Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Model ex vivo ataku limfocytów T kierowanego przez oligodendrocyty w ostrych wycinkach mózgu

6.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52205

⸱

5 lutego 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, University of Münster, 2Germany and Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Münster, 3Institute of Physiology I - Neuropathophysiology I, University of Münster

W tym artykule

Podsumowanie

Aby zająć się mechanizmami demielinizacji i apoptozy neuronów w uszkodzeniach korowych zapalnych zaburzeń demielinizacyjnych, używane są różne modele zwierzęce. Opisujemy tutaj podejście ex vivo polegające na użyciu limfocytów T CD8 + specyficznych dla oligodendrocytów na wycinkach mózgu, co powoduje śmierć oligodendroglialną i neuronalną. Omówiono potencjalne zastosowania i ograniczenia modelu.

Streszczenie

Śmierć oligodendrocytów, której towarzyszy zniszczenie neuronów i aksonów, to typowe wyniki histopatologiczne w korowych i podkorowych zmianach istoty szarej w zapalnych zaburzeniach demielinizacyjnych, takich jak stwardnienie rozsiane (SM). W tych zaburzeniach stwierdza się głównie limfocyty T CD8 + o przypuszczalnej swoistości dla antygenów związanych z mieliną i oligodendrocytami, tak że apoptoza neuronów w zmianach istoty szarej może być efektem ubocznym tych komórek. Stworzono różne typy modeli zwierzęcych w celu zbadania mechanizmów leżących u podstaw wspomnianych procesów patofizjologicznych. Jednak, mimo że naśladują one niektóre aspekty stwardnienia rozsianego, niemożliwe jest dokładne przeanalizowanie mechanizmu i przebiegu w czasie "ubocznej" śmierci komórek neuronalnych. Aby zająć się tym kursem, tutaj pokazujemy protokół do badania mechanizmów i reakcji czasowej uszkodzenia neuronów po ataku limfocytów T CD8 + kierowanym przez oligodendrocyty. Aby celować tylko w osłonkę mielinową i oligodendrocyty, aktywowane in vitro limfocyty T CD8 + specyficzne dla oligodendrocytów są przenoszone do ostro izolowanych wycinków mózgu. Po określonym okresie inkubacji można analizować uszkodzenia mieliny i neuronów w różnych obszarach zainteresowania. Omówione zostaną potencjalne zastosowania i ograniczenia tego modelu.

Wprowadzenie

Śmierć oligodendrocytów i zniszczenie osłonki mielinowej, któremu towarzyszy utrata neuronów i aksonów, są typowymi patologicznymi objawami zmian w istocie szarej u osób cierpiących na stwardnienie rozsiane (MS)1,2. Zmiany korowe można do tej pory podzielić na trzy różne podtypy2: zmiany subpialne, wewnątrzkorowe i leukokorowe. W porównaniu z blaszkami istoty białej, nacieki charakteryzują się przewagą limfocytów T CD8+, co sugeruje ich możliwą decydującą rolę w zapaleniu istoty szarej3. Ponadto ekspansje oligoklonalne we krwi, płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF) i w zmianach zapalnych można znaleźć dla samych limfocytów T CD8 + 4-6.

Zgodnie z tym, zakłada się, że limfocyty T CD8+ mogą być specyficzne dla różnych białek mielinowych7,8. Rzeczywiście, limfocyty T CD8 + znajdują się w pobliżu oligodendrocytów i osłonek mielinowych9,10, które wykazują ekspresję MHC I11 i dlatego mogą być odpowiedzialne za utratę osłonki mielinowej. Proces ten jest często obserwowany wraz z rozległym "ubocznym" uszkodzeniem neuronów i aksonów w istocie szarej ośrodkowego układu nerwowego (OUN)1,2. W rzeczywistości bezpośrednia i pośrednia śmierć oligodendrocytów i neuronów jest indukowana przez limfocyty T CD8 + za pomocą dwóch różnych mechanizmów: (i) obrzęku i pęknięcia błony komórkowej z powodu tworzenia się granulek cytotoksycznych po uwolnieniu perforyn i granzymów oraz (ii) podwiązania do receptorów Fas lub ekspozycji FasL na ich powierzchni8,12,13.

Różne typy modeli zwierzęcych są tworzone w celu zbadania mechanizmu leżącego u podstaw wspomnianych procesów. W związku z tym zaszczepione limfocyty T CD8 + specyficzne dla autoantygenów z indukowaną ekspresją w komórkach glejowych OUN, takich jak oligodendrocyty lub astrocyty, mogą być adoptywnie przenoszone w celu analizy "pobocznej" śmierci neuronów i aksonów w istocie szarej14,15. Przeprowadzenie takich eksperymentów in vivo jest bardzo pomocne w naśladowaniu niektórych patofizjologicznych aspektów stwardnienia rozsianego, jednak podejście to nie jest odpowiednie do rozwiązania mechanizmu i kinetyki leżącej u podstaw uszkodzenia aksonów i apoptozy neuronów.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia, stworzono podejście ex vivo do badania mechanizmów i przebiegu czasowego śmierci komórek neuronalnych po ataku limfocytów T CD8+ kierowanym przez oligondendrocyty. Ponieważ tylko oligodendrocyty, a tym samym produkcja osłonki mielinowej, powinny być celem komórek odpornościowych, stosuje się limfocyty T OT-I z ograniczeniami MHC klasy I, reaktywnymi albuminą jaja kurzego (OVA)16. Komórki te są następnie przenoszone do wycinków mózgu uzyskanych od myszy selektywnie eksprymujących OVA w oligodendrocytach (myszy ODC-OVA)17.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na myszach powinny być przeprowadzane zgodnie z wytycznymi odpowiedniego instytucjonalnego komitetu ds. opieki i użytkowania zwierząt.

1. Ogólne uwagi do eksperymentów na myszach

  1. Trzymaj myszy w warunkach wolnych od patogenów i umożliwiaj im dostęp do pożywienia i wody ad libitum.
    UWAGA: Ważne jest, aby używać myszy dopasowanych pod względem wieku i płci w grupach eksperymentalnych, ponieważ wzorce immunologiczne mogą się różnić w zależności od wieku i płci.

2. Przygotowanie i aktywacja specyficznych dla OVA limfocytów T CD8+ (OT-I)

  1. Wykonaj stymulację limfocytów T OT-I zgodnie z poniższym opisem 5 dni przed przygotowaniem plastrów mózgu.
    UWAGA: 5 x 105 aktywowanych efektorów CD8 + OT-I Limfocyty T (limfocyty T CD8 + myszy transgenicznych rozpoznających tylko peptyd OVA257-264 w kontekście cząsteczek MHC-I) są potrzebne na plasterek Stężenie 5 x 105 zostało wybrane eksperymentalnie jako optymalne, aby sprzyjać dobrej interakcji komórka-komórka, gdy komórki zaczną migrować do wycinka i, Jednocześnie ilość komórek nie jest zbyt duża, aby wywołać nadmierną reakcję, co pozwala na policzeniepojedynczych komórek 8,18.
  2. Przygotuj pożywkę do hodowli limfocytów T OT-I. Suplement 500 ml DMEM z 5% płodową surowicą cielęcą (FCS), 10 mM HEPES, 2 mM L-glutaminą, 50 μM 2-merkaptoetanolem, 1% aminokwasami endogennymi i 25 μg/ml gentamycyny. Przechowywać pożywkę w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
  3. Usuń śledzionę myszy transgenicznych OT-I zgodnie z odniesieniem16. Przełóż je do przygotowanego podłoża.
  4. Wytwarzać zawiesinę jednokomórkową przez rozcieranie śledziony przez sitko o średnicy 70 μm i odwirować zawiesinę w temperaturze 300 x g przez 5 minut, 4 °C.
  5. Zawiesinę komórek inkubować z 5 ml buforu chlorku amonu i potasu (ACK) (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH 7,3) przez 5 minut w celu lizy czerwonych krwinek.
  6. Przerwać inkubację z 10 ml pożywki i ponownie odwirować, jak opisano powyżej.
  7. Rozcieńczyć zawiesinę komórek w pożywce i obliczyć liczby. Płytki komórek o gęstości 3 x 107 komórek/basenik na 12-dołkowej płytce i zagruntować je przez inkubację z OVA257–264 (SIINFEKL; 1 nM) i interleukiną 2 (IL-2) (500 j.m./ml) przez 5 dni.
  8. Po 4 dniach ponownie dodać IL-2 w stężeniu 500 j.m./ml.
  9. Po stymulacji oczyść limfocyty T OT-I z zawiesiny komórkowej za pomocą zestawu do izolacji mysich limfocytów T CD8 + opartego na selekcji negatywnej, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Oczyszczanie opiera się na wyczerpaniu wszystkich komórek innych niż CD8 + przy użyciu koktajlu przeciwciał przeciwko CD4, CD11b, CD11c, CD19, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, MHC klasy II, Ter-119 i TCRγ / δ które są następnie odrzucane za pomocą kolumn magnetycznych do elucji oczyszczonych limfocytów T CD8 +.
    UWAGA: Krytyczne etapy tej procedury są wskazane przez producentów: ważne jest, aby reakcja obejmowała tylko pojedyncze komórki, ponieważ obecność grudek może zablokować kolumnę podczas etapu elucji; Zliczanie komórek przed dodaniem koktajlu Byotin jest ważne dla stopnia czystości próbki, a procedura powinna być wykonywana na lodzie, aby zminimalizować niespecyficzne wiązania przeciwciał.

3. Przygotowanie ostrych wycinków mózgu i kokultura z limfocytami T OT-I

  1. Przed przygotowaniem ostrych wycinków mózgu19 należy przygotować lodowaty roztwór soli fizjologicznej placedine placedine przy użyciu 200 mM sacharozy, 20 mM RUR, 2,5 mM KCL, 1,25 mM NaH2PO4, 10 mMMgSO4, 0,5 CaCl 2 i 10 mM dekstrozy oraz sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF) przy użyciu 125 mM NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 24 mM NaHCO3, 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 10 mM dekstroza. Dostosuj pH każdego roztworu do 7,35 za pomocą NaOH. Przed dostosowaniem pH ACSF roztwór należy przepłukać mieszaniną 95%O2 i 5% CO2 .
  2. Wstępnie schłodzić roztwory.
  3. Znieczulenie należy znieczulać myszy w wieku 8 - 10 tygodni (np. C57Bl/6 jako kontrolne lub transgeniczne myszy ODC-OVA17 z inhalacją przy użyciu 5,0% izofluranu, 5,0% halotanu lub wstrzyknąć 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg masy ciała ksylazyny za pomocą ip. Poczekaj na znieczulenie i użyj szczypania palca u nogi, aby ocenić poziom znieczulenia i natychmiast odciąć im głowę. Eutanazja myszy zgodnie z kryteriami instytucjonalnego komitetu ds. opieki nad zwierzętami i wykorzystania do eutanazji.
  4. Ustaw mysz w pozycji brzusznej. Zdezynfekuj i wytnij strzałkowo skórę głowy. Otwórz kość czaszki strzałkowo, szybko usuń mózg za pomocą miarki i przymocuj go do płytki wibratomu za pomocą kleju.
  5. Napełnij talerz przygotowanym lodowatym roztworem soli fizjologicznej placedine.
  6. Wytnij plastry koronalne o grubości 300 μm za pomocą wibratomu.
    UWAGA: Wiadomo, że ta procedura pozwala uzyskać żywe nienaruszone próbki tkanek odpowiednie do funkcjonalnych badań komórkowych w przedziale czasu co najmniej 8 godzin19-21. Rzeczywiście, po tym czasie, już rozpoczynającym się po 6 godzinach, preparat wykazuje obniżoną jakość, a mianowicie zmiany w podstawowych i funkcjonalnych właściwościach, takich jak generowanie potencjału czynnościowego i propagacja.
  7. Po podziale na sekcje natychmiast przenieś jedną kromkę do każdego dołka 12-dołkowej płytki wypełnionej ACSF.
  8. Dodaj ostrożnie 5 x 105 komórek T OT-I na plasterek.
  9. Plastry inkubować do 8 godzin w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ).
  10. Po okresie inkubacji zbierz plastry i osadź je za pomocą tka tkankowego związku OCT i zamroź je w ciekłym azocie. Przechowywać je w temperaturze -20 °C do dalszych badań histologicznych, np. w celu oceny struktury neuronalnej (np. przy użyciu przeciwciał anty-MAPII lub anty-synaptofizyny) lub apoptozy (np. przy użyciu przeciwciał anty-kaspazy-3 i przeciwciał anty-NeuN) zgodnie ze standardowymi procedurami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Po inkubacji skrawków mózgu z limfocytami T CD8+ skierowanymi przeciwko oligodendrocytom, zarówno oligodendrocyty, jak i neurony ulegają apoptozie (Ryc. 2A i 1C, odpowiednio). Histologiczne oznaki apoptozy (np. kaspaza-3, Tunel) mogą zostać wykryte najwcześniej po 3 h inkubacji. Okres inkubacji nie powinien przekraczać 8 h, aby zapewnić dobrą jakość preparatu i powtarzalne wyniki. Komórki apoptotyczne można znaleźć w całym skrawku, z przewagą w obszarach zmielinizowanych. Przykładowe ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W ciągu ostatnich dziesięcioleci opisano różne modele zwierzęce w celu zbadania patologicznych cech zapalnych zaburzeń demielinizacyjnych, takich jak stwardnienie rozsiane. Modele in vivo myszy i szczurów są szeroko stosowane do naśladowania patofizjologicznych cech choroby, a mianowicie analizy konsekwencji procesów demielinizacji i remielinizacji oraz mieszających się epizodów zapalenia i neurodegeneracji. Niemniej jednak tylko podejście ex vivo pozwala na dokładne przeanalizowanie mechanizmów leżącyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Interdyscyplinarne Centrum Badań Klinicznych (IZKF) Münster (SEED 03/12, SB), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB TR128, TP B6 do S.G.M. ME3283/2-1 do S.G.M.) oraz przez Innovative Medizinische Forschung, Münster (I-BI111316, SB i SGM).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytka 12-dołkowaCorning3513
2-merkaptoetanolGibco31350-010
2-metylobutanRoth3927.1
70 &mikro; m filtr siatkowyFalcon352350
CaCl2Merck1.02382.0500chlorek wapnia
CD8+-zestaw izolacyjnyMiltenyi Biotech130-090-859
D(+)-glukozaMerck1.08337.1000
DMEMGibco31966-021ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem
EDTASigmaE5134
FCSPAA LaboratoriesA15-151płodowa surowica cielęca
GentamycynaGibco15750-060
HEPES 1 MGibco15630-050
IL-2Peprotech212-12
IsofluranAbbott05260-05
KClMerck1.04933.0500chlorek potasu
KHCO3SigmaP9144wodorowęglan potasu
L-glutaminaGibco35050-038
MgSO4Merck1.05886.0500siarczan magnezu
NaClSigma31434chlorek
soduNaH2PO4 * H2OMerck1.06346.0500wodorofosforan sodu
NaHCO3Merck1.06329.0500wodorowęglan sodu
NaOHMerck1.09137.1000wodorotlenek sodu
NH4ClSigma213330chlorek amonu
Aminokwas endogennyGibco11140-050
OVA (257-264)GenscriptRP10611albumina jaja kurzego
RURYSigmaP6757
SacharozaMerck1.07687.1000
Tissue-Tek OCTSakura4583

Bibliografia

  1. Moll, N. M., et al. Cortical demyelination in PML and MS: Similarities and differences. Neurology. 70 (5), 336-343 (2008).
  2. Peterson, J. W., Bo, L., Mork, S., Chang, A., Trapp, B. D. Transected neurites, apoptotic neurons, and reduced inflammation in cortical multiple sclerosis lesions. Ann Neurol. 50 (3), 389-400 (2001).
  3. Bo, L., Vedeler, C. A., Nyland, H. I., Trapp, B. D., Mork, S. J. Subpial demyelination in the cerebral cortex of multiple sclerosis patients. J Neuropathol Exp Neurol. 62 (7), 723-732 (2003).
  4. Babbe, H., et al. Clonal expansions of CD8(+) T cells dominate the T cell infiltrate in active multiple sclerosis lesions as shown by micromanipulation and single cell polymerase chain reaction. J Exp Med. 192 (3), 393-404 (2000).
  5. Junker, A., et al. Multiple sclerosis: T-cell receptor expression in distinct brain regions. Brain. 130 (11), 2789-2799 (2007).
  6. Skulina, C., et al. Multiple sclerosis: brain-infiltrating CD8+ T cells persist as clonal expansions in the cerebrospinal fluid and blood. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (8), 2428-2433 (2004).
  7. Friese, M. A., Fugger, L. Autoreactive CD8+ T cells in multiple sclerosis: a new target for therapy. Brain. 128 (8), 1747-1763 (2005).
  8. Melzer, N., Meuth, S. G., Wiendl, H. CD8+ T cells and neuronal damage: direct and collateral mechanisms of cytotoxicity and impaired electrical excitability). FASEB J. 23 (11), 3659-3673 (2009).
  9. Booss, J., Esiri, M. M., Tourtellotte, W. W., Mason, D. Y. Immunohistological analysis of T lymphocyte subsets in the central nervous system in chronic progressive multiple sclerosis. J Neurol Sci. 62 (1-3), 219-232 (1983).
  10. Hauser, S. L., et al. Immunohistochemical analysis of the cellular infiltrate in multiple sclerosis lesions. Ann Neurol. 19 (6), 578-587 (1986).
  11. Hoftberger, R., et al. Expression of major histocompatibility complex class I molecules on the different cell types in multiple sclerosis lesions. Brain Pathol. 14 (1), 43-50 (2004).
  12. Göbel, K., et al. Collateral neuronal apoptosis in CNS gray matter during an oligodendrocyte-directed CD8(+) T cell attack. Glia. 58, 469-480 (2010).
  13. Melzer, N., et al. Excitotoxic neuronal cell death during an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack in the CNS gray matter. J Neuroinflammation. 10, 121(2013).
  14. Huseby, E. S., et al. A pathogenic role for myelin-specific CD8(+) T cells in a model for multiple sclerosis. J Exp Med. 194 (5), 669-676 (2001).
  15. McPherson, S. W., Heuss, N. D., Roehrich, H., Gregerson, D. S. Bystander killing of neurons by cytotoxic T cells specific for a glial antigen. Glia. 53 (5), 457-466 (2006).
  16. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76 (1), 17-27 (1994).
  17. Cao, Y., et al. Induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in transgenic mice expressing ovalbumin in oligodendrocytes. Eur J Immunol. 36 (1), 207-215 (2006).
  18. Göbel, K., et al. CD4(+) CD25(+) FoxP3(+) regulatory T cells suppress cytotoxicity of CD8(+) effector T cells: implications for their capacity to limit inflammatory central nervous system damage at the parenchymal level. J Neuroinflammation. 9, 41(2012).
  19. Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).
  20. Meuth, S. G., et al. Contribution of TWIK-related acid-sensitive K+ channel 1 (TASK1) and TASK3 channels to the control of activity modes in thalamocortical neurons. J Neurosci. 23 (16), 6460-6469 (2003).
  21. Misgeld, U., Frotscher, M. Dependence of the viability of neurons in hippocampal slices on oxygen supply. Brain Res Bull. 8 (1), 95-100 (1982).
  22. Ling, C., Verbny, Y. I., Banks, M. I., Sandor, M., Fabry, Z. In situ activation of antigen-specific CD8+ T cells in the presence of antigen in organotypic brain slices. J Immunol. 180, 8393-8399 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja limfocyt w T CD8Przygotowanie skrawk w m zguMikroskopia immunofluorescencyjnaApoptoza oligodendrocyt wApoptoza neuron wKo kultura limfocyt w TAnaliza histologiczna
Model ex vivo ataku limfocytów T kierowanego przez oligodendrocyty w ostrych wycinkach mózgu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.