7% (v/v) formaldehydu przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
   3. Podczas utrwalania rozcieńczyć barwienie DNA, Hoechst-33258 1:50 roztworem montażowym.
   4. Po utrwaleniu umyj komórki 2 razy HBSS, a następnie oddziel komory od szkiełek szkiełkowych. Dodać 50 μl roztworu montażowego zawierającego barwienie DNA w każdym miejscu odpowiadającym studzienkom szkiełek komory. Przykryj komórki szklanymi szkiełkami nakrywkowymi, uszczelnij krawędzie przezroczystym lakierem do paznokci i susz na powietrzu przez 10 minut w temperaturze RT (ciemnej).
   5. Obrazowanie komórek pod odpowiednim mikroskopem fluorescencyjnym lub mikroskopem konfokalnym. Użyj następujących ustawień wzbudzenia i emisji do wizualizacji odpowiednich składników: jądra (Hoechst-33258: wzbudzenie 405 nm, emisja 420–480 nm). NBD-DOPE (lipid liposomalny: wzbudzenie 488 nm, emisja 530 nm). DY-676-COOH (barwnik fluorescencyjny NIR: wzbudzenie 633–645 nm, emisja 650–700 nm).
      UWAGA: Upewnij się, że dostępny mikroskop fluorescencyjny jest wyposażony w odpowiednie filtry, które umożliwiają wzbudzenie i emisję fal o długości fali większej niż 630 nm.

3. Obrazowanie fluorescencyjne in vivo stanu zapalnego oparte na liposomach

1. Przygotowanie zwierząt i materiałów
   1. Trzymaj 8-12 tygodniowe samce myszy NMRI o wadze około 36 g w standardowych warunkach z jedzeniem i wodą ad libitum.
   2. Siedem dni przed rozpoczęciem eksperymentów należy podawać wszystkim myszom dietę o niskiej zawartości feoforbidu w celu zmniejszenia autofluorescencji tkanek.
   3. Dwadzieścia cztery godziny przed rozpoczęciem każdego eksperymentu należy ogolić myszy w żądanym obszarze (np. w całym obszarze pleców, jeśli pożądane jest obrazowanie obrzęku tylnych nóg).
   4. Zważyć zwierzęta i obliczyć ilość sondy do wstrzyknięcia na mysz (Lip-Q i Lip-dQ przy stężeniu 10 μmol (stężenie lipidów) na kg masy i wolnym DY-676-COOH (równoważnym zawartości barwnika w użytej Lip-Q).
   5. Zobrazuj zwierzęta w całym ciele za pomocą obrazowania fluorescencyjnego NIR z tymi samymi ustawieniami, co w przypadku granulek komórkowych. Pomiar ten zapewnia autofluorescencję zwierząt.
   6. Rozpuścić 10 mg zymozanu-A w 1 ml izotonicznego roztworu soli fizjologicznej i przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C.
2. Indukcja stanu zapalnego i obrazowanie NIRF in vivo
   1. Przygotować 3 strzykawki na mysz zawierające następujące roztwory. Napełnić jedną strzykawkę 50 μl roztworu zymozanu-A (10 mg/ml), a drugą strzykawkę 50 μl izotonicznego roztworu soli fizjologicznej. Napełnić trzecią strzykawkę sondami, przy czym Lip-Q i Lip-dQ (10 μmol/kg masy (lipid)) są przeznaczone dla zwierząt badanych i wolne DY-676-COOH (stężenie jak w Lip-Q) dla zwierząt kontrolnych. Upewnij się, że sondy są rozcieńczone sterylnym HBSS do 150 μl końcowej objętości.
   2. Nałóż krem pod oczy zwierząt, aby uniknąć wysuszenia i znieczulij zwierzęta 2% izofluranem, aż zapadną w głęboki sen i nie będą reagować na dotyk łap (trwa to około 2 minut).
   3. Umieść mysz na ciepłej macie (nadal w narkozie) i wstrzyknij roztwór zymozanu-A podskórnie w prawą tylną nogę, a roztwór soli fizjologicznej w lewą tylną nogę. Natychmiast wstrzyknij sondę dożylnie, a następnie zobrazuj zwierzę, a następnie zarejestruj czas wstrzyknięcia/pomiaru (jako t = 0 godzina). Zapisz wynikowe obrazy jako kostki obrazu i powtórz powyższe kroki dla wszystkich innych zwierząt i odpowiednich sond.
   4. Zobrazuj zwierzęta co 2 godziny przez 10 godzin po wstrzyknięciu, a następnie po 24 godzinach po wstrzyknięciu, upewniając się, że stopień komory pomiarowej jest ciepły (na przykład poprzez umieszczenie ciepłej maty pod spodem), aby uniknąć hipotermii. Po każdym pomiarze umieść zwierzęta w klatce z jedzeniem i wodą ad libitum i umieść klatkę w komorze dla zwierząt w klimacie umiarkowanym. Poddaj zwierzęta eutanazji, najpierw znieczulając 2% izofluranem, aż zwierzęta przestaną reagować na dotyk, a następnie poddaj eutanazji dwutlenkiem węgla przez 5-10 minut, upewniając się, że zwierzęta całkowicie przestaną oddychać i nastąpi rigor mortis.
   5. Przeprowadź sekcję myszy zgodnie ze standardowymi protokołami, które można ocenić online (http://www.freebookez.com/mouse-dissection-lab-report/) i zobrazuj narządy.
   6. Oceń wyniki pomiarów zgodnie z instrukcjami producenta, najpierw odejmując ogólną fluorescencję zwierząt (rozmieszanie), a następnie przypisując obszary zainteresowania do autofluorescencji (lewa tylna noga z solą fizjologiczną) i docelową fluorescencję obszaru objętego stanem zapalnym (prawa tylna noga z zymosanem-A).

Enkapsulacja wysokich stężeń barwników fluorescencyjnych, takich jak barwnik NIRF DY676-COOH stosowany tutaj w wodnym wnętrzu liposomów, prowadzi do wysokiego poziomu wygaszania fluorescencji. Wygaszanie fluorescencji, zjawisko obserwowane w przypadku wielu fluoroforów o wysokim stężeniu, może być wykorzystane w kilku zastosowaniach obrazowania in vivo, w których wymagana jest wysoka czułość i niezawodne wykrywanie obszaru docelowego. Zastosowanie liposomów zapewnia również ochronę barwnika, która jest niezbędna w zastosowaniach in vivo. Konieczna jest dokładna charakterystyka liposomów, która obejmuje kilka czynników, takich jak poziom barwnika kapsułkowanego, stabilność i rozmiar liposomów, wygaszanie fluorescencji i aktywność kapsułkowanego barwnika in vitro, a także możliwość zastosowania do celów obrazowania in vivo. Porównanie wolnego barwnika, DY-676-COOH i wygaszonych liposomów (Lip-Q), a także niegaszonego liposomu (Lip-dQ) o bardzo niskim stężeniu kapsułkowanego barwnika ma zatem kluczowe znaczenie, zwłaszcza dla charakterystyki in vivo.

Liposomy przygotowane przy użyciu techniki hydratacji i ekstruzji filmu z kolejnymi cyklami zamrażania i rozmrażania przed ekstruzją zawierają resztki wolnych cząsteczek barwnika, które mogą być z powodzeniem oddzielone od liposomów ze względu na ich dłuższe zatrzymywanie w matrycy filtracji żelowej, w porównaniu do liposomów, które szybciej się eluują (Rysunek 1B). W zależności od poziomu rozcieńczenia po filtracji żelowej, opcjonalny etap ultrawirowania umożliwia zagęszczenie liposomów, jak pokazano na ilustracji (rysunek 1C). Na podstawie właściwości absorpcyjnych i emisyjnych barwnika kapsułkowanego, stężenie barwnika w kapsułkach określa się za pomocą krzywej kalibracyjnej wolnego barwnika (rysunek 1D). Oprócz stężenia kapsułkowanego barwnika ważne jest określenie wielkości i jednorodności liposomów po przygotowaniu. Jak widać na rysunku 1E, mikrofotografie elektronowe liposomów przygotowanych podstawową metodą ujawniają głównie jednopłytkową morfologię pęcherzyków liposomalnych, zawierających dopęcherzykowy DY-676-COOH albo w zakresie stężeń gaszących (Lip-Q; 606–846 μM DY-676), albo przy niegaszonym stężeniu barwnika (Lip-dQ; 25 μM DY-676). Ponadto wykazują one jednorodny rozkład wielkości wynoszący około 120 nm i wskaźniki polidyspersyjności znacznie poniżej 1 (tabela 1). Dzięki wygaszaniu fluorescencji, Lip-Q wykazuje dwa maksima absorpcji w buforze wodnym, przy czym jeden pik charakteryzuje się przesunięciem w kierunku niebieskich długości fal. W związku z tym emisja fluorescencji jest bardzo niska w porównaniu z wolnym barwnikiem (rys. 2A i B, po prawej). Uszkodzenie liposomów przez zamarzanie powoduje uwolnienie barwnika, który rozcieńcza się w otaczającym roztworze. W związku z tym przesunięty ku niebieskiemu pik absorpcji znika, co skutkuje pojedynczym pikiem absorpcji Lip-Q. W związku z tym obserwuje się wzrost intensywności fluorescencji uszkodzonego przez lód Lip-Q, co wskazuje, że nastąpiła aktywacja fluorescencyjna uwolnionych cząsteczek barwnika. Wolny barwnik ujawnia tylko jedno maksimum absorpcji i wysoką intensywność fluorescencji, które pozostają na tym samym poziomie, niezależnie od zamarzania (ryc. 2A i B, po lewej). Odkrycie to sugeruje, że enkapsulacja barwnika w liposomach, podobnie jak w Lip-Q, chroniłaby barwnik przed środowiskiem, utrzymywałaby wysokie stężenie i związane z tym wygaszanie fluorescencji, a gdyby została aktywowana przez docelowe wyzwalacze, umożliwiłaby wykrycie ze względu na wzrost fluorescencji.

Sondy liposomalne o podstawowym składzie lipidowym ujawniają dominujący wychwyt fagocytarny, który jest hamowany przez wyczerpanie energii. Można to zaobserwować poprzez wychwyt Lip-Q przez wysoce fagocytarną mysią linię komórkową makrofagów J774A.1 oraz łagodnie fagocytarną ludzką linię komórkową glejaka U-118MG w temperaturze 37 °C i hamowanie w 4 °C (Figura 3A i B). Wolny barwnik DY-676-COOH ujawnia wychwyt w fagocytarnych liniach komórkowych zarówno w temperaturze 37 °C, jak i w 4 °C, co wskazuje, że sonda liposomalna Lip-Q nie zawiera pozostałości wolnego barwnika w roztworze i może ulegać tylko aktywnemu wychwytowi. Konfokalne obrazy mikroskopowe ze skaningiem laserowym dodatkowo potwierdzają wychwyt i aktywację Lip-Q w komórkach fagocytarnych (Figura 3C). Ponadto brak fluorescencji w niefagocytarnej linii komórkowej ludzkiego włókniakomięsaka, HT-1080, wskazuje, że wychwyt Lip-Q odbywa się głównie przez fagocytozę, a zatem byłby odpowiedni do obrazowania stanu zapalnego, w którym zaangażowane są monocyty / makrofagi fagocytarne.

Zgodnie z fagocytarnym wychwytem liposomów obserwowanym w hodowanych liniach komórkowych, a dzięki wygaszaniu fluorescencji, dożylne wstrzyknięcie Lip-Q prowadzi do zależnego od czasu wzrostu intensywności fluorescencji obrzęku w modelach mysich (Figura 4A, Lip-Q), z bardzo niską fluorescencją tła. Maksymalna intensywność fluorescencji obrzęku jest wykrywana 8-10 godzin po wstrzyknięciu Lip-Q. Przeciwnie, stosunkowo silną fluorescencję NIR całej myszy obserwuje się po zastosowaniu wolnego DY-676-COOH (Figura 4A, DY-676-COOH) lub zawsze aktywnego liposomu Lip-dQ (Figura 4A, Lip-dQ). W porównaniu z Lip-Q, szybka perfuzja i klirens wolnego DY-676-COOH, widoczny od 0-4 godzin po wstrzyknięciu, zakłóca obrazowanie, tak że wiarygodne wykrycie obrzęku nie jest możliwe (Figura 4A, DY-676-COOH). Co więcej, niegaszony liposom Lip-dQ ujawnia maksymalną fluorescencję obrzęku w ciągu 2-4 godzin po wstrzyknięciu, która pozostaje prawie stała do 8 godzin, a następnie stopniowo maleje, podobnie jak wygaszona fluorescencja obrzęku na bazie Lip-Q. Wykonując analizy półilościowe, w których obszary zainteresowania (ROI) są ustawiane dla obrzęku w porównaniu z tłem, można wyciągnąć wnioski na temat różnych poziomów wykrywania za pomocą różnych sond. Zgodnie z półilościową analizą 5 zwierząt na grupę (sondę), obrzęk można bardziej znacząco (P = 0,001) wykryć za pomocą Lip-Q niż za pomocą wolnego DY-676-COOH lub niegaszonego Lip-dQ (Figura 4B).

Obrazowanie narządów myszy poddanych eutanazji 24 godziny po wstrzyknięciu sond ujawnia łagodną fluorescencję ex vivo wątroby/pęcherzyka żółciowego i nerek oraz bardzo niską lub żadną fluorescencję śledziony, płuc i serca (Ryc. 5), co służy jako dowód na eliminację sond drogą wątrobowo-żółciową.

Rysunek 1: Przygotowanie liposomów obciążonych DY-676-COOH. (A-C) Schematyczny przegląd etapów syntezy. (A) Ustawienie hydratacji i ekstruzji folii za pomocą barwnika bliskiej podczerwieni DY-676-COOH. (B) Zdjęcie samodzielnie wykonanego zestawu filtracji żelu pokazującego interfazę między niekapsułkowanym (wolnym) barwnikiem a liposomami. Liposomy najpierw eluują się i wydają się niebiesko-zielone dzięki kapsułkowanemu DY-676-COOH (niebieski) i włączonemu zielonemu fosfolipidowi, NBD-DOPE. (C) Reprezentatywny obraz osadu liposomowego (Lip-Q) po zagęszczeniu przez ultrawirowanie. (D) Reprezentatywna krzywa kalibracyjna DY-676-COOH w 10 mM Tris pH 7,4 (zawierającym 1% Triton X100) stosowana do oznaczania ilościowego barwnika liposomalnego. (E) Kriotransmisyjna mikrografia elektronowa Lip-Q. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję rysunku.

Rysunek 2: Fizykochemiczne oznaczanie wygaszania i aktywacji fluorescencji in vitro. (A) Widma absorpcyjne Lip-Q (po prawej) i wolnego DY-676-COOH (po lewej) mierzone w 10 mM buforze Tris o pH 7,4, przed lub po zamrożeniu w temperaturze -80 °C. Zwróć uwagę na charakterystyczny podwójny pik Lip-Q w porównaniu do wolnego DY-676-COOH oraz zanik przesuniętego ku niebieskiemu pikowi po uszkodzeniu Lip-Q przez zamarznięcie. (B) Odpowiednie widma emisji fluorescencji Lip-Q (po prawej) i wolnego DY-676-COOH (po lewej) mierzone w 10 mM buforze Tris o pH 7,4 przed lub po zamrożeniu w temperaturze -80 °C.

Rycina 3: Wychwyt komórkowy i aktywacja fluorescencyjna liposomów. Obrazy w (A) zostały przygotowane metodą obrazowania fluorescencyjnego NIR granulek komórek po ekspozycji na odpowiednie sondy przez 24 godziny we wskazanych temperaturach. Komórki HT-1080 nie przetrwały 24-godzinnych okresów inkubacji w temperaturze 4 °C. Wykresy słupkowe w (B) reprezentują półilościowe poziomy sygnałów fluorescencyjnych uzyskanych przez przypisanie ROI do granulek komórek w A. Każdy słupek oznacza średnią intensywność n = 3 eksperymentów ± SD. Obrazy w (C) uzyskano za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej komórek wystawionych na działanie sond na szkiełkach komory hodowlanej przez 24 godziny w temperaturze 37 °C. Należy zwrócić uwagę na wysoki poziom fluorescencji w linii komórkowej mysich makrofagów o wysokiej fagocytarnej J774A.1 i umiarkowaną fluorescencję w łagodnej linii komórkowej ludzkiego glejaka fagocytarnego U-118MG. Niefagocytarna ludzka linia komórkowa włókniakomięsaka HT-1080 nie wykazuje fluorescencji sond. NBD-DOPE: fosfolipid fluorescencyjny zielony. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję rysunku.

Rysunek 4. Obrazowanie optyczne in vivo obrzęku wywołanego zymozanem u myszy. (A) Zdjęcie myszy po lewej stronie pokazuje pozycje podskórnie podawanego zymozanu-A (500 μg w 50 μl soli fizjologicznej) i kontrolnego roztworu soli fizjologicznej (50 μl) na lewym boku. Dożylne wstrzyknięcie wskazanych sond i obrazowanie fluorescencyjne NIR całego ciała we wskazanych punktach czasowych ujawniają stopniowy, ale wysoki wzrost sygnałów fluorescencyjnych obrzęku i niskie sygnały tła Lip-Q (górny panel) z maksymalną fluorescencją po 8 godzinach od wstrzyknięcia. Wolny barwnik ujawnia perfuzję i szybki klirens w ciągu 4 godzin po wstrzyknięciu (środkowy panel), podczas gdy Lip-dQ ujawnia wykrycie obrzęku przy niskiej intensywności sygnału i ogólnie wyższej fluorescencji tła. Prezentacja graficzna w (B) powtarza obserwowane sygnały fluorescencyjne obrzęku wykryte za pomocą każdej sondy w porównaniu z regionem kontrolnym (sól fizjologiczna) u n = 5 zwierząt w grupie. Każdy wykres przedstawia średnie sygnały fluorescencji (n=5) ± SEM. Na wykresach można łatwo odróżnić maksymalny sygnał fluorescencyjny obrzęku wykryty za pomocą każdej sondy (Lip-Q, 8 godzin; Lip-dQ 2-4 godziny i wolny DY-676-COOH, 2 godziny po wstrzyknięciu). Istnieje znacznie (P = 0,001) wyższa intensywność fluorescencji obrzęku w przypadku Lip-Q w porównaniu z Lip-dQ w t = 0-24 godzinie, a w przypadku Lip-Q w porównaniu z wolnym DY-676-COOH w t = 4-24 godzinie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję rysunku.

Rycina 5: Biooptyczne obrazy ex vivo narządów pobranych od myszy 24 godziny po zastosowaniu sondy i odpowiadająca im półilościowa analiza intensywności fluorescencji narządów. Każdy słupek reprezentuje średnią intensywności fluorescencji (n = 4) ± SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję rysunku.

Tabela 1: Charakterystyka liposomów za pomocą dynamicznego rozpraszania światła.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.