Ocena żywotności wstrzyknięcia ludzkiego tłuszczu nagim myszom za pomocą mikrotomografii komputerowej

Podsumowanie

Przeszczep tłuszczu jest podstawową techniką rekonstrukcji deficytów tkanek miękkich. Pozostaje jednak nieprzewidywalną procedurą charakteryzującą się zmienną przeżywalnością przeszczepu. Naszym celem było opracowanie modelu mysiego, który wykorzystuje nowatorską metodę obrazowania do porównania zachowania objętości między różnymi technikami przygotowania i dostarczania przeszczepu tłuszczu.

Streszczenie

Lipotransfer jest kluczowym narzędziem w arsenale chirurga do leczenia deficytów tkanek miękkich w całym ciele. Tłuszcz jest idealnym wypełniaczem tkanek miękkich, ponieważ jest łatwo dostępny, łatwo dostępny, niedrogi i z natury biokompatybilny. ¹ Jednak pomimo rosnącej popularności, przeszczep tłuszczu jest utrudniony przez nieprzewidywalne wyniki i zmienną przeżywalność przeszczepu, z opublikowanymi wskaźnikami retencji wahającymi się od 10 do 80%. ^1-3

Aby ułatwić badania nad przeszczepem tłuszczu, opracowaliśmy model zwierzęcy, który pozwala na analizę w czasie rzeczywistym retencji objętości wstrzykniętego tłuszczu. Krótko mówiąc, w skórze głowy nagiej myszy CD-1 wykonuje się małe nacięcie, a na czaszce umieszcza się 200-400 μl przetworzonego lipoaspiratu. Skóra głowy jest wybierana jako miejsce biorcze ze względu na brak natywnej tkanki tłuszczowej podskórnej oraz ze względu na doskonały kontrast tła zapewniany przez kalwarię, która pomaga w procesie analizy. Mikrotomografia komputerowa (mikro-CT) służy do skanowania przeszczepu na początku badania, a następnie co dwa tygodnie. Obrazy tomografii komputerowej są rekonstruowane, a oprogramowanie do obrazowania służy do ilościowego określania objętości przeszczepu.

Tradycyjnie, techniki oceny objętości przeszczepu tłuszczu wymagały eutanazji badanego zwierzęcia, aby zapewnić tylko jedną ocenę wagi i objętości przeszczepu za pomocą fizycznego pomiaru ex vivo. Porównania biochemiczne i histologiczne również wymagały, aby badane zwierzę zostało poddane eutanazji. Ta opisana technika obrazowania ma tę zaletę, że po wstępnym szczepieniu wizualizacji i obiektywnej oceny ilościowej objętości w wielu punktach czasowych bez konieczności poświęcania badanego zwierzęcia. Technika ta jest ograniczona rozmiarem przeszczepu, który można wstrzyknąć, ponieważ większe przeszczepy grożą martwicą skóry i tłuszczu. Metoda ta ma zastosowanie we wszystkich badaniach oceniających żywotność przeszczepu tłuszczu i retencję objętości. Szczególnie dobrze nadaje się do wizualnej reprezentacji przeszczepów tłuszczu i śledzenia zmian objętości w czasie.

Wprowadzenie

Wady tkanek miękkich wynikają z różnych przyczyn, w tym urazu, resekcji guza, starzenia się i wad wrodzonych. Mogą być wyniszczające dla pacjentów i stanowią jeden z najczęstszych, a jednocześnie trudnych problemów dla chirurgów rekonstrukcyjnych. Istnieje wiele metod radzenia sobie z niedoborami tkanek miękkich, takich jak miejscowe i wolne płaty, zastrzyki z kolagenu i syntetyczne wypełniacze. ^4-8 Jednak od czasu pierwszego udokumentowanego zastosowania przez Neubera w 1893 r.¹, autologiczny transfer tłuszczu pozostaje złotym standardem w naprawie deficytów tkanek miękkich, ponieważ jest gotowy do pobrania, łatwy i bezpieczny do pobrania oraz naturalnie kompatybilny. ^1,2

Pomimo tych zalet, autologiczne przeszczepy tłuszczu cierpią z powodu nieprzewidywalnego i zmiennego przeżycia, z wskaźnikami retencji wahającymi się od 10 do 80% w czasie. ^1-3,9 Aby uwzględnić tę oczekiwaną utratę objętości i symetrii, chirurdzy często muszą dokonywać nadmiernej korekcji podczas wypełniania ubytków tkanek miękkich lub wykonywać wiele procedur kontrolnych.

Słabo unaczynione łóżka przeszczepów są częściowo odpowiedzialne za tę resorpcję tkanek. Ponadto brak metody analizy porównawczej do porównywania przeżywalności przeszczepu może również przyczyniać się do niespójności w raportowanych wynikach. Precyzyjna metoda pomiaru objętości przeszczepu zmniejszyłaby błąd pomiaru podczas oceny wskaźników retencji. To z kolei pomogłoby naukowcom dokładniej zidentyfikować czynniki sprawcze, które wpływają na przeżywalność przeszczepu. Chociaż wiele laboratoryjnych modeli zwierzęcych ułatwiło zarówno ilościową, jak i jakościową ocenę przeżywalności przeszczepu ludzkiego tłuszczu, większość z nich opiera się na środkach histologicznych i biochemicznych i wymaga poświęcenia badanego zwierzęcia w celu uzyskania pojedynczego pomiaru. ^3,10-12 Niewiele doniesień na temat stosowania technik obrazowania do obliczania retencji objętości przeszczepu tłuszczu in vivo.

Kilka badań klinicznych wykazało bardziej skuteczne techniki pomiarowe wykorzystujące obrazowanie. Obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) zostało zastosowane przez Hörla i wsp. do pomiaru przeżywalności przeszczepu tłuszczu¹³, a CT został wykorzystany przez Har-Shai i wsp. oraz Fontdevila i wsp. w swoich analizach zachowania objętości po przeszczepieniu u pacjentów cierpiących na HIV. ^14,15 Wykorzystując oprogramowanie do obrazowania trójwymiarowego (3D), Meier i wsp. Mierzono retencję objętości u ludzi po autologicznym przeszczepie tłuszczu, porównując obrazy z okresu przedoperacyjnego i pooperacyjnego. ¹⁶

Jednak w badaniach podstawowych brakuje ustandaryzowanej metody wykorzystującej obrazowanie do pomiaru przeżywalności przeszczepów tłuszczu. Podejście do obrazowania o wysokiej rozdzielczości do oceny objętości przeszczepów tłuszczu pozwoliłoby nie tylko na dokładne i powtarzalne pomiary objętości, ale także na powtarzalne pomiary umożliwiające wizualizację ewolucji przeżywalności przeszczepów tłuszczowych w czasie rzeczywistym.

Protokół

UWAGA: Protokoły eksperymentalne i formularze zgody pacjenta na uzyskanie tłuszczu zostały przejrzane i zatwierdzone przez Institutional Review Board Uniwersytetu Stanforda (Protokół #2188). Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Stanford Administrative Panel on Laboratory Animal Care (APLAC) na mocy Protokołu #9999. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone przy ścisłym przestrzeganiu wytycznych dotyczących bezpieczeństwa zwierząt i humanitarnej opieki.

1. Zbieranie tłuszczu

1. Za pomocą procedury Colemana^17-19 należy pozyskać ludzką tkankę tłuszczową z okolic brzucha, boku i/lub ud zdrowych pacjentek poddawanych liposukcji planowej.
2. Aby przetworzyć lipoaspirat do szczepienia, zacznij od pozostawienia tłuszczu na 30 minut.
3. Lipoaspirat zazwyczaj składa się z trzech warstw, z olejem na górze, tłuszczem w środku i krwią na dole. Odessać i wyrzucić górną warstwę oleju i dolną warstwę krwi.
4. W celu dalszego usunięcia pozostałego płynu tumescencyjnego lub resztek komórkowych, należy odwirowywać tłuszcz przez 5 minut w temperaturze 350 x g i temperaturze 4 °C, a następnie zassać dolną warstwę wodną.
5. Oblicz ilość tłuszczu potrzebną do szczepienia, uwzględniając 20% błąd podania, i przenieś żądaną objętość tłuszczu do 50 ml stożka. Pomnóż 400 przez liczbę myszy w badaniu, aby uzyskać mikrolitry tłuszczu potrzebnego do szczepienia.
6. W tym momencie, jeśli wykonujesz Lipotransfer wspomagany komórkami^20,21, umieść objętość tłuszczu do szczepienia na lodzie. Następnie zbierz komórki zrębu pochodzące z tkanki tłuszczowej (ASC) z pozostałego tłuszczu przy użyciu standardowej techniki opisanej przez Zuk i wsp. ²².

2. Przeszczep tłuszczu

1. Uzyskaj samice, homozygotyczne nagie myszy CD-1 do badania eksperymentalnego. Wybierz myszy w wieku od 8 do 12 tygodni
.
2. Aby wywołać znieczulenie, umieść mysz w pudełku z 2,5% mieszaniną izofluranu i tlenu w tempie 2 l/min na około 10 minut. Należy pamiętać, że zalecana dawka izofluranu różni się w zależności od szczepu myszy.
3. Gdy tempo oddychania myszy zwolni, potwierdź odpowiednią sedację za pomocą uszczypnięcia palca u nogi. Nałóż weterynaryjną smarującą maść okulistyczną na oba oczy myszy.
4. Jeśli mysz nie drgnie w odpowiedzi na uszczypnięcie palca, potwierdza to wystarczającą płaszczyznę znieczulenia. Umieść nos myszy w stożku nosowym dostarczającym 2,5% mieszaniny izofluranu i tlenu z prędkością 1-2 l/min. Jeśli mysz cofnie się po uszczypnięciu palca, wróć do pudełka do powalania i przetestuj ponownie po 5 minutach.
5. Ustaw sterylne pole pod myszą, a następnie wysterylizuj skórę głowy 2,5% jodonem powidonu, a następnie 70% roztworem etanolu. Powtórz jeszcze dwa razy.
6. Umieść serwety chirurgiczne na myszy i uważaj, aby utrzymać sterylne pole. Przez cały czas należy używać sterylnych narzędzi, rękawic i środków ochrony osobistej.
7. Jeśli objętość tłuszczu do szczepienia została wcześniej umieszczona na lodzie, pozwól tłuszczowi najpierw dostosować się do RT przed podaniem.
8. Do strzykawki typu luer-lock o pojemności 1 ml należy dodać 1 ml tłuszczu.
9. Podłącz kaniulę do przeszczepu tłuszczu o długości 14 G i długości 8 cm do końca strzykawki.
10. Zalać system poprzez wciśnięcie tłoka strzykawki do momentu, aż w strzykawce pozostanie od 200 do 400 μl tłuszczu. Wciskając tłok strzykawki, upewnij się, że kaniula jest całkowicie wypełniona tłuszczem, obserwując tłuszcz wychodzący z dystalnego otworu kaniuli.
11. Za pomocą cienkich kleszczy podnieś skórę grzbietową w linii środkowej pokrywającą najbardziej ogonową część czaszki. Wykonaj nacięcie 1,5 mm w skórze za pomocą cienkich nożyczek.
12. Umieść pojedynczy nylonowy szew 6-0 przez środek cięcia, który później zostanie użyty do zbliżenia krawędzi rany po wykonaniu przeszczepu. Nie wiązać szwu.
13. Utwórz kieszeń podskórną nad czaszką, wprowadzając kaniulę przez nacięcie skóry i przesuwając kaniulę tam iz powrotem w kształcie wachlarza nad czaszką, aby uwolnić wszelkie przyczepy tkanki łącznej do leżącej nad nią skóry.
14. Po utworzeniu kieszeni umieść kaniulę w linii środkowej myszy bezpośrednio nad czaszką, aż końcówka znajdzie się w najbardziej rostralnej części kieszeni, która powinna znajdować się tuż za linią narysowaną między oczami. (Rysunek 1A)
15. Powoli wstrzykuj tłuszcz w sposób wsteczny, przesuwając tłok, jednocześnie odciągając kaniulę do tyłu. Za pomocą kleszczy zbliż do siebie krawędzie rany i podnieś je, aby tłuszcz nie wyciekał z kieszeni.
16. Zawiąż szew, który został wcześniej założony, upewniając się, że pierwszy węzeł lekko przylega do skóry. Zawiąż jeszcze trzy kwadratowe węzły i odetnij szew ogonem o średnicy 3 mm. (Rysunek 1B)
17. Potwierdź za pomocą wizualizacji i ręcznego badania palpacyjnego, że kieszeń nie jest przepełniona, a skóra pokrywająca kieszeń nie jest napięta. Jeśli kieszeń została przepełniona, przetnij szew i usuń cały tłuszcz z kieszeni. Umyj kieszeń solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) o pH 7,4 i ponownie wstrzyknij mniejszą ilość tłuszczu.
18. Wyjmij mysz ze znieczulenia i umieść ją na plecach lub boku w czystej klatce. Monitoruj zwierzę pod kątem regularnego oddychania, normalnych ruchów, braku krwawienia oraz oznak bólu lub niepokoju. Buprenorfinę należy podawać podskórnie w dawce 0,1 mg/kg mc. co 6 godzin przez okres do 48 godzin, jeśli zwierzę odczuwa ból.
19. Upewnij się, że zwierzę obudziło się na tyle, aby utrzymać leżącą mostek, zanim pozostawisz je bez opieki. Nie umieszczaj zwierzęcia w klatce z innymi zwierzętami, dopóki w pełni nie wyzdrowieje.
20. Po 4 godzinach upewnij się, że zwierzę jest w stanie normalnie jeść i pić, poruszać się i oddychać oraz że nie ma krwawienia z miejsca operacji. Zwróć go do placówki opieki nad zwierzętami.

3. Mikrotomografia komputerowa

1. Skanuj myszy pod kątem objętości wyjściowej do 3. dnia po operacji, a następnie powtórz skany w 2., 4., 6. i 8. tygodniu po operacji.
2. Podczas obrazowania myszy w każdym punkcie czasowym należy postępować zgodnie z wytycznymi dotyczącymi sedacji i opieki nad zwierzętami przed i po zabiegu, jak opisano wcześniej w krokach 2.2-2.4 i 2.17-2.19.
3. Wykonaj skany za pomocą mikrotomografu komputerowego o rozmiarze woksela rekonstrukcyjnego 100 μm lub lepszym.
4. Przy szczytowym kilonapięciu promieniowania rentgenowskiego wynoszącym 80 kVp i prądzie anodowym 450 μA, podaj każdej myszy dawkę około 5 centiGy podczas 9-minutowego skanowania. Należy pamiętać, że wartości te różnią się w zależności od protokołu skanowania.
5. Przed wykonaniem pierwszego skanu należy skalibrować mikrotomografię komputerową za pomocą fantomu obrazowania, który rozróżnia intensywność powietrza, wody i kości.
6. Umieść cztery myszy w skanerze w pozycji brzusznej, z dwiema myszami na górze i dwiema na dole. Łóżko skanujące można łatwo zbudować przy użyciu strzykawek o pojemności 60 ml do przytrzymywania ciała myszy i strzykawek o pojemności 10 ml jako stożków do nosa. ²³
7. Utrzymuj myszy w znieczuleniu za pomocą 2,5% mieszaniny izofluranu i tlenu w ilości 1-2 l na minutę.
8. Potwierdź za pomocą obrazu zwiadowczego, że cała czaszka myszy, od nosa do pierwszego kręgu szyjnego i od czubka czaszki do podstawy czaszki, zostanie zobrazowana.

4. Analiza mikrotomografii komputerowej

1. Otwórz zrekonstruowane obrazy za pomocą oprogramowania do analizy obrazowania mikrotomografem komputerowym, które umożliwia tworzenie obszarów zainteresowania (ROI) poprzez wybór wokseli przy użyciu progów intensywności pikseli. Oprogramowanie umożliwia również tworzenie powierzchni 3D poprzez interpolację wybranych wokseli oraz do analizy objętościowej.
2. Zacznij od załadowania zrekonstruowanych obrazów TK w dwuwymiarowym (2D) widoku koronalnym, osiowym i strzałkowym. (Rysunek 2A)
3. Używając wycinka osiowego jako przewodnika, przejdź do wycinka strzałkowego, który odpowiada skrajnemu lewemu aspektowi przeszczepu tłuszczu. Wybierz górny i dolny próg intensywności pikseli, który przechwytuje wszystkie woksele odpowiadające przeszczepowi tłuszczu, ale nie obejmuje otaczającej tkanki i kości. (Rysunek 2B)
4. Zdefiniuj ROI w widoku strzałkowym, który odpowiada przeszczepowi tłuszczu, korzystając z wcześniej zdefiniowanych progów intensywności pikseli. Powtarzaj tę procedurę co piąty plasterek strzałkowy, nawigując, aż do osiągnięcia skrajnego prawego aspektu przeszczepu. (Rysunek 2C)
5. Interpoluj wybrane woksele ze wszystkich ROI 2D w jeden, połączony ROI 3D. (Rysunek 2D)
6. Rejestruj wielkość zwrotu z inwestycji obliczoną przez oprogramowanie.
7. Renderuj izopowierzchnię 3D, aby zwizualizować końcową objętość przeszczepu tłuszczu. (Rysunek 2E)
8. W kolejnych analizach należy pamiętać, aby maksymalne i minimalne wartości progowe intensywności pikseli były takie same, jak te używane w analizie bazowej.

5. Żniwa tłuszczu

1. Po przeskanowaniu myszy w 8 tygodniu ^24,25 punkt czasowy, znieczulij myszy, jak opisano wcześniej w krokach 2.2-2.4 i 2.17-2.19.
2. Postępując zgodnie z wytycznymi APLAC, poddaj myszy eutanazji, oddzielając ich kręgosłupy.
3. Umieść mysz w polu operacyjnym. Za pomocą nożyczek do tenotomii ostrożnie otwórz kieszeń i wypreparuj leżące nad nią przyczepy skóry i tkanki łącznej z przeszczepu tłuszczu.
4. W tym momencie pomocne może być wycięcie łaty leżącej nad nim skóry grzbietowej, aby pomóc w ekstrakcji przeszczepu. (Rysunek 3A)
5. Lekko utrzymuj przyczepność na przeszczepie za pomocą kleszczy i obracaj przeszczep z boku na bok, aby uwidocznić kolejne punkty napięcia, które należy zwolnić nożyczkami.
6. Podczas wycinania należy trzymać się jak najbliżej przeszczepu, aby zminimalizować tkankę łączną pobraną wraz z przeszczepem. (Rysunek 3B)
7. Po wycięciu przeszczepu zmierz masę na wytarowanej skali z dokładnością co najmniej 0,01 grama.
8. Obliczyć objętość przeszczepu tłuszczu, używając zmierzonej wartości masy i średniej gęstości ludzkiego tłuszczu (0,9 g/ml) jako współczynnika konwersji.
9. Porównaj obliczoną objętość przeszczepu tłuszczu z tą uzyskaną za pomocą mikrotomografii komputerowej.
10. Przeszczepy tłuszczu można przetworzyć w celu badania histologicznego lub dalszej analizy, jeśli zajdzie taka potrzeba.

Wyniki

Objętość przeszczepów tłuszczowych stopniowo zmniejszała się w trakcie badania, co poskutkowało średnim przeżyciem na poziomie 62,2% do 8. tygodnia. (Rycina 4A)²⁴Po zakończeniu skanowania w 8. tygodniu każdy przeszczep tłuszczowy wyekstrahowano w jednym kawałku. Do porównania różnic między pomiarami objętości przeszczepów tłuszczowych uzyskanymi za pomocą mikro-CT a objętością obliczoną na podstawie masy fizycznej zastosowano test sum rang Wilcoxona. Nie stwierdzono istotnych różnic między tym...

Dyskusja

Do tego momentu większość badaczy polegała na metodach niezwiązanych z obrazowaniem w celu ilościowego określenia długoterminowego przeżycia przeszczepów tłuszczu, ale metody te wymagają poświęcenia badanego zwierzęcia i dają tylko jeden pomiar. ^3,10-12 Nasze badanie stanowi ulepszoną metodę analizy, która pozwala na obiektywną kwantyfikację w czasie rzeczywistym przeżywalności przeszczepu tłuszczu w modelu mysim.

Kluczowe znaczenie w tym procesie ma zapewnienie, że do badania zosta...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wirówka do lipoaspiratu
	Beckman Coulter, Inc., Pasadena, CA
50 ml probówki stożkowe	BD Biosciences, San Jose, CA
CD-1 nagie myszy (Crl:CD1-Foxn1nu)	Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA
Isoflurane	Henry Schein, Dublin, OH
2,5% Betadine	Purdue Pharma, L.P., Stamford, CT
70% roztwór etanolu	Gold Shield, Hayward, Kalifornia
Strzykawka luer-lock 1cc	BD Biosciences, San Jose, kaniula CA
o rozmiarze 14	Shippert Medical, Centennial, CO
Kleszcze	Fine Science Tools, Heidelberg, Niemcy
Nożyczki do tenotomii	Fine Science Tools, Heidelberg, Niemcy
Szew nylonowy 6-0	Ethicon, Popiół niebieski,
	Gibco, Karlowe Wary, CA
mikrotomograf komputerowy	Siemens Healthcare, Pleasanton, CA
Phantom	TriFoil Imaging, Northridge, CA
Oprogramowanie do analizy obrazowania	IRW, Siemens Healthcare, Pleasanton, CA
Scale	Mettler-Toledo International, Inc., Columbus, OH

SAL sól fizjologiczna buforowana fosforanem OH