Artykuł metodologiczny

Produkcja i celowanie w monowalentne kropki kwantowe

26.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52198

⸱

23 października 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Otolaryngology, University of California, San Francisco, 2Department of Chemistry, University of California, Berkeley, 3Materials Science Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, 4Department of Pharmaceutical Chemistry, University of California, San Francisco, 5Tetrad Graduate Program, University of California, San Francisco, 6Center for Systems and Synthetic Biology, University of California, San Francisco, 7Chemistry and Chemical Biology Graduate Program, University of California, San Francisco

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Dostarczamy szczegółowe instrukcje dotyczące przygotowania monowalentnych docelowych kropek kwantowych (mQD) z fosforoazotanu DNA o określonej długości. Owijanie DNA odbywa się z dużą wydajnością, dlatego produkty nie wymagają oczyszczania. Demonstrujemy zastosowanie znacznika SNAP do kierowania mQD do receptorów na powierzchni komórki w zastosowaniach obrazowania żywych komórek.

Streszczenie

Wielowartościowość komercyjnych kropek kwantowych (QD) i trudności związane z produkcją kropek monowartościowych ograniczyły ich zastosowania w biologii, gdzie grupowanie i przestrzenna organizacja biomolekuł jest często przedmiotem badań. Opisujemy tutaj protokół wytwarzania monowalentnych kropek kwantowych (mQD), który można osiągnąć w większości biologicznych laboratoriów badawczych poprzez proste zmieszanie QD rdzenia/powłoki CdSe/ZnS z fosforotionianem DNA (ptDNA) o określonej długości. Po tym, jak pojedyncza nić ptDNA owinie QD, dodatkowe nici są wykluczane z powierzchni. Produkcja mQD w ten sposób może odbywać się na małą i dużą skalę, przy użyciu komercyjnych odczynników i w minimalnych krokach. Te mQD mogą być specyficznie kierowane na cele biologiczne poprzez hybrydyzację z komplementarnym jednoniciowym docelowym DNA. Demonstrujemy zastosowanie tych mQD jako sond obrazowych, znakując receptory Notch oznaczone SNAP na żywych komórkach ssaków, na które są ukierunkowane mQD zawierające ugrupowanie benzylguaninowe.

Wprowadzenie

Dynamika pojedynczych cząsteczek na żywych komórkach przyczynia się do ich biologicznej funkcji. Obrazowanie fluorescencyjne pojedynczej cząsteczki jest popularną metodą badania dynamiki pojedynczej cząsteczki na powierzchni komórki1,2,3. Jednak najczęściej stosowane sondy obrazowe w tych badaniach mają kilka istotnych wad. Na przykład konwencjonalne barwniki organiczne i białka fluorescencyjne zapewniają umiarkowaną jasność, około 105–106 M-1 cm-1, ale są niestabilne fotochemicznie, bielejąc się po emisji około 105–10 6 fotonów w typowych warunkach obrazowania żywych komórek4,5. Natomiast nanocząstki półprzewodnikowe, często nazywane kropkami kwantowymi (QD), są znacznie jaśniejsze i bardziej stabilne, ze współczynnikami ekstynkcji w zakresie 106–107 M-1 cm-1 i przekraczającymi 107–108 wyemitowanych fotonów przed fotobieleniem5. Poprawiona jasność i fotostabilność QD w porównaniu z fluoroforami organicznymi umożliwia obserwację pojedynczych cząsteczek ze znacznie większą liczbą klatek na sekundę i na znacznie dłuższych trajektoriach6.

Pomimo ich zalet i dostępności komercyjnej, te potężne środki do obrazowania mają jeszcze kilka zobowiązań. Po pierwsze, mają słabo zdefiniowaną wartościowość ukierunkowaną, co może skutkować sieciowaniem docelowych biomolekuł6. Po drugie, mają one na ogół duży rozmiar hydrodynamiczny (> 20 nm), co ogranicza dostęp do niektórych zatłoczonych środowisk komórkowych7. Po trzecie, mają ograniczoną modułowość kierowania7. Kilka strategii próbowało rozwiązać te problemy8,9,10, ale generalnie wymagają specjalistycznej wiedzy i odczynników do wdrożenia.

Aby rozwiązać te problemy, niedawno opisaliśmy strategię "Wykluczenie steryczne" dla przygotowania monowalentnych, małych i modułowych QD11. Kolejki karnetów są owinięte pojedynczym polimerem DNA o długiej fosforotanii (ptDNA). ptDNA wiąże się z powierzchnią QD poprzez wielokrotne oddziaływania Zn-S między odsłoniętymi powierzchniowo atomami Zn a grupami fosforotionianowymi polimeru ptDNA. Pojedynczo związany polimer sterycznie i elektrostatycznie wyklucza wiązanie dodatkowych odpowiedników polimeru bez znacznego zwiększania całkowitego rozmiaru cząstki (około 2 nm). Wszystkie odczynniki są dostępne w handlu, produkty są formowane z wysoką wydajnością, a proces wymaga jedynie etapów odsalania w celu oczyszczenia. Po znakowaniu, QD owinięte pojedynczym ptDNA (mQD) wiążą się z komplementarnymi niciami DNA zawierającymi domeny docelowe (np. benzylguaninę (BG), benzylocytozynę lub alkilohalogenki).

Te funkcje są ukierunkowane na mQD specjalnie do znaczników enzymatycznych, takich jak SNAP, CLIP & HALO, które są genetycznie połączone z interesującym nas białkiem. Jest to protokół syntezy, celowania i obrazowania żywych komórek mQD wytwarzanych przez wykluczenie steryczne.

Protokół

1. Produkcja monowalentnych kropek kwantowych

  1. Przeniesienie fazowe QD z fazy organicznej do fazy wodnej
    1. Rozcieńczyć 200 μM 1 μM roztworu QD fazy organicznej z 400 μl chloroformu w szklanej fiolce o pojemności 5 ml.
    2. Zmieszać 400 μl 0,3 M roztworu chloroformu bromku tetrabutyloamonu (TBAB) z 36 μl czystego tiolu mPEG (CH3O(CH2CH2O)6C2H5SH) i wstrząsnąć O/N.
    3. Dodać 800 μl 0,2 M wodnego roztworu NaOH i wstrząsać przez 30 sekund. Przeniesienie fazowe następuje w ciągu kilku minut, na co wskazuje przeniesienie kolorowych cząstek do fazy wodnej powyżej gęstszej fazy organicznej.
    4. Jeżeli cząstki agregują się w trzeciej fazie między fazą wodną a fazą organiczną, należy wydłużyć czas inkubacji z tiolem mPEG. Jeśli faza wodna pozostaje czysta, oznacza to, że QD nie uległy przeniesieniu fazowemu (patrz rysunek 3A). Alternatywnie, zwiększ stężenie tiolu mPEG w kroku 2, aby złagodzić słabe przenoszenie faz
      5. .
    5. Odzyskać (zabarwioną) fazę wodną, a następnie zagęścić zebrane mięśnie czasu reakcji za pomocą kolumny wirowej Centricon (odcięcie masy cząsteczkowej 30 kDa) do 1 ml.
    6. Dodać stężony roztwór QD do kolumny Sephadex NAP10 wstępnie zrównoważonej 10 mM buforem Tris zawierającym 30 mM NaCl (pH 8,0). Eluować QD za pomocą 1,5 ml buforu elucyjnego za pomocą przepływu grawitacyjnego.
    7. Zmierzyć stężenie mięśni czasu środkowego za pomocą spektroskopii absorpcyjnej przy długości fali 350 nm.
  2. Przygotowanie mQD
    1. Kup (lub zsyntetyzuj) ptDNA. W protokole tym stosuje się sekwencję 5'-AS50(CT)10(ACTG)5 -3' (patrz Tabela 1).
DNAkolejność
5'-AS50(CT)10(ACTG)5-3'ASASASAS/> ASASA SAS
ASASAS /> CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTGACTGACTGACTGACTGACTGACTGACTGACTG
5'-NH2-(CT)10(CAGT)5-3'NH2-/C6spacer/ CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGT
BG-DNABG-/C6spacer/ CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGT

Tabela 1. Sekwencje DNA używane do produkcji i celowania w mQD.

  1. Przygotować 1 ml roztworu QD o stężeniu 100 nM w 10 mM buforze Tris zawierającym 30 mM NaCl (pH 8).
  2. Dodaj kroplami 500 μl roztworu ptDNA o stężeniu 100 nM do wodnych separatorów czasu na 1 minutę, energicznie mieszając. Wymieszaj lub umieść na shakerze na dodatkowe 9 godzin.
    Uwaga: Teoretycznie powinno to dać stosunek ptDNA:QD 1:2. Jednak rzeczywista stechiometria nigdy nie jest idealna - zwykle wynik jest bliższy 1:1,5. Aby uzyskać stosunek ptDNA:QD 1:1, konieczna jest densytometria po elektroforezie żelowej w celu ilościowego określenia dokładnego stosunku koniugacji przy znanych objętościach użytych powyżej.
  3. Usunąć ~10 μl mieszaniny QD, aby uruchomić na analitycznym żelu agarozowym. Usuń również podobne stężenie niesprzężonych QD w fazie wodnej (z kroku 1.2.1).
    1. Dodać ~2 μl 6x buforu ładującego Ficoll (w celu zwiększenia gęstości roztworu) i uruchomić te dwie próbki razem na żelu agarozowym 0,8% wag./v w buforze boranu sodu przez 15 minut przy 150 V. Widoczne jest pojedyncze pasmo na niesprzężonym pasie kontrolnym migrującym w pobliżu studni oraz dwa pasma na pasie ze sprzężonymi QD (patrz żele na rysunku 2B).
  4. Oblicz niesprzężoną frakcję QD, używając względnej intensywności dwóch pasm (patrz równanie na rysunku 2B). Następnie użyj tej frakcji do obliczenia dodatkowej objętości roztworu ptDNA o stężeniu 100 nM wymaganej do dopasowania liczby karbów.
  5. Powtórz kroki od 1.2.3 do 1.2.5 jeszcze raz z tą obliczoną objętością lub do momentu, gdy sprzężone QD zapadną się w pojedyncze pasmo na żelu, wskazując na całkowite sprzężenie wszystkich QD.
  6. Dodać 100 μl 10 mM (CO2H)CH2O(CH2CH2O)6C11H23SH (karboksylowy PEG6 alkanowy tiol) w 10 mM buforze Tris zawierającym 30 mM NaCl (pH 8) do sprzężonych mQD wytworzonych powyżej i wstrząsać przez 10 min.
    Uwaga: Te ligandy PEG pasywują powierzchnię QD. Dłuższy PEG będzie lepiej pasywował QD, jednak zwiększy również ich rozmiar. Hydrofobowa funkcjonalność alkanu tiolowego ma znacznie większe powinowactwo do QD, w ujęciu zbiorczym, niż mniej hydrofobowy PEG-tiol stosowany do przenoszenia faz. Dlatego nie pozwól, aby ten krok trwał zbyt długo, w przeciwnym razie ptDNA zostanie zastąpione przez alkan-PEG-tiol. Po ~ 30 minutowej inkubacji znaczna część DNA zostanie przemieszczona z QD (Figura 3B).
  7. Aby usunąć nadmiar alkanu, PEG-tiol, dodać 0,5 ml roztworu QD do kolumny sephadex NAP5 wstępnie zrównoważonej buforem elucyjnym (10 mM bufor Tris zawierający 30 mM NaCl). Zebrać mQD za pomocą 1,0 ml buforu elucyjnego za pomocą przepływu grawitacyjnego.
  8. Zagęścić zebrane QD za pomocą kolumny wirującej Centricon (30 kDa). Przechowywać te mQD w temperaturze 4 °C przez wiele miesięcy. Nie zamrażaj ich.
    Uwaga: Jeśli na dnie tubki widoczny jest kolorowy granulek, kropki zagregowały się i prawdopodobnie nie nadają się już do użytku.

2. Produkcja celującego DNA (benzylguaniny-)

  1. Wyprodukuj lub kup DNA zakończone aminami. W protokole tym stosuje się sekwencję 5'-NH2-(CT)10-(CAGT)5-3' (patrz Tabela 1). Łącznik poly-CT zwiększa dostęp do funkcji ukrytych głęboko w glikokaliksie, ale może nie być potrzebny we wszystkich zastosowaniach. Jeśli jest dostęp do syntezatora DNA, należy wyprodukować aminomodyfikowane DNA przy użyciu odpowiedniego modyfikatora 5' aminomodyfikatora (modyfikatora 5' amino-modyfikatora C6).
  2. Rozpuścić BG-N-hydroksysukcynimid (BG-NHS) w suchym dimetylosulfotlenku (DMSO) w stężeniu 10 mg/ml.
    Uwaga: BG-NHS absorbuje wodę z powietrza i prowadzi do hydrolizy reaktywnego estru NHS, szczególnie w rozpuszczalnikach higroskopijnych, takich jak DMSO i dimetyloformamid (DMF). BG-NHS najlepiej przechowywać w temperaturze -80 °C w postaci proszku we własnej fiolce w wtórnym pojemniku zawierającym środek osuszający. Ogrzać do suchego oleju przed otwarciem fiolki. Alternatywnie, natychmiast podwielokrotność estru BG-NHS do jednorazowego użytku należy przekształcić w suchy rozpuszczalnik polarny i zamrozić w temperaturze -80 °C lub w pełni przereagować z aminowym DNA w kroku 2.2.
  3. Reaguj, mieszając BG-NHS w DMSO z kroku 2.1 z DNA zakończonym aminami w wodzie buforowanej HEPES (kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy) (pH 8,5). W typowej reakcji 20 μl 10 mg/ml BG-NHS w DMSO z 2 μl 2 mM NH2-(CT)10-(CAGT)5 w 58 μl wody dejonizowanej buforowanej 20 μl 0,5 M HEPES pH 8,5. Przeprowadzać reakcje w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Mieszaj szybko, ponieważ reakcja postępuje szybko i musi konkurować z hydrolizą estrów NHS.
  4. Sonikować przez 5–10 minut, aby zapewnić dokładne wymieszanie. Inkubacja ~ 1 godzina w RT. Stosunek stechiometryczny BG:DNA można zmienić, aby doprowadzić reakcję do końca.
  5. Odsolić reakcję za pomocą standardowej kolumny NAP5 do 100 mM octanu trietyloaminy (TEAA, pH 7).
  6. Oczyść BG-DNA z nieprzereagowanego aminowego DNA za pomocą HPLC z odwróconymi fazami, przeprowadzając gradient 100 mM TEAA:acetonitryl (ACN) między 8% a 95% acetonitrylu przez 30 minut. Nieprzereagowany aminowy DNA wymyje się przed BG-DNA. Zbierz frakcję BG-DNA w stożkowej probówce.
    1. Użyj kolumny Zorbax C18 do standardowego oczyszczania oligonukleotydów i następującego gradientu:
      0→15 min: 8→30% ACN;
      15→21 min: 30–90% ACN;
      21→25 min: 90→8% ACN;
      25→30 min: 8% PKW;
  7. Zamrozić w ciekłym azocie i liofilizować zebraną frakcję. Ponownie zawiesić DNA w wodzie dejonizowanej. Aby zachować szczególną ostrożność, liofilizuj jeszcze dwa razy, aby usunąć resztki TEAA. Resztkowe TEAA mogą być toksyczne dla komórek w wyższych stężeniach.
  8. Ponownie zawiesić liofilizowane BG-DNA w wodzie, upewniając się, że umyłeś boki probówki i rozcieńczyć do ~25 μM. Porcję i przechowywać w temperaturze 4 °C. Próbki przechowywano przez ~9 miesięcy bez zauważalnej degradacji.

3. Oznaczanie żywych komórek za pomocą monowalentnych kropek kwantowych

  1. Opcjonalnie pasywować mQD tuż przed eksperymentem obrazowym przy użyciu odczynników, takich jak kazeina (0,5%) lub albumina surowicy bydlęcej (BSA, 1-3%).
  2. Komórki płytki wyrażające białko znakowane SNAP na szkle o jakości fluorescencji o całkowitym wewnętrznym odbiciu (TIRF). W tym eksperymencie używamy linii komórkowej U2OS wyrażającej receptor Notch1 oznaczony SNAP i wysokiej jakości szklane powierzchnie.
  3. Po przyczepieniu komórek do szkła (~24 godziny) usuń pożywkę wzrostową, przemyj PBS i inkubuj komórki przez 10–30 minut w temperaturze pokojowej w ~100–150 μl PBS lub pożywki komórkowej zawierającej ~1 μM BG-DNA z kroku 2.6 powyżej.
  4. Po inkubacji z BG ostrożnie umyć komórki PBS lub pożywką komórkową. Inkubować komórki przez ~ 5–10 minut z mQD wyprodukowanymi w kroku 1.2.9 (i opcjonalnie pasywowanymi w kroku 3.1).
  5. Opcjonalnie przemyć niezwiązane mQD i umieścić komórki z powrotem w buforze/pożywce odpowiedniej zarówno do obrazowania, jak i hodowli. W przypadku komórek, które miały być obrazowane w trybie TIRF, końcowy etap płukania był często zbędny, ponieważ niezwiązane mQD w roztworze dyfundowały tak szybko w porównaniu z związanymi mQD, że były niewykrywalne podczas analizy.

4. Mikroskopia i analiza

  1. Zobrazuj komórki za pomocą mikroskopu TIRF.
    Uwaga: Oscylomierz musi być wyposażony w rozłączne filtry wzbudzenia i emisji lub niestandardową kostkę filtra QD. Kolejki przełożonych najlepiej wzbudza się laserem o niskiej długości fali (405 lub 488 nm). Odstępy czasu o różnej średnicy mają charakterystyczne długości fal emisyjnych, zwykle związane z dużym przesunięciem Stoke'a.
  2. Ze względu na jasność mQD, zbieraj obrazy z dużą liczbą klatek na sekundę w TIRF podczas obrazowania podstawowej strony żywej komórki.
    Uwaga: Alternatywnie, dynamikę pojedynczych cząsteczek można śledzić w innych płaszczyznach ogniskowych za pomocą mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem. Zautomatyzowane oprogramowanie do śledzenia pojedynczych cząstek jest na ogół skuteczne w dokładnym śledzeniu jasnych i fotostabilnych mQD.

Wyniki

Przeniesienie QD z fazy organicznej do wodnej jest kluczowe dla produkcji mQD, jednak może być zależne zarówno od warunków, jak i od rodzaju QD. Przeniesienie fazy w sekcji 1.1 powinno wyglądać tak przejrzyście, jak w dwóch pierwszych fiolkach na Rysunku 3. Jeśli przeniesienie przypomina bardziej fiolkę 3, należy spróbować ponownie, zmieniając warunki.

Po pokryciu kropki kwantowych (QD) ujemnie naładowanym DNA powinny one migrować w żelu oddzielnie od nieopakowanych QD. Przy użyciu alikwotu nieopakowanych QD jako kontroli, po dodaniu ptDNA powinien pojawić się drugi, szybciej migrujący prążek, co widać na pierwszym żelu na Rysunku 2B. Całkowite utworzenie mQD jest demonstrowane przez zanik prążka nieruchomego i jego przejście w prążek ruchomy, co widać na ostatnim żelu na Rysunku 2B. Jeśli alikwot otrzymanego produktu mQD migruje jako pojedynczy prążek oddzielny od nieopakowanych QD, oznacza to, że mQD są monowalentne i gotowe do użycia w kolejnych krokach.

Labelowanie komórek powinno być specyficzne dla wybranego celu i powinno zależeć od poziomów ekspresji białka oraz stężenia mQD. W przypadku każdej konkretnej aplikacji często wymagana jest empiryczna optymalizacja zarówno stężenia mQD, jak i pasywacji mQD. Rysunek 4B przedstawia labelowanie komórek U2OS wykazujących ekspresję receptora Notch z tagiem SNAP przy użyciu mQD w stężeniu od 0,5 nM do 10 nM.

Schemat reakcji chemicznych przedstawiający oddziaływania białek celowanych za pomocą SNAP, CLIP i HALO z DNA.
Rysunek 1. Modułowe celowanie mQDs. mQDs hybrydyzują z ssDNA funkcjonalizowanym różnymi cząsteczkami celującymi. DNA połączone z benzylguaniną kieruje mQDs do białek fuzyjnych znakowanych SNAP. Inne modyfikacje 5’ oraz sekwencje DNA umożliwiają kierowanie mQDs do wielu innych biomolekuł. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat procesu powlekania nanocząsteczek PEG z owijaniem DNA; układ przeniesienia fazowego; uwagi chemiczne.
Rycina 2. Schemat produkcji mQD. (A) Kropki kwantowe (QD) w fazie organicznej są przenoszone do fazy wodnej poprzez traktowanie mPEG-tiolem i TBAB, owijane ptDNA i pasywowane karboksy-PEG6-alkanotiolem. Reprezentatywne obrazy TEM przedstawiają odpowiednio organiczne QD545, QD585 i QD605. (B) Metoda empirycznego wyznaczania stechiometrii oddziaływania między QD a ptDNA w kroku drugim opisanym powyżej. Stechiometrie QD i ptDNA są weryfikowane empirycznie za pomocą densytometrii w taki sposób, aby końcowa stechiometria reakcji wynosiła 1:1 (QD:ptDNA). Początkowa liczba moli ptDNA jest mnożona przez stosunek QD:mQD i korygowana o rzeczywistą objętość po konjugacji, aby uzyskać liczbę moli wymaganą do osiągnięcia konjugacji 1:1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Proces transferu fazowego kropek kwantowych; schemat przedstawiający udany/nieudany transfer oraz analizę pasywacji.
Rysunek 3. Szczegóły eksperymentalne produkcji mQDs. (A) Reprezentatywne zdjęcia udanego i nieudanego transferu fazowego. Kropki kwantowe powinny widocznie przenosić się między gęstą fazą organiczną a mniej gęstą fazą wodną. Niepełne rozdzielenie faz świadczy o słabym transferze. (B) ptDNA może zostać zastąpiony przez alkan-PEG-tiol. Dane z żelu po prawej stronie są reprezentatywne dla reakcji, w której znaczna frakcja ptDNA została wyparta z kropek kwantowych w wyniku nadmiernej pasywacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat ekspresji SNAP-tagu; znakowanie BG-DNA, hybrydyzacja kropkami kwantowymi. Wyniki analizy kropek kwantowych.
Rysunek 4. Znakowanie białek z SNAP-tagiem w żywych komórkach. (A) Schemat przedstawiający ekspresję, przyłączenie i znakowanie receptora z SNAP-tagiem za pomocą mQD ukierunkowanego na BG. (B) Reprezentatywne znakowanie komórek wykazujących ekspresję konstruktu SNAP-Notch-mCherry przy różnych stężeniach mQD. mQDs pasywowane PEG12 kolokalizują z mCherry, co wskazuje na specyficzne znakowanie. Niższe gęstości znakowania (<0,5 nM) są zazwyczaj preferowane dla śledzenia pojedynczych cząsteczek. Pasek skali wynosi 10 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Modułowość konstrukcji mQD umożliwia zwiększenie stopnia elastyczności eksperymentalnej. Na przykład, różne mQD mogą być szybko przygotowane w unikalnych kolorach, co pozwala na jednoczesne obrazowanie wielu celów. Sekwencja celująca w ssDNA może kierować mQD do białek, cukrów12, lipidów i powierzchni13. Dostępnych jest wiele znaczników enzymatycznych z reaktywnościami ortogonalnymi, co pozwala na jednoczesne obrazowanie wielu celów za pomocą różnie ukierunkowanych mQD. Oprócz celowania za pomocą znacznika SNAP, udało się również znakować docelowe białka za pomocą mQD za pomocą znacznika CLIP, znacznika HALO i białek biotynylowanych. Protokół ten demonstruje specyficzne znakowanie receptora powierzchniowego na żywych komórkach za pomocą tych mQD, ale protokół można łatwo dostosować do wielu różnych kontekstów.

Istotnym wglądem metodologicznym w wytwarzaniu mQD o określonej wartościowości jest to, że ~ 50 zasad połączonych z fosforotionianem jest potrzebnych do owinięcia QD (a tym samym zapobieżenia jednoczesnemu wiązaniu się dwóch cząsteczek). Sekwencja poli-AS50 odtwarzalnie i stabilnie związana QD 605 nm firmy Life Technologies. Chociaż ten produkt został wycofany, strategia wykluczenia sterycznego można uogólnić na podobne produkty od innych dostawców o różnych rozmiarach, kształtach, właściwościach spektralnych.

Wydajność i stabilność QD owiniętych ptDNA zależy krytycznie od chemii powierzchni i struktury QD. W związku z tym sukces protokołu będzie zależał od komercyjnego źródła i struktury chemicznej QD. Dla celów niniejszego protokołu istnieją trzy główne różnice między różnymi komercyjnymi źródłami QD: różnica w warunkach niezbędnych do przeniesienia fazy; różnica w sile początkowego wiązania PEG-tiol-ligand, co może utrudniać przemieszczanie się przez ptDNA; oraz różnica w ilości odsłoniętego rdzenia CdSe, która może prowadzić do wygaszania QD w warunkach przenoszenia fazy tiolowej mPEG.

W chwili publikacji, QD o najlepszej strukturze do produkcji mQD to QD 4–10 nm CdSe/ZnS core/shell QD zakupione od Life Technologies z widmami emisji przy 545, 585, 605 i 625 nm (rysunek 2A). Odstępy czasu nienastawionego oparte na preparacie "Vivid" (545, 605 itd.) ulegają zanikowi po dodaniu tiolu mPEG i nie nadają się do tego zastosowania. Separatory QD firmy Aldrich i Ocean Nanotech działają dobrze, ale wymagają dłuższych etapów przenoszenia faz i wstępnej obróbki tlenkiem trioktylofosfiny. Ten protokół został zoptymalizowany pod kątem QD firmy Life Technologies.

Sekwencja fosforonianu poli-A używana do owijania QD jest zakończona natywnym 20-merowym ogonem DNA zawierającym sekwencję (ACTG)5 , do której może hybrydyzować nić celująca. Ta sekwencja jest wygodna, ponieważ ma niewielką lub żadną strukturę drugorzędową i pozostanie hybrydyzowana w temperaturze 37 °C w PBS. Jeśli istnieje dostęp do syntezatora DNA, ptDNA można zsyntetyzować, a następnie oczyścić za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (HPLC) przy użyciu kolumny C8 . ptDNA wymyje się później w HPLC niż równoważne oligonukleotydy z natywnym szkieletem. Zazwyczaj pozostawiamy grupę ochronną 5' DMT na naszych oligonukleotydach fosforoazotanu po oczyszczeniu.

Pasywacja QD owiniętych ptDNA jest zwykle wymagana w celu poprawy stabilności koloidalnej QD i zmniejszenia wiązania tła w większości zastosowań eksperymentalnych. Protokół wykorzystuje warstwę PEG do pasywacji QD. Karboksylowy tiol alkanowy PEG z dodatkowymi jednostkami PEG ((CO2H)CH2O(CH2CH2O)12C11H23SH, karboksyl-PEG12 alkanowy tiol) zapewnia znacznie zmniejszone tło, chociaż dłuższe PEG są zarówno większe, jak i ogólnie droższe. mQD pokryte karboksylowymi ligandami tiolowymi karboksylowymi PEG alkanowymi są wysoce stabilne w fizjologicznych, takich jak sól fizjologiczna buforowana fosforanami i pożywki hodowlane. Długotrwałe przechowywanie (> 8 miesięcy) mQD w temperaturze 4 °C nie wykazało znaczącej agregacji ani oderwania ptDNA11. W zależności od eksperymentu, sama pasywacja PEG QD nie zawsze wystarczająco zmniejsza niespecyficzne wiązanie mQD. Inkubacja zarówno komórek, jak i mQD w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) zawierającej 3% BSA przez 20 minut przed użyciem znacznie zmniejsza niespecyficzne wiązanie z komórkami, chociaż zwiększa pozorny promień hydrodynamiczny mQD o ~50%. Pasywacja 0,5% kazeiną jeszcze bardziej zmniejsza niespecyficzne wiązanie, ale zwiększa pozorny rozmiar w większym stopniu niż BSA.

Koniec 5' nici DNA komplementarnej do mQD może być modyfikowany, aby umożliwić celowanie w wiele różnych biomolekuł. Istnieje wiele uznanych technik kowalencyjnej modyfikacji białek, lipidów i cukrów za pomocą jednoniciowego DNA (ssDNA). Tak długo, jak ssDNA jest prezentowane zewnątrzkomórkowo, jest dostępne dla rozpuszczalnych mQD. mQD z powyższymi sekwencjami szybko hybrydyzują ze swoją komplementarną nicią DNA w warunkach hodowli komórkowej. 10-20-krotny dystans poli-(CT) między ptDNA a sekwencją docelową może być wymagany do skutecznego celowania, aby podnieść sekwencję wiążącą ponad gruby i ujemnie naładowany glikokaliks komórki. W tym protokole zdecydowaliśmy się wyprodukować BG-DNA z komplementarną sekwencją (CAGT)5 , która zarówno zhybrydyzuje się z mQD, jak i kowalencyjnie połączy się z białkiem SNAP-tag w celu szybkiego i specyficznego znakowania. Podobny protokół dobrze sprawdza się w sprzęganiu innych estrów NHS z oligonukleotydami modyfikowanymi amino.

W przypadku obrazowania pojedynczych cząsteczek zwykle wymagana jest niska gęstość znakowania w celu rozdzielenia pojedynczych cząsteczek. Końcowe stężenie mQD wynoszące ~0,5 nM w PBS ze środkiem pasywującym jest dobrym celem. Jednak te wysokie rozcieńczenia czasami powodowały niedostateczne znakowanie komórek. W takim przypadku można dodać dodatkowe mQD, aż do uzyskania optymalnej gęstości etykietowania. W przypadku ludzkiego Notch1 znakowanego SNAP, stężenia >10 nM mQD wytworzyły gęste komórki znakujące, podczas gdy 0,5 nM mQD spowodowało przyłączenie ~ 20 mQD na podstawowej powierzchni docelowej komórki (patrz Figura 4B). Znakowanie komórek za pomocą mQD było w dużym stopniu zależne od konfluencji posianych komórek. Nadmiernie zlewające się komórki nie znakują się na ich podstawowych powierzchniach.

Podsumowując, opisano prostą metodę generowania monowalentnych i modułowych QD. Te mQD znajdują zastosowanie w szerokim zakresie zastosowań obrazowania żywych komórek, jak wykazano poprzez obrazowanie receptora Notch na żywych komórkach U2OS. Zastosowanie mQD nie ogranicza się do tego konkretnego przypadku, ale może być potencjalnie rozszerzone na inne cele komórkowe, takie jak inne białka, kwasy nukleinowe i enzymy.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Finansowanie zapewnione przez DOD W81XWH-10-1-1023 (Z.J.G.), grant P50 GM081879 od UCSF Center for Systems and Synthetic Biology (Z.J.G.), NIH 5R21EB015088-02 (Y.J.) i NIH 1R21EB018044 (Z.J.G. & Y.J.). D.S. był wspierany przez Human Frontier Science Program Interdyscyplinarne stypendium badawcze na stażu podoktorskim.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
mQD Production
Phosphorothioate DNA:
(A*)x50-(ACTG)x5IDTWiększość firm zajmujących się syntezą DNA
Kropki kwantowe:
QDots 525, 585, 605 & 625InvitrogenQ21791MP (545), Q21711MP (585), Q21701MP (605)Niestandardowa synteza QD dla QD625.
QD610Ocean NanotechQSP-610-10 
QD 610 lamdaAldrich731854
Chloroform, 99,8%ACROS67-66-3
Bromek tetrabutyloamoniowy, 98,0%Sigma-Aldrich426288
mPEG tiol [2,5,8,11,14,17,20-heptaoksadokozan-22-tiol], MW 354,5, 95%Polipure11156-0695
HSC11EG6CO2H  [HS-(CH2)11-(OCH2CH2)6-OCH2CO2H]ProChimiaTH 003-m11.n6-0.1
Kwas borowy, 99,5%Sigma-AldrichB0394
Wodorotlenek sodu, 99,0%ACROSS/4845
Chlorek sodu, 98%Sigma-Aldrich310166
Agaroza LEU.S. Biotech SourcesG02PD-125
EtanolSigma-Aldrich459828
BG-Produkcja DNA
Amine DNA:
(CAGT)5-NH2IDTN/AWiększość firm zajmujących się syntezą DNA
(CAGT)5(T)40-NH2IDTN/AWiększość firm zajmujących się syntezą DNA
NHS-GLA-BenylguaninaNowa Anglia BiosciencesS9151
DMSOSigma-AldrichD8428
Bufor HEPESSigma-Aldrich83264
Kolumna NAP5 GEHealthcare17-0853-01
C18 Kolumna
acetonitrylu
Hodowla komórek ssaków i Obrazowanie
Linia komórkowa wyrażająca białko znakowane SNAPNew England BiosciencesE9100S
McCoys 5AUCSF Zakładspecyficzny dla hodowli U2OS
Surowica bydlęca płoduUCSF Zakładhodowli komórkowej specyficzny dla hodowli U2OS
PBSUCSF Cell Culture Facility
Nunc Lab-tek II Chambered Szkło nakrycioweThermo-Fischer Scientific155409
Matryplate 96-dołkowa płytkaBrooks Life Science SystemsMGB096-1-2-LG-L
BSA
5% rozpuszczalna w alkaliach kazeinaEMD Millipore70955Nie wszystkie kazeiny są takie same
(Opcjonalnie) Odczynniki do syntezy DNA
5' Modyfikator aminy C6Glen ResearchOct-06
dA-tiofosforamidytGlen Research10-700
Analysis Software
FIJIhttp://valelab.ucsf.edu/~schindelin/
RyTrack.prohttp://sun.iwu.edu/~gspaldin/rytrack.html
Tracker
hodowli komórkowej http://www.gartnerlab.ucsf.edu/more/software

Bibliografia

  1. Sako, Y., Minoghchi, S., Yanagida, T. Single-molecule imaging of EGFR signaling on the surface of living cells. Nature Cell Biology. 2 (3), 168-172 (2000).
  2. Luo, W., He, K., Xia, T., Fang, X. Single-molecule monitoring in living cells by use of fluorescence microscopy. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (1), 43-49 (2013).
  3. Chung, I., et al. Spatial control of EGF receptor activation by reversible dimerization on living cells. Nature. 464 (7289), 783-787 (2010).
  4. Fernández-Suárez, M., Ting, A. Fluorescent probes for super-resolution imaging in living cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (12), 929-943 (2008).
  5. Sark, W. G. J. H. M., Frederix, P. L. T. M., Vanden Heuvel, D. J., Gerritsen, H. C. Photooxidation and photobleaching of single CdSe/ZnS quantum dots probed by room-temperature time-resolved spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 105 (35), 8281-8284 (2001).
  6. Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. Probing cellular events, one quantum dot at a time. Nature Methods. 7 (4), 275-285 (2010).
  7. Michalet, X., et al. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics. Science. 307 (5709), 538-544 (2005).
  8. Howarth, M., et al. Monovalent, reduced-size quantum dots for imaging receptors on living cells. Nature Methods. 5 (5), 397-399 (2008).
  9. Iyer, G., et al. Aromatic aldehyde and hydrazine activated peptide coated quantum dots for easy bioconjugation and live cell imaging. Bioconjugate Chemistry. 22 (6), 1006-1011 (2011).
  10. Tikhomirov, G., et al. DNA-based programming of quantum dot valency, self-assembly and luminescence. Nature Nanotechnology. 6 (8), 485-490 (2011).
  11. Farlow, J., Seo, D., Broaders, K. E., Taylor, M. J., Gartner, Z. J., Jun, Y. W. Formation of targeted monovalent quantum dots by steric exclusion. Nature Methods. 10 (12), 1203-1205 (2013).
  12. Gartner, Z. J., Bertozzi, C. R. Programmed assembly of 3-dimensional microtissues with defined cellular connectivity. Proceeding of the National Academy of Sciences USA. 106 (12), 4606-4610 (2009).
  13. Selden, N. S., et al. Chemically programmed cell adhesion with membrane-anchored oligonucleotides. Journal of the American Chemical Society. 134 (2), 765-768 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Synteza kropek kwantowychowijanie DNAfosforotioate DNAobrazowanie pojedynczych cząsteczekreceptory z tagiem SNAPtargetowanie benzylguaninątransfer fazowyanalityczna elektroforeza żelowaznakowanie żywych komórek
Produkcja i celowanie w monowalentne kropki kwantowe
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.