Analiza swoistości metylotransferaz lizyny białkowej przy użyciu macierzy peptydowych SPOT

Podsumowanie

Tablice peptydowe syntetyzowane metodą SPOT mogą być używane do analizy specyficzności substratowej metylotransferaz lizynowych białek (PKMT) oraz do zdefiniowania spektrum substratów PKMT, aby zrozumieć ich biologiczną rolę. Protokół ten opisuje, jak syntetyzować macierze peptydowe, metylować je za pomocą PKMT i analizować wyniki.

Streszczenie

Metylacja lizyny jest nową modyfikacją potranslacyjną i została zidentyfikowana na kilku białkach histonowych i niehistonowych, gdzie odgrywa kluczową rolę w rozwoju komórek i wielu chorobach. Zidentyfikowano około 5000 miejsc metylacji lizyny na różnych białkach, które są wyznaczane przez kilkadziesiąt metylotransferaz lizyny białek. Sugeruje to, że każdy PKMT metyluje wiele białek, jednak do tej pory zidentyfikowano tylko jeden lub dwa substraty dla kilku z tych enzymów. Aby podejść do tego problemu, wprowadziliśmy analizy specyficzności substratów PKMT oparte na macierzy peptydów. Macierze peptydowe są potężnymi narzędziami do charakteryzowania specyficzności PKMT, ponieważ metylację kilku substratów o różnych sekwencjach można przetestować na jednej macierzy. Zsyntetyzowaliśmy macierze peptydowe na membranie celulozowej za pomocą syntezatora Intavis SPOT i przeanalizowaliśmy specyficzność różnych PKMT. Na podstawie uzyskanych wyników można było zidentyfikować nowe substraty dla kilku z tych enzymów. Na przykład w przypadku NSD1, stosując macierze peptydowe, wykazaliśmy, że metyluje on K44 H4 zamiast zgłoszonego H4K20, a ponadto H1.5K168 jest wysoce preferowanym substratem w stosunku do wcześniej znanego H3K36. W związku z tym macierze peptydowe są potężnymi narzędziami do biochemicznej charakterystyki PKMT.

Wprowadzenie

W ciągu ostatnich dwóch dekad kilka raportów wykazało znaczenie modyfikacji potranslacyjnych (PTM) w rozwoju komórkowym i kilku chorobach, takich jak rak, ale ostatnio metylacja lizyny białek pojawiła się jako kolejny ważny PTM. Podczas gdy początkowo stwierdzono, że metylacja lizyny histonów jest niezbędnym znacznikiem chromatyny, późniejsze prace wykazały również metylację lizyny kilku białek niehistonowych ^1-4. Sekwencyjny transfer grup metylowych z S-adenozylo-L-metioniny do grupy ε-aminowej reszt lizyny jest katalizowany przez rodzinę enzymów zwanych metylotransferazami lizyny białkowej (PKMT), która zawiera ponad 60 białek w ludzkim genomie. PKMT zostały początkowo odkryte jako enzymy modyfikujące histony, które metylują specyficzną resztę lizyny, ale późniejsze doniesienia wykazały, że mogą one również metylować białka niehistonowe ⁵. Do tej pory zidentyfikowano około 5000 miejsc metylacji lizyny na różnych białkach ⁶, ale enzymy odpowiedzialne za te modyfikacje często nie są identyfikowane. Jedną z przyczyn takiego stanu rzeczy jest fakt, że specyfika większości PKMT nie została dokładnie zbadana. W związku z tym regularnie dochodzi do odkrywania nowych substratów PKMT. Brak szczegółowej wiedzy na temat specyficzności substratowej PKMT utrudnia zrozumienie ich funkcji biologicznej i roli. Aby szczegółowo zbadać specyficzność PKMT, należy zmierzyć i porównać szybkość metylacji wielu substratów peptydowych, które różnią się jednym lub kilkoma aminokwasami, co najlepiej zrobić za pomocą macierzy peptydowych. Na podstawie uzyskanych profili specyficzności można zidentyfikować potencjalne substraty PKMT, które można dalej badać.

Tablice peptydowe są powszechnie używanymi narzędziami do analizy biochemicznej przeciwciał, enzymów modyfikujących peptydy i mapowania miejsc interakcji białko-białko (przeciwciało-antygen, receptor-ligand) ^7-9. Do takich zastosowań potrzebnych jest kilkaset peptydów. Dostępne są różne metody syntezy peptydów, wśród nich bardzo powszechnie stosowana jest synteza peptydów na żywicy, ale ma ona ograniczoną przepustowość i jest stosunkowo droga. Problemy te zostały rozwiązane wraz z wprowadzeniem metody syntezy SPOT przez Franka i współpracowników ¹⁰. Metoda syntezy SPOT pozwala na równoległą syntezę kilkuset peptydów i jest średnio niedroga w porównaniu z syntezą żywicy. Peptydy zsyntetyzowane na membranie celulozowej mogą być używane bezpośrednio do różnych zastosowań lub peptydy mogą być oddzielane od membrany i używane jako wolne peptydy do testów w roztworze lub do przygotowania mikromacierzy peptydowych ^10-13.

Synteza SPOT jest wariantem syntezy peptydów w fazie stałej, która wykorzystuje membranę celulozową jako stałe wsparcie i wykorzystuje standardową chemię Fmoc ^10-13. W związku z tym synteza łańcuchów peptydowych rozpoczyna się na końcu C-końcowym i postępuje w kierunku końca N-końcowego, w przeciwieństwie do syntezy biologicznej w rybosomach. Błony celulozowe są funkcjonalizowane do przyłączania pierwszych aktywowanych aminokwasów (rys. 1). Metoda SPOT opiera się na sekwencyjnym dostarczaniu aktywowanych aminokwasów w kropelce rozpuszczalnika do określonych miejsc na membranie za pomocą zautomatyzowanego systemu pipetowania. Kropelka cieczy jest dozowana na porowatą membranę, gdzie tworzy okrągłą mokrą plamę, która później działa jako otwarty reaktor dla reakcji chemicznych w syntezie peptydów. Wielkość plamki zależy od dozowanej objętości i zdolności absorpcyjnej membrany, wielokrotności takich plamek są ułożone w tablice. Skala syntezy koreluje z wielkością plamki i nośnością membrany. Odległość między punktami i gęstość tablic są zarządzane przez zmianę rozmiarów plamek. Membrana celulozowa ma kilka zalet jako faza stała w syntezie peptydów, jest niedroga, tolerancyjna na chemikalia stosowane w syntezie peptydów, stabilna w roztworach wodnych i łatwa w obsłudze. Ponadto jego hydrofilowy charakter sprawia, że nadaje się do kilku systemów testów biologicznych. Synteza SPOT może być przeprowadzana ręcznie lub automatycznie (dla 1000 peptydów) w zależności od wymaganej liczby peptydów. Do naszych zastosowań używany jest w pełni zautomatyzowany syntezator SPOT firmy Intavis (Kolonia, Niemcy). Pozwala na syntezę peptydów w różnych ilościach i o różnej długości. Peptydy liniowe są regularnie syntetyzowane o długości od 15 do 20 aminokwasów, ponadto peptydy o długości do 42 aminokwasów można również otrzymać w drodze syntezy etapowej ^14,15. Jednak zwiększenie liczby aminokwasów prowadzi do zmniejszenia ogólnej wydajności sprzęgania, co wpływa na jakość peptydów. Ze względu na małą ilość peptydów na plamkę, produkty są często trudne do oczyszczenia, a jakość poszczególnych peptydów nie może być łatwo oceniona. W związku z tym wyniki uzyskane z macierzy peptydowych SPOT muszą być potwierdzone albo peptydami syntetyzowanymi standardowymi metodami w większej skali, które mogą być oczyszczane i analizowane zgodnie ze standardami w syntezie peptydów lub poprzez syntezę białek zawierających pożądane sekwencje peptydowe. Mimo to stwierdziliśmy, że synteza SPOT jest wysoce wiarygodna, a wyniki ogólnie powtarzalne. Synteza SPOT nie jest ograniczona do aminokwasów proteinogennych, kilka dostępnych na rynku zmodyfikowanych aminokwasów może być również użytych do syntezy, umożliwiając modyfikację peptydów przed i po ostatecznym rozszczepieniu grupy ochronnej łańcucha bocznego, a ponadto umożliwia włączenie aminokwasów fosforylowanych, metylowanych lub acetylowanych ¹¹.

Unieruchomione biblioteki peptydów syntetyzowane metodą SPOT mogą być bezpośrednio używane do wielu testów biologicznych i biochemicznych. Zastosowaliśmy macierze peptydowe składające się z 300-400 peptydów, aby zbadać specyficzność substratową PKMT. W celu modyfikacji enzymatycznej macierze peptydowe inkubuje się z odpowiednim PKMT i znakuje [metylo-3 H]-AdoMet w odpowiednim buforze. Metylację odpowiedniego substratu analizuje się poprzez śledzenie enzymatycznego transferu znakowanych radioaktywnie grup metylowych z AdoMet do substratu peptydowego za pomocą autoradiografii (ryc. 3). Dzięki tej procedurze macierze peptydowe umożliwiają badanie metylacji różnych substratów peptydowych w tym samym czasie. Jedną z ważnych zalet tej metody jest to, że wszystkie peptydy są metylowane w konkurencji, tak że podczas liniowej fazy kinetyki metylacji względna metylacja każdego peptydu jest proporcjonalna do stałej szybkości katalitycznej podzielonej przez stałą dysocjacji (k_cat / K_D) enzymu dla odpowiedniego substratu peptydu. W związku z tym ilość radioaktywności wbudowanej w każdą plamkę jest bezpośrednio skorelowana z aktywnością enzymatyczną w stosunku do danego peptydu. Korzystając z wyników eksperymentu metylacji macierzy peptydowej, można zdefiniować profil specyficzności PKMT i na tej podstawie określić nowe substraty. Macierze peptydowe umożliwiają szybką i ekonomiczną walidację metylacji nowych substratów na poziomie peptydów. W tym celu przygotowuje się tablice, które zawierają przewidywane nowe substraty wraz ze zmodyfikowanymi peptydami zawierającymi Ala zamiast Lys w miejscach docelowych, a także peptydy kontroli pozytywnej i ujemnej. Wreszcie, nowe substraty można przygotować jako białka wraz z mutantami, w których docelowy Lys jest zmieniany w Ala, a metylację można potwierdzić na poziomie białka. W zależności od uzyskanych wyników, następnie prowadzone są badania biologiczne dotyczące potencjalnej roli metylacji nowo opisanych substratów białkowych.

Protokół

1. Przygotowanie tablic peptydowych

1. Programowanie sekwencji peptydowych
   1. Projektowanie sekwencji peptydowych do syntezy za pomocą oprogramowania MultiPep Spotter. Wprowadź sekwencje peptydowe w jednoliterowych kodach.
      Peptyd 1: T A R K S T G K A
   2. Generuj biblioteki spacerów alaniny lub argininy za pomocą określonego polecenia (.replace, A), aby przesiać ważne aminokwasy wymagane do rozpoznania zdefiniowanego substratu. Na przykład w poniższym przykładzie pierwszy wiersz to sekwencja typu dzikiego, a z drugiej linii każdy aminokwas w peptydzie jest sekwencyjnie przekształcany w alaninę.
      zamiana, A
      T-A-R-K-S-T-G
      A-A-R-K-S-T-G
      T-A-R-K-S-T-G
      T-A-A-K-S-T-G
      T-A-R-A-S-T-G
      T-A-R-K-a-T-G
      T-A-R-K-S-a-G
      T-A-R-K-S-T-A
   3. Użyj podobnych poleceń (.replace R, .replace N itp.), jak opisano w 1.1.2 ze wszystkimi naturalnie dostępnymi resztami aminokwasowymi (ostatecznie pomijając cysteinę, metioninę i tryptofan, ponieważ te reszty są podatne na utlenianie i czasami niższą wydajność syntezy), aby zsyntetyzować tablicę peptydów do określenia motywu konsensusowej sekwencji substratu dla enzymu.
      UWAGA: Jak pokazano na rysunku 4A, oś pozioma reprezentuje daną sekwencję peptydową, a oś pionowa reprezentuje aminokwasy, które są wybrane do polecenia. Podobnie jak w sekwencji pokazanej w 1.1.2, A na osi pionowej oznacza, że Ala sekwencyjnie zastępuje każdą pozycję danej sekwencji w pierwszym rzędzie na rys. 4A. Podobnie arginina sekwencyjnie zastępuje każdy aminokwas w drugim rzędzie i tak dalej z innymi aminokwasami. Kompletne biblioteki macierzy peptydowych są syntetyzowane poprzez systematyczne zastępowanie każdej reszty w dostarczonej sekwencji substratu peptydowego każdą z innych naturalnie dostępnych reszt aminokwasowych, co pomaga zrozumieć wpływ każdej reszty w każdej pozycji danej sekwencji.
   4. Alternatywnie, metylację znanych lub przewidywanych substratów peptydowych można łatwo zweryfikować, syntetyzując biblioteki peptydów z docelowymi peptydami PKMT wraz z pozytywnymi i ujemnymi kontrolami metylacji (tj. peptydami, o których wiadomo, że są metylowane lub o których wiadomo, że nie są metylowane). Zsyntetyzuj peptydy, wymieniając przypuszczalną docelową lizynę na alaninę, aby potwierdzić metylację docelowej lizyny, jak pokazano poniżej, za pomocą ręcznego programowania.
      Peptyd typu dzikiego: S T G G K P R Q F L
      Zmutowany peptyd : S T G G A P R Q F L
      UWAGA: Oprogramowanie posiada również wbudowane skrypty do tworzenia różnych bibliotek, takich jak mapowanie epitopów z pożądanym przesunięciem klatki sekwencji w celu zmapowania ważnych aminokwasów wymaganych do interakcji.
2. Przygotowanie membrany, aminokwasów i odczynników
   1. Wstępnie napęcznij membranę SPOT w DMF (N,N-dimetyloformamid) przez 10 minut, a następnie umieść mokrą membranę na ramie syntezatora SPOT bez pęcherzyków powietrza i zmarszczek.
   2. Umyj membranę trzykrotnie 100% etanolem. Całkowicie wysuszyć membrany przez co najmniej 10 minut przed rozpoczęciem programu syntezy.
   3. Równolegle należy przygotować świeżo 0,5 M stężenia robocze dostępnych na rynku aminokwasów chronionych Fmoc poprzez rozpuszczenie ich w NMP, a także przygotować aktywator i zasadę zgodnie z opisem w tabeli 1.
   4. Upewnij się, że wszystkie pojemniki na roztwór odpadowy syntezatora SPOT zostały opróżnione i ponownie napełnij zbiorniki rozpuszczalnika DMF, etanolem i piperydyną.
      UWAGA: Teraz maszyna jest gotowa do syntezy.
3. Plamienie pierwszego aminokwasu
   1. Aby wytworzyć wiązanie amidowe z wolną grupą aminową na błonie, aktywuj grupę karboksylową przychodzącego aminokwasu, dodając aktywator (N,N'-diizopropylokarbodiiimid) i roztwór zasady (cyjanooctan etylu hydroksyimino) do pochodnej aminokwasu.
   2. Znajdź żądane objętości aktywowanych aminokwasów na membranie funkcjonalizowanej Amino-PEG za pomocą programowalnego robota.
      UWAGA: W ten sposób C-koniec aminokwasu jest sprzężony z grupą aminową błony.
   3. Powtórz ten krok trzy razy, aby zapewnić lepsze sprzężenie pierwszego aktywowanego aminokwasu. Inkubować membranę przez 20 minut, a następnie przemyć DMF w celu usunięcia niesprzężonych aminokwasów.
4. Blokowanie wolnych przestrzeni na obszarach niepunktowych
   UWAGA: Po sprzężeniu pierwszego C-końcowego aminokwasu wszystkich peptydów z grupą aminową błony, grupy aminowe między plamkami, a także niektóre grupy aminowe w obszarach plamki nie tworzą wiązań z aminokwasami.
   1. Zablokuj te wolne grupy aminowe przez inkubację z roztworem zamykającym (20% bezwodnik octowy w DMF) przez 5 min.
      UWAGA: Pozwala to uniknąć sprzężenia aminokwasów w dalszych cyklach z błoną zamiast rosnącym łańcuchem peptydowym.
5. Usunięcie Grupy Fmoc
   1. Po zablokowaniu przemyć membranę DMF 4 razy, a następnie inkubować z 20% piperydyną w DMF przez 20 minut, aby usunąć grupę ochronną Fmoc.
      UWAGA: Ten krok prowadzi do usunięcia grup Fmoc chroniących przed aminami i nazywa się to deprotekcją.
   2. Następnie umyj membranę dwukrotnie DMF i dwukrotnie etanolem i pozostaw do wyschnięcia.
      UWAGA: Teraz membrana jest gotowa do sprzężenia kolejnych aminokwasów.
6. Wydłużenie łańcucha
   UWAGA: Dodanie każdego aminokwasu nazywa się cyklem. Oprócz sprzężenia pierwszego aminokwasu, cykl rozpoczyna się od deprotekcji grupy Fmoc sprzężonego aminokwasu, a następnie następuje sprzężenie aktywowanej grupy karboksylowej przychodzącego aminokwasu z grupą aminową rosnącego łańcucha peptydowego.
   1. Powtarzaj kroki 1.3 i 1.5, aż do uzyskania pożądanej długości peptydu.
7. Barwienie
   UWAGA: Po ostatnim cyklu macierze peptydowe są barwione błękitem bromofenolowym, aby potwierdzić pomyślną syntezę peptydów. Błękit bromofenolowy wiąże się z wolnymi grupami aminowymi peptydów. Plamki peptydowe po barwieniu mają jasnoniebieski kolor, ale intensywność plam różni się w zależności od sekwencji peptydów. Barwienie to pozwala potwierdzić całkowite usunięcie piperydyny, ponieważ w obecności piperydyny błękit bromofenolowy nie barwi peptydów. Ponadto pomaga to również oznaczyć macierze peptydowe do dalszego wykorzystania.
   1. Po deprotekcji grupy Fmoc w ostatnim cyklu syntezy należy przemyć membranę DMF i 100% etanolem. Następnie należy potraktować błonę błękitem bromofenolowym (0,02% błękitu bromofenolowego w DMF) przez co najmniej 5 minut, aż całkowicie zmieni kolor na niebieski.
   2. Następnie umyj membranę DMF i etanolem, a następnie susz przez 10 minut. Teraz wyjmij membranę z syntezatora i ręcznie wykonaj deochronę łańcucha bocznego (sekcja 1.8). W razie potrzeby sfotografuj membranę, aby udokumentować wyniki syntezy peptydów (ryc. 2).
8. Deochrona łańcucha bocznego
   1. Potraktuj membrany 20 do 25 ml mieszaniny deprotekcyjnej łańcucha bocznego składającej się z 95% kwasu trifluorooctowego (TFA) w celu rozszczepienia grup ochronnych łańcucha bocznego i odczynników zmiatających (2,5% wody i 2,5% triizopropylanu) w celu ochrony łańcuchów bocznych aminokwasów przed modyfikacją na tym etapie. Weź wystarczającą ilość mieszaniny do usuwania protekcji, aby upewnić się, że całkowicie pokrywa membranę w szczelnie zamkniętym, odpornym na chemikalia pudełku i inkubuj ją przez 1 do 2 godzin, delikatnie wstrząsając.
   2. Przemyć membranę sześć razy 20-25 ml DCM (Dichlorometanu) przez 2 minuty każdy, a na koniec dwa razy 100% etanolem i wysuszyć w eksykatorze przez noc.
      UWAGA: Teraz membrana może być używana do eksperymentów. Schemat syntezy macierzy peptydowej przedstawiono na rysunku 1.

2. Ekspresja i oczyszczanie białek

1. Ekspresja białek PKMT jako fuzje GST
   1. Korzystając ze standardowych technik, sklonuj gen kodujący PKMT na całej długości lub jego domenę katalityczną do bakteryjnego wektora ekspresyjnego (takiego jak pGEX-6p2), aby wyrazić go jako białko fuzyjne GST.
   2. Przenieś wektor z żądaną wstawką PKMT do kodonu BL21 lub BL21 oraz komórek E. coli metodą szoku cieplnego lub dowolną inną metodą.
   3. Przygotować hodowlę wstępną z 30 ml pożywki Luria-Bertani (LB) w dniu odciągania i inkubować w temperaturze 37 °C przez 7-8 godzin, ciągle wstrząsając.
   4. Następnie przenieść 10 ml kultury wstępnej do dużych kolb z przegrodami o pojemności 2 l, zawierających 1 l pożywki LB i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze, ciągle wstrząsając, aż kultura osiągnie określoną gęstość optyczną przy 600 nm.
      UWAGA: Chociaż można to zoptymalizować dla każdego białka, rutynowo indukujemy przy OD_{600 nm} wynoszącym około 0,8. Temperatura indukcji musi być zoptymalizowana indywidualnie dla każdego białka, niektóre białka wykazują dobrą ekspresję w temperaturze 22 °C, a inne w wyższych temperaturach.
   5. Przesunąć komórki do temperatury indukcji na 15 minut, następnie indukować 1 mM izopropylo-beta-D-tiogalaktopiranozydu i pozwolić kulturze rosnąć przez 10-12 godzin w temperaturze indukcji.
   6. Następnie zebrać komórki przez odwirowanie przy 5 000 x g przez 15 minut, a na koniec przepłukać granulki 30 ml buforu STE (10 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl i 0,1 mM EDTA) i przechowywać w temperaturze -20 °C do dalszego wykorzystania.
2. Oczyszczanie białek
   1. Rozmrozić osad komórkowy i ponownie zawiesić w 30 ml buforu sonikacyjnego (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT i 5% glicerolu) i rozbić przez sonikację.
      UWAGA: Ten bufor musi zostać ostatecznie zoptymalizowany dla każdego białka.
   2. Odwirować lizat komórkowy przy 22 000 x g przez 1 godzinę, a następnie zebrać supernatant i przepuścić przez kolumnę zawierającą 600 μl żywicy glutationowej Sepharose 4B.
   3. Przemyć kolumnę 50 ml buforu sonikacyjnego, a następnie 100 ml buforu o wysokiej zawartości soli (50 mM Tris pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM DTT i 5% glicerolu) w celu usunięcia niespecyficznie związanych białek. Eluować związane białko za pomocą 5 ml buforu o wysokiej zawartości soli zawierającego 40 mM glutationu.
   4. Uwolnione białko należy dializować w 2 litrach buforu do dializy za pomocą niskiego poziomu glicerolu (20 mM Tris pH 7,4, 100 mM KCl, 0,5 mM DTT i 10% glicerolu) przez 2 godziny, a następnie w 20 mM Tris pH 7,4, 100 mM KCl, 0,5 mM DTT i 70% glicerolu przez 8 godzin lub przez noc. Upewnij się, że wszystkie oczyszczające mają temperaturę 4 °C i przeprowadź oczyszczanie białka w chłodni, aby uniknąć denaturacji białka.

3. Metylacja tablicy peptydów

1. Wstępna inkubacja macierzy peptydowych
   1. Przeprowadzić metylację macierzy peptydowej w pudełku o odpowiednim rozmiarze lub w plastikowej torbie, aby uniknąć marnotrawstwa enzymu i drogiego radioaktywnie znakowanego AdoMetu. Wstępnie inkubować błonę macierzy peptydowej w szczelnie zamkniętej plastikowej torbie zawierającej odpowiedni bufor metylacyjny bez enzymu i znakowanej [metylo-3H]-AdoMet przez 10 minut. Objętość buforu zależy od wielkości macierzy, na przykład należy użyć 8 ml buforu metylacyjnego, aby uzyskać pełny profil specyficzności układu peptydów. Zoptymalizuj ilość i stężenie AdoMet dla każdego enzymu.
2. Metylacja macierzy peptydowych
   1. Odrzucić bufor do wstępnej inkubacji i inkubować błonę w 8 ml buforu metylacyjnego zawierającego odpowiedni PKMT i znakowany [metylo-3H]-AdoMet przez 1 do 2 godz.
      UWAGA: Ilość enzymu wymagana do reakcji metylacji zależy od aktywności określonego PKMT, rozpoczynamy nasze eksperymenty przesiewowe zwykle przy końcowym stężeniu enzymu 50 nM.
3. Mycie macierzy peptydowych
   1. Następnie wyrzucić bufor metylacyjny do pojemnika na odpady radioaktywne i przemyć macierze peptydowe 5 razy 20 ml buforu zawierającego 100 mM wodorowęglanu amonu i 1% SDS przez 5 minut w celu usunięcia związanego białka. Wyrzucić bufor do przemywania do pojemnika na odpady radioaktywne.
4. Wykrywanie sygnału radioaktywnego
   1. Po przepłukaniu inkubować membranę przez 5 minut w 10 ml roztworu amplifikacyjnego (NAMP100V).
   2. Następnie wyrzuć roztwór amplifikacyjny do pojemnika na odpady radioaktywne na rozpuszczalniki organiczne, zamknij matrycę peptydową w plastikowej torbie i włóż ją do kasety autoradiograficznej.
   3. Umieść film autoradiograficzny na matrycy peptydowej w ciemnym pomieszczeniu. Ostrożnie zamknij kasetę i wystawij ją na działanie temperatury -80 °C przez niezbędny czas. Następnie wywołaj film, aby przeanalizować wyniki. Uchwyć obraz kilka razy z różnymi czasami naświetlania, aby uniknąć nasycenia silnie metylowanych substratów peptydowych.

4. Przetwarzanie i analiza danych

1. Analiza densytometryczna intensywności plamek
   1. Zeskanuj film w konwencjonalnym skanerze i przeanalizuj intensywność plamki za pomocą densytometrii. Zrób to za pomocą ImageJ (który jest darmowy) lub komercyjnego programu.
      UWAGA: Do tego zadania używamy oprogramowania Phoretix.
2. Normalizacja i uśrednianie wyników z różnych membran
   1. Przeprowadzić eksperymenty z metylacją macierzy peptydowej co najmniej w trzech egzemplarzach. Znormalizuj intensywności skanowania dla każdego eksperymentu przez odejmowanie tła i ustawienie aktywności na podłożu referencyjnym na 1,0. Uśrednij dane dla poszczególnych miejsc i podaj je jako wartości średnie i odchylenia standardowe.
3. Analiza i wyświetlanie danych
   1. Wykreśl dane w 2D przy użyciu skali szarości lub schematu kolorów, aby wskazać względną aktywność. Zrób to za pomocą Excela lub Sigmaplot, jak pokazano tutaj. Przygotuj również wykres rozkładu odchyleń standardowych powtarzanych eksperymentów, aby przeanalizować jakość danych.
   2. Aby porównać i wyświetlić dokładność ilościowego rozpoznawania każdej reszty w peptydzie substratowym, należy obliczyć względną preferencję PKMT dla każdego aminokwasu i w pozycji x za pomocą współczynnika dyskryminacji D ^16,17:
      D_X;i = < V_j≠i>/V_i - 1
      Gdzie v_i jest szybkością metylacji wariantu peptydu przenoszącego aminokwas i w pozycji x, a j≠i> jest średnią szybkością metylacji wszystkich 19 peptydów przenoszących inny aminokwas j≠i w pozycji x (w tym sekwencji typu dzikiego).
      UWAGA: Zdefiniowany przez to współczynnik dyskryminacji zależy od poziomu tła. Jeżeli na danym stanowisku akceptowana jest tylko jedna pozostałość o tle wynoszącym 3%, uzyskuje się współczynnik dyskryminacji wynoszący 32,3. Brak preferencji na danym stanowisku skutkuje współczynnikiem dyskryminacji równym 0.

Wyniki

Tablice peptydowe zostały z powodzeniem wykorzystane do biochemicznego scharakteryzowania specyficzności PKMT, a dzięki temu podejściu zidentyfikowano kilka nowych substratów histonowych i niehistonowych PKMT ^5,16-19. Zdefiniowanie prawidłowego spektrum substratów PKMT (lub dowolnego enzymu) jest niezbędnym krokiem w kierunku zrozumienia jego mechanizmu molekularnego i funkcji komórkowych.

Jako przykład zastosowania metody metylacji peptydowej tablicy SPOT, opisujemy wyniki analizy ...

Dyskusja

Opisana tutaj synteza SPOT jest potężną metodą mapowania miejsc interakcji białko-białko i badania rozpoznawania substratów enzymów modyfikujących peptydy. Jednak synteza SPOT nadal ma pewne wady, ponieważ chociaż peptydy syntetyzowane metodą SPOT mają czystość ponad 90% ²¹ , jest to trudne do potwierdzenia w każdym przypadku. W związku z tym wyniki muszą być odtwarzane innymi metodami, na przykład przy użyciu domen białkowych lub oczyszczonych peptydów syntetyzowanych standardowymi metodami. Ponadto inną powa...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Etanol abs Gradient Grade HPLC	Honeywell	10299901	Łatwopalny
N,N< / em>-dimetyloformamid Synteza peptydów	Biosolve	4193302	Łatwopalna, toksyczna
piperydyna≥ 99% do syntezy peptydów	Roth	A122.1	Łatwopalny, toksyczny,
Oxyma Pure ((hydroksyimino)cyjanooctan etylu)	Novabiochem	8510860100
N,N' -Diisopropylocarbodiimide purum ≥ 98% GC	Fluka	38370	Łatwopalny, Toksyczny,
Bezwodnik octowy	Roth	CP28.1	Łatwopalny, Toksyczny,
Triizopropylosilan 99%	Aldrich	233781	Łatwopalny, Toksyczny
Dichlormetan ≥ 99,9%	Roth	P089.1	Rakotwórczy
N-metylo-2-pirolidon	Roth	4306.2	Toksyczna
derywatyzowana membrana celulozowa	Intavis AG Kö ln	32.1
Kwas trifluorooctowy	Roth	P088.2	Toksyczny,
Bromphenolblue	AppliChem	A3640.0010
Wodorowęglan amonu	Roth	T871.2
Toksyczne granulki dodecylosiarczanu sodu	Roth	CN30.3	Toksyczny, łatwopalny
syntezator MultiPep	Intavis AG Kö ln	n.a.Folia
o wysokiej wydajności HyperfilmTM	Oprogramowanie GE Healthcare	28906837
Phoretix	TotalLab	n.d.