Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykrywanie i analiza uszkodzeń DNA w mięśniach szkieletowych myszy in situ metodą TUNEL

16K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52211

⸱

16 grudnia 2014

 , 
1Division of Neuropathology, Department of Pathology, Pathobiology Graduate Program, Johns Hopkins School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Ten film opisuje preparację, przetwarzanie tkanek, cięcie i fluorescencyjne znakowanie TUNEL mięśni szkieletowych myszy. Opisano w nim również metodę półautomatycznej analizy etykietowania TUNEL.

Streszczenie

Końcowe znakowanie końca deoksynukleotydylotransferazy (TdT) deoksyurydynotrifosforanu (dUTP) (TUNEL) to metoda użycia enzymu TdT do kowalencyjnego dołączania oznakowanej formy dUTP do 3' końców dwu- i jednoniciowych pęknięć DNA w komórkach. Jest to niezawodna i użyteczna metoda wykrywania uszkodzeń DNA i śmierci komórek in situ. Ten film opisuje preparację, przetwarzanie tkanek, cięcie i fluorescencyjne znakowanie TUNEL mięśni szkieletowych myszy. Opisano w nim również metodę półautomatycznego oznaczania ilościowego sygnału TUNEL. Wrodzone normalne cechy tkanek i warunki przetwarzania tkanek wpływają na zdolność enzymu TdT do skutecznego znakowania DNA. Przetwarzanie tkanek może również dodać niepożądaną autofluorescencję, która będzie zakłócać wykrywanie sygnału TUNEL. Dlatego ważne jest, aby empirycznie określić metody przetwarzania tkanek i znakowania TUNEL, które zapewnią optymalny stosunek sygnału do szumu do późniejszej oceny ilościowej. Opisany tutaj test oparty na fluorescencji umożliwia wykluczenie sygnału autofluorescencyjnego przez odejmowanie kanałów cyfrowych. Test TUNEL, stosowany z odpowiednimi technikami przetwarzania tkanek i kontrolami, jest stosunkowo szybką, powtarzalną, ilościową metodą wykrywania apoptozy w tkankach. Może być stosowany do potwierdzania uszkodzeń DNA i apoptozy jako mechanizmów patologicznych, do identyfikacji dotkniętych typów komórek oraz do oceny skuteczności leczenia in vivo.

Wprowadzenie

Końcowe znakowanie końca deoksynukleotydylu (TdT) dUTP (TUNEL) to proces polegający na użyciu enzymu TdT do przyłączania dUTP do 3' końców dwu- i jednoniciowych pęknięć DNA12,23. Metoda TUNEL do wykrywania apoptozy i uszkodzeń DNA została po raz pierwszy opisana ponad 20 lat temu przez Gavrieli i wsp.1,12,24. Od tego czasu został oceniony i zoptymalizowany w różnych preparatach tkankowych7,23,27,40. TUNEL został wykorzystany do badania indukowanej niedokrwieniem śmierci komórek neuronów6,14,29 i kardiomiocytów43,44, ekscytotoksycznej śmierci komórek neuronalnych30,31 oraz jako biomarker w leczeniu zapalenia stawów39. Jest również stosowany jako czynnik prognostyczny i marker komórek nowotworowych w różnych nowotworach u ludzi2,3,15,32,37,38,42.

Istnieją alternatywne metody wykrywania uszkodzeń DNA i śmierci komórek, ale mają one techniczne wyzwania i zastrzeżenia. Southern blot może być stosowany do ilościowego określania uszkodzeń DNA w całych tkankach lizatów7,9-11, ale ta metoda nie zapewnia rozdzielczości na poziomie komórkowym i jest trudna do ilościowego określenia. Test kometarny jest alternatywną metodą opartą na komórkach, która wymaga ekstrakcji zachowanych jąder z komórek4,20,28,36. Chociaż test kometarny działa dobrze na hodowanych izolowanych komórkach, znacznie trudniej jest przygotować nienaruszone jądra z tkanki mięśni szkieletowych8,21. Podobnie jak w przypadku Southern blot, test komety nie dostarcza informacji specyficznych dla typu komórki z homogenatu całej tkanki mięśniowej. Inną alternatywą dla metody TUNEL jest immunohistochemia z wykorzystaniem przeciwciał przeciwko jednoniciowemu DNA25,33,41 lub przeciwko białkom uczestniczącym w odpowiedzi na uszkodzenie DNA i szlakach śmierci komórki (np. p53, H2AX i kaspazy)13,17,22,40. Takie metody oparte na przeciwciałach wymagają dokładnej charakterystyki przeciwciał i doskonałej swoistości przeciwciał, aby uzyskać wysoki stosunek sygnału do tła. Nawet jeśli istnieją specyficzne przeciwciała, mogą one wymagać denaturacji białka docelowego poprzez procedury pobierania antygenu34,35. Jak omówimy tutaj, pobieranie antygenu w tkance mięśniowej powoduje niedopuszczalnie wysoką autofluorescencję. W przeciwieństwie do metod alternatywnych, TUNEL osiąga wykrywanie uszkodzeń DNA z wysokim sygnałem i niskim tłem, doskonałą specyficznością, którą można testować za pomocą prostych kontroli pozytywnych i negatywnych, dobrą penetracją tkanek, która nie wymaga pobierania antygenu, oraz rozdzielczością na poziomie komórkowym. Ponadto metoda TUNEL trwa około 4 godzin, podczas gdy metody alternatywne zazwyczaj wymagają inkubacji przez noc.

Badamy śmierć komórek mięśni szkieletowych w mysim modelu rdzeniowego zaniku mięśni (SMA)10, który został wygenerowany przez Hsieh-Li i współpracowników16. Aby określić ilościowo komórki apoptotyczne w mięśniach, opracowaliśmy metodę przygotowania, barwienia i oznaczania ilościowego tkanek, która działa solidnie w różnych grupach mięśni szkieletowych w różnych punktach rozwojowych u myszy. Korzystamy z dostępnego na rynku zestawu do etykietowania TUNEL oraz dostępnego na rynku oprogramowania do analizy obrazu. Z powodzeniem zastosowaliśmy również test TUNEL w połączeniu z barwieniem immunofluorescencyjnym w rdzeniu kręgowym10.

Opisane tutaj metody są przydatne dla badaczy, którzy chcą ocenić patologię tkanek, mechanizmy choroby, mechanizmy starzenia się oraz rozwojową (przed- i pourodzeniową) śmierć komórek w mięśniach szkieletowych. Technika TUNEL jest szczególnie przydatna w badaniach nad uszkodzeniem i naprawą DNA oraz śmiercią komórki w systemach modelowych, w których dotyczy to tylko podzbioru komórek i konieczna jest rozdzielczość na poziomie komórkowym.

Ten film opisuje sekcję, przetwarzanie tkanek, cięcie i fluorescencyjne znakowanie TUNEL mięśni szkieletowych myszy. Opisano w nim również metodę półautomatycznego oznaczania ilościowego sygnału TUNEL.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Wszystkie procedury na zwierzętach opisane w tym protokole zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych National Institutes of Health26. Protokół (MO13M391) został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa.

1. Ofiara, sekcja i fiksacja noworodków myszy

  1. Złożyć w ofierze nowonarodzoną mysz przez wdychanie CO2 .
  2. Natychmiast odetnij tylną kończynę powyżej kolana. Do około 7 dnia po urodzeniu kości nóg są wystarczająco miękkie, aby przeciąć je dużymi nożyczkami laboratoryjnymi lub ostrym ostrzem, a następnie przeciąć na kriostacie.
  3. Umieść tylną kończynę w 10 ml lodowatego 4% paraformaldehydu w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w probówce o pojemności 15 ml.
  4. Zanurzenie tylnej kończyny w paraformaldehydzie na 4-24 godziny w temperaturze 4 °C. Tkanka embrionalna wymaga tylko kilku godzin utrwalenia.
    1. Unikaj fiksacji dłuższej niż 24 godziny, ponieważ może to zmniejszyć skuteczność testu TUNEL.
  5. Krioprotekcjonalna kończyna tylna poprzez zanurzenie jej w roztworze sacharozy.
    1. Zamień paraformaldehyd na 10% sacharozy w PBS w tej samej probówce o pojemności 15 ml, inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    2. Zmienić na 30% sacharozy w PBS, inkubować przez noc w temperaturze 4 °C lub do momentu, gdy tylna kończyna opadnie na dno probówki. Tkanka może być pozostawiona w 30% sacharozie przez dłuższy czas, pod warunkiem, że sacharoza została sterylnie przefiltrowana.

2. Osadzanie tkanek

  1. Napełnij oznaczoną formę do zatapiania do połowy środkiem do zatapiania.
  2. Umieść tylną kończynę na podłożu do zatapiania, stroną ciętą jak najbliżej jednej ścianki formy. Zaznacz orientację tylnej kończyny na zewnątrz formy.
    1. Osadź kilka tylnych kończyn i wytnij w tym samym bloku. Jednak ważne jest, aby upewnić się, że wszystkie tylne kończyny w bloku są zorientowane równolegle do siebie, aby uzyskać odcinki na pasujących poziomach wzdłuż osi kończyny.
  3. Przykryj tylne kończyny podłożem do zatapiania. Jeśli tylne kończyny przesuwają się podczas nalewania pożywki, zmień ich orientację za pomocą kleszczy z końcówkami lub wykałaczki.
  4. Pozwól, aby podłoże osadzające przeniknęło do tkanki w temperaturze pokojowej przez co najmniej 15 minut.
  5. Umieść foremki bezpośrednio na suchym lodzie lub w izopentanie na suchym lodzie, aby zamrozić medium do zatapiania. Upewnij się, że formy są zawsze wypoziomowane i unikaj przesuwania się osadzonej tkanki.
  6. Zamrożone foremki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu przygotowania do krojenia, przez okres do kilku miesięcy.

3. Kriosekcja osadzonych kończyn

  1. Ustaw temperaturę komory kriostatu na -20 °C, temperaturę obiektu na -18 °C; w razie potrzeby zmniejsz temperaturę obiektu.
  2. Utrzymuj równowagę bloku tkankowego w komorze kriostatu przez co najmniej 30 minut. Prawidłowa temperatura bloku ma kluczowe znaczenie dla jakości sekcji.
  3. Ciąć przekroje poprzeczne o grubości 10 μm lub mniejszej. Grubsze odcinki nie zostaną w pełni przeniknięte przez odczynniki TUNEL. Użyj płyty zapobiegającej przechylaniu się, ostrzy i kąta nachylenia ostrza (zwykle 5°) zalecanego dla kriostatu.
  4. Zebrać skrawki na szkiełka pokryte żelatyną lub wektabondem w temperaturze pokojowej. Natychmiast umieścić w pudełku na suwak na suchym lodzie. Pudełko ze szkiełkami należy przechowywać w osobnym pojemniku z suchym lodem umieszczonym w pobliżu kriostatu w zasięgu ręki.
    1. Przetnij poprzeczne odcinki szeregowe przez długą oś kończyny, pomijając 100-200 μm. Zbierz co najmniej 3 sąsiednie sekcje na każdym poziomie szeregowym.

4. Test TUNEL na odcinkach kończyn tylnych przy użyciu dostępnego na rynku zestawu (wszystkie kroki w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej)

  1. Rozmrozić zjeżdżalnie z sekcjami do temperatury pokojowej i wysuszyć przez noc lub w weekend.
  2. Nawadniaj sekcje, zanurzając szkiełka w PBS na 2 x 10 minut w słoiku Coplin. Osuszyć chusteczką laboratoryjną, usuwając jak najwięcej płynu wokół sekcji.
  3. Sekcje przepuszczalności
    1. Użyj komercyjnego odczynnika na bazie saponiny lub 0,5% Tween20 i 0,05% Triton X100 w PBS.
    2. Umieść szkiełko w komorze wilgotnościowej. Prosta komora wilgotnościowa to puste pudełko na końcówki do pipet ze szczelną pokrywą, z dodatkiem wystarczającej ilości wody, aby przykryć dno pudełka.
    3. Odpipetować odczynnik w ilości wystarczającej do pokrycia przekroju (50 μl wystarcza na kończyny nowonarodzonych myszy). Nie pipetować bezpośrednio na sekcję, ponieważ powtarzające się mieszanie może spowodować oderwanie się sekcji od szkiełka.
    4. Za pomocą kleszczy z końcówkami umieść mały prostokąt parafilmu na górze sekcji, aby rozprowadzić kroplę odczynnika i całkowicie zakryć sekcję. Jeśli pod parafilmem utworzą się bąbelki, delikatnie go zdejmij, wysusz i ponownie nałóż.
    5. Inkubować szkiełka z odczynnikiem do przepuszczalności przez 1 godzinę w zakrytej komorze wilgotnościowej. Jeśli sekcje zaczną odrywać się od zjeżdżalni, czas przepuszczalności może zostać skrócony do 30 minut.
    6. Umyj szkiełka w PBS w słoiku Coplin 2 x 5 min. Prostokąty parafilmu powinny unosić się do góry, a następnie można je usunąć i wyrzucić.
    7. Za pomocą chusteczki laboratoryjnej osusz jak najwięcej płynu wokół sekcji.
  4. Znakowanie pęknięć DNA za pośrednictwem TdT
    1. Postępuj zgodnie z instrukcjami zestawu, aby zrobić 1x bufor do etykietowania TdT, odpipetować wystarczającą ilość buforu do etykietowania na szkiełku, aby pokryć przekrój tkanki (50 μl jest wystarczające dla kończyn noworodków myszy). Inkubować w komorze wilgotnościowej przez 5 minut. Alternatywnie, zanurz szkiełko w buforze do etykietowania TdT w słoiku z koplinem.
    2. Postępuj zgodnie z instrukcjami zestawu, aby przygotować mieszankę do etykietowania TdT. Zestaw zawiera kationy kobaltu, magnezu i manganu; Kation manganu działa dobrze na różne tkanki, w tym mięśnie szkieletowe, tkanki układu nerwowego, wątrobę, skórę i kości.
    3. W celu uzyskania kontroli dodatniej dodać DNazę (oznaczoną jako "nukleaza" w zestawie) do mieszaniny znakującej TdT. Alternatywnie, należy wstępnie potraktować sekcję kontroli dodatniej DNazą w buforze nukleazy przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, zgodnie z instrukcją zestawu. Trzymaj roztwór DNazy i sekcje poddane działaniu DNazy z dala od innych sekcji eksperymentalnych, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.
    4. W przypadku kontroli ujemnej należy pominąć enzym TdT w mieszaninie znakującej.
    5. Użyj chusteczki laboratoryjnej, aby usunąć jak najwięcej bufora etykietowania TdT ze szkiełka. Odpipetować mieszaninę do etykietowania TdT na szkiełku (50 μl na sekcję), przykryć nowym prostokątem parafilmu i inkubować w komorze wilgotnościowej w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    6. Postępuj zgodnie z instrukcjami zestawu, aby utworzyć bufor 1x stop. Użyj chusteczki laboratoryjnej, aby usunąć mieszaninę do znakowania TdT ze szkiełka i dodaj 200-300 μl buforu zatrzymującego, aby pokryć przekrój tkanki i inkubować w komorze wilgotnościowej przez 5 minut. Alternatywnie, zanurz szkiełko w buforze zatrzymującym w słoiku Coplin.
    7. Umyj szkiełko 2 x 2 minuty w PBS. Użyj chusteczki laboratoryjnej, aby usunąć jak najwięcej PBS ze szkiełka.
  5. Etykietowanie fluorescencyjne
    1. Postępuj zgodnie z instrukcjami zestawu, aby przygotować roztwór do znakowania fluoresceiny do znakowania dNTP w przerwach DNA. Odpipetować roztwór na szkiełko podstawowe (50 μl na sekcję), przykryć nowym prostokątem parafilmu i inkubować w komorze wilgotnościowej przez 20 minut.
    2. Myj szkiełko przez 2 minuty w PBS w słoiku Coplin. Użyj chusteczki laboratoryjnej, aby usunąć jak najwięcej PBS ze szkiełka.
    3. Rozcieńczyć barwnik jądrowy Hoechst 33258 do 1 μg/ml w PBS i odpipetować na szkiełko (100-200 μl wystarcza do pokrycia przekroju). Inkubować w komorze wilgotnościowej przez 5 minut.
    4. Prać 3x przez 5 min w PBS.
    5. Szkiełko nakrywkowe z fluorescencyjnymi środkami montażowymi zapobiegającymi blaknięciu i krawędziami uszczelniającymi z lakierem do paznokci.

5. Akwizycja obrazu cyfrowego

  1. Uzyskuj obrazy za pomocą konwencjonalnego mikroskopu fluorescencyjnego z filtrami DAPI, FITC i Texas Red (lub ich odpowiednikami). Użyj obiektywu o większym powiększeniu (20X lub 40X), aby sprawdzić, czy znakowanie się powiodło, a jądra (nienaruszone lub fragmentaryczne) zostały oznaczone. Obiektyw 10X jest wystarczający do ilościowego określenia punktacji TUNEL-dodatniej.
  2. Zbierz obrazy barwienia Hoechsta, barwienia TUNEL i sygnału autofluorescencyjnego jako trzy oddzielne kanały sztucznych barw połączone na jednym obrazie. Jeśli etykieta fluoroforowa TUNEL jest zielona, zobrazuj sygnał autofluorescencyjny w czerwonym filtrze i odwrotnie.
    1. Zachowaj równoważność wszystkich ustawień obrazowania między szkiełkami w celu późniejszego progowania i oceny ilościowej. Dla każdego filtra zaprogramuj i zapisz czasy ekspozycji, wzmocnienie i binning (brak binningu jest najlepszy); Nie używaj automatycznych ustawień ekspozycji ani wzmocnienia.
    2. Użyj metody prób i błędów, aby znaleźć ustawienia ekspozycji i wzmocnienia, które najlepiej uchwycą zakres intensywności na wszystkich zabarwionych slajdach. Upewnij się, że na uzyskanych obrazach nie ma nasyconych pikseli, ponieważ spowoduje to odchylenie w ocenie ilościowej.
  3. Rób zdjęcia całej grupy mięśni, która Cię interesuje. Może to wymagać "zszycia" ze sobą wielu obrazów.

6. Analiza obrazu

  1. Korzystaj z dostępnych na rynku programów do analizy obrazu, aby analizować cyfrowe obrazy barwienia TUNEL. Analiza przy użyciu komercyjnego oprogramowania jest pokazana tutaj. Alternatywnie, do analizy barwienia TUNEL można użyć bezpłatnego oprogramowania ImageJ firmy NIH.
  2. Zabarwić przekrój przylegający do odcinka wybarwionego TUNEL hematoksyliną i eozyną (H&E) i wykonać pełny obraz cyfrowy przekroju za pomocą konwencjonalnego mikroskopu jasnego pola. Użyj tego obrazu H&E w połączeniu z atlasem anatomicznym5,18,19, aby prześledzić struktury anatomiczne, które mają zostać określone ilościowo.
  3. Przy wyłączonym kanale TUNEL ręcznie prześledź kontur obszaru, który ma być określony ilościowo, korzystając z kanałów Hoechsta i autofluorescencji jako wskazówek. Przekształć obrysowany obszar w maskę (zestaw wybranych współrzędnych pikseli, które mają być analizowane).
  4. Włącz kanał TUNEL. Korzystając z funkcji progowania intensywności w programie do analizy obrazu, ustaw dolny próg, aby wykluczyć cały sygnał autofluorescencji.
  5. Zastosuj te same ustawienia progowe do wszystkich obrazów w zestawie do nauki. Konwertowanie zaznaczeń z progami na maski.
  6. Dla każdego obrazu połącz maskę obszaru mięśniowego i maskę TUNEL. Nowa maska kombinowana będzie reprezentować sygnał TUNEL tylko w obrębie śledzonego obszaru mięśniowego.
  7. Wykonaj kwantyfikację maski na masce złożonej, aby określić liczbę obiektów i obszar obiektu sygnału TUNEL w śledzonym obszarze mięśniowym. W tym celu należy użyć funkcji Particle Analyzer (Analizator cząstek) w programie ImageJ.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W przypadku poprawnego barwienia sygnał TUNEL-dodatni powinien być wystarczająco jasny, aby można było go oddzielić od autofluorescencji poprzez ustawienie progów intensywności. Obiekty TUNEL-dodatnie przy małym powiększeniu mogą wyglądać jak jasne, nieregularne fragmenty w mięśniach szkieletowych (Rysunek 1A). Jednak przy większym powiększeniu, w przypadku gdy mechanizmem śmierci komórkowej jest apoptoza, powinny być widoczne niektóre obiekty TUNEL-dodatnie o klasycznej morfologii apoptotycznej (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisano metodę wykrywania i ilościowej analizy apoptozy związanej z uszkodzeniem DNA w mięśniach szkieletowych myszy. Procedura obejmuje pobranie tkanek, barwienie TUNEL, cyfrową akwizycję obrazu i analizę obrazu. Potrzebne są zwykłe materiały i narzędzia histologiczne, a także specjalny komercyjny zestaw TUNEL. Niezbędnymi elementami wyposażenia są kriostat, mikroskop epifluorescencyjny z funkcją cyfrowego obrazowania oraz system komputerowy do analizy obrazu.

Eksperymentator powinien zdawać ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez grant NIH-NINDS RO1-NS065895 oraz grant NIH-NINDS 5-F31-NS076250-02.

Dziękujemy JHU SOM Microscope Facility za korzystanie z kriostatu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4% paraformaldehyd w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanamiMikroskopia elektronowa Nauki19202Do opisanych tutaj procedur 4% roztwór przygotowano świeżo z proszku. Można stosować paraformaldehyd od dowolnego dostawcy. Przygotowany roztwór formaldehydu należy przechowywać w temperaturze 4 & deg; C i nie należy go stosować po upływie terminu ważności (do kilku miesięcy). Paraformaldehyd jest czynnikiem rakotwórczym i toksyną powodowaną przez drogi oddechowe i kontakt ze skórą. Należy przestrzegać środków ostrożności określonych w karcie charakterystyki podczas obchodzenia się z paraformaldehydem.
SacharozaSigmaS0389Służy do krioochrony tkanek przed zamrożeniem. Można użyć sacharozy od dowolnego dostawcy.
Związek O.C.T.Tissue-Tek4583Podłoże do zatapiania do kriosekcji.
KriostatLeicaCM 3050SDo opisywanych tutaj preparatów użyto kriostatu Leica CM3050S. dowolny kriostat zdolny do cięcia 10 μ Można stosować przekroje m.
Można stosować szkiełka szklane, 25 x 75 x 1 mmFisher12-552-3Można stosować prowadnice od dowolnego dostawcy.
ŻelatynaSigmaG-9391Żelatyna służy do wspomagania przylegania przekroju tkanki do szkiełek podstawowych. Aby pokryć szkiełka żelatyną, rozpuść 2,75 g żelatyny i 0,275 g ałunu chromowego w 500 ml wody destylowanej, podgrzanej do temperatury 60 °; C, zanurz szkiełka na kilka sekund i pozostaw do wyschnięcia. Można użyć żelatyny od dowolnego dostawcy. Alternatywnie można zakupić szkiełka z żelatyną.
Dwunastowodny siarczan potasu chromu(III) (ałun chromowy)Ałun chromowy243361chromowy dodaje się do roztworu żelatyny w celu zwiększenia przyczepności tkanek na szkiełkach podstawowych. Jest to potencjalny czynnik rakotwórczy i toksyna powodowana przez drogi oddechowe i kontakt ze skórą. Należy przestrzegać środków ostrożności określonych w karcie charakterystyki podczas obchodzenia się z ałunem chromowym.
Odczynnik do adhezji tkanek VectabondVector LabsSP-1800Opcjonalne podłoże dla lepszej przyczepności tkanek do szkiełek podstawowych; zamiast tego można zastosować szkiełka powlekane żelatyną.
Tween20SigmaP9416Detergent stosowany do przepuszczalności tkanek. Można użyć Tween20 od dowolnego dostawcy.
Triton X100SigmaT8787Detergent służący do przepuszczalności tkanek. Można stosować Triton X100 od dowolnego dostawcy.
TACS 2 TdT fluoresceina in situ zestaw do wykrywania apoptozyTrevigen4812-30-KKomercyjny zestaw do znakowania TUNEL na bazie fluorescencji.
DNaza/nukleazaTrevigen4812-30-K(w zestawie)
Bufor DNazy/nukleazyTrevigen4812-30-K(w zestawie)
10x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), pH 7,4Amresco780Przygotuj 1x PBS do płukania i rozcieńczania. Można stosować PBS od dowolnego dostawcy.
Woda wolna od DNazQuality Biologicals351-029-131Można używać wody od dowolnego dostawcy.
Hoechst 33258Sigma94403Barwnik jądrowy. Można użyć dowolnego niebieskiego fluorescencyjnego barwnika jądrowego. Jako barwnik wiążący DNA, Hoechst jest podejrzewany o działanie rakotwórcze i powinien być traktowany przy użyciu sprzętu ochronnego, aby zminimalizować kontakt ze skórą.
ParafilmM multiple807Można stosować dowolną inną folię hydrofobową lub szkiełko nakrywkowe. Dostępne od wielu dostawców.
Mikroskop fluorescencyjny z kamerą cyfrową -- --Można użyć dowolnego mikroskopu fluorescencyjnego zdolnego do cyfrowego rejestrowania fluorescencji czerwonej, zielonej i niebieskiej w oddzielnych kanałach.
Można stosować media przeciwblaknięcia VectashieldVector LabsH-1000Antifade od dowolnego dostawcy.
szkiełka nakrywkowe szklane o grubości nr 1Brain Research Labs2222-1Można stosować szkiełka nakrywkowe od dowolnego dostawcy. Najmniejszy rozmiar 22 x 22 mm jest wystarczający dla sekcji nóg noworodków myszy.
Lakier do paznokciTed Pella114-8Służy do uszczelniania szkiełek nakrywkowych. Można używać lakieru do paznokci od dowolnego dostawcy (w tym stałych sprzedawców). Unikaj używania lakieru do paznokci z kolorem lub dodatkami, które mogą odbijać światło podczas obrazowania fluorescencyjnego.

Bibliografia

  1. Ansari, B., Coates, P. J., Greenstein, B. D., Hall, P. A. In situ end-labelling detects DNA strand breaks in apoptosis and other physiological and pathological states. 170 (1), 1-8 (1993).
  2. Ben-Izhak, O., Laster, Z., Akrish, S., Cohen, G., Nagler, R. M. TUNEL as a tumor marker of tongue cancer. Anticancer Res. 28 (5B), 2981-2986 (2008).
  3. Colecchia, M., et al. Detection of apoptosis by the TUNEL technique in clinically localised prostatic cancer before and after combined endocrine therapy. 50 (5), 384-388 (1997).
  4. Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol. Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
  5. Delaurier, A., et al. The Mouse Limb Anatomy Atlas: an interactive 3D tool for studying embryonic limb patterning. 8, 83(2008).
  6. Torres, C., Munell, F., Ferrer, I., Reventos, J., Macaya, A. Identification of necrotic cell death by the TUNEL assay in the hypoxic-ischemic neonatal rat brain. Neurosci. Lett. 230 (1), 1-4 (1997).
  7. Didenko, V. V. In Situ Detection of DNA Damage : Methods and Protocols. , Humana Press. 978-970 (2002).
  8. Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L. Isolation of skeletal muscle nuclei. J. Cell Biol. 27 (2), 365-378 (1965).
  9. Facchinetti, A., Tessarollo, L., Mazzocchi, M., Kingston, R., Collavo, D., Biasi, G. An improved method for the detection of DNA fragmentation. J. Immunol. Methods. 136 (1), 125-131 (1991).
  10. Fayzullina, S., Martin, L. J. Skeletal muscle DNA damage precedes spinal motor neuron DNA damage in a mouse model of spinal muscular atrophy (SMA). PLoS.One. 9 (3), e93329(2014).
  11. Ferrer, I., et al. Naturally occurring cell death in the developing cerebral cortex of the rat. Evidence of apoptosis-associated internucleosomal DNA fragmentation. Neurosci. Lett. 182 (1), 77-79 (1994).
  12. Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J. Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).
  13. Gown, A. M., Willingham, M. C. Improved detection of apoptotic cells in archival paraffin sections: immunohistochemistry using antibodies to cleaved caspase 3. J. Histochem. Cytochem. 50 (4), 449-454 (2002).
  14. Hara, A., et al. Neuronal apoptosis studied by a sequential TUNEL technique: a method for tract-tracing. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4 (2), 140-146 (1999).
  15. Harn, H. J., et al. Apoptosis occurs more frequently in intraductal carcinoma than in infiltrating duct carcinoma of human breast cancer and correlates with altered p53 expression: detected by terminal-deoxynucleotidyl-transferase-mediated dUTP-FITC nick end labelling (TUNEL). Histopathology. 31 (6), 534-539 (1997).
  16. Hsieh-Li, H. M., et al. A mouse model for spinal muscular atrophy. Nat. Genet. 24 (1), 66-70 (2000).
  17. Huerta, S., Goulet, E. J., Huerta-Yepez, S., Livingston, E. H. Screening and detection of apoptosis. J. Surg. Res. 139 (1), 143-156 (2007).
  18. Iwaki, T., Yamashita, H., Hayakawa, T. A color atlas of sectional anatomy of the mouse. 1, 1st edn, Braintree Scientific. Japan. (2001).
  19. Kaufman, M. H. The atlas of mouse development. , 1st edn, Academic Press. London. (1992).
  20. Koppen, G., Angelis, K. J. Repair of X-ray induced DNA damage measured by the comet assay in roots of Vicia faba. Environ. Mol. Mutagen. 32 (2), 281-285 (1998).
  21. Kuehl, L. Isolation of skeletal muscle nuclei. Methods Cell Biol. 15, 79-88 (1977).
  22. Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
  23. Labat-Moleur, F., et al. TUNEL apoptotic cell detection in tissue sections: critical evaluation and improvement. J. Histochem. Cytochem. 46 (3), 327-334 (1998).
  24. Modak, S. P., Bollum, F. J. Detection and measurement of single-strand breaks in nuclear DNA in fixed lens sections. Exp. Cell Res. 75 (2), 307-313 (1972).
  25. Naruse, I., Keino, H., Kawarada, Y. Antibody against single-stranded DNA detects both programmed cell death and drug-induced apoptosis. Histochemistry. 101 (1), 73-78 (1994).
  26. National Research Council (US) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edn, National Research Council. Washington, D.C.. (2011).
  27. Negoescu, A., et al. In situ apoptotic cell labeling by the TUNEL method: improvement and evaluation on cell preparations). J. Histochem. Cytochem. 44 (9), 959-968 (1996).
  28. Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 123 (1), 291-298 (1984).
  29. Phanithi, P. B., Yoshida, Y., Santana, A., Su, M., Kawamura, S., Yasui, N. Mild hypothermia mitigates post-ischemic neuronal death following focal cerebral ischemia in rat brain: immunohistochemical study of Fas, caspase-3 and TUNEL. Neuropathology. 20 (4), 273-282 (2000).
  30. Portera-Cailliau, C., Price, D. L., Martin, L. J. Excitotoxic neuronal death in the immature brain is an apoptosis-necrosis morphological continuum. J. Comp Neurol. 378 (1), 70-87 (1997).
  31. Portera-Cailliau, C., Price, D. L., Martin, L. J. Non-NMDA and NMDA receptor-mediated excitotoxic neuronal deaths in adult brain are morphologically distinct: further evidence for an apoptosis-necrosis continuum. J. Comp Neurol. 378 (1), 88-104 (1997).
  32. Ravi, D., Ramadas, K., Mathew, B. S., Nalinakumari, K. R., Nair, M. K., Pillai, M. R. De novo programmed cell death in oral cancer. Histopathology. 34 (3), 241-249 (1999).
  33. Sakaki, T., Kohmura, E., Kishiguchi, T., Yuguchi, T., Yamashita, T., Hayakawa, T. Loss and apoptosis of smooth muscle cells in intracranial aneurysms. Studies with in situ DNA end labeling and antibody against single-stranded DNA. Acta Neurochir.(Wien). 139 (5), 469-474 (1997).
  34. Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future. J. Histochem. Cytochem. 45 (3), 327-343 (1997).
  35. Shi, S. R., Imam, S. A., Young, L., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry under the influence of pH using monoclonal antibodies. J. Histochem. Cytochem. 43 (2), 193-201 (1995).
  36. Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp. Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).
  37. Sirvent, J. J., Aguilar, M. C., Olona, M., Pelegri, A., Blazquez, S., Gutierrez, C. Prognostic value of apoptosis in breast cancer pT1-pT2). A TUNEL, p53, bcl-2, bag-1 and Bax immunohistochemical study. Histol.Histopathol. 19 (3), 759-770 (2004).
  38. Skyrlas, A., Hantschke, M., Passa, V., Gaitanis, G., Malamou-Mitsi, V., Bassukas, I. D. Expression of apoptosis-inducing factor (AIF) in keratoacanthomas and squamous cell carcinomas of the skin. Exp. Dermatol. 20 (8), 674-676 (2011).
  39. Smith, M. D., Weedon, H., Papangelis, V., Walker, J., Roberts-Thomson, P. J., Ahern, M. J. Apoptosis in the rheumatoid arthritis synovial membrane: modulation by disease-modifying anti-rheumatic drug treatment. Rheumatology.(Oxford). 49 (5), 862-875 (2010).
  40. Stadelmann, C., Lassmann, H. Detection of apoptosis in tissue sections). Cell Tissue Res. 301 (1), 19-31 (2000).
  41. Schans, G. P., van Loon, A. A., Groenendijk, R. H., Baan, R. A. Detection of DNA damage in cells exposed to ionizing radiation by use of anti-single-stranded DNA monoclonal antibody. Int. J. Radiat. Biol. 55 (5), 747-760 (1989).
  42. Watanabe, I., et al. Detection of apoptotic cells in human colorectal cancer by two different in situ methods: antibody against single-stranded DNA and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end-labeling (TUNEL) methods. Jpn. J. Cancer Res. 90 (2), 188-193 (1999).
  43. Watanabe, T., et al. Apoptosis signal-regulating kinase 1 is involved not only in apoptosis but also in non-apoptotic cardiomyocyte death. Biochem. Biophys. Res. Commun. 333 (2), 562-567 (2005).
  44. Yaoita, H., Ogawa, K., Maehara, K., Maruyama, Y. Attenuation of ischemia/reperfusion injury in rats by a caspase inhibitor. Circulation. 97 (3), 276-281 (1998).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wykrywanie uszkodzeń DNAopracowywanie tkanekznakowanie fluorescencyjnekwantyfikacja sygnałuodejmowanie autofluorescencjiwykrywanie apoptozyanaliza śmierci komórkowejanaliza in situ
Wykrywanie i analiza uszkodzeń DNA w mięśniach szkieletowych myszy in situ metodą TUNEL
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.