Internalizacja i obserwacja biomolekuł fluorescencyjnych w żywych mikroorganizmach za pomocą elektroporacji

Podsumowanie

Badania biomolekuł in vivo są kluczowe dla zrozumienia funkcji molekularnej w kontekście biologicznym. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę pozwalającą na internalizację biomolekuł fluorescencyjnych, takich jak DNA czy białka, do żywych mikroorganizmów. Przedstawiono i omówiono również analizę danych in vivo zarejestrowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Streszczenie

Możliwość badania biomolekuł in vivo jest kluczowa dla zrozumienia ich funkcji w kontekście biologicznym. Jedno z zaawansowanych podejść polega na fuzji cząsteczek będących przedmiotem zainteresowania z białkami fluorescencyjnymi, takimi jak GFP, w celu zbadania ich ekspresji, lokalizacji i funkcji. Jednak GFP i jego pochodne są znacznie większe i mniej fotostabilne niż fluorofory organiczne zwykle stosowane w eksperymentach in vitro, co może ograniczać zakres badań.

Niedawno wprowadziliśmy prostą, wszechstronną i wysokowydajną metodę opartą na elektroporacji, pozwalającą na internalizację biomolekuł znakowanych organicznymi fluoroforami w żywych mikroorganizmach. Tutaj opisujemy, jak używać elektroporacji do internalizacji znakowanych fragmentów DNA lub białek do Escherichia coli i Saccharomyces cerevisiæ, jak określić ilościowo liczbę zinternalizowanych cząsteczek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz jak określić ilościowo żywotność komórek poddanych elektroporacji. Dane można uzyskać na poziomie pojedynczej komórki lub pojedynczej cząsteczki za pomocą fluorescencji lub FRET. Przedstawiono również możliwość internalizacji nieznakowanych cząsteczek, które wywołują fizjologicznie obserwowalną odpowiedź in vivo. Na koniec omówiono strategie optymalizacji protokołu dla określonych systemów biologicznych.

Wprowadzenie

Większość badań fluorescencyjnych wewnątrz żywych komórek opiera się na fuzjach białek z białkami fluorescencyjnymi (FP), takimi jak GFP¹. Te znaczniki fluorescencyjne umożliwiają badanie liczby kopii, wzoru dyfuzji lub lokalizacji białek zaangażowanych w procesy takie jak ekspresja genów lub transport błonowy^2-7. FP oferują wysoką specyficzność etykietowania, łatwą implementację i są dostępne w dużym asortymencie wariantów o różnych właściwościach fotofizycznych i chemicznych¹. Jednak fluorofory organiczne pozostają głównym wyborem do eksperymentów in vitro ze względu na ich większą fotostabilność (do 100 razy bardziej stabilną niż FPs)^8,9, mały rozmiar (do 100 razy mniejszą objętość niż FPs) i łatwość znakowania wewnątrzcząsteczkowego (głównie dzięki zastosowaniu reszt cysteiny). Wszystkie te czynniki są szczególnie ważne dla badań fluorescencji pojedynczej cząsteczki i FRET¹⁰.

W ciągu ostatniej dekady wprowadzono kilka metod internalizacji łączących zalety etykietowania organicznego i wykrywania in vivo; jednak takie metody albo wykorzystują stosunkowo duże znaczniki polipeptydów (np. TMP, HALO, lub znaczniki SNAP 20 kDa)^11-14, wymagają użycia nienaturalnych aminokwasów¹⁵, albo są ograniczone do dużych, jednobłonowych komórek eukariotycznych (np. ładowanie skrobaniem, ładowanie strzykawki, mikroiniekcja)^16-19.

Ten protokół opisuje nowatorską, prostą i wysokoprzepustową metodę internalizacji, która łączy zalety organicznych fluoroforów z obserwacją in vivo. Aby opracować tę technikę, dostosowaliśmy procedurę elektroporacji powszechnie stosowaną do transformacji komórek z plazmidowym DNA^20,21 w celu obciążenia mikroorganizmów, takich jak E. coli lub S. cerevisiæ, organicznie znakowanymi biomolekułami. Protokół składa się z 4 prostych kroków: inkubacji komórek z oznakowanymi biomolekułami, elektroporacji, odzyskiwania komórek i mycia komórek w celu usunięcia niezinternalizowanych biomolekuł. Tutaj przedstawiamy ten protokół elektroporacji, a także procesy obrazowania i analizy danych komórkowych w celu badania fluorescencji komórkowej i jednocząsteczkowej oraz sygnałów FRET.

Elektroporacja polega na rozładowywaniu pola elektrycznego o wysokim napięciu przez zawiesinę komórek o niskiej sile jonowej, tworząc przejściowe pory błonowe, przez które biomolekuły mogą dostać się do komórek (Rysunek 1)^20,21. Podobnie jak w przypadku transformacji bakterii lub drożdży z plazmidowym DNA, komórki muszą być przygotowane przed elektroporacją, aby zapewnić ich elektrokompetencję. Ta procedura, składająca się z kilku etapów mycia wodą, zwiększa przepuszczalność membrany i obniża siłę jonową roztworu ogniwa, aby uniknąć wyładowań łukowych w kuwecie elektroporacyjnej. W tym protokole komórki mogą być przygotowane zgodnie z opisem poniżej (patrz PROTOKÓŁ: 1.1) lub zakupione od dostawców komercyjnych.

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie protokołu internalizacji. Od lewej do prawej: dodaj kilka mikrolitrów znakowanych biomolekuł do podwielokrotności komórek elektrokompetentnych (w tym przykładzie podwójnie znakowanych fragmentów DNA i bakterii); inkubować przez 1-10 minut na lodzie i przenieść do wstępnie schłodzonej kuwety do elektroporacji; elektroporanować, a następnie natychmiast dodać 0,5-1 ml bogatej pożywki do komórek; inkubować w temperaturze 37 °C (lub w temperaturze wymaganej przez organizm, np. 29 °C w przypadku drożdży), aby umożliwić komórkom regenerację; Wykonaj 5 kroków mycia, aby usunąć nadmiar niezinternalizowanych znakowanych cząsteczek; zawiesić końcowy osad w 100-200 μl buforu PBS i odpipetować 10 μl na podkładce agarozowej; przykryć podkładkę oczyszczonym szkiełkiem nakrywkowym i wykonać obraz pod mikroskopem fluorescencyjnym (w trybie szerokiego pola lub w trybie HILO).

Elektrokompetentne komórki są inkubowane z oznaczonymi biomolekułami tuż przed elektroporacją, co można wykonać za pomocą standardowych elektroporatorów znajdujących się w większości laboratoriów biochemicznych. Bezpośrednio po elektroporacji komórki są inkubowane w bogatym podłożu, co pozwala na ich regenerację przed myciem (ryc. 1). Nadmiar niezinternalizowanych, znakowanych biomolekuł jest najpierw usuwany przez mycie w buforze zawierającym dość wysokie stężenie soli i trochę detergentu (patrz PROTOKÓŁ: 3.3). Obecność soli zakłóca niespecyficzne oddziaływania elektrostatyczne tworzone przez niezinternalizowane znakowane biomolekuły, które w przeciwnym razie mogłyby przykleić się do błony zewnętrznej. Podobnie obecność detergentu w buforze myjącym zaburza niespecyficzne oddziaływania hydrofobowe.

Chociaż internalizacja DNA jest prosta (Rysunek 2), należy zachować środki ostrożności podczas internalizacji znakowanych białek za pomocą elektroporacji. Po pierwsze, podstawowa próbka białka znakowanego organicznie może nadal zawierać niewielki procent wolnego barwnika. Wolne cząsteczki barwnika są znacznie mniejsze niż białka i dlatego mogą być preferencyjnie internalizowane. Aby upewnić się, że zdecydowana większość obserwowanych zinternalizowanych cząsteczek fluorescencyjnych odpowiada białku będącemu przedmiotem zainteresowania, początkowa próbka białka powinna zawierać mniej niż ~ 2% wolnego barwnika (ryc. 5)²². Nadmiar niezinternalizowanych znakowanych białek może również przyklejać się do zewnętrznej błony komórkowej po elektroporacji; Zjawisko to jest specyficzne dla białka i musi być sprawdzane dla każdego nowego białka. Proponujemy kilka opcji, które pozwalają na usunięcie niezinternalizowanych białek z załadowanej próbki komórki (Patrz PROTOKÓŁ: 3.3.3).

Na koniec, komórki są ponownie zawieszane w małej objętości buforu fosforanowego i pipetowane na podkładkę agarozową, co pozwala na ich obrazowanie pod mikroskopem fluorescencyjnym. Unieruchomienie na opuszkach agarozowych jest prostym i skutecznym sposobem obrazowania komórek na szkiełku nakrywkowym bez szkody dla ich integralności. Podkładka powinna zawierać pożywkę hodowlaną o niskiej fluorescencji.

Obrazowanie komórek można wykonać zarówno w szerokim polu fluorescencji wewnętrznego odbicia (TIRF), jak i przy użyciu mikroskopii HILO (Highly Inclined and Laminated Optical Sheet). W konfiguracji HILO wiązka lasera wnika głębiej w próbkę niż w TIRF, ale nie oświetla całej próbki, jak w przypadku szerokiego pola, co pozwala na większy stosunek sygnału do szumu²³. W zależności od użytej mocy lasera i rozdzielczości czasowej, zinternalizowane biomolekuły mogą być liczone (za pomocą krokowej analizy fotowybielania, ryc. 3), lokalizowane lub śledzone^{w latach 24-28}. Internalizacja podwójnie znakowanych konstruktów za pomocą pary fluoroforów FRET pozwala na ilościowe określenie FRET zarówno na poziomie pojedynczej komórki, jak i pojedynczej cząsteczki (ryc. 6).

Różne parametry mogą być zmieniane w zależności od pożądanej wydajności i badanego systemu biologicznego. Po pierwsze, ilość zinternalizowanego materiału na komórkę można dostroić, zmieniając stężenie znakowanych biomolekuł dodanych do komórek przed elektroporacją (ryc. 2). Natężenie pola elektroporacji będzie również miało wpływ zarówno na wydajność ładowania, jak i żywotność ogniwa; zgodnie z oczekiwaniami, podczas gdy wydajność ładowania wzrasta wraz ze wzrostem natężenia pola, żywotność ogniw elektroporowanych maleje (rysunek 4A). Oba parametry można określić ilościowo, rejestrując procent obciążonych i dzielących się komórek po elektroporacji. Ten test żywotności w połączeniu z obrazowaniem fluorescencyjnym weryfikuje również obserwację zinternalizowanych biomolekuł w żywych komórkach i umożliwia ciągłą obserwację przez kilka pokoleń (ryc. 4B).

Podsumowując, ten protokół pozwala na internalizację fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek DNA i białek do E.coli lub S. cerevisiæ²⁶. Pojedyncze cząsteczki znakowane organicznymi fluoroforami mogą być śledzone z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną w skalach czasowych o rząd wielkości dłuższych niż FPs. Wreszcie, metoda ta jest kompatybilna z detekcją szerokokątną, TIRF i konfokalną, a także schematami wzbudzenia impulsowego, takimi jak ALEX (naprzemienne wzbudzenie laserowe^28,29).

Protokół

1. Przygotowanie komórek

1. Przygotowanie laboratoryjnych bakterii elektrokompetentnych
   1. Przygotuj 5-10 ml kultury wstępnej na noc z pojedynczej kolonii interesującego szczepu E. coli w pożywce o niskiej fluorescencji, takiej jak M9 lub EZ Rich Defined Medium.
   2. Rano zaszczepić nową 400 ml kulturę wstępną przez noc, tak aby OD_{600 nm} zaczynał się od 0,02. Do 400 ml pożywki o niskiej fluorescencji dodać 2,5 ml 1 M_MgSO4 i 2,5 ml 1 M MgCl₂.
   3. Rosnąć w temperaturze 37 °C i 250 obr./min, aż OD_{600 nm} osiągnie 0,4 do 0,6.
   4. Zatrzymaj wzrost, schładzając kulturę w lodowatej kąpieli wodnej przez 10-15 min.
      Uwaga: Od teraz wszystkie czynności należy wykonywać w temperaturze 4 °C (na lodzie).
   5. Odwirować kulturę przez 15 minut przy 1000 x g. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 250 ml schłodzonego i sterylnie destylowanego_H2O.
   6. Powtórzyć etapy wirowania i ponownego zawieszenia dwukrotnie, zmniejszając objętość wody do 100 ml, a następnie do 50 ml.
   7. Odwirować kulturę przez 10 minut przy 1000 x g. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 25 ml schłodzonego i sterylnie destylowanego_H2O+ 10% glicerolu.
   8. Powtórzyć etapy wirowania i ponownego zawieszania trzy razy, zmniejszając objętość 10% roztworu glicerolu do 10 ml, 5 ml i na końcu do 500 μl.
   9. Podwielokrotność komórek należy podzielić na porcje po 20 μl każda, błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80°C.
2. Komercyjne elektrokompetentne ogniwa bakteryjne
   1. Rozcieńczyć dostępną w handlu podwielokrotność komórkową w stosunku 1:1 sterylnie schłodzoną wodą destylowaną. Przygotować 20 μl porcji i przechowywać w temperaturze -80 °C.
3. Przygotowanie drożdży elektrokompetentnych
   Uwaga: Elektrokompetentne komórki S. cerevisiæ są przygotowywane przed każdym eksperymentem elektroporacyjnym i nie mogą być przechowywane w temperaturze -80°C, jak w przypadku E. coli.
   1. Na początek zaszczep 50 ml pożywki YPD pojedynczą kolonią pożądanego szczepu, który Cię interesuje.
   2. Inkubować w temperaturze 30 °C i 250 obr./min, aż średnica zewnętrzna_{600 nm} osiągnie 0,6–0,8.
   3. Odwirować komórki przy 1000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   4. Zawiesić osad w 25 ml schłodzonego i sterylnego destylowanego_H2O.
   5. Powtórzyć etapy płukania, ponownie dwukrotnie w 25 ml wody i dwukrotnie w 2 ml schłodzonego roztworu sorbitolu w 1 M.
   6. Zawiesić komórki w 250 μl 1 M sorbitolu i podzielić komórki na 50 μl podwielokrotności.

2. Przygotowanie podkładki agarozowej

1. Aby usunąć fluorescencyjne cząstki tła, należy spalić szkiełko nakrywkowe w piecu w temperaturze 500 °C przez 1 godzinę. "Czyste spalone" szkiełka nakrywkowe można przechowywać tygodniami w temperaturze pokojowej przykryte folią aluminiową.
   Uwaga: Inne popularne metody czyszczenia, takie jak czyszczenie plazmowe lub roztwór piranii, mogą być stosowane, o ile fluorescencja tła czyszczonych szkiełek pozostaje prawie zerowa.
2. Przygotować roztwór agarozy o niskiej fluorescencji, topiąc w kuchence mikrofalowej 2% roztwór wody destylowanej agarozy (70 °C). Natychmiast dodać 500 μl klarownego 2% roztworu agarozy do 500 μl pożywki hodowlanej 2X o niskiej fluorescencji i delikatnie wymieszać.
3. Zanim ostygnie i stwardnieje, należy niezwłocznie odpipetować ten roztwór agarozy - pożywki na szkiełku nakrywkowym mikroskopu (grubość nr 1,5) w celu uformowania podkładki o średnicy około 2 cm i wysokości kilku milimetrów. Unikaj pęcherzyków i w razie potrzeby przebij je końcówkami pipety.
4. Spłaszcz podkładkę za pomocą drugiego "spalonego" szkiełka nakrywkowego (nr 1,5 grubości, patrz rysunek 1).
   Uwaga: To górne szkiełko nakrywkowe pomaga uformować płaską, jednorodną podkładkę i chroni przed kurzem i wysuszeniem podczas przygotowywania komórek. Minimalne podłoże, takie jak M9 lub bogate podłoże, takie jak EZ Rich Defined Medium, zostało przetestowane pod kątem niskiej fluorescencji.

3. Elektroporacja

1. Inkubacja
   1. Dodać do 5 μl znakowanych cząsteczek przechowywanych w buforze o niskiej zawartości soli (< 50 mM soli) do pojedynczej porcji kompetentnych komórek (20 μl bakterii lub 50 μl drożdży) i inkubować 10 minut na lodzie.
      Uwaga: Stężenie znakowanych fluorescencyjnie cząsteczek w roztworach podstawowych, a tym samym ilość znakowanych cząsteczek dodanych do ogniwa przed elektroporacją jest bezpośrednio skorelowane z wydajnością ładowania (Rysunek 3 i dyskusja). Ponieważ niektóre białka są mniej kompatybilne w warunkach niskiej zawartości soli, stężenie soli w buforze magazynowym może zostać zwiększone, ale objętość znakowanych cząsteczek dodanych do komórek przed elektroporacją musi zostać zmniejszona.
   2. Przenieś mieszaninę komórek i znakowanych biomolekuł do wstępnie schłodzonej kuwety do elektroporacji (odstępy odpowiednio 0,1 i 0,2 cm dla bakterii i drożdży). Delikatnie postukaj w kuwetę na stole, aby usunąć wszelkie potencjalne pęcherzyki z roztworu.
   3. Umieść kuwetę w elektroporatorze i przyłóż impuls elektryczny o wysokim napięciu do roztworu (0,9 do 1,8 kV/cm, więcej szczegółów na temat wyboru napięcia można znaleźć w Dyskusji). Taki impuls tworzy przejściowe pory w błonach komórkowych, umożliwiając znakowane biomolekuły dyfuzję do komórek.
   4. Sprawdź, czy stała czasowa wyświetlana na elektroporatorze wynosi od 4 do 6 ms. Niższe stałe czasowe są często spowodowane zbyt wysokim stężeniem soli i/lub obecnością pęcherzyków w kuwecie i prowadzą do bardzo niskiego obciążenia ogniw lub ich braku.
2. Odzyskiwania
   1. Bezpośrednio po elektroporacji dodaj do ogniw 500 μl bogatej pożywki, takiej jak SOC, EZ Rich Defined Medium, YPD lub dowolnej bogatej pożywki.
   2. Inkubować próbkę w temperaturze 37 °C dla bakterii i 29 °C dla drożdży przez 2-10 minut. Do pomiarów żywotności, gdzie użytkownik chce ocenić procent komórek rosnących i dzielących się po elektroporacji, należy użyć dłuższego czasu regeneracji (do 1 godziny), ponieważ obserwujemy takie czasy opóźnienia przed pierwszym podziałem komórki.
3. Etapy prania
   1. Umyć komórki w celu usunięcia wszelkich niezinternalizowanych biomolekuł, obracając komórki przez 1 minutę w temperaturze 3300 x g i 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 μl PBS.
      Uwaga: Dla każdej próbki należy przygotować kontrolę ujemną komórek inkubowanych z taką samą ilością znakowanych biomolekuł, ale niepoddanych elektropostacji i przemytych dokładnie w taki sam sposób, jak próbka główna.
   2. Powtórz poprzednie kroki 3 razy.
   3. W przypadku internalizacji białka zoptymalizuj procedurę mycia w zależności od właściwości i zachowania znakowanego białka, które Cię interesuje. Poniższe kroki są przykładowymi możliwymi optymalizacjami:
      1. Wykonaj pierwsze 3 cykle płukania przy użyciu PBS zawierającego 100 mM NaCl i 0,005% Triton X100, aby usunąć niezinternalizowane białka, które mogą przyklejać się do zewnętrznej błony komórkowej^22,26.
         1. Przefiltrować elektroporowane ogniwa za pomocą filtra o średnicy porów 0,22 μm umieszczonego w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, pipetując elektroporowane ogniwa do filtra. Wirować przez 3 minuty w temperaturze 800 x g i temperaturze 4 °C. Wyrzucić przepływ. Dodać 500 μl nowego PBS na komórki i obrócić je ponownie jak poprzednio, a następnie powtórzyć te kroki raz²².
      2. Dodać niewielką ilość proteazy K (10 ng na 500 μl PBS) podczas pierwszego cyklu prania, aby umożliwić trawienie wszelkich niezinternalizowanych białek.
   4. Wirować komórki przez 1 minutę w temperaturze 3300 x g i w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 150 μl PBS.
   5. Rozprowadzić obciążony roztwór komórkowy na waduszce agarozowej, usuwając górne szkiełko nakrywkowe i rozprowadzając 10 μl zawiesiny komórek kropla po kropli. Wymień nieużywane, czyste, przypalone szkiełko nakrywkowe (nr 1,5 grubości, zgodne ze specyfikacją obiektywu mikroskopu) na górze podkładki i bardzo delikatnie dociśnij szkiełko.
   6. Chroń elektroporowane ogniwa przed światłem, przechowując elektropotury w nieprzezroczystym pudełku podczas obrazowania różnych próbek.

4. Akwizycja danych mikroskopowych

Uwaga: Mikroskopia fluorescencyjna pojedynczych komórek i pojedynczych cząsteczek w żywych mikroorganizmach może być wykonana na dowolnym odpowiednim mikroskopie fluorescencyjnym (zbudowanym na zamówienie lub komercyjnym).

1. Ustawienia
   1. Oświetlenie szerokokątne lub HILO
      1. Obrazowanie próbek za pomocą dowolnego mikroskopu TIRF/jednocząsteczkowego.
         Uwaga: Na przykład używamy w laboratorium niestandardowego mikroskopu odwróconego z konfiguracją TIRF. Wiązki z lasera diodowego 532 nm i 637 nm są łączone i kolimowane przed ustawieniem ostrości na tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu. Fluorescencja z próbki jest zbierana przez ten sam obiektyw, oddzielana od światła wzbudzającego za pomocą filtra długoprzepustowego i wycinającego, a następnie dzielona na kanały czerwony i zielony za pomocą lustra dichroicznego. Dwa kanały są obrazowane na oddzielnych połówkach chipa kamery EM-CCD (EM-CCD) z urządzeniem zwielokrotnionym ładunkiem. Filmy są nagrywane w trybie kinetycznym. Obrazy w świetle białym uzyskuje się za pomocą lampy ze światłem białym i kondensora podłączonego do mikroskopu jako źródła oświetlenia.
      2. W przypadku ogólnych obserwacji pojedynczych cząsteczek należy ustawić tryb oświetlenia mikroskopu na TIRF lub HILO²³ (więcej informacji na temat obrazowania TIRF i HILO można znaleźć w Dyskusji). Aby ustawić tryb HILO w mikroskopie TIRF, należy nieznacznie zmniejszyć kąt padania światła wzbudzającego, aby przesunąć ostrość nieco wyżej niż powierzchnia szkiełka nakrywkowego (należy zobrazować wnętrze komórki, a nie jej dolną błonę stykającą się ze szkiełkiem nakrywkowym, patrz 4.5.4).
      3. W przypadku analizy na poziomie komórki, długich eksperymentów śledzenia pojedynczych cząsteczek lub krokowej analizy fotowybielania, ustaw tryb oświetlenia mikroskopu na tryb szerokiego pola, zapewniając ciągłą obserwację całej objętości komórki, a tym samym wszystkich zinternalizowanych znakowanych cząsteczek.
   2. Zazwyczaj stosuje się moc wzbudzenia około 0,5-3 mW (~50-400 W/cm²).
      Uwaga: Niższe moce lasera są przydatne do uzyskania długotrwałej obserwacji i śledzenia fluorescencji (ponad 1 minutę), podczas gdy wyższe moce lasera mogą być wymagane do wyższej rozdzielczości czasoprzestrzennej lub krokowej analizy fotowybielania.
   3. Użyj czasów naświetlania w zakresie od 15 ms do śledzenia eksperymentów do 100 ms do bardziej ogólnej obserwacji i kwantyfikacji intensywności. Uwaga: Można używać innych szybkości klatek i trybów, takich jak oświetlenie stroboskopowe, szczególnie do badania szybko rozpraszających się gatunków ³⁰.
   4. W mikroskopie TIRF zarejestruj kanał fluorescencyjny w kamerze CCD zwielokrotniającej elektrony (EMCCD) w powiększeniu, co daje długość piksela ~100 nm/piksel. Konfiguracja TIRF jest opisana bardziej szczegółowo w odnośniku²⁶.
2. Akwizycja danych
   1. Wyłącz lub zablokuj oświetlenie laserowe do czasu rozpoczęcia eksperymentu. Wyłącz wzmocnienie kamery EMCCD, aby zapobiec uszkodzeniu aparatu z powodu prześwietlenia.
   2. Umieść kanapkę z podkładką agarozową do góry nogami na stoliku mikroskopowym, stroną pokrytą komórką skierowaną w dół, aby zbliżyć komórkę do obiektywu. Ustaw ostrość na komórkach w trybie mikroskopii w świetle przechodzącym²⁸. Zapisz obraz każdej komórki view w obrazowaniu w świetle białym, aby zlokalizować kontury komórek przed wyłączeniem białego światła.
   3. Chroń próbkę przed światłem laboratoryjnym.
   4. W trybie wzbudzenia HILO należy dostosować kąt wiązki wzbudzenia do każdego maksymalnego stosunku sygnału do szumu, oświetlając tylko ten fragment próbki, który znajduje się blisko powierzchni szkiełka nakrywkowego.
      1. Aby uzyskać oświetlenie HILO, należy skupić wiązkę lasera na tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu 100x NA 1.4²⁸ (odpowiednie są również wyższe apertury numeryczne, takie jak 1.45 lub 1.49). Przesuwając soczewkę skupiającą prostopadle do wiązki, ostrość oddala się od środka obiektywu, tak że wiązka wychodzi z obiektywu pod kątem.
      2. Dostosuj położenie soczewki, aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu, intensywność fluorescencji wewnątrzkomórkowej w porównaniu z zewnątrzkomórkowym sygnałem tła.
   5. Przełącz wzmocnienie kamery i rozpocznij akwizycję danych przed włączeniem lasera.
   6. Podczas rejestrowania danych należy uzyskać obraz w świetle białym każdego pola widzenia przed lub po zarejestrowaniu danych fluorescencyjnych; pomaga to zidentyfikować granice komórek w kanałach fluorescencyjnych.
   7. Do oszacowania rentowności
      1. Użyj pożywki bogatej w fluorescencję w podkładce agarozowej, aby umożliwić komórkom wzrost po elektroporacji.
      2. Wyrównać mikroskop do temperatury optymalnej dla badanego mikroorganizmu (37 °C dla E. coli, 29 °C dla S. cerevisiæ) za pomocą systemu podgrzewania obiektywu.
      3. Rejestruj zarówno obrazy w świetle białym, jak i fluorescencyjnym co 30 minut, upewniając się, że pozostajesz dokładnie w tym samym polu widzenia podczas całego rejestrowania danych. Zwykle obserwuje się opóźnienie ≈1 godziny, zanim komórki zaczną się dzielić.
   8. Zliczanie liczby zinternalizowanych biomolekuł na komórkę
      1. Ustaw moc lasera na wysokie wartości (2-3 mW) i długi czas naświetlania (100 ms).
      2. Ustaw oświetlenie w trybie szerokiego pola, aby oświetlić całą komórkę.
      3. Nagrywaj filmy zgodnie z opisem w kroku 4.2, upewniając się, że nagrywasz dodatkowe klatki (50-100 klatek) po zakończeniu fotowybielania fluorescencyjnego.

5. Analiza danych

1. Analiza ogólna
   1. Analizuj zarejestrowane obrazy i filmy, zarówno w świetle białym, jak i wzbudzeniach fluorescencyjnych, za pomocą oprogramowania do obrazowania, takiego jak bezpłatne oprogramowanie ImageJ.
      1. W ImageJ otwórz obrazy lub filmy nagrane pod mikroskopem (format TIF) w Plik>Otwórz>Twoja lokalizacja pliku.
      2. Aby jakościowo porównać intensywność fluorescencji na ekranie komputera, upewnij się, że wszystkie obrazy fluorescencyjne są wyświetlane z tymi samymi ustawieniami jasności i kontrastu w Image>Adjust>Brightness/Contrast. Dostosuj ręcznie lub automatycznie ustawienia dla wybranego obrazu, naciśnij przycisk "Ustaw" i wybierz opcję "Propaguj do wszystkich innych obrazów".
      3. Ustaw typ informacji do wyodrębnienia: Analizuj>Ustaw pomiary i wybierz (przynajmniej) "Obszar", "Odchylenie standardowe", "Min i maksymalna wartość szarości" oraz "Średnia wartość szarości".
      4. Aby porównać intensywność fluorescencji komórek, wybierz obszar zainteresowania za pomocą przycisku wyboru odręcznego w ImageJ i wyodrębnij intensywności komórek w Analyze>Measure. Wynikowa tabela zawiera wartości pomiarowe i może być zapisywana i/lub kopiowana do innego oprogramowania. Wartość "Średnia" odpowiada średniej intensywności na piksel w wybranym obszarze i może być bezpośrednio porównana między komórkami lub między komórką a tłem.
      5. W elektroporowanej próbce ogniwa komórkę uważa się za załadowaną, jeśli jej średnia intensywność na piksel jest większa niż średnia intensywność na piksel kontroli ujemnej plus 3-krotność jej odchylenia standardowego (Av(komórka _obciążona I) > Av(I_–EP)+3*StdDev(I_–EP)).
   2. Twórz obrazy i filmy z nakładkami fluorescencji w sztucznych kolorach, aby ocenić jakość i obciążenie próbek.
      1. W obrazie ImageJ nakładaj na siebie obrazy, takie jak obraz światła białego i obraz fluorescencyjny odpowiadający temu samemu polu widzenia w kanałach Image>Colors>Merge. Wybierz kolor dla każdego obrazu (C4 (szary) dla światła białego, C1 (czerwony) dla kanału czerwonego, C2 (zielony dla kanału zielonego...itd.).
      2. Sprawdź na nałożonym obrazie, czy fluorescencja znajduje się w granicach komórki (obraz w świetle białym) i czy fluorescencja tła jest niska i jednorodna (brak jasnych punktów poza granicami komórki).
      3. Przed analizą dużej liczby ogniw należy sprawdzić jakościowo, czy obrazy odpowiadające próbce ujemnej są podobne do obrazów pustych komórek i wykazują znacznie niższą intensywność niż ogniwa elektroporowane.
   3. W przypadku doświadczeń żywotności należy ręcznie policzyć procentowy udział dzielących się, niedzielących się, ale widocznie nienaruszonych (identycznych) i uszkodzonych (martwych) komórek z tego samego pola widzenia, rosnących w czasie (patrz 4.2.6).
   4. Oceń żywotność co najmniej 200 komórek na próbkę (elektroporowanych, kontroli ujemnej i pustych komórek) w celu zebrania wystarczających danych statystycznych.
2. Analiza oparta na komórkach
   1. Liczenie liczby zinternalizowanych biomolekuł na komórkę za pomocą krokowej analizy fotowybielania
      1. Podziel komórki na segmenty, zaznaczając obszar zainteresowania za pomocą przycisku wyboru odręcznego w ImageJ i narysuj kształt otaczający dokładnie komórkę (odpowiednik błony komórkowej).
      2. Wyodrębnij intensywność komórek w czasie w Image>Stacks>Plot Z-axis Profile. Wynikowy wykres przedstawia średnią intensywność na piksel dla obszaru w granicach komórki w stosunku do każdej klatki filmu, co daje krzywą fotowybielania dla tej konkretnej komórki. Zawiera początkowy wykładniczy spadek intensywności komórki, osiągając niższą asymptotę (fluorescencja tła). Wartości pomiarowe można zapisać i/lub skopiować do innego oprogramowania, klikając "Zapisz" lub "Kopiuj".
      3. Skopiuj i wklej wartości wybielania do kolumny arkusza kalkulacyjnego (_{I surowe}).
      4. Oblicz średnią autofluorescencję na piksel pozostałą po fotowybielaniu (I_auto), uśredniając wartości_{I raw} uzyskane dla ostatnich 50-100 klatek (dolna asymptota).
      5. Odejmij średnią autofluorescencję na piksel pozostałą po fotowybielaniu dla tej komórki od początkowej krzywej fotowybielania: I_wybielanie = I_{surowe -} I_auto.
      6. Użyj odjętych od linii bazowej śladów czasu fotowybielania (_wybielanie I w porównaniu z klatką) pokazujących mniej niż 10 skwantowanych kroków, aby ocenić średnią wielkość kroku (jednostkową intensywność fluoroforu) w wyniku bielenia pojedynczego fluoroforu²⁶.
      7. Oceń liczbę zinternalizowanych cząsteczek na komórkę, dzieląc początkową intensywność komórek odjętą od linii podstawowej (_bielenie przy t = 0) przez jednostkową intensywność fluoroforu.
   2. Wydajność jednoogniwowego FRET
      1. Zmierzyć średnią intensywność komórek na piksel zarówno w kanale emisyjnym dawcy, jak i akceptora (po wzbudzeniu dawcy) oraz w granicach komórki dla każdego kanału, jak wyjaśniono w 5.1.1.4.
      2. Zmierz średnią intensywność pikseli tła w każdym kanale od pustego obszaru slajdu.
      3. Odejmij tę intensywność tła od średniej intensywności na piksel. Użyj tych intensywności fluorescencji odjętej w tle, aby obliczyć FRET dla każdej komórki, obliczając intensywność akceptacji odjętą w tle podzieloną przez całkowitą intensywność odjętego tła (akceptor + donor) przy wzbudzeniu dawcy: I_akceptor / (I_akceptor + I_dawca)
3. Analiza pojedynczych cząsteczek
   1. Śledzenie pojedynczych cząsteczek i analiza dyfuzji
      Uwaga: Opisano protokół śledzenia dyfuzyjnych cząsteczek fluorescencyjnych w żywych komórkach i oceny ich pozornego współczynnika dyfuzji^26,28.
      1. Krótko mówiąc, dopasuj obrazy pojedynczych fluoroforów w każdej klatce za pomocą eliptycznego Gaussa 2D. Połącz zlokalizowane cząsteczki ze ścieżką, jeśli pojawiły się w kolejnych klatkach w oknie 5-7 pikseli (0,48-0,67 μm). Użyj parametru pamięci o wartości 1 klatki, aby uwzględnić przejściowy zanik fluoroforu z powodu mrugania lub pominiętej lokalizacji.
   2. Analiza in vivo smFRET
      1. Ręcznie identyfikuj zlokalizowane cząsteczki wewnątrz komórek z filmów, przechodząc przez film w ImageJ i identyfikuj nieruchome (lub dość nieruchome) cząsteczki w kanale FRET (akceptorowym).
      2. Aby wyodrębnić intensywności w kanale akceptorowym i donorowym odpowiadające cząsteczce nieruchomej, wybierz obszar wokół cząsteczki w każdym kanale za pomocą przycisku wyboru "Owalny" w ImageJ (zakreśl wokół każdego pojedynczego fluoroforu, używając promienia ∼3 pikseli) i wyodrębnij intensywności cząsteczki w Analyze>Measure. Wynikowa tabela zawiera wartości pomiarowe i może być zapisywana i/lub kopiowana do innego oprogramowania.
      3. Obliczanie wartości tła na kanał na podstawie średniej intensywności pikseli z okręgu o tym samym rozmiarze w pustym obszarze slajdu we wszystkich analizowanych klatkach.
      4. Użyć odjętych w tle wartości fluorescencji w kanałach donorowym i akceptorowym (po wzbudzeniu donora) dla śladów fluorescencji i czasu FRET, jak w przypadku jednokomórkowego FRET (patrz 5.2.1.7).
         Uwaga: Zautomatyzowana i solidna analiza i algorytmy zostały opisane w piśmiennictwie^26-28,31.

Wyniki

Przygotowanie próbki

Różne kroki protokołu są przedstawione jako schematy na rysunku 1. Jako przykład przedstawiliśmy obciążenie bakterii podwójnie znakowanymi (barwniki donorowe i akceptorowe) fragmentami DNA. Reprezentatywne wyniki internalizacji DNA przedstawiono na rysunku 2. Dla każdej próbki poddanej elektroporacji zarejestrowano również dane dotyczące ogniw pustych i nieelektroporowanych (rysunek 2). "Puste komórki" odpowiadają elektrokompetentnym komórkom, które nie są inkubowane z fluorescencyjnymi biomolekułami ani nie są elektroporowane; Ich intensywność w kanale fluorescencyjnym odzwierciedla poziom autofluorescencji w identycznych warunkach eksperymentalnych (moc lasera, rozdzielczość czasowa, temperatura itp.). "Ogniwa nieelektroporowane" (zwane również –EP, tj. minus EP) odpowiadają kontroli ujemnej, w której elektrokompetentne komórki były inkubowane z biomolekułami fluorescencyjnymi, ale nie poddawane elektroporacji. Te nieelektroporowane ogniwa powinny wykazywać poziom fluorescencji podobny do autofluorescencji pustych komórek i znacznie niższy niż intensywność fluorescencji wykazywana przez obciążone, elektroporowane ogniwa. Potwierdza to usunięcie wszelkich niezinternalizowanych, znakowanych biomolekuł, które mogły przylegać do zewnętrznej błony komórkowej.

Rysunek 2: Reprezentatywne wyniki internalizacji dsDNA znakowanego różnymi fluoroforami w różnych stężeniach w bakteriach (A-E) i drożdżach (F). Od lewej do prawej: obrazy w świetle białym, fluorescencyjne i nakładkowe. -/+ EP oznacza inkubację bez/z elektroporacją. Podziałka: 3 μm. A. Cy3B dsDNA, 10 pmol, E. coli. B. ATTO647N dsDNA, 10 pmol, E. coli. C. Alexa647 dsDNA, 5 pmol, E. coli. D. Cy3B dsDNA, 100 pmol, E. coli. E. ATTO647N dsDNA, 100 pmol, E. coli. F. ATTO647N dsDNA, 30 pmol, drożdże. Rysunek ten został zmodyfikowany w stosunku do numeru referencyjnego 26. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Zliczanie liczby zinternalizowanych biomolekuł na komórkę

Procedura szacowania liczby zinternalizowanych, znakowanych biomolekuł na komórkę za pomocą analizy fotowybielania jest przedstawiona na rysunku 3 i filmie uzupełniającym 2, wraz z reprezentatywnymi wynikami uzyskanymi dla różnych stężeń znakowanego DNA. Wydajność ładowania komórek wzrasta wraz z początkową ilością inkubowanego znakowanego DNA, co pozwala użytkownikowi dostroić liczbę znakowanych cząsteczek na komórkę z poziomu "pojedynczej cząsteczki" (<10, film uzupełniający 2B) do poziomu "zespołu" (>10, film uzupełniający 2A). Niezawodnym sposobem oszacowania procentu obciążonych komórek jest policzenie liczby elektroporowanych ogniw wykazujących intensywność ogniwa powyżej średniej intensywności ogniw nieelektroporowanych plus 3-krotność ich odchylenia standardowego (tj. Av(I–EP)+3*StdDev(I–EP), gdzie Av = średnia, I = intensywność na piksel, Std. Dev. = odchylenie standardowe i –EP = nieelektroporowane), jak pokazano na rysunku 3.

Rysunek 3: Zliczanie liczby zinternalizowanych cząsteczek za pomocą analizy fotowybielania. (A) Analiza fotobielenia pojedynczych komórek. Przykłady śladów czasowych intensywności fluorescencji (niebieski: dane surowe; czerwony: pasuje; wstawki: WL i obrazy fluorescencyjne E. coli załadowane znakowanym ATTO647N dsDNA przed i po wybielaniu). U góry: jednoetapowe wybielanie. Środek: komórka zawierająca ±3 cząsteczki wykazujące bielenie i mruganie. Na dole: komórka zawierająca >10 kroków odpowiadających co najmniej 10 cząsteczkom. (B) Histogram intensywności wysokości pojedynczego kroku z automatycznego algorytmu dopasowywania stopni z 57 komórek zawierających mniej niż 6 rozróżnialnych kroków. Dopasowanie pojedynczego Gaussa jest wyśrodkowane w odległości 11 ± 3 n.a., co odpowiada jednostkowej intensywności fluoroforu wynoszącej 8100 fotonów na sekundę. Gwiazdka oznacza pojemnik zbierający wszystkie wysokości stopni powyżej lub równe 50 a.u. (C) Histogram zinternalizowanych cząsteczek na komórkę elektroporowaną różnymi ilościami ATTO647N dsDNA, obliczony po podzieleniu początkowej intensywności fluorescencji przez jednostkową intensywność fluoroforu. Od góry do dołu: puste komórki (tj. nie inkubowane z cząsteczkami fluorescencyjnymi i nie elektroporowane), nieelektroporowane (ale inkubowane z cząsteczkami fluorescencyjnymi, o nazwie –EP) oraz komórki elektroporowane inkubowane z 10 i 100 pmol dsDNA (o nazwie +EP). Puste i nieelektroporowane ogniwa odpowiadają autofluorescencji, podczas gdy ogniwa elektroporowane wykazują szeroki rozkład zinternalizowanych cząsteczek, z wyższym odsetkiem wysoce obciążonych komórek przy 100 pmol (≥ 4 cząsteczki, patrz pojemnik oznaczony gwiazdką). Skuteczność internalizacji (frakcja komórek o średniej Int. > + 3x Std. Dev. próbki innej niż EP) dla próbek 10 i 100 pmol wynosiła odpowiednio 94% i 90%. Średnia liczba zinternalizowanych cząsteczek na komórkę: 121 ± 106 cząsteczek na 10 pmol dsDNA i 176 ± 187 cząsteczek na 100 pmol dsDNA. Ustawienia: ekspozycja 100 ms, oświetlenie szerokokątne. Podziałka skali: 1 μm. Rysunek ten został zmodyfikowany w stosunku do numeru ^{referencyjnego 26}. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ładowanie komórek i żywotność

Oprócz zmiany ilości znakowanych biomolekuł dodawanych do komórek przed elektroporacją, użytkownik może dostosować ilość zinternalizowanych molekuł, wybierając różne natężenia pola podczas elektroporacji (Rysunek 4, Dodatkowy film 1). Wyższe natężenie pola prowadzi do większej wydajności internalizacji, ale prowadzi do niewielkiego spadku żywotności komórek. W przypadku internalizacji białek zastosowanie etapu filtracji może pomóc w usunięciu niezinternalizowanych znakowanych białek (patrz 3.3.3.1.1). W takich przypadkach filtracja komórkowa zapewnia, że obserwowane białka fluorescencyjne są rzeczywiście internalizowane w cytoplazmie bakteryjnej; zauważamy jednak, że filtracja ma również negatywny wpływ na żywotność komórek (więcej szczegółów znajduje się w REF ²²).

Rysunek 4: Wpływ napięcia elektroporacji na obciążenie i żywotność ogniwa. (A) Wykres słupkowy przedstawiający wpływ natężenia pola elektroporacji na wydajność obciążenia (czerwone słupki) i żywotność ogniw (zielone słupki). 84 ± 8 % nieelektroporowanej komórki (0 kV/cm) dzieli się po 1 godzinie na podkładce agarozowej w temperaturze 37 °C. W tych samych warunkach 78 ± 3 % i 49 ± 3 % ogniw wyładowanych elektroporacją odpowiednio 0,9 kV/cm i 1,8 kV/cm dzieli się po 1 godzinie. Aby zapewnić wydajność obciążenia, 73 ± 8% ogniw jest obciążonych napięciem 0,9 kV/cm, podczas gdy 92 ± 6% ogniw jest obciążonych napięciem 1,8 kV/cm. Słupki błędu reprezentują odchylenie standardowe obliczone na podstawie trzech niezależnych pomiarów; Przeanalizowano ponad 200 komórek dla każdej próbki i każdego powtórzenia. Ogólna wydajność obciążenia wzrasta wraz z napięciem elektroporacyjnym z niewielką szkodą dla żywotności ogniwa. (B) Pomiary fluorescencji na komórkach przez kilka pokoleń pokazują, że ogólna intensywność fluorescencji jest równomiernie rozłożona między obie komórki potomne. Komórki 1 i 2 odnoszą się do numeru komórki na obrazie w świetle białym (po lewej) i obrazu fluorescencji w t = 0. Podziałka: 1 μm). Rysunek ten został zmodyfikowany w stosunku do numeru referencyjnego 26.

Internalizacja białek

Reprezentatywne wyniki internalizacji białek znajdują się na rysunkach 5A i B. Szczególnie ważne jest, aby przed elektroporacją usunąć jak najwięcej pozostałego wolnego (nieprzereagowanego) barwnika z próbki białka. W przykładach na rysunkach 5A i B, próbka fragmentu Klenowa znakowana Cy3b (Cy3b-KF, gdzie KF jest fragmentem Klenowa polimerazy DNA E. coli I, 66 kDa) zawiera tylko 1% wolnego barwnika; Taki udział barwnika w ogólnym obciążeniu komórek jest znikomy. Porównania elektroporowanej próbki będącej przedmiotem zainteresowania zarówno z komórkami nieelektroporowanymi (inkubowanymi z tą samą ilością znakowanego białka), jak i komórkami elektroporowanymi równoważną ilością wolnego barwnika, stanowią dwie wymagane kontrole, aby zapewnić, że obserwowane cząsteczki fluorescencyjne są rzeczywiście zinternalizowanymi znakowanymi białkami.

Rycina 5: Internalizacja białek u żywych bakterii. (A) Reprezentatywne pole widzenia nakładki fluorescencyjnej. Ogniwa elektroporowane napięciem 1,4 kV z podjednostką 50 pmol RNAP ω z roztworu białkowego, który zawierał tylko 1% wolnego barwnika Cy3b. Ogniwa nieelektroporowane (non –EP) i puste są zdefiniowane jak poprzednio. Wolny barwnik został zinternalizowany w tym samym stężeniu, co w elektroporowanej próbce RNAP ω. Obrazowanie w trybie szerokiego pola, wzbudzenie 532 nm przy 1 mW, ekspozycja 50 ms. (B) Rozkład nieskorygowanych intensywności uśrednionych dla komórek dla próbek w (A), podany proporcjonalnie do całkowitej liczby komórek. Segmentacji poddano ponad 400 komórek z każdej próbki. Rysunek ten został zmodyfikowany w stosunku do numeru ^{referencyjnego 22}. (C) Internalizacja nieznakowanej polimerazy T7 RNA (T7 RNAP, 98 kDa) do elektrokompetentnego DH5α przenoszącego plazmid pRSET-EmGFP kodujący szmaragdowy GFP (EmGFP) pod kontrolą promotora T7. Po lewej: Schemat testu. Środek: nakładka fluorescencyjna. Po prawej: histogramy intensywności fluorescencji na bazie komórek dla próbki nieelektroporowanej (u góry) oraz komórek inkubowanych i elektroporowanych za pomocą T7 RNAP (u dołu); około 11% elektroporowanych ogniw wykazuje wysoką intensywność fluorescencji (frakcja komórek o średniej Int. > + 3x Std. Dev. próbki innej niż EP) wskazującej na ekspresję EmGFP. Gwiazdki oznaczają pojemniki zbierające wszystkie natężenia powyżej lub równe 1,100 a.u. Podziałka: 3 μm. Rysunek ten został zmodyfikowany w stosunku do numeru ^{referencyjnego 26}.

Rysunek 5C przedstawia inne zastosowanie elektroporacji białek. W tym przypadku elektroporowane białko jest nieznakowane, ale jego internalizacja wyzwala obserwowalną reakcję fluorescencyjną. Eksperyment ten weryfikuje obecność i funkcjonalność elektroporowanych białek w cytoplazmie komórki. Nieznakowana polimeraza RNA T7 (98 kDa) została zinternalizowana do szczepu E. coli DH5α zawierającego plazmid kodujący białko fluorescencyjne EmGFP pod kontrolą promotora T7²⁶. Ponieważ gen polimerazy T7 RNA jest nieobecny w DH5α, ekspresja EmGFP w naszych eksperymentach wymaga, aby funkcjonalna polimeraza T7 RNA została wprowadzona do komórek poprzez elektroporację (Figura 5C). Po elektroporacji z 1 pmol T7 RNAP, >11% komórek (niebieski pasek, ryc. 5C) wykazywało fluorescencję wyższą niż kontrola negatywna (inkubowane z tą samą ilością T7 RNAP, ale nie elektroporowane). Wynik ten stwierdza, że część cząsteczek T7 RNAP zinternalizowanych przez elektroporację zachowuje swoją integralność in vivo i może pełnić zamierzone funkcje w cytoplazmie komórki.

In vivo FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki i pojedynczej komórki

Na koniec, internalizacja i analiza podwójnie oznaczonych gatunków w żywych bakteriach jest przedstawiona na rysunku 6 i filmie uzupełniającym 3. Ponieważ fuzje białek fluorescencyjnych nie są idealne do badań in vivo smFRET, możliwość dostarczania podwójnie znakowanych biomolekuł do żywych komórek za pomocą elektroporacji jest jedną z największych zalet tej metody. Rysunek 6A przedstawia jednokomórkową analizę FRET bakterii obciążonych różnymi standardami DNA FRET (przy użyciu fluoroforów Cy3B i Atto647N jako pary FRET donor-akceptor). Komórki są elektropostowane 20 pmol trzech krótkich, podwójnie znakowanych wzorców dsDNA FRET z pozorną wydajnością FRET (E*) 0,17, 0,48 i 0,86 in vitro (wcześniej oznaczoną²⁶). Wszystkie DNA skutecznie wnikają do komórek (ryc. 6A, po lewej), a główny pik każdej dystrybucji E* pojedynczej komórki dobrze zgadza się z wynikami in vitro (ryc. 6A, po prawej). W próbkach o pośrednim i wysokim frecie obserwuje się populacje komórek o niższym E* niż oczekiwano, prawdopodobnie z powodu kombinacji bielenia akceptorowego i braku aktywności fotofizycznej, zmiennego obciążenia komórek (a więc zmiennego stosunku sygnału do szumu) i degradacji DNA.

Rycina 6: Reprezentatywne wyniki obserwacji pojedynczych komórek i jednocząsteczkowych FRET u żywych bakterii. Badania zespołowe i smFRET na pojedynczych bakteriach. (A) Analiza komórek obciążonych 20 pmol każdy z trzech wzorców DNA FRET wykazujących niski (~0,17), pośredni (~0,48) i wysoki (~0,86) FRET (mierzony za pomocą pomiarów pojedynczych cząsteczek in vitro; patrz REF 26). Po lewej: białe światło i zielono-czerwona (FRET) nakładka fluorescencyjna (podziałka skali: 3 μm). Przykłady wartości FRET z różnych komórek są wskazane (kolor biały). Po prawej (od góry do dołu): nieskorygowane histogramy FRET (E*) oparte na komórkach tylko dla dawcy (ciemnozielony), niski (jasnozielony), pośredni (żółty) i wysoki (czerwony) standard DNA FRET. (B–D) SmFRET in vivo. Komórki są załadowane 0,25 pmol pośrednim DNA FRET (panel B), 0,25 pmol wysoko-FRET DNA (panel C) i 5 pmol podwójnie znakowanym KF (panel D). Lewa kolumna: zielono-czerwona nakładka fluorescencyjna pojedynczej klatki przed i po fotowybielaniu akceptorowym. Środkowa kolumna: ślady czasowe odpowiadające cząsteczce w żółtym kółku. Sprawność FRET, intensywność emisji donorów i intensywności emisji akceptorów są wyświetlane odpowiednio na niebiesko, zielono i czerwono. Prawa kolumna: histogramy FRET cząsteczek tylko donorowych (zielony) i cząsteczek donor-akceptor (żółty, czerwony i szary) z 20 śladów czasowych dla każdej próbki. Podziałka liniowa: 3 μm dla A, 1 μm dla B–D. Rysunek ten został zmodyfikowany w stosunku do numeru ^{referencyjnego 26}. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby obserwować smFRET in vivo dla próbek DNA lub białek, małe ilości (0,25 pmol) pośrednich i wysokich standardów DNA FRET (Rysunek 6B, C) lub 5 pmol podwójnie znakowanych KF (fluorofory Alexa647/Cy3B jako para FRET, Rysunek 6D) są elektroporyzowane do E. coli. Takie stężenia doprowadziły do powstania wielu komórek załadowanych kilkoma (n = 1–10) znakowanymi cząsteczkami, co umożliwiło bezpośrednią lokalizację, śledzenie i monitorowanie FRET dla pojedynczych cząsteczek. Niektóre cząsteczki dyfundują swobodnie, podczas gdy inne wydają się nieruchome lub dyfundują powoli (film uzupełniający 3). Ślady czasowe unieruchomionych, podwójnie znakowanych biomolekuł (ryc. 6, środek) utrzymują się od 1 do 30 s i wykazują cechy charakterystyczne smFRET: antyskorelowane zmiany w fluorescencji dawcy i akceptora po bieleniu akceptora (na przykład t ~ 16 sekund; Rycina 6B, w środku), a następnie jednoetapowe wybielanie dawcy (na przykład t~; 19 sekund; Rysunek 6B). Rozkłady FRET wygenerowane z takich śladów czasowych (Rysunek 6, po prawej) dają średnią wartość, która jest doskonale zgodna z opublikowanymi badaniami in vitro ^26,31,32. Wyniki te wskazują na możliwość ilościowych badań smFRET na zinternalizowanych DNA i białkach oraz sugerują, że białka zachowują swoją integralność i strukturę po elektroporacji i internalizacji (co potwierdzają eksperymenty internalizacji T7 RNAP).

Film uzupełniający 1: Żywotność komórki. Po lewej: Obrazy w białym świetle. Po prawej: obrazy fluorescencyjne. Animowany GIF animowany przedstawiający podział po elektroporacji (1,8 kV/cm) bakterii obciążonych 10 pmol znakowanym DNA Atto647. Ogólny pozorny spadek fluorescencji jest spowodowany rozcieńczeniem znakowanego DNA po podziale komórki, a także częściowo fotowybielaniem, które występuje podczas każdego pomiaru.

>Film uzupełniający 2: Badania fotowybielania oparte na komórkach. A. Reprezentatywny przykład mocno obciążonej komórki (zawierającej >100 cząsteczek DNA znakowanych Atto647N). U góry po lewej, biały jasny obraz interesującej komórki (czerwony prostokąt). U góry po prawej, film z załadowanymi komórkami pokazujący ich zanik fluorescencji w ciągu kilku minut. Na dole, ślad czasowy całkowitego zaniku intensywności fluorescencji interesującej nas komórki. Fluorofory organiczne mogą wykazywać czas życia fotowybielania o 2 rzędy wielkości wyższy niż FP (tutaj ~41 sekund dla Atto647N). B. Reprezentatywny przykład komórki załadowanej mniej niż 10 znakowanymi cząsteczkami (w tym przypadku 3). U góry, tak samo jak panel A. U dołu, ślad czasowy ogólnej intensywności fluorescencji komórki będącej przedmiotem zainteresowania, pokazujący jednoetapowe wybielanie i/lub odpowiadające pojedynczym fluoroforom organicznym. Średnia wysokość tych stopni odpowiada jednostkowej intensywności pojedynczej cząsteczki (tutaj ~12 j.a.) używanej do oszacowania początkowej liczby zinternalizowanych cząsteczek na komórkę. Filmy w trybie ciągłego wzbudzenia czerwonym laserem o mocy 300 μW i 100 ms na klatkę.

Film uzupełniający 3: In vivo jednocząsteczkowy FRET. U góry: Komórki załadowane 0,25 pmol DNA o wysokiej zawartości FRET (jak na rysunku 6C) stale monitorowane z prędkością 50 ms na klatkę przy oświetleniu nTIRF przy użyciu zielonego lasera o mocy 1 mW (532 nm). Każda klatka jest zielono-czerwoną (FRET) nakładką fluorescencyjną każdego kanału. Można zaobserwować dyfundujące i nieruchome czerwone (nienaruszone) i zielone (pojedynczy znacznik aktywny) cząsteczki DNA. Dół: Ślad czasowy odpowiadający cząsteczce w żółtym kółku. Sprawność FRET, intensywność emisji donorów i intensywności emisji akceptorów są wyświetlane odpowiednio na niebiesko, zielono i czerwono. Antyskorelowane zdarzenie bielenia akceptora (przejścia z czerwieni do zieleni) odpowiada sygnaturze jednocząsteczkowego FRET.

Dyskusja

Wiele parametrów może być zmienianych podczas elektroporacji ogniw i pozyskiwania danych w zależności od systemu biologicznego będącego przedmiotem zainteresowania i dokładnego charakteru eksperymentu (analiza na poziomie komórki lub pojedynczej cząsteczki). Na przykład, podczas elektroporacji DNA do bakterii, 0,25 do 5 pmol znakowanych fragmentów dsDNA prowadzi do niskiej wydajności internalizacji, umożliwiając bezpośrednie wykrywanie pojedynczych cząsteczek (tj. bez konieczności wcześniejszego fotowybielania). Powyżej 5 pmol dsDNA komórki są zwykle mocno obciążone, co lepiej nadaje się do analizy pojedynczych komórek. Wszystkie znakowane DNA powinny być również uprzednio oczyszczone żelem w celu usunięcia wszelkich śladów wolnego barwnika (nieprzereagowanego fluoroforu) z roztworu podstawowego DNA. Poza tym potencjalne problemy z degradacją DNA, szczególnie w przypadku eksperymentów smFRET, można rozwiązać, stosując DNA z nienaturalnymi kwasami nukleinowymi lub motywami, które chronią końcówki dostępne dla egzonukleazy, takie jak pętle spinki do włosów.

Kolejnym regulowanym parametrem w elektroporacji jest natężenie pola przyłożone podczas elektroporacji. Niskie natężenie pola (~1 kV/cm) doprowadzi do niskiej wydajności obciążenia odpowiedniej dla badań pojedynczych cząsteczek. Wyższe natężenie pola (do 1,8 kV/cm) zwiększy wydajność obciążenia; jednak istnieje odwrotna korelacja między natężeniem pola a żywotnością ogniwa po elektroporacji (patrz rysunek 4). Dla porównania, normalne natężenie pola stosowane do elektroporacji bakterii i drożdży wynosi ~1,5 kV/cm. Stała czasowa, reprezentująca długość tego rozpadu, jest wygodnym parametrem do naśladowania, ponieważ stała czasowa spada, gdy tylko w kuwecie wystąpi jakiekolwiek zjawisko łukowe. Przy normalnych ustawieniach stała czasowa powinna być większa niż 4 ms; Niższe wartości doprowadzą do niskiej wydajności ładowania, a nawet do nieobciążonych uszkodzonych ogniw. Większość elektroporatorów oferuje inne stopnie swobody (takie jak "obcinanie impulsów" lub "kształt impulsu"), które można modyfikować w celu dostrojenia zarówno obciążenia ogniwa, jak i żywotności. Zastosowaliśmy tę metodę zarówno do bakterii, jak i drożdży, jednak podobne procedury powinny również umożliwić internalizację znakowanych biomolekuł w komórkach ssaków przy użyciu odpowiednich ustawień elektroporatora, ponieważ ich błona jest w rzeczywistości mniej złożona (pojedyncza dwuwarstwa lipidowa) i ponieważ elektroporacja była już stosowana w takich komórkach ²¹.

Podczas internalizacji znakowanych białek cały wolny barwnik musi zostać usunięty ze znakowanego roztworu podstawowego białka przed elektroporacją. Wolne cząsteczki barwnika, ze względu na swój mniejszy rozmiar, mogą być internalizowane preferencyjnie w stosunku do białek będących przedmiotem zainteresowania i są trudne do odróżnienia podczas analizy danych (pomimo ich oczekiwanej szybszej dyfuzji). Orientacyjnie, aby próbka białka znakowanego organicznie nadawała się do elektroporacji, ilość pozostałego wolnego barwnika powinna wynosić poniżej 2% (wykryta za pomocą skanowania fluorescencyjnego SDS-PAGE)²². Proces ten jest szczególnie ważny, ponieważ niektóre cząsteczki mogą przyklejać się do zewnętrznych błon elektroporowanych bakterii lub drożdży. W związku z tym ujemna próbka kontrolna powinna wykazywać intensywność fluorescencji na komórkę wyraźnie niższą niż w przypadku komórek poddanych elektroporacji, najlepiej tak niską, jak poziom autofluorescencji pustych komórek (komórek, które nie były inkubowane z żadnymi biomolekułami znakowanymi fluorescencyjnie ani elektroporowane, rysunek 2).

Podobnie jak w przypadku dsDNA, skuteczność internalizacji znakowanych białek jest związana z ilością biomolekuł dodanych do komórek przed elektroporacją. Jednak inne parametry, takie jak rozmiar i ładunek, odgrywają rolę w internalizacji. Małe białka wykazują wysoką wydajność internalizacji, podczas gdy większe białka (do 98 kDa) mogą być z powodzeniem internalizowane, ale z niższą wydajnością (ryc. 5)²⁶. Izoloelektryczny punkt białka, potencjalne interakcje z błoną komórkową i inne parametry fizykochemiczne również wpływają na obciążenie komórki podczas elektroporacji. W rezultacie, użytkownicy muszą zoptymalizować eksperymenty dla własnego systemu, wiedząc, że wysokie początkowe stężenie znakowanego białka (>50 μM) da największą szansę na pomyślne załadowanie. Elektroporacja oferuje również nowe narzędzie do zaburzania i analizowania funkcji komórkowych poprzez wprowadzanie białek i innych biomolekuł do komórek (znakowanych lub nieznakowanych). Eksperymenty z polimerazą RNA T7 (ryc. 5C) stanowią taki przykład eksperymentu, w którym możemy wprowadzić biomolekułę, która może zmienić ekspresję genów in vivo za pomocą elektroporacji.

Podczas wykonywania eksperymentów z fluorescencją pojedynczych cząsteczek, oświetlenie TIR jest zwykle preferowane w stosunku do innych trybów oświetlenia, ponieważ oferuje najlepszy stosunek sygnału do szumu poprzez wzbudzanie tylko fluoroforów w cienkim odcinku nad powierzchnią szkiełka nakrywkowego (~100 nm). Jednak obrazowanie znakowanych biomolekuł dyfundujących wewnątrz żywych mikroorganizmów może wymagać głębszego oświetlenia (do 0,8 μm w przypadku E. coli). Głębsze oświetlenie uzyskuje się w trybie HILO, przy jednoczesnym zachowaniu wysokiego stosunku sygnału do szumu. Z drugiej strony, obrazowanie szerokokątne jest szczególnie ważne w krokowej analizie fotowybielania, w której użytkownik szacuje liczbę zinternalizowanych cząsteczek poprzez fotowybielanie całej załadowanej komórki za pomocą dużej mocy lasera i podzielenie początkowej intensywności fluorescencji komórki przez jednostkową intensywność wytwarzaną przez pojedynczą cząsteczkę (pojedynczy etap fotowybielania, rysunek 3). Obrazowanie szerokokątne jest również wymagane do długoterminowego śledzenia cząsteczek w celu zlokalizowania dyfuzyjnych cząsteczek będących przedmiotem zainteresowania, nawet jeśli ich trajektorie obejmują całą objętość komórki.

W tym protokole przedstawiamy, w jaki sposób elektroporacja, standardowa technika dostarczania kwasów nukleinowych do komórek stosowana przez biologów i biochemików, stanowi prostą metodę dostarczania fluorescencyjnych biomolekuł w różnych typach komórek. Ta nowatorska, wysokoprzepustowa technika oferuje unikalne narzędzie do obserwacji znakowanych cząsteczek w ich naturalnym środowisku. Oprócz biomolekuł znakowanych fluoroforami obejmującymi szeroki zakres długości fal, elektroporacja może dostarczać cząsteczki zmodyfikowane wieloma grupami chemicznymi, takimi jak nienaturalne nukleotydy i aminokwasy, chelatory metali, środki sieciujące i grupy klatkowe. Jeśli interesujący nas system biologiczny nie jest niezbędny do rozwoju komórki, gen kodujący białko docelowe może również zostać usunięty (lub powalony), zapewniając, że białka obserwowane po internalizacji reprezentują całość (lub większość) wewnątrzkomórkowej puli białkowej. Zasadniczo elektroporacja może "przeszczepić" elastyczność biokoniugatów in vitro do żywych komórek, a tym samym przynieść korzyści wysiłkom w dziedzinie biologii syntetycznej, biologii systemowej i wykrywania pojedynczych cząsteczek in vivo .

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ElectroMax DH5-alfa Comptent ogniwa	Invitrogen	11319-019	lub inne komercyjne lub laboratoryjne bakterie elektrokompetentne lub drożdże.
EZ Rich Defined Madia	Teknova	M2105	niskofluorescencyjny
aparat do elektroporacji MicroPulser rich media	Biorad	165-2100	lub dowolny klasyczny elektroporator do transformacji mikroorganizmów
Certyfikowany Biologia Molekularna agaroza	Biorad	161-3100	agaroza niskofluorescencyjna do podkładki agarozowej
Szkiełka nakrywkowe mikroskopowe nr 1,5 grubości	Menzel	BB024060SC	usuwa cząstki tła poprzez podgrzewanie szkiełek w piecu w temperaturze 500 &; C for 1h
Jednocząsteczkowy mikroskop fluorescencyjny	Zbudowany		w domu opisany w REFs
Oprogramowanie lokalizacyjne	Specjalnie napisany, dostępny online		pakiet oprogramowania MATLAB i C++, który można dostosować do analizy lokalizacji.
Oprogramowanie śledzące	Dostępne online		wdrożenie MATLAB przez Blair i Dufresne.