Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wygaszanie fluorescencji fluoroforu bliskiej podczerwieni w obudowie liposomalnej jako narzędzie do obrazowania optycznego in vivo

15.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52136

⸱

5 stycznia 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Experimental Radiology, Institute of Diagnostic and Interventional Radiology I, Jena University Hospital, 2Department of Pharmaceutical Technology, Friedrich-Schiller-University Jena, 3Center for Electron Microscopy, Jena University Hospital

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Użycie fluoroforów do obrazowania in vivo może być znacznie ograniczone przez opsonizację, szybki klirens, niską czułość wykrywania i cytotoksyczne działanie na gospodarza. Enkapsulacja fluoroforów w liposomach poprzez hydratację i ekstruzję filmu prowadzi do wygaszania i ochrony fluorescencji, co umożliwia obrazowanie in vivo o wysokiej czułości wykrywania.

Streszczenie

Obrazowanie optyczne oferuje szeroki zakres modalności diagnostycznych i cieszy się dużym zainteresowaniem jako narzędzie do obrazowania biomedycznego. Pomimo ogromnej liczby dostępnych obecnie technik obrazowania i postępu w oprzyrządowaniu, nadal istnieje zapotrzebowanie na wysoce czułe sondy, które nadają się do obrazowania in vivo. Jednym z typowych problemów dostępnych przedklinicznych sond fluorescencyjnych jest ich szybki klirens in vivo, co zmniejsza ich czułość obrazowania. Aby obejść szybki klirens, należy zwiększyć liczbę cząsteczek barwnika w miejscu docelowym, a tym samym zmniejszyć autofluorescencję tła, przeprowadzono enkapsulację barwnika fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni, DY-676-COOH w liposomach i weryfikację jego potencjału do obrazowania zapalenia in vivo. DY-676 jest znany ze swojej zdolności do samogaszenia w wysokich stężeniach. Najpierw określiliśmy stężenie odpowiednie do samogaszenia, a następnie zamknęliśmy to stężenie hartujące w wodnym wnętrzu pegylowanych liposomów. Aby potwierdzić potencjał hartowania i aktywacji liposomów, stosujemy ostrą metodę zamrażania, która prowadzi do uszkodzenia błon liposomalnych bez wpływu na kapsułkowany barwnik. Liposomy charakteryzujące się wysokim poziomem wygaszania fluorescencji zostały określone jako Lip-Q. Wykazaliśmy poprzez eksperymenty z różnymi liniami komórkowymi, że wychwyt Lip-Q odbywa się głównie przez fagocytozę, co z kolei umożliwiło scharakteryzowanie jego potencjału jako narzędzia do obrazowania in vivo stanu zapalnego w modelach mysich. Ponadto używamy modelu obrzęku wywołanego zymozanem u myszy, aby potwierdzić potencjał Lip-Q w optycznym obrazowaniu stanu zapalnego in vivo. Biorąc pod uwagę możliwe wchłanianie z powodu efektu zwiększonej przepuszczalności i retencji (EPR) wywołanego stanem zapalnym, w badaniach na zwierzętach porównano zawsze aktywny preparat liposomowy o niskim, niewygaszonym stężeniu DY-676-COOH (określanym jako Lip-dQ) i wolnym DY-676-COOH z Lip-Q.

Wprowadzenie

Liposomy zostały intensywnie zbadane i służą jako jeden z najbardziej biokompatybilnych systemów dostarczania leków biomedycznych do zastosowań klinicznych1,2. Składają się głównie z fosfolipidów i cholesterolu, z których oba są biokompatybilnymi związkami naśladującymi części naturalnych błon komórkowych. Podczas gdy substancje hydrofilowe mogą być uwięzione we wnętrzu wodnym, czynniki lipofilowe mogą być włączane do liposomalnej dwuwarstwy fosfolipidowej3. Enkapsulacja substancji w wodnym wnętrzu liposomów zapewnia ochronę przed degradacją in vivo, a także zapobiega toksycznemu działaniu układu gospodarza przed toksycznym działaniem leków cytotoksycznych stosowanych w terapii chorób, na przykład chemioterapeutyków mających na celu niszczenie komórek nowotworowych. Modyfikacja powierzchni liposomalnej za pomocą polimerów, takich jak glikol polietylenowy (PEGylacja), dodatkowo wydłuża czas liposomalnego krążenia krwi in vivo dzięki stabilizacji sterycznej4. Ponadto liposomy mogą sekwestrować wysokie stężenia kilku substancji, takich jak białka5,6, substancje hydrofilowe7,8 i enzymy9. W związku z tym służą jako wiarygodne narzędzia kliniczne, terapeutyczne i diagnostyczne, które zasługują na ich dopuszczenie do stosowania leków cytotoksycznych, takich jak doksorubicyna, w terapii nowotworów4. Ze względu na swoją elastyczność liposomy mogą być również ładowane fluorochromami do celów diagnostycznych i chirurgicznych pod kontrolą obrazu.

Obrazowanie fluorescencyjne dostarcza opłacalnego i nieinwazyjnego narzędzia diagnostycznego in vivo, które jednak wymaga pewnych podstawowych wymagań. Można wykazać, że fluorochromy, które najlepiej nadają się do obrazowania in vivo, mają charakterystyczne maksima absorpcji i emisji w zakresie, w którym dyspersja i rozpraszanie światła, a także autofluorescencja tkanek pochodzących z wody i hemoglobiny są niskie. Tak więc takie sondy mają swoje maksima abs/em między 650 a 900 nm10. Poza tym stabilność fluorochromów zarówno in vitro, jak i in vivo ma kluczowe znaczenie, ponieważ opsonizacja i szybki klirens mogą znacznie ograniczyć ich zastosowanie w obrazowaniu in vivo 11. Inne skutki, takie jak słaba stabilność i niska czułość lub działanie cytotoksyczne na narządy docelowe, jak obserwowane w przypadku zieleni indocyjaninowej (ICG)12-16, są niepożądane i muszą być brane pod uwagę przy projektowaniu sond do obrazowania in vivo. Obserwacje te doprowadziły do aktywnego rozwoju kilku przedklinicznych fluorochromów NIR, nanocząstek, a także nowych technik obrazowania in vivo procesów zapalnych, nowotworów oraz chirurgii sterowanej obrazem17-20. Pomimo stabilności większości przedklinicznych barwników NIRF (fluorescencja bliskiej podczerwieni) in vitro, ich szybka perfuzja i klirens przez wątrobę i nerki utrudniają ich zastosowanie w obrazowaniu optycznym in vivo chorób i procesów zapalnych.

Dlatego prezentujemy protokół enkapsulacji fluorochromów, takich jak dobrze scharakteryzowany barwnik fluorescencyjny bliskiej podczerwieni DY-676-COOH, znany ze swojej tendencji do samoczynnego gaszenia przy stosunkowo wysokich stężeniach21 w liposomach. Przy wysokich stężeniach tworzenie H-dimerów i/lub oddziaływania pi-stacking między cząsteczkami fluoroforu znajdującymi się w promieniu Förstera powodują transfer energii rezonansu Förstera (FRET) między cząsteczkami fluorochromu. Przy niskim stężeniu zwiększa się przestrzeń między cząsteczkami fluoroforu, zapobiegając w ten sposób interakcji pi-stacking i tworzeniu się H-dimerów, co skutkuje wysoką emisją fluorescencji. Przełączanie między wysokim i niskim stężeniem oraz towarzyszące mu wygaszanie i aktywacja fluorescencji jest obiecującą strategią, którą można wykorzystać do obrazowania optycznego22. Pod tym względem enkapsulacja wysokich stężeń barwnika NIRF DY-676-COOH w wodnym wnętrzu liposomów jest korzystniejsza do obrazowania in vivo niż wolny barwnik. Wyzwanie związane z tą metodą polega po pierwsze na prawidłowej enkapsulacji, a po drugie, na walidacji korzyści wynikających z kapsułkowania wysokich stężeń barwnika. Niezbędne jest porównanie właściwości obrazowania wygaszonych liposomów z właściwościami wolnego barwnika, a także z niegaszonym preparatem liposomowym o niskich stężeniach barwnika. Za pomocą prostego, ale bardzo skutecznego protokołu hydratacji i ekstruzji folii w połączeniu z naprzemiennymi cyklami zamrażania i rozmrażania pokazujemy, że enkapsulacja stężeń hartujących DY-676-COOH w liposomach jest możliwa. Inne metody stosowane do przygotowania liposomów, takie jak metoda odparowywania z odwróconymi fazami23, a także metoda wstrzykiwania etanolu24, umożliwiają przygotowanie liposomów o wysokiej skuteczności enkapsulacji dla wielu substancji hydrofilowych. Jednak charakter substancji, która ma być kapsułkowana, może mieć wpływ na skuteczność kapsułkowania. W efekcie, przedstawiony tutaj protokół hydratacji i ekstruzji folii wykazał najwyższą skuteczność enkapsulacji DY-676-COOH. Aby zilustrować korzyści płynące z liposomalnej enkapsulacji DY-676-COOH, wykorzystano model obrzęku wywołany zymosanem, który pozwala na badanie procesów zapalnych w ciągu kilku godzin. W tym miejscu wykazano, że liposomy o wysokich stężeniach kapsułkowanego DY-676-COOH są bardziej odpowiednie do optycznego obrazowania procesów zapalnych całego ciała in vivo niż wolny barwnik lub niegaszona formuła liposomalna o niskich stężeniach barwnika. W ten sposób podstawowy protokół zapewnia prostą i szybką metodę wytwarzania wygaszonych liposomów fluorescencyjnych oraz walidacji ich potencjału aktywacji i obrazowania zarówno in vitro, jak i in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Wszystkie procedury są zatwierdzone przez regionalny komitet ds. zwierząt i zgodne z międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi etycznego wykorzystywania zwierząt.

1. Przygotowanie materiałów i instrumentów

  1. Przygotowanie spontanicznie powstałej dyspersji pęcherzykowej (SFV)
    1. Rozpuścić i przygotować roztwory podstawowe następujących fosfolipidów: 214 mg/ml fosfatydylocholiny jaj (EPC), 134 mg/ml cholesterolu, 122 mg/ml 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminy-N-[metoksy(glikol polietylenowy)-2000] (sól amonowa) (mPEG2000-DSPE) i 2 mg/ml 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-(7-nitro-2-1,3-benzoksadiazol-4-ylo) (sól amonowa) (NBD-DOPE) w chloroformie i przechowywać w szklanych fiolkach.
    2. Dostarczyć około 3 ml chloroformu do kolby okrągłodennej i przenieść odpowiednią objętość roztworu podstawowego fosfolipidów do kolby okrągłodennej w celu przygotowania liposomów złożonych z EPC:Chol:mPEG2000-DSPE w stosunku molowym 6,5:3:0,5. W celu podwójnego znakowania fluorescencyjnego liposomów dodać 0,3% mol NBD-DOPE do roztworu lipidowego.
    3. Odparować chloroform z organicznego roztworu fosfolipidów pod zmniejszonym ciśnieniem (300 mbar) w temperaturze 55 °C za pomocą wyparki obrotowej.
    4. Po utworzeniu jednorodnego filmu fosfolipidowego należy zmniejszyć ciśnienie do 10 mbar na 1-2 godziny, aby usunąć resztki osadu chloroformu.
    5. Podczas parowania chloroformu rozpuść DY-676-COOH (6,181 μM) w 10 mM buforze Tris o pH 7,4 i napełnij naczynie Dewara ciekłym azotem. Włączyć łaźnię ultradźwiękową i ustawić na 50 °C.
    6. Przenieść odpowiednią objętość (0,5–1 ml) roztworu DY-676-COOH (6,181 μM) do kolby okrągłodennej w celu uwodnienia suchego filmu fosfolipidowego i energicznie wirować, aż utworzy się spontanicznie utworzona dyspersja pęcherzykowa (SFV). Upewnij się, że wszystkie fosfolipidy są rozproszone, aby uniknąć utraty lipidów.
    7. Ostrożnie przenieść kolbę okrągłodenną zawierającą dyspersję SFV do ciekłego azotu i zamrozić dyspersję na 3–5 minut. Umieścić kolbę okrągłodenną w łaźni ultradźwiękowej o temperaturze 50 °C w celu rozmrożenia dyspersji, a następnie energicznie wirować dyspersję przez 1–2 minuty. Powtórz tę procedurę sześć razy, co daje w sumie siedem cykli zamrażania i rozmrażania.
  2. Wytłaczanie SFV w celu utworzenia jednorodnych pęcherzyków liposomowych
    1. Przenieść dyspersję SFV do strzykawki o pojemności 1 ml (strzykawka-a) i wytłaczać dyspersję przez membranę poliwęglanową 100 nm za pomocą ekstrudera LiposoFast-Basic do strzykawki-b.
    2. Wyciśnij dyspersję ze strzykawki b z powrotem do strzykawki a, a następnie powtórz cykl dziesięć razy. Na skutek wytłaczania roztwór w strzykawce z czasem zmienia się z zamglonego wyglądu w wyraźną dyspersję. Po dziesięciu cyklach (dwadzieścia pojedynczych etapów wytłaczania) wyjmij strzykawkę b z urządzenia i po raz ostatni wyciśnij dyspersję ze strzykawki a bezpośrednio do sterylnej probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 ml.
  3. Oczyszczanie liposomalnego kapsułkowanego DY-676-COOH z wolnego barwnika
    1. Przygotować kolumnę do chromatografii żelowej przy użyciu kulek G25 nasączonych 10 mM buforem Tris o pH 7,4 (długość kolumny 28 cm, średnica 0,8 cm).
    2. Przenieść 0,5 ml wytłaczanej dyspersji pęcherzykowej na złoże żelowe i pozwolić próbce spłynąć do matrycy żelowej.
    3. Eluować liposomy za pomocą 10 mM buforu Tris o pH 7,4 (Rysunek 1A) i myć kolumnę, aż wolny barwnik całkowicie spłynie z kolumny. W razie potrzeby zbierz i poddaj recyklingowi wolny barwnik poprzez odsalanie i odwadnianie zgodnie z instrukcjami producenta.
    4. Zagęścić eluowane liposomy przez ultrawirowanie (200 000 x g, 2 godziny w temperaturze 8 °C), a następnie rozproszyć je w odpowiedniej objętości sterylnego 10 mM buforu Tris o pH 7,4.
  4. Kwantyfikacja stężenia DY-676-COOH w kapsułkach
    1. Przygotować krzywą kalibracyjną, rozpuszczając DY-676-COOH (0, 82, 124, 247, 494, 988 nM) w 10 mM buforze Tris o pH 7,4 zawierającym 0,1% Triton X100.
    2. Rozpuścić 2 μl (100 nmol końcowego lipidu z 50 mmol/l podstawy) liposomów przez 5 minut w temperaturze pokojowej w 100 μl buforu Tris zawierającego 1% Triton X100 w celu zniszczenia pęcherzyków i uwolnienia kapsułkowanego barwnika. Następnie rozcieńczyć próbki 10 mM buforem Tris o pH 7,4 do końcowego stężenia Triton-X100 wynoszącego 0,1% (v/v), uzyskując całkowitą objętość 1 ml. Przygotować wszystkie próbki w dwóch egzemplarzach.
    3. Zmierzyć absorpcję i emisję wszystkich próbek (wolne liposomy poddane działaniu DY-676-COOH i Triton-X100) przy wzbudzeniu λ=645 nm i emisji λ = 700 nm. Ustalić i użyć krzywej kalibracyjnej wolnego barwnika w celu określenia stężenia barwnika w kapsułkach.
  5. Charakterystyka liposomów
    1. Określ rozmiary i potencjał zeta liposomów za pomocą dynamicznego rozpraszania światła. Próbki liposomalne rozcieńczyć wysterylizowanym filtrem (0,2 μm) 10 mM buforem Tris o pH 7,4 do stężenia 100–300 μM (lipid). Rozcieńczone próbki należy przenieść do jednorazowej kuwety o małej objętości i zmierzyć próbkę zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Scharakteryzuj liposomy za pomocą mikroskopii elektronowej, aby uzasadnić wielkość, integralność i jednorodność pęcherzyków liposomalnych zgodnie ze standardowymi protokołami.

2. Walidacja wygaszania fluorescencji i aktywacji przygotowanych liposomów

  1. Analiza fizykochemiczna wygaszania i aktywacji fluorescencji
    1. Przygotuj dwie probówki o pojemności 1,5 ml dla Lip-Q i 2 probówki dla wolnego DY-676-COOH. Przenieść 100 nmol lipidów całkowitych (2,38 μl roztworu podstawowego Lip-Q o stężeniu 42 mmol/l, zawierającego 138 μg/ml kapsułkowanego DY-676-COOH) do odpowiednich probówek. Transfer wolny DY-676-COOH odpowiadający zawartości barwnika w Lip-Q (0,38 μg, co wynika np. z 138 μg/1 000 μl x 2,38 μl użytego Lip-Q). Inkubować jedną probówkę każdej sondy w temperaturze 4 °C i zamrażać drugą probówkę w temperaturze -80 °C przez noc (16 godzin).
    2. Podgrzać blok grzewczy do temperatury 30 °C. Napełnić komorę chłodzącą kruszonym lodem i zrównoważyć podwielokrotność 10 mM buforu Tris o pH 7,4 do temperatury pokojowej.
    3. Wyjąć sondy z 4 °C i zrównoważyć w temperaturze pokojowej (owinięte folią aluminiową w celu ochrony przed światłem) i szybko rozmrozić sondy od -80 °C w temperaturze 30 °C przez 5 minut. Schłodzić rozmrożone sondy na lodzie przez 1 minutę przed przeniesieniem ich do temperatury pokojowej (również owinięte folią aluminiową w celu ochrony przed światłem).
    4. Dodać 10 mM buforu Tris (pH 7,4) do każdej z sond do 100 μl końcowej objętości i równoważyć wszystkie sondy w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
    5. Pobrać pipetę po 80 μl z każdej sondy do szklanej kuwety o małej objętości i zmierzyć absorpcję każdej sondy w zakresie 400–900 nm na spektrometrze. Umieść sondę z powrotem w odpowiednich rurkach.
    6. Przenieść 80 μl każdej sondy do odpowiedniej szklanej kuwety i zmierzyć emisję fluorescencji na spektrofluorometrze, wzbudzając sondy przy 674 nm i mierząc fluorescencję w zakresie 694–800 nm.
  2. Wychwyt komórkowy i aktywacja fluorescencji
    1. Pobrać i wyhodować następujące linie komórkowe w odpowiednich pożywkach hodowlanych zgodnie ze standardowymi warunkami (37 °C, 5% CO2 i 95% wilgotnej atmosfery). W tym przypadku użyj mysiej linii komórkowej makrofagów J774A.1 (zmodyfikowana pożywka Eagle's firmy Dulbecco uzupełniona 10% (v/v) płodową surowicą cielęcą), ludzką linię komórkową glejaka, U-118MG (MEM zawierającą niezbędne witaminy i 10% (v/v) płodową surowicę cielęcą) oraz ludzką linię komórkową włókniakomięsaka, HT-1080 (RPMI z 5% FCS).
    2. Pokryj szkiełka 8-dołkowe poli-L-lizyną (dodać 100 μl 0,001% poli-L-lizyny do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Odessać roztwór i pozostawić komorę do wyschnięcia przez co najmniej 4 godziny w temperaturze pokojowej na sterylnym stole warsztatowym. Przepłukać szkiełka komory 3 razy 200 μl buforowanego roztworu soli Hanka, a następnie zamknąć je parafiną i folią aluminiową i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będą potrzebne.
    3. Podczas gdy szkiełka komory wysychają, przefiltruj i wysterylizuj liposomy i roztwór barwnika i przechowuj w temperaturze 4 °C do czasu, aż będą potrzebne.
    4. Do analizy wychwytu sondy za pomocą systemu obrazowania fluorescencyjnego NIR in vivo należy przygotować 5 małych kolb hodowlanych dla każdej z 3 linii komórek testowych (łącznie 15 kolb). Wysiewaj 2 x 106 komórek J774A.1, U-118MG i HT-1080 w kolbie hodowlanej z 5 ml odpowiedniej pożywki hodowlanej (w pięciokrotkach) i hoduj przez 16-24 godziny. Równolegle do kolb hodowlanych należy zasiać 30 000 komórek z każdej linii komórkowej (J774A.1 i HT-1080) lub 20 000 komórek (U-118MG) odpowiednio do 2 dołków szkiełka komorowego i hodować w pożywce hodowlanej o objętości 500 μl przez 16-24 godziny.
    5. Następnego dnia dodać 100 nmol (końcowa ilość lipidów) Lip-Q do 2 kolb na linię komórkową i do jednego dołka każdej linii komórkowej na szkiełku komorowym. Natychmiast przenieść 1 kolbę na linię komórkową do temperatury 4 °C, a drugą kolbę z powrotem do inkubatora.
      UWAGA: Objętość sond dodawanych do kolb i szkiełek komorowych jest taka sama, co sprawia, że stężenie na szkiełkach komory jest 10-krotnie wyższe (5 ml to na 500 μl pożywki hodowlanej). Jest to konieczne, ponieważ detekcja mikroskopowa jest mniej czuła niż system obrazowania fluorescencyjnego NIR, w którym obrazowane są osady komórek z kolb.
    6. Dodać wolny DY-676-COOH o stężeniu równoważnym zawartości barwnika w Lip-Q do komórek w 2 kolbach na linię komórkową i do jednego dołka każdej linii komórkowej na szkiełku komorowym, a następnie natychmiast przenieść 1 kolbę na linię komórkową do temperatury 4 °C (wyczerpanie energii), a drugą kolbę wraz ze szkiełkiem komorowym z powrotem do inkubatora. Inkubować wszystkie komórki przez 24 godziny w odpowiednich warunkach. Komórki w kolbie bez sondy służą jako kontrola niepoddana działaniu substancji.
  3. Obrazowanie NIRF i analiza półilościowa
    1. Po 24 godzinach inkubacji zebrać komórki do kolb, myjąc komórki 2 razy buforowym roztworem soli Hanksa (HBSS), a następnie zeskrobać komórki w 500 μl HBSS i osadzać przez odwirowanie (5 min przy 200 x g) w probówkach o pojemności 500 μl.
    2. Umieść probówki z granulkami ogniw (i HBSS) w kamerze NIRF i zobrazuj za pomocą filtrów do wzbudzenia (615–665 nm) i emisji (cięcia w >700 nm).
    3. Odejmij autofluorescencję i oceń intensywność celu w porównaniu z autofluorescencją zgodnie z instrukcjami producenta. W ten sposób uzyskane zostaną półilościowe poziomy intensywności fluorescencji jako średni sygnał (skalowane liczby/s), który reprezentuje poziomy zliczania po przeskalowaniu dla czasu ekspozycji, wzmocnienia kamery, binningu i głębi bitowej, tak aby pomiary były porównywalne między sobą.
  4. Konfokalna analiza mikroskopowa
    1. Po 24 godzinnej inkubacji zebrać komórki na szkiełkach komorowych, przemłukując je 2 razy 500 μl HBSS.
    2. Utrwalić komórki za pomocą 200 μl HBSS zawierającego 3,7% (v/v) formaldehydu przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Podczas utrwalania rozcieńczyć barwienie DNA, Hoechst-33258 1:50 roztworem montażowym.
    4. Po utrwaleniu umyj komórki 2 razy HBSS, a następnie oddziel komory od szkiełek szkiełkowych. Dodać 50 μl roztworu montażowego zawierającego barwienie DNA w każdym miejscu odpowiadającym studzienkom szkiełek komory. Przykryj komórki szklanymi szkiełkami nakrywkowymi, uszczelnij krawędzie przezroczystym lakierem do paznokci i susz na powietrzu przez 10 minut w temperaturze RT (ciemnej).
    5. Obrazowanie komórek pod odpowiednim mikroskopem fluorescencyjnym lub mikroskopem konfokalnym. Użyj następujących ustawień wzbudzenia i emisji do wizualizacji odpowiednich składników: jądra (Hoechst-33258: wzbudzenie 405 nm, emisja 420–480 nm). NBD-DOPE (lipid liposomalny: wzbudzenie 488 nm, emisja 530 nm). DY-676-COOH (barwnik fluorescencyjny NIR: wzbudzenie 633–645 nm, emisja 650–700 nm).
      UWAGA: Upewnij się, że dostępny mikroskop fluorescencyjny jest wyposażony w odpowiednie filtry, które umożliwiają wzbudzenie i emisję fal o długości fali większej niż 630 nm.

3. Obrazowanie fluorescencyjne in vivo stanu zapalnego oparte na liposomach

  1. Przygotowanie zwierząt i materiałów
    1. Trzymaj 8-12 tygodniowe samce myszy NMRI o wadze około 36 g w standardowych warunkach z jedzeniem i wodą ad libitum.
    2. Siedem dni przed rozpoczęciem eksperymentów należy podawać wszystkim myszom dietę o niskiej zawartości feoforbidu w celu zmniejszenia autofluorescencji tkanek.
    3. Dwadzieścia cztery godziny przed rozpoczęciem każdego eksperymentu należy ogolić myszy w żądanym obszarze (np. w całym obszarze pleców, jeśli pożądane jest obrazowanie obrzęku tylnych nóg).
    4. Zważyć zwierzęta i obliczyć ilość sondy do wstrzyknięcia na mysz (Lip-Q i Lip-dQ przy stężeniu 10 μmol (stężenie lipidów) na kg masy i wolnym DY-676-COOH (równoważnym zawartości barwnika w użytej Lip-Q).
    5. Zobrazuj zwierzęta w całym ciele za pomocą obrazowania fluorescencyjnego NIR z tymi samymi ustawieniami, co w przypadku granulek komórkowych. Pomiar ten zapewnia autofluorescencję zwierząt.
    6. Rozpuścić 10 mg zymozanu-A w 1 ml izotonicznego roztworu soli fizjologicznej i przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C.
  2. Indukcja stanu zapalnego i obrazowanie NIRF in vivo
    1. Przygotować 3 strzykawki na mysz zawierające następujące roztwory. Napełnić jedną strzykawkę 50 μl roztworu zymozanu-A (10 mg/ml), a drugą strzykawkę 50 μl izotonicznego roztworu soli fizjologicznej. Napełnić trzecią strzykawkę sondami, przy czym Lip-Q i Lip-dQ (10 μmol/kg masy (lipid)) są przeznaczone dla zwierząt badanych i wolne DY-676-COOH (stężenie jak w Lip-Q) dla zwierząt kontrolnych. Upewnij się, że sondy są rozcieńczone sterylnym HBSS do 150 μl końcowej objętości.
    2. Nałóż krem pod oczy zwierząt, aby uniknąć wysuszenia i znieczulij zwierzęta 2% izofluranem, aż zapadną w głęboki sen i nie będą reagować na dotyk łap (trwa to około 2 minut).
    3. Umieść mysz na ciepłej macie (nadal w narkozie) i wstrzyknij roztwór zymozanu-A podskórnie w prawą tylną nogę, a roztwór soli fizjologicznej w lewą tylną nogę. Natychmiast wstrzyknij sondę dożylnie, a następnie zobrazuj zwierzę, a następnie zarejestruj czas wstrzyknięcia/pomiaru (jako t = 0 godzina). Zapisz wynikowe obrazy jako kostki obrazu i powtórz powyższe kroki dla wszystkich innych zwierząt i odpowiednich sond.
    4. Zobrazuj zwierzęta co 2 godziny przez 10 godzin po wstrzyknięciu, a następnie po 24 godzinach po wstrzyknięciu, upewniając się, że stopień komory pomiarowej jest ciepły (na przykład poprzez umieszczenie ciepłej maty pod spodem), aby uniknąć hipotermii. Po każdym pomiarze umieść zwierzęta w klatce z jedzeniem i wodą ad libitum i umieść klatkę w komorze dla zwierząt w klimacie umiarkowanym. Poddaj zwierzęta eutanazji, najpierw znieczulając 2% izofluranem, aż zwierzęta przestaną reagować na dotyk, a następnie poddaj eutanazji dwutlenkiem węgla przez 5-10 minut, upewniając się, że zwierzęta całkowicie przestaną oddychać i nastąpi rigor mortis.
    5. Przeprowadź sekcję myszy zgodnie ze standardowymi protokołami, które można ocenić online (http://www.freebookez.com/mouse-dissection-lab-report/) i zobrazuj narządy.
    6. Oceń wyniki pomiarów zgodnie z instrukcjami producenta, najpierw odejmując ogólną fluorescencję zwierząt (rozmieszanie), a następnie przypisując obszary zainteresowania do autofluorescencji (lewa tylna noga z solą fizjologiczną) i docelową fluorescencję obszaru objętego stanem zapalnym (prawa tylna noga z zymosanem-A).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Enkapsulacja wysokich stężeń barwników fluorescencyjnych, takich jak zastosowany tutaj barwnik NIRF DY676-COOH, w wodnistym wnętrzu liposomów prowadzi do wysokiego poziomu gaszenia fluorescencji. Gaszenie fluorescencji, zjawisko obserwowane u wielu fluoroforów przy wysokim stężeniu, może zostać wykorzystane w kilku zastosowaniach obrazowania in vivo, w których wymagana jest wysoka czułość i niezawodna detekcja obszaru docelowego. Zastosowanie liposomów zapewnia również ochronę barwnika, co jest niezbędne w aplik...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ponieważ liposomy mogą również służyć jako systemy dostarczania barwników fluorescencyjnych, umożliwiają obrazowanie chorób docelowych. Enkapsulacja wysokich stężeń barwników fluorescencyjnych, takich jak zastosowany tutaj barwnik NIRF, DY676-COOH, prowadzi do wysokiego poziomu wygaszania fluorescencji uwięzionego barwnika. Wygaszanie fluorescencji, zjawisko obserwowane w przypadku wielu fluoroforów o wysokim stężeniu, może być wykorzystane w kilku zastosowaniach obrazowania in vivo , w których wymagana jest wys...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty Deutsche Forschungsgemeinschaft HI-698/10-1 i RU-1652/1-1. Dziękujemy Doreen May za doskonałą pomoc techniczną oraz firmie DYOMICS GmbH z Jeny za życzliwe wsparcie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiały i urządzenia do przygotowania liposomów
egg phospahtidylcholineAvanti Polar Lipids840051PRozpuścić w chloroformie i przechowywać w szklanych fiolkach (214 mg/ml)
cholesterolSigmaC8667Rozpuścić w chloroformie i przechowywać w szklanych fiolkach (134 mg/ml)
1,2-distearoilo-sn-glycero-3-fosphoethanolamine-N-[methoxy(glikol polietylenowy)-2000] (sól amonowa)AvantiPolar Lipids880120PRozpuścić w chloroformie i przechowywać w szklanych fiolkach (122 mg/ml)
1,2-dioleoiloilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminaN-(7-nitro-2-1, 3-benzoksadiazol-4-ylo) (sól amonowa)Avanti Polar Lipids810145PRozpuścić w chloroformie i przechowywać w szklanych fiolkach (2 mg/ml)
Sartorius MC1 (d = 0,01 mg)Sartorius AGResearch RC 210 Pstosowany do ważenia fosfolipidów
RotavaporBü chi Labortechnik AGR-114stosowany do hydratacji filmu fosfolipidowego
WaterbathBü chi Labortechnik AGR-481stosowany do hydratacji filmu fosfolipidowego
Regulator próżniBü chi Labortechnik AGB-720stosowany do hydratacji filmu fosfolipidowego
VacoboxBü chi Labortechnik AGB-177stosowany do hydratacji filmu fosfolipidowego
Chłodziarka cyrkulacyjnaLAUDA DR. R. WOBSER
GMBH & CO. KG		WKL 230stosowany do hydratacji filmu fosfolipidowego
DY-676-COOHDyomics GmbH676-00Rozpuścić w 10 mM Tris i przechowywać zapasy w temperaturze -20° C
Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethanApplichemA1086bufor 10 mM, pH 7,4
TrichlormethanCarl Roth GmbH + Co. KGY015.2stosowany do przygotowania liposomów
SonicatorMerck Eurolab GmbHUSR 170 Hużywany do przygotowania liposomów
Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, nr 146-3011-00)Scientific Industries Inc.SI-0256stosowany do preparatu liposomów
Sephadex G25 podłoże GE Healthcare Europe GmbH17-0033-01używany do oczyszczania liposomów
Triton X100Ferak Berlin GmbH505002używany do niszczenia liposomów  do oznaczania ilościowego barwnika
LiposoFast-BasicAvestin Inc.stosowany do wytłaczania liposomów
Poliwęglanowa membrana filtracyjna, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U)VWRstosowany do wytłaczania liposomów za pomocą LiposoFast-Basic
Fluostar OptimaBMG Labtechstosowany do oznaczania ilościowego barwnika
Zetasizer Nano ZSMalvernstosowany do oznaczania wielkości liposomów i zetapotencjału
Ultrawirówka Beckmann Coulter GmbHXL 80służy do zagęszczania próbek
RotorBeckmann Coulter GmbHSW 55 TIsłuży do zagęszczania próbek
Materiały i urządzenia do oceny liposomów i obrazowania optycznego
Zymosan-A z Saccharomyces cereviciaeSigmaZ4250-250MGstosowany do indukcji stanu zapalnego
Sól fizjologiczna (0,9%)Fresenius GmbHPZN-2159621stosowana do rozcieńczania parownika Zymosan-A
IsofluraneOhmeda Isotec 4stosowana do znieczulania zwierząt
IsofluraneActavis GmbH PZN-7253744znieczulenie
Thermo Mat Pro 20 WLucky Reptile61202-HTP-20stosowane do utrzymywania ciepła zwierząt podczas znieczulenia
Omnican-F (1 ml iniekcja) BraunPZN-3115465stosowany do podskórnego i dożylnego stosowania sond
Pantenol krem pod oczyJenapharmPZN-3524531stosowany w celu zapobiegania suchości oczu zwierząt podczas znieczulenia
Hanks buforowany roztwór soli fizjologicznejPAA Laboratories /Biochrom AGL2045bez Mg2+, Ca2+ i czerwieni fenolowej. Do rozcieńczania sond i do mycia komórek
Szkiełka z 8-dołkową komorąBD Biosciences354108używane do hodowli komórkowych, a następnie do mikroskopii 
Kolby do hodowli komórkowychGreiner BioOne
Pożywki do hodowli komórkowychGibco (life technologies GmbH)
Surowica cielęca płodu Invitrogen
roztwór poli-L-lizyny (0,01%, 50  ml)SigmaP4832służy do powlekania szkiełek komory hodowli komórkowych
Mocowanie PermafluorThermoScientific S21022-3Roztwór montażowy do mikroskopii
Hoechst-33258Barwienie DNA AppliChemdo mikroskopii
Hera-SafeHeraeus Instrumentssterylny stół roboczy używany do hodowli komórek
Komórka HERAHeraeus Inkubatorużywany do hodowli komórek
LSM510-MetaZeissużywany do mikroskopii konfokalnej
System obrazowania fluorescencyjnego in vivo Maestro-TMCRi, Woburnużywany do obrazowania fluorescencyjnego całego ciała małych zwierząt
Spektrofotometr (Ultrospec 4300 pro UV)GE Healthcareużywany do pomiaru absorpcji
Spektrofluorometr (Jasco FP-6200)Jascoużywany do pomiaru emisji
Zwierzęta
Myszy NMRI (8-12 tygodni, samiec)Elevage Janvier, Francjaużywane do prób zapalnych
fluorescencji

Bibliografia

  1. Buse, J., El-Aneed, A. Properties, engineering and applications of lipid-based nanoparticle drug-delivery systems: current research and advances. Nanomedicine (Lond). 5, 1237-1260 (2010).
  2. Lim, S. B., Banerjee, A., Onyuksel, H. Improvement of drug safety by the use of lipid-based nanocarriers). Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 163, 34-45 (2012).
  3. Cabanes, A., et al. Enhancement of antitumor activity of polyethylene glycol-coated liposomal doxorubicin with soluble and liposomal interleukin 2. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 5, 687-693 (1999).
  4. Gabizon, A., Shmeeda, H., Grenader, T. Pharmacological basis of pegylated liposomal doxorubicin: impact on cancer therapy. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 45, 388-398 (2012).
  5. Balasubramanian, S. V., Bruenn, J., Straubinger, R. M. Liposomes as formulation excipients for protein pharmaceuticals: a model protein study. Pharmaceutical research. 17, 344-350 (2000).
  6. Meyer, J., Whitcomb, L., Collins, D. Efficient encapsulation of proteins within liposomes for slow release in vivo. Biochemical and biophysical research communications. 199, 433-438 (1994).
  7. Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et biophysica acta. 858, 161-168 (1986).
  8. Mayer, L. D., Bally, M. B., Hope, M. J., Cullis, P. R. Techniques for encapsulating bioactive agents into liposomes. Chemistry and physics of lipids. 40, 333-345 (1986).
  9. Walde, P., Ichikawa, S. Enzymes inside lipid vesicles: preparation, reactivity and applications. Biomolecular engineering. 18, 143-177 (2001).
  10. Weissleder, R., Ntziachristos, V. Shedding light onto live molecular targets. Nature medicine. 9, 123-128 (2003).
  11. Licha, K., Riefke, B., Ebert, B., Grotzinger, C. Cyanine dyes as contrast agents in biomedical optical imaging. Academic radiology. 9 Suppl 2, S320-S322 (2002).
  12. Pauli, J., et al. Novel fluorophores as building blocks for optical probes for in vivo near infrared fluorescence (NIRF) imaging. Journal of fluorescence. 20, 681-693 (2010).
  13. Holzer, W., et al. Photostability and thermal stability of indocyanine green. Journal of photochemistry and photobiology. B, Biology. 47, 155-164 (1998).
  14. Gandorfer, A., Haritoglou, C., Kampik, A. Retinal damage from indocyanine green in experimental macular surgery. Investigative ophthalmology & visual science. 44, 316-323 (2003).
  15. Saxena, V., Sadoqi, M., Shao, J. Degradation kinetics of indocyanine green in aqueous solution. Journal of pharmaceutical. 92, 2090-2097 (2003).
  16. Kodjikian, L., et al. Toxic effects of indocyanine green, infracyanine green, and trypan blue on the human retinal pigmented epithelium. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 243, 917-925 (2005).
  17. Sevick-Muraca, E. M., Houston, J. P., Gurfinkel, M. Fluorescence-enhanced, near infrared diagnostic imaging with contrast agents. Current opinion in chemical biology. 6, 642-650 (2002).
  18. Bremer, C., Ntziachristos, V., Weissleder, R. Optical-based molecular imaging: contrast agents and potential medical applications. European radiology. 13, 231-243 (2003).
  19. Hilderbrand, S. A., Kelly, K. A., Weissleder, R., Tung, C. H. Monofunctional near-infrared fluorochromes for imaging applications. Bioconjugate chemistry. 16, 1275-1281 (2005).
  20. Langhals, H., et al. Cyanine dyes as optical contrast agents for ophthalmological surgery. Journal of medicinal chemistry. 54, 3903-3925 (2011).
  21. Pauli, J., et al. An in vitro characterization study of new near infrared dyes for molecular imaging. European journal of medicinal chemistry. 44, 3496-3503 (2009).
  22. Ogawa, M., Kosaka, N., Choyke, P. L., Kobayashi, H. H-type dimer formation of fluorophores: a mechanism for activatable, in vivo optical molecular imaging. ACS chemical biology. 4, 535-546 (2009).
  23. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 75, 4194-4198 (1978).
  24. Batzri, S., Korn, E. D. Single bilayer liposomes prepared without sonication. Biochimica et biophysica acta. 298, 1015-1019 (1973).
  25. Fahr, A., van Hoogevest, P., May, S., Bergstrand, N., ML, S. L. Transfer of lipophilic drugs between liposomal membranes and biological interfaces: consequences for drug delivery. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 26, 251-265 (2005).
  26. New, R. R. C. Liposomes a practical approach. , IRL Press at Oxford University Press. (1990).
  27. Barenholz, Y., et al. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Biochemistry. 16, 2806-2810 (1977).
  28. Schwendener, R. A. The preparation of large volumes of homogeneous, sterile liposomes containing various lipophilic cytostatic drugs by the use of a capillary dialyzer. Cancer drug delivery. 3, 123-129 (1986).
  29. Pauli, J., et al. Suitable labels for molecular imaging--influence of dye structure and hydrophilicity on the spectroscopic properties of IgG conjugates. Bioconjugate chemistry. 22, 1298-1308 (2011).
  30. Wu, P., Brand, L. Resonance energy transfer: methods and applications. Analytical biochemistry. 218, 1-13 (1994).
  31. Stark, B., Pabst, G., Prassl, R. Long-term stability of sterically stabilized liposomes by freezing and freeze-drying: Effects of cryoprotectants on structure. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 41, 546-555 (2010).
  32. Tansi, F. L., et al. Liposomal encapsulation of a near-infrared fluorophore enhances fluorescence quenching and reliable whole body optical imaging upon activation in vivo. Small. 9, 3659-3669 (2013).
  33. Chen, R. F., Knutson, J. R. Mechanism of fluorescence concentration quenching of carboxyfluorescein in liposomes: energy transfer to nonfluorescent dimers. Analytical biochemistry. 172, 61-77 (1988).
  34. Windler-Hart, S. L., Chen, K. Y., Chenn, A. A cell behavior screen: identification, sorting, and enrichment of cells based on motility. BMC cell biology. 6, 14(2005).
  35. Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
  36. Erdo, F., Torok, K., Aranyi, P., Szekely, J. I. A new assay for antiphlogistic activity: zymosan-induced mouse ear inflammation. Agents and actions. 39, 137-142 (1993).
  37. Ajuebor, M. N., et al. Endogenous monocyte chemoattractant protein-1 recruits monocytes in the zymosan peritonitis model. Journal of leukocyte biology. 63, 108-116 (1998).
  38. Ajuebor, M. N., Das, A. M., Virag, L., Szabo, C., Perretti, M. Regulation of macrophage inflammatory protein-1 alpha expression and function by endogenous interleukin-10 in a model of acute inflammation. Biochemical and biophysical research communications. 255, 279-282 (1999).
  39. Ajuebor, M. N., et al. Role of resident peritoneal macrophages and mast cells in chemokine production and neutrophil migration in acute inflammation: evidence for an inhibitory loop involving endogenous IL-10. J Immunol. 162, 1685-1691 (1999).
  40. Binstadt, B. A., et al. Particularities of the vasculature can promote the organ specificity of autoimmune attack. Nature. 7, 284-292 (2006).
  41. Ishida, T., Harashima, H., Kiwada, H. Liposome clearance. Bioscience reports. 22, 197-224 (2002).
  42. Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. Understanding the correlation between in vitro and in vivo immunotoxicity tests for nanomedicines. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 172, 456-466 (2013).
  43. Szebeni, J., et al. Prevention of infusion reactions to PEGylated liposomal doxorubicin via tachyphylaxis induction by placebo vesicles: a porcine model. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 160, 382-387 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Enkapsulacja liposomalnafluorescencja w bliskiej podczerwieniobrazowanie in vivowychwyt fagocytarnyhydratacja filmu lipidowegooczyszczanie przez ekstruzjępomiary spektrometryczneobrzęk indukowany zymosanemliposomy PEGylowane
Wygaszanie fluorescencji fluoroforu bliskiej podczerwieni w obudowie liposomalnej jako narzędzie do obrazowania optycznego in vivo
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.