Wykrywanie i analiza uszkodzeń DNA w mięśniach szkieletowych myszy in situ metodą TUNEL

Podsumowanie

Ten film opisuje preparację, przetwarzanie tkanek, cięcie i fluorescencyjne znakowanie TUNEL mięśni szkieletowych myszy. Opisano w nim również metodę półautomatycznej analizy etykietowania TUNEL.

Streszczenie

Końcowe znakowanie końca deoksynukleotydylotransferazy (TdT) deoksyurydynotrifosforanu (dUTP) (TUNEL) to metoda użycia enzymu TdT do kowalencyjnego dołączania oznakowanej formy dUTP do 3' końców dwu- i jednoniciowych pęknięć DNA w komórkach. Jest to niezawodna i użyteczna metoda wykrywania uszkodzeń DNA i śmierci komórek in situ. Ten film opisuje preparację, przetwarzanie tkanek, cięcie i fluorescencyjne znakowanie TUNEL mięśni szkieletowych myszy. Opisano w nim również metodę półautomatycznego oznaczania ilościowego sygnału TUNEL. Wrodzone normalne cechy tkanek i warunki przetwarzania tkanek wpływają na zdolność enzymu TdT do skutecznego znakowania DNA. Przetwarzanie tkanek może również dodać niepożądaną autofluorescencję, która będzie zakłócać wykrywanie sygnału TUNEL. Dlatego ważne jest, aby empirycznie określić metody przetwarzania tkanek i znakowania TUNEL, które zapewnią optymalny stosunek sygnału do szumu do późniejszej oceny ilościowej. Opisany tutaj test oparty na fluorescencji umożliwia wykluczenie sygnału autofluorescencyjnego przez odejmowanie kanałów cyfrowych. Test TUNEL, stosowany z odpowiednimi technikami przetwarzania tkanek i kontrolami, jest stosunkowo szybką, powtarzalną, ilościową metodą wykrywania apoptozy w tkankach. Może być stosowany do potwierdzania uszkodzeń DNA i apoptozy jako mechanizmów patologicznych, do identyfikacji dotkniętych typów komórek oraz do oceny skuteczności leczenia in vivo.

Wprowadzenie

Końcowe znakowanie końca deoksynukleotydylu (TdT) dUTP (TUNEL) to proces polegający na użyciu enzymu TdT do przyłączania dUTP do 3' końców dwu- i jednoniciowych pęknięć DNA^12,23. Metoda TUNEL do wykrywania apoptozy i uszkodzeń DNA została po raz pierwszy opisana ponad 20 lat temu przez Gavrieli i wsp.^1,12,24. Od tego czasu został oceniony i zoptymalizowany w różnych preparatach tkankowych^7,23,27,40. TUNEL został wykorzystany do badania indukowanej niedokrwieniem śmierci komórek neuronów^6,14,29 i kardiomiocytów^43,44, ekscytotoksycznej śmierci komórek neuronalnych^30,31 oraz jako biomarker w leczeniu zapalenia stawów³⁹. Jest również stosowany jako czynnik prognostyczny i marker komórek nowotworowych w różnych nowotworach u ludzi^{2,3,15,32,37,38,42}.

Istnieją alternatywne metody wykrywania uszkodzeń DNA i śmierci komórek, ale mają one techniczne wyzwania i zastrzeżenia. Southern blot może być stosowany do ilościowego określania uszkodzeń DNA w całych tkankach lizatów^7,9-11, ale ta metoda nie zapewnia rozdzielczości na poziomie komórkowym i jest trudna do ilościowego określenia. Test kometarny jest alternatywną metodą opartą na komórkach, która wymaga ekstrakcji zachowanych jąder z komórek^4,20,28,36. Chociaż test kometarny działa dobrze na hodowanych izolowanych komórkach, znacznie trudniej jest przygotować nienaruszone jądra z tkanki mięśni szkieletowych^8,21. Podobnie jak w przypadku Southern blot, test komety nie dostarcza informacji specyficznych dla typu komórki z homogenatu całej tkanki mięśniowej. Inną alternatywą dla metody TUNEL jest immunohistochemia z wykorzystaniem przeciwciał przeciwko jednoniciowemu DNA^25,33,41 lub przeciwko białkom uczestniczącym w odpowiedzi na uszkodzenie DNA i szlakach śmierci komórki (np. p53, H2AX i kaspazy)^13,17,22,40. Takie metody oparte na przeciwciałach wymagają dokładnej charakterystyki przeciwciał i doskonałej swoistości przeciwciał, aby uzyskać wysoki stosunek sygnału do tła. Nawet jeśli istnieją specyficzne przeciwciała, mogą one wymagać denaturacji białka docelowego poprzez procedury pobierania antygenu^34,35. Jak omówimy tutaj, pobieranie antygenu w tkance mięśniowej powoduje niedopuszczalnie wysoką autofluorescencję. W przeciwieństwie do metod alternatywnych, TUNEL osiąga wykrywanie uszkodzeń DNA z wysokim sygnałem i niskim tłem, doskonałą specyficznością, którą można testować za pomocą prostych kontroli pozytywnych i negatywnych, dobrą penetracją tkanek, która nie wymaga pobierania antygenu, oraz rozdzielczością na poziomie komórkowym. Ponadto metoda TUNEL trwa około 4 godzin, podczas gdy metody alternatywne zazwyczaj wymagają inkubacji przez noc.

Badamy śmierć komórek mięśni szkieletowych w mysim modelu rdzeniowego zaniku mięśni (SMA)¹⁰, który został wygenerowany przez Hsieh-Li i współpracowników¹⁶. Aby określić ilościowo komórki apoptotyczne w mięśniach, opracowaliśmy metodę przygotowania, barwienia i oznaczania ilościowego tkanek, która działa solidnie w różnych grupach mięśni szkieletowych w różnych punktach rozwojowych u myszy. Korzystamy z dostępnego na rynku zestawu do etykietowania TUNEL oraz dostępnego na rynku oprogramowania do analizy obrazu. Z powodzeniem zastosowaliśmy również test TUNEL w połączeniu z barwieniem immunofluorescencyjnym w rdzeniu kręgowym¹⁰.

Opisane tutaj metody są przydatne dla badaczy, którzy chcą ocenić patologię tkanek, mechanizmy choroby, mechanizmy starzenia się oraz rozwojową (przed- i pourodzeniową) śmierć komórek w mięśniach szkieletowych. Technika TUNEL jest szczególnie przydatna w badaniach nad uszkodzeniem i naprawą DNA oraz śmiercią komórki w systemach modelowych, w których dotyczy to tylko podzbioru komórek i konieczna jest rozdzielczość na poziomie komórkowym.

Ten film opisuje sekcję, przetwarzanie tkanek, cięcie i fluorescencyjne znakowanie TUNEL mięśni szkieletowych myszy. Opisano w nim również metodę półautomatycznego oznaczania ilościowego sygnału TUNEL.

Protokół

UWAGA: Wszystkie procedury na zwierzętach opisane w tym protokole zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych National Institutes of Health²⁶. Protokół (MO13M391) został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa.

1. Ofiara, sekcja i fiksacja noworodków myszy

1. Złożyć w ofierze nowonarodzoną mysz przez wdychanie CO₂ .
2. Natychmiast odetnij tylną kończynę powyżej kolana. Do około 7 dnia po urodzeniu kości nóg są wystarczająco miękkie, aby przeciąć je dużymi nożyczkami laboratoryjnymi lub ostrym ostrzem, a następnie przeciąć na kriostacie.
3. Umieść tylną kończynę w 10 ml lodowatego 4% paraformaldehydu w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w probówce o pojemności 15 ml.
4. Zanurzenie tylnej kończyny w paraformaldehydzie na 4-24 godziny w temperaturze 4 °C. Tkanka embrionalna wymaga tylko kilku godzin utrwalenia.
   1. Unikaj fiksacji dłuższej niż 24 godziny, ponieważ może to zmniejszyć skuteczność testu TUNEL.
5. Krioprotekcjonalna kończyna tylna poprzez zanurzenie jej w roztworze sacharozy.
   1. Zamień paraformaldehyd na 10% sacharozy w PBS w tej samej probówce o pojemności 15 ml, inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
   2. Zmienić na 30% sacharozy w PBS, inkubować przez noc w temperaturze 4 °C lub do momentu, gdy tylna kończyna opadnie na dno probówki. Tkanka może być pozostawiona w 30% sacharozie przez dłuższy czas, pod warunkiem, że sacharoza została sterylnie przefiltrowana.

2. Osadzanie tkanek

1. Napełnij oznaczoną formę do zatapiania do połowy środkiem do zatapiania.
2. Umieść tylną kończynę na podłożu do zatapiania, stroną ciętą jak najbliżej jednej ścianki formy. Zaznacz orientację tylnej kończyny na zewnątrz formy.
   1. Osadź kilka tylnych kończyn i wytnij w tym samym bloku. Jednak ważne jest, aby upewnić się, że wszystkie tylne kończyny w bloku są zorientowane równolegle do siebie, aby uzyskać odcinki na pasujących poziomach wzdłuż osi kończyny.
3. Przykryj tylne kończyny podłożem do zatapiania. Jeśli tylne kończyny przesuwają się podczas nalewania pożywki, zmień ich orientację za pomocą kleszczy z końcówkami lub wykałaczki.
4. Pozwól, aby podłoże osadzające przeniknęło do tkanki w temperaturze pokojowej przez co najmniej 15 minut.
5. Umieść foremki bezpośrednio na suchym lodzie lub w izopentanie na suchym lodzie, aby zamrozić medium do zatapiania. Upewnij się, że formy są zawsze wypoziomowane i unikaj przesuwania się osadzonej tkanki.
6. Zamrożone foremki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu przygotowania do krojenia, przez okres do kilku miesięcy.

3. Kriosekcja osadzonych kończyn

1. Ustaw temperaturę komory kriostatu na -20 °C, temperaturę obiektu na -18 °C; w razie potrzeby zmniejsz temperaturę obiektu.
2. Utrzymuj równowagę bloku tkankowego w komorze kriostatu przez co najmniej 30 minut. Prawidłowa temperatura bloku ma kluczowe znaczenie dla jakości sekcji.
3. Ciąć przekroje poprzeczne o grubości 10 μm lub mniejszej. Grubsze odcinki nie zostaną w pełni przeniknięte przez odczynniki TUNEL. Użyj płyty zapobiegającej przechylaniu się, ostrzy i kąta nachylenia ostrza (zwykle 5°) zalecanego dla kriostatu.
4. Zebrać skrawki na szkiełka pokryte żelatyną lub wektabondem w temperaturze pokojowej. Natychmiast umieścić w pudełku na suwak na suchym lodzie. Pudełko ze szkiełkami należy przechowywać w osobnym pojemniku z suchym lodem umieszczonym w pobliżu kriostatu w zasięgu ręki.
   1. Przetnij poprzeczne odcinki szeregowe przez długą oś kończyny, pomijając 100-200 μm. Zbierz co najmniej 3 sąsiednie sekcje na każdym poziomie szeregowym.

4. Test TUNEL na odcinkach kończyn tylnych przy użyciu dostępnego na rynku zestawu (wszystkie kroki w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej)

1. Rozmrozić zjeżdżalnie z sekcjami do temperatury pokojowej i wysuszyć przez noc lub w weekend.
2. Nawadniaj sekcje, zanurzając szkiełka w PBS na 2 x 10 minut w słoiku Coplin. Osuszyć chusteczką laboratoryjną, usuwając jak najwięcej płynu wokół sekcji.
3. Sekcje przepuszczalności
   1. Użyj komercyjnego odczynnika na bazie saponiny lub 0,5% Tween20 i 0,05% Triton X100 w PBS.
   2. Umieść szkiełko w komorze wilgotnościowej. Prosta komora wilgotnościowa to puste pudełko na końcówki do pipet ze szczelną pokrywą, z dodatkiem wystarczającej ilości wody, aby przykryć dno pudełka.
   3. Odpipetować odczynnik w ilości wystarczającej do pokrycia przekroju (50 μl wystarcza na kończyny nowonarodzonych myszy). Nie pipetować bezpośrednio na sekcję, ponieważ powtarzające się mieszanie może spowodować oderwanie się sekcji od szkiełka.
   4. Za pomocą kleszczy z końcówkami umieść mały prostokąt parafilmu na górze sekcji, aby rozprowadzić kroplę odczynnika i całkowicie zakryć sekcję. Jeśli pod parafilmem utworzą się bąbelki, delikatnie go zdejmij, wysusz i ponownie nałóż.
   5. Inkubować szkiełka z odczynnikiem do przepuszczalności przez 1 godzinę w zakrytej komorze wilgotnościowej. Jeśli sekcje zaczną odrywać się od zjeżdżalni, czas przepuszczalności może zostać skrócony do 30 minut.
   6. Umyj szkiełka w PBS w słoiku Coplin 2 x 5 min. Prostokąty parafilmu powinny unosić się do góry, a następnie można je usunąć i wyrzucić.
   7. Za pomocą chusteczki laboratoryjnej osusz jak najwięcej płynu wokół sekcji.
4. Znakowanie pęknięć DNA za pośrednictwem TdT
   1. Postępuj zgodnie z instrukcjami zestawu, aby zrobić 1x bufor do etykietowania TdT, odpipetować wystarczającą ilość buforu do etykietowania na szkiełku, aby pokryć przekrój tkanki (50 μl jest wystarczające dla kończyn noworodków myszy). Inkubować w komorze wilgotnościowej przez 5 minut. Alternatywnie, zanurz szkiełko w buforze do etykietowania TdT w słoiku z koplinem.
   2. Postępuj zgodnie z instrukcjami zestawu, aby przygotować mieszankę do etykietowania TdT. Zestaw zawiera kationy kobaltu, magnezu i manganu; Kation manganu działa dobrze na różne tkanki, w tym mięśnie szkieletowe, tkanki układu nerwowego, wątrobę, skórę i kości.
   3. W celu uzyskania kontroli dodatniej dodać DNazę (oznaczoną jako "nukleaza" w zestawie) do mieszaniny znakującej TdT. Alternatywnie, należy wstępnie potraktować sekcję kontroli dodatniej DNazą w buforze nukleazy przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, zgodnie z instrukcją zestawu. Trzymaj roztwór DNazy i sekcje poddane działaniu DNazy z dala od innych sekcji eksperymentalnych, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.
   4. W przypadku kontroli ujemnej należy pominąć enzym TdT w mieszaninie znakującej.
   5. Użyj chusteczki laboratoryjnej, aby usunąć jak najwięcej bufora etykietowania TdT ze szkiełka. Odpipetować mieszaninę do etykietowania TdT na szkiełku (50 μl na sekcję), przykryć nowym prostokątem parafilmu i inkubować w komorze wilgotnościowej w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
   6. Postępuj zgodnie z instrukcjami zestawu, aby utworzyć bufor 1x stop. Użyj chusteczki laboratoryjnej, aby usunąć mieszaninę do znakowania TdT ze szkiełka i dodaj 200-300 μl buforu zatrzymującego, aby pokryć przekrój tkanki i inkubować w komorze wilgotnościowej przez 5 minut. Alternatywnie, zanurz szkiełko w buforze zatrzymującym w słoiku Coplin.
   7. Umyj szkiełko 2 x 2 minuty w PBS. Użyj chusteczki laboratoryjnej, aby usunąć jak najwięcej PBS ze szkiełka.
5. Etykietowanie fluorescencyjne
   1. Postępuj zgodnie z instrukcjami zestawu, aby przygotować roztwór do znakowania fluoresceiny do znakowania dNTP w przerwach DNA. Odpipetować roztwór na szkiełko podstawowe (50 μl na sekcję), przykryć nowym prostokątem parafilmu i inkubować w komorze wilgotnościowej przez 20 minut.
   2. Myj szkiełko przez 2 minuty w PBS w słoiku Coplin. Użyj chusteczki laboratoryjnej, aby usunąć jak najwięcej PBS ze szkiełka.
   3. Rozcieńczyć barwnik jądrowy Hoechst 33258 do 1 μg/ml w PBS i odpipetować na szkiełko (100-200 μl wystarcza do pokrycia przekroju). Inkubować w komorze wilgotnościowej przez 5 minut.
   4. Prać 3x przez 5 min w PBS.
   5. Szkiełko nakrywkowe z fluorescencyjnymi środkami montażowymi zapobiegającymi blaknięciu i krawędziami uszczelniającymi z lakierem do paznokci.

5. Akwizycja obrazu cyfrowego

1. Uzyskuj obrazy za pomocą konwencjonalnego mikroskopu fluorescencyjnego z filtrami DAPI, FITC i Texas Red (lub ich odpowiednikami). Użyj obiektywu o większym powiększeniu (20X lub 40X), aby sprawdzić, czy znakowanie się powiodło, a jądra (nienaruszone lub fragmentaryczne) zostały oznaczone. Obiektyw 10X jest wystarczający do ilościowego określenia punktacji TUNEL-dodatniej.
2. Zbierz obrazy barwienia Hoechsta, barwienia TUNEL i sygnału autofluorescencyjnego jako trzy oddzielne kanały sztucznych barw połączone na jednym obrazie. Jeśli etykieta fluoroforowa TUNEL jest zielona, zobrazuj sygnał autofluorescencyjny w czerwonym filtrze i odwrotnie.
   1. Zachowaj równoważność wszystkich ustawień obrazowania między szkiełkami w celu późniejszego progowania i oceny ilościowej. Dla każdego filtra zaprogramuj i zapisz czasy ekspozycji, wzmocnienie i binning (brak binningu jest najlepszy); Nie używaj automatycznych ustawień ekspozycji ani wzmocnienia.
   2. Użyj metody prób i błędów, aby znaleźć ustawienia ekspozycji i wzmocnienia, które najlepiej uchwycą zakres intensywności na wszystkich zabarwionych slajdach. Upewnij się, że na uzyskanych obrazach nie ma nasyconych pikseli, ponieważ spowoduje to odchylenie w ocenie ilościowej.
3. Rób zdjęcia całej grupy mięśni, która Cię interesuje. Może to wymagać "zszycia" ze sobą wielu obrazów.

6. Analiza obrazu

1. Korzystaj z dostępnych na rynku programów do analizy obrazu, aby analizować cyfrowe obrazy barwienia TUNEL. Analiza przy użyciu komercyjnego oprogramowania jest pokazana tutaj. Alternatywnie, do analizy barwienia TUNEL można użyć bezpłatnego oprogramowania ImageJ firmy NIH.
2. Zabarwić przekrój przylegający do odcinka wybarwionego TUNEL hematoksyliną i eozyną (H&E) i wykonać pełny obraz cyfrowy przekroju za pomocą konwencjonalnego mikroskopu jasnego pola. Użyj tego obrazu H&E w połączeniu z atlasem anatomicznym^5,18,19, aby prześledzić struktury anatomiczne, które mają zostać określone ilościowo.
3. Przy wyłączonym kanale TUNEL ręcznie prześledź kontur obszaru, który ma być określony ilościowo, korzystając z kanałów Hoechsta i autofluorescencji jako wskazówek. Przekształć obrysowany obszar w maskę (zestaw wybranych współrzędnych pikseli, które mają być analizowane).
4. Włącz kanał TUNEL. Korzystając z funkcji progowania intensywności w programie do analizy obrazu, ustaw dolny próg, aby wykluczyć cały sygnał autofluorescencji.
5. Zastosuj te same ustawienia progowe do wszystkich obrazów w zestawie do nauki. Konwertowanie zaznaczeń z progami na maski.
6. Dla każdego obrazu połącz maskę obszaru mięśniowego i maskę TUNEL. Nowa maska kombinowana będzie reprezentować sygnał TUNEL tylko w obrębie śledzonego obszaru mięśniowego.
7. Wykonaj kwantyfikację maski na masce złożonej, aby określić liczbę obiektów i obszar obiektu sygnału TUNEL w śledzonym obszarze mięśniowym. W tym celu należy użyć funkcji Particle Analyzer (Analizator cząstek) w programie ImageJ.

Wyniki

W przypadku poprawnego barwienia sygnał TUNEL-dodatni powinien być wystarczająco jasny, aby można było go oddzielić od autofluorescencji poprzez ustawienie progów intensywności. Obiekty TUNEL-dodatnie przy małym powiększeniu mogą wyglądać jak jasne, nieregularne fragmenty w mięśniach szkieletowych (Rysunek 1A). Jednak przy większym powiększeniu, w przypadku gdy mechanizmem śmierci komórkowej jest apoptoza, powinny być widoczne niektóre obiekty TUNEL-dodatnie o klasycznej morfologii apoptotycznej (

Dyskusja

Opisano metodę wykrywania i ilościowej analizy apoptozy związanej z uszkodzeniem DNA w mięśniach szkieletowych myszy. Procedura obejmuje pobranie tkanek, barwienie TUNEL, cyfrową akwizycję obrazu i analizę obrazu. Potrzebne są zwykłe materiały i narzędzia histologiczne, a także specjalny komercyjny zestaw TUNEL. Niezbędnymi elementami wyposażenia są kriostat, mikroskop epifluorescencyjny z funkcją cyfrowego obrazowania oraz system komputerowy do analizy obrazu.

Eksperymentator powinien zdawać ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
4% paraformaldehyd w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami	Mikroskopia elektronowa Nauki	19202	Do opisanych tutaj procedur 4% roztwór przygotowano świeżo z proszku. Można stosować paraformaldehyd od dowolnego dostawcy. Przygotowany roztwór formaldehydu należy przechowywać w temperaturze 4 & deg; C i nie należy go stosować po upływie terminu ważności (do kilku miesięcy). Paraformaldehyd jest czynnikiem rakotwórczym i toksyną powodowaną przez drogi oddechowe i kontakt ze skórą. Należy przestrzegać środków ostrożności określonych w karcie charakterystyki podczas obchodzenia się z paraformaldehydem.
Sacharoza	Sigma	S0389	Służy do krioochrony tkanek przed zamrożeniem. Można użyć sacharozy od dowolnego dostawcy.
Związek O.C.T.	Tissue-Tek	4583	Podłoże do zatapiania do kriosekcji.
Kriostat	Leica	CM 3050S	Do opisywanych tutaj preparatów użyto kriostatu Leica CM3050S. dowolny kriostat zdolny do cięcia 10 μ Można stosować przekroje m.
Można stosować szkiełka szklane, 25 x 75 x 1 mm	Fisher	12-552-3	Można stosować prowadnice od dowolnego dostawcy.
Żelatyna	Sigma	G-9391	Żelatyna służy do wspomagania przylegania przekroju tkanki do szkiełek podstawowych. Aby pokryć szkiełka żelatyną, rozpuść 2,75 g żelatyny i 0,275 g ałunu chromowego w 500 ml wody destylowanej, podgrzanej do temperatury 60 °; C, zanurz szkiełka na kilka sekund i pozostaw do wyschnięcia. Można użyć żelatyny od dowolnego dostawcy. Alternatywnie można zakupić szkiełka z żelatyną.
Dwunastowodny siarczan potasu chromu(III) (ałun chromowy)	Ałun chromowy	243361	chromowy dodaje się do roztworu żelatyny w celu zwiększenia przyczepności tkanek na szkiełkach podstawowych. Jest to potencjalny czynnik rakotwórczy i toksyna powodowana przez drogi oddechowe i kontakt ze skórą. Należy przestrzegać środków ostrożności określonych w karcie charakterystyki podczas obchodzenia się z ałunem chromowym.
Odczynnik do adhezji tkanek Vectabond	Vector Labs	SP-1800	Opcjonalne podłoże dla lepszej przyczepności tkanek do szkiełek podstawowych; zamiast tego można zastosować szkiełka powlekane żelatyną.
Tween20	Sigma	P9416	Detergent stosowany do przepuszczalności tkanek. Można użyć Tween20 od dowolnego dostawcy.
Triton X100	Sigma	T8787	Detergent służący do przepuszczalności tkanek. Można stosować Triton X100 od dowolnego dostawcy.
TACS 2 TdT fluoresceina in situ zestaw do wykrywania apoptozy	Trevigen	4812-30-K	Komercyjny zestaw do znakowania TUNEL na bazie fluorescencji.
DNaza/nukleaza	Trevigen	4812-30-K	(w zestawie)
Bufor DNazy/nukleazy	Trevigen	4812-30-K	(w zestawie)
10x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), pH 7,4	Amresco	780	Przygotuj 1x PBS do płukania i rozcieńczania. Można stosować PBS od dowolnego dostawcy.
Woda wolna od DNaz	Quality Biologicals	351-029-131	Można używać wody od dowolnego dostawcy.
Hoechst 33258	Sigma	94403	Barwnik jądrowy. Można użyć dowolnego niebieskiego fluorescencyjnego barwnika jądrowego. Jako barwnik wiążący DNA, Hoechst jest podejrzewany o działanie rakotwórcze i powinien być traktowany przy użyciu sprzętu ochronnego, aby zminimalizować kontakt ze skórą.
Parafilm	M multiple	807	Można stosować dowolną inną folię hydrofobową lub szkiełko nakrywkowe. Dostępne od wielu dostawców.
Mikroskop fluorescencyjny z kamerą cyfrową	--	--	Można użyć dowolnego mikroskopu fluorescencyjnego zdolnego do cyfrowego rejestrowania fluorescencji czerwonej, zielonej i niebieskiej w oddzielnych kanałach.
Można stosować media przeciwblaknięcia Vectashield	Vector Labs	H-1000	Antifade od dowolnego dostawcy.
szkiełka nakrywkowe szklane o grubości nr 1	Brain Research Labs	2222-1	Można stosować szkiełka nakrywkowe od dowolnego dostawcy. Najmniejszy rozmiar 22 x 22 mm jest wystarczający dla sekcji nóg noworodków myszy.
Lakier do paznokci	Ted Pella	114-8	Służy do uszczelniania szkiełek nakrywkowych. Można używać lakieru do paznokci od dowolnego dostawcy (w tym stałych sprzedawców). Unikaj używania lakieru do paznokci z kolorem lub dodatkami, które mogą odbijać światło podczas obrazowania fluorescencyjnego.