Artykuł metodologiczny

Przyżyciowe obrazowanie interakcji aksonalnych z mikroglejem i makrofagami w urazie zmiażdżenia kolumny grzbietowej myszy

DOI:

10.3791/52228

⸱

23 listopada 2014

 ,  ,  , 
1Department of Neurosciences, Case Western Reserve University, 2Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University, 3Department of Pediatrics, Case Western Reserve University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dwufotonowe obrazowanie przyżyciowe może być użyte do zbadania interakcji między różnymi typami komórek w rdzeniu kręgowym w ich naturalnym środowisku tkankowym u chimerycznego zwierzęcia szpiku kostnego z urazowym uszkodzeniem rdzenia kręgowego w kolumnie grzbietowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Urazowe uszkodzenie rdzenia kręgowego powoduje reakcję zapalną z udziałem makrofagów pochodzenia krwionośnego i mikrogleju rezydującego w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). Mikroskopia dwufotonowa przyżyciowych umożliwia badanie makrofagów i mikrogleju w uszkodzeniu rdzenia kręgowego u żywego zwierzęcia. Można to wykonać u dorosłych zwierząt z urazowym urazem kolumny grzbietowej. W tym miejscu opisujemy metody odróżniania makrofagów od mikrogleju w OUN za pomocą chimery szpiku kostnego napromieniającej w celu uzyskania zwierząt, u których tylko makrofagi lub mikroglej są znakowane genetycznie kodowanym zielonym białkiem fluorescencyjnym. Opisujemy również model urazu, który miażdży grzbietową kolumnę rdzenia kręgowego, wytwarzając w ten sposób prostą, łatwo dostępną, prostokątną zmianę, którą można łatwo uwidocznić u zwierzęcia za pomocą laminektomii. Ponadto przedstawimy procedury sekwencyjnego obrazowania zwierząt w anatomicznym miejscu urazu w celu zbadania interakcji komórkowych w ciągu pierwszych kilku dni do tygodni po urazie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reakcja zapalna na chorobę lub uraz w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) jest słabo poznana, szczególnie w odniesieniu do interakcji między komórkami odpornościowymi i rezydentnymi w tkance. Badania tych interakcji komórkowych w rdzeniu kręgowym są szczególnie interesujące u żyjących zwierząt. Jedyny łatwo dostępny szlak istoty białej OUN znajduje się w grzbietowych kolumnach rdzenia kręgowego, co czyni go ważnym obszarem, na którym należy skoncentrować wysiłki w celu poprawy wykonalnego podejścia eksperymentalnego. Badania te były ograniczone ze względu na trudności techniczne w dostępie i stabilizacji OUN do obrazowania. Obrazowanie na żywo w rdzeniu kręgowym zostało opisane wcześniej1-13, jednak niewiele badań dotyczyło ruchu komórkowego w urazie rdzenia kręgowego dłużej niż kilka godzin po początkowym urazie. Urazowe uszkodzenie rdzenia kręgowego jest złożonym środowiskiem, w którym znajdują się neurony, astrocyty, fibroblasty, komórki progenitorowe NG2 i komórki odpornościowe, w tym mikroglej, neutrofile, makrofagi, limfocyty T, limfocyty B i komórki dendrytyczne14,15. Makrofagi są podzbiorem komórek odpornościowych odpowiedzialnych za fagocytozę w zmianie, infiltrujących z krążenia. Rola tych komórek fagocytarnych była dyskutowana, a doniesienia wskazują, że komórki te mogą pełnić zarówno szkodliwe, jak i ochronne role w uszkodzonej tkance. Role te wahają się od zwiększenia wtórnego zamierania aksonów po urazie i działania w sposób fagocytarny16-22, do przyjęcia fenotypu gojenia się ran i zmniejszenia deficytów funkcjonalnych u zranionego zwierzęcia21,23,24.

Poprzednio, próby odróżnienia makrofagów od mikrogleju opierały się głównie na morfologii zdrowych tkanek. Jednak aktywowany mikroglej i makrofagi wyrażają wiele tych samych markerów i wykazują nieodróżnialną morfologię po urazie25-29, co utrudnia rozdzielenie różnych aktywności tych komórek na podstawie samych tych czynników30. Komórki te można rozdzielić przez różnicową ekspresję CD45 za pomocą cytometrii przepływowej33,34, chociaż podejście to jest mniej przydatne w rozróżnianiu tych typów komórek in vivo. Zbadano również wykorzystanie zróżnicowanej ekspresji CCR2 i CX3CR1 w mikrogleju i makrofagach, chociaż dynamiczne zmiany w ekspresji tych markerów, gdy monocyty różnicują się w makrofagi, mogą komplikować dokładną analizę35,36. Mikroglej jest rezydującymi komórkami odpornościowymi w OUN i powstaje z komórek progenitorowych woreczka żółtkowego podczas rozwoju płodu, podczas gdy makrofagi pochodzą z komórek progenitorowych szpiku kostnego i dostają się do uszkodzonego OUN po zniewadze31,32. Alternatywnym podejściem do wykorzystania morfologii do rozróżnienia tych dwóch typów komórek jest zastąpienie szpiku kostnego progenitorami od zwierzęcia dawcy wykazującymi ekspresję identyfikowalnego markera w makrofagach pochodzących od przodków dawcy, przy jednoczesnym zachowaniu mikrogleju pochodzącego od biorcy zamieszkującego OUN. Te chimeryczne modele szpiku kostnego są powszechnie wykorzystywane w wielu innych zastosowaniach37-40. Metoda ta ma unikalne zastrzeżenia związane z uszkodzeniem integralności bariery krew-mózg spowodowanym napromienianiem lub lekami cytotoksycznymi stosowanymi w celu wyeliminowania komórek progenitorowych szpiku u gospodarza, ograniczając w ten sposób jej zastosowanie w niektórych zastosowaniach. Ostatnio zaczynają być dostrzegane funkcjonalne różnice między mikroglejem a makrofagami w OUN za pomocą cytometrii przepływowej, analizy macierzy chipów genowych i metod chimeryzmu24,26,41-44, które okażą się bardzo przydatne w przyszłości. Chociaż oddzielenie tych dwóch typów komórek pozostaje trudne, zrozumienie ich unikalnych funkcji jest ważne w prowadzeniu do bardziej ukierunkowanego leczenia zaburzeń, które obejmują zarówno mikroglej, jak i makrofagi w OUN.

Opis interakcji komórkowych w obrębie uszkodzenia rdzenia kręgowego pochodzi głównie z badań z udziałem modeli hodowli komórkowych. Wynika to z wyzwań związanych z obrazowaniem zarówno uszkodzenia rdzenia kręgowego, jak i komórek odpornościowych u żywego zwierzęcia. Obecne modele urazów rdzenia kręgowego u gryzoni o różnym typie i stopniu obejmują modele stłuczenia45,46, urazy ukłucia szpilką2, rany szarpane47 i opisane tutaj urazy zmiażdżenia kręgosłupa16,18,48. Stan zapalny opon mózgowych nasila się wraz z ciężkością urazu i stanowi wyjątkowe wyzwanie dla implantacji okien lub operacji w celu seryjnego obrazowania. Niektóre z tych wyzwań obejmują infiltrację komórek fagocytarnych, a także wytwarzanie tkanki włóknistej w miejscu operacji. Niektóre z tych problemów można przezwyciężyć, tworząc mniejsze zmiany i pokrywając odsłonięty rdzeń kręgowy nieimmunogennym opatrunkiem chirurgicznym między oponą twardą a mięśniami przykolcowymi, aby umożliwić późniejszą operację ponownego otwarcia, tak jak ma to miejsce w przypadku badania uszkodzenia zmiażdżenia kolumny grzbietowej. Możliwość zobrazowania tylko grzbietowej części rdzenia kręgowego również ogranicza wybór urazu, ponieważ modele stłuczenia powodują przede wszystkim uszkodzenie rdzenia centralnego, często oszczędzając najbardziej grzbietową część kolumn grzbietowych, zwłaszcza we wczesnych punktach czasowych po urazie45,49. Dlatego opisujemy prosty model urazu, który daje czystą, powtarzalną zmianę o prostokątnym kształcie, która jest przydatna zarówno do obserwacji ruchu komórek w obrębie zmiany, jak i do łatwego ilościowego określenia pozycji aksonów względem zmiany.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie zwierzęta powinny być trzymane i wykorzystywane zgodnie z zaleceniami komitetu ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania (IACUC) w instytucji. Wszystkie opisane tutaj procedury są zatwierdzone przez Case Western Reserve University IACUC.

1. Zwierzęta transgeniczne

  1. Użyj dostępnych w handlu fluorescencyjnych myszy reporterowych do znakowania aksonów (Thy-1 YFP H)50 i mikrogleju / monocytów (CX3CR1GFP / GFP 51; patrz lista materiałów). Myszy te powinny być krzyżowane i utrzymywane jako indywidualne kolonie hodowlane zgodnie z instytucjonalną polityką opieki nad zwierzętami.

2. Chimery szpiku kostnego

  1. Zidentyfikować zwierzęta, które ukończyły co najmniej 8 tygodni, w celu wykorzystania ich jako biorców.
  2. Umieść zwierzęta żywicielskie w okrągłej klatce do napromieniania, zaprojektowanej tak, aby utrzymać mysz w pozycji zapewniającej równomierne napromieniowanie całego ciała.
  3. Ustaw timer na promienniku cezu (Cs-137), aby podać zwierzętom dawkę promieniowania całego ciała 800-1,000 Rads zgodnie z instrukcjami producenta (pokazane tutaj przykłady to 980 Rads).
  4. Zwierzęta należy umieścić w klatkach, aby odpoczęły przez co najmniej 4 godziny.
  5. Jako źródło komórek progenitorowych szpiku należy wybrać zwierzęta dawców o odpowiednim genotypie (patrz rysunek 2A).
    UWAGA: Odpowiednimi dawcami są zwierzęta wykazujące ekspresję różnych reporterów fluorescencyjnych specyficznych dla linii od gospodarza w celu identyfikacji różnych populacji komórek lub jednej o tym samym genotypie co grupa kontrolna.
  6. Napełnij jedną szalkę Petriego 70% alkoholem, a drugą pożywkę 10 ml pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI) i sitkiem o średnicy 40 μm nasączonym w pożywce. Napełnij stożkową probówkę o pojemności 15 ml pożywką RPMI. Trzymaj naczynia i rurkę na lodzie.
  7. Uśmiercać zwierzęta dawcy przez uduszenie CO2 zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Oczyść skórę i sierść, mocząc całe zwierzę w 70% etanolu, aż całe futro będzie mokre.
  8. Usuń skórę z dolnej połowy zwierzęcia, przecinając wokół środkowej części i ciągnąc skórę w dół po tylnych nogach, aby całkowicie odsłonić mięśnie nóg.
  9. Usuń kość piszczelową przez nadmierny przedni wyprost w stawie kolanowym, aby zwichnąć kość, a następnie za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek oderwij i odetnij mięśnie z obu końców kości piszczelowej. Umieścić kość na szalce Petriego z alkoholem na okres do 30 sekund, a następnie przenieść do sitka do komórek wewnątrz szalki Petriego zawierającej podłoże.
  10. Zwichnij staw biodrowy i oderwij mięśnie przyczepione do kości udowej, umieść kość udową na krótko w alkoholu, a następnie umieść ją w tym samym sitku komórkowym wewnątrz naczynia.
  11. W kapturze do hodowli tkankowej użyj sterylnych nożyczek, aby odciąć oba końce kości i włóż igłę 21G na strzykawce o pojemności 1 ml w koniec kości. Przepłukać szpik kostny do 15 ml stożka z pożywką. Powtórz procedury dla pozostałych kości.
  12. Używając tylnej części tłoka ze strzykawki o pojemności 3 ml, zmiażdżyć końce kości w sitku na szalce Petriego, aby usunąć więcej komórek.
  13. Umieścić filtr na górze stożkowej probówki o pojemności 50 ml i przenieść pożywkę z zasysanymi komórkami z probówki stożkowej o pojemności 15 ml. Użyć tylnej części tłoka, aby zmiażdżyć szpik w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej. Przemyć stożkową probówkę o pojemności 15 ml, fragmenty kości i sitko do komórek z 30 ml pożywki do probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
  14. Odwirować komórki przez 5 minut przy 500 x g w celu osadzenia komórek.
  15. Lizować krwinki czerwone za pomocą 2 ml buforu do lizy chlorku amonu i potasu (ACK) przez 2 minuty. Ugasić bufor do lizy 10 ml pożywki zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej. Wirować przy 500 x g przez 5-10 minut do osadzania.
  16. Umyj komórki raz w 10 ml pożywki RPMI i dwa razy w soli fizjologicznej, odwirowując przy 500 x g przez 5-10 minut do granulacji przy każdym płukaniu.
  17. Zawiesić komórki do końcowego stężenia 3 x 106 komórek w 200 μl soli fizjologicznej.
  18. Przenieś 3 x 106 komórek szpiku przez wstrzyknięcie żyły ogonowej do napromieniowanych myszy biorców.
  19. Umieść zakwaszoną wodę (pH 3,0) w klatce biorcy i pozwól myszom dojść do siebie.
    UWAGA: Myszy, które nie przejdą przeszczepu, umrą w ciągu 10-14 dni po zabiegu.
  20. Po 8 tygodniach sprawdź rekonstytucję szpiku, badając komórki odpornościowe krwi obwodowej za pomocą cytometrii przepływowej (ryc. 2B-C).

3. Uraz zmiażdżenia kolumny grzbietowej

UWAGA: Wybierz odpowiednie zwierzęta chimery lub podwójnie transgeniczne zwierzęta do operacji na podstawie pożądanego eksperymentu. Zwierzęta z oznakowanymi komórkami rezydentnymi lub pochodzącymi ze szpiku kostnego zostały stworzone w poprzednich etapach.

  1. Przygotuj i autoklawuj narzędzia chirurgiczne, w tym rongeurs, kleszcze Dumont #4, nożyczki do tęczówki, kleszcze do trzymania tkanek, wkrętaki do igieł i klipsy do ran.
  2. Przygotuj leki do podania myszom w celu kontroli bólu. Bupernex i Marcaine są powszechnie stosowane w celu kontroli bólu. Stosuj odpowiednie leki zgodnie z wymaganiami i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC).
  3. Wywołaj znieczulenie 4% izofluranem i utrzymuj 1-2% izofluranu, aby osiągnąć częstość oddechów 60-100 oddechów na minutę. Nałóż smar do oczu zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu w znieczuleniu i potwierdzić brak reakcji przez uszczypnięcie stopy. Utrzymuj temperaturę za pomocą poduszki grzewczej i monitoruj temperaturę za pomocą sondy doodbytniczej.
  4. Ogol grzbiet myszy golarką elektryczną na docelowym poziomie rdzenia kręgowego, a następnie trzykrotnie przetrzyj obszar powidonem-jodem, a następnie dwukrotnie 70% alkoholem. Umieść zwierzę na sterylnym serwowaniu i przykryj zwierzę inną sterylną serwetą z otworem wyciętym w odpowiednim miejscu, aby uwidocznić miejsce operacji. Utrzymuj wszystkie narzędzia na sterylnych obłożach przez cały czas trwania zabiegu.
  5. Przetnij skórę wzdłuż linii środkowej na pożądanym poziomie kręgosłupa nożyczkami do tęczówki, aby odsłonić mięsień na grzbiecie zwierzęcia.
  6. Pod mikroskopem preparacyjnym przetnij mięśnie pleców, w tym mięsień czworoboczny i więzadła najszerszego grzbietu wzdłuż linii środkowej, gdzie przyczepiają się do grzbietowych wyrostków kręgosłupa, i odsłoń kręgosłup.
  7. Usuń mięśnie rotatorów między wyrostkami grzbietowymi i poprzecznymi kręgu, aby odsłonić blaszkę konkretnego kręgu, który ma zostać usunięty (w tym przypadku T11). Zidentyfikuj T11 poprzez wstawienie ostatniego niepływającego żebra do tego procesu.
  8. Włóż końcówki rongeurs w przestrzeń powyżej i poniżej procesu, który ma zostać usunięty, i lekko podnieś, aby upewnić się, że są bezpiecznie na miejscu wokół blaszki kręgowej, ale nie za głęboko, aby uszkodzić kręgosłup. Zamknij rongeurs jednym ruchem, aby usunąć blaszkę.
  9. W razie potrzeby powiększ laminektomię, używając rongeurs do usunięcia małych części pozostałego kręgu.
  10. Odmierz 1 mm od końcówek kleszczyków #4, przytrzymując je przy linijce i oznaczając trwałym markerem. Odmierz 1 mm odstępu między dwoma zębami, przytrzymując kleszcze przy linijce i ustal maksymalną szerokość końcówek na 1 mm, wsuwając gumowy pierścień kleszczowy na miejsce nad trzonkiem kleszczy.
  11. Utwórz mały otwór, wprowadzając igłę o rozmiarze 30 przez oponę twardą w dwóch punktach wprowadzania zębów kleszczy, aby uzyskać dostęp do rdzenia kręgowego.
  12. Włóż zęby kleszczy pod kątem 90° do opony twardej przez otwory na głębokość 1 mm zaznaczone po bokach kleszczy, upewniając się, że znak znajduje się nad oponą twardą. Ściśnij kleszcze i przytrzymaj przez 10 sekund. Zwolnij i powtórz kleszcze, ściśnij jeszcze dwa razy, co daje w sumie trzy chwyty. Usuń kleszcze z rdzenia kręgowego.
  13. Namocz kawałek wchłanialnej gąbki żelatynowej w soli fizjologicznej i umieść w miejscu urazu.
  14. Za pomocą ściegu do biegania zszyj mięsień na miejscu nad laminektomią i nasączoną gąbką żelatynową z syntetycznymi, niewchłanialnymi szwami nylonowymi #4.
  15. Przypnij skórę na miejscu za pomocą klipsów do ran o średnicy 5 mm.
  16. Wstrzyknąć 10 μl Marcaine (1,0 mg/kg) w 490 μl soli fizjologicznej podskórnie wokół miejsca nacięcia i 5 μl Bupernexu (0,1 mg/kg) domięśniowo do mięśni pośladkowych.
  17. Pozwól zwierzęciu dojść do siebie na ciepłej podkładce i monitoruj, czy nie ma trudności w poruszaniu się lub oznak paraliżu kończyn tylnych. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki lub w obecności innych zwierząt, dopóki nie dojdzie do całkowitego wyzdrowienia ze znieczulenia. Nie należy używać zwierząt, które wykazują zauważalne deficyty motoryczne.
    UWAGA: Chociaż ta zmiana zmiażdżenia może być wykonana na dowolnym poziomie wzdłuż rdzenia kręgowego, praktycznie T10-L4 stwarza mniej wyzwań technicznych dla obrazowania w odniesieniu do oddychania i stabilizacji ruchu ciała za pomocą zacisków. Umieszczenie zacisku musi być zmodyfikowane wokół klatki piersiowej, aby obrazować na poziomie klatki piersiowej.

4. Obrazowanie przyżyciowe

  1. Przygotuj i autoklawuj narzędzia chirurgiczne, w tym kleszczyki Dumont #4, nożyczki do tęczówki, kleszcze do trzymania tkanek, wkrętaki do igieł i klipsy do ran.
  2. Znieczulić mysz jak poprzednio izofluranem. Wywołaj znieczulenie na poziomie 4-5% i utrzymuj na poziomie 1-2% w razie potrzeby, aby utrzymać częstość oddechów 60-100 oddechów na minutę i brak reakcji na szczypanie stopy. Utrzymuj mysz w cieple, monitoruj częstość oddechów, gdy nie obrazujesz i stale monitoruj temperaturę zwierzęcia za pomocą sondy doodbytniczej.
  3. Oczyść skórę wokół klipsów do ran Betadine, a następnie alkoholem i zdejmij klipsy do ran zgodnie z instrukcjami producenta. Po usunięciu klipsów do ran, w razie potrzeby usuń włosy za pomocą Nair i ponownie oczyść miejsce powidonem i 70% alkoholem.
  4. Ponownie otwórz skórę nożyczkami. Usuń wszelkie pozostałe szwy z mięśni i rozsuń mięśnie kleszczami, w razie potrzeby przecinając nożyczkami.
  5. Pod mikroskopem preparacyjnym utwórz kieszenie na zaciski rdzenia kręgowego, przecinając mięsień nożyczkami po stronie wyrostków poprzecznych na kręgu na jednym poziomie kręgu powyżej i poniżej laminektomii.
  6. Umieść zaciski wokół każdego z tych kręgów i dokręć. Dostosuj w razie potrzeby, aby umożliwić obiektywowi mikroskopu dotarcie do rdzenia kręgowego. Upewnij się, że rdzeń kręgowy jest równoległy do platformy obrazowania i utrzymuj stabilność tkanek podczas obrazowania. Jeśli widoczny jest artefakt oddychania, odpowiednio wyreguluj zaciski, aby zminimalizować ruch w polu obrazowania.
  7. Przykryj zaciski parafilmem.
  8. Usuń wchłanialną żelatynową gąbkę skompresowaną z rdzenia kręgowego za pomocą kleszczy, delikatnie odrywając jak najwięcej kawałków, usuwając również jak najwięcej tkanki bliznowatej znad opon mózgowych. W razie potrzeby przykryj odsłonięty rdzeń kręgowy solą fizjologiczną i nową gąbką.
    UWAGA: Jeśli wystąpi jakiekolwiek krwawienie z otaczającego mięśnia, zatamuj gąbką lub kauteryzuj w razie potrzeby. Należy jednak uważać, aby nie dotykać rdzenia kręgowego kauteryzacją. Podczas kauteryzacji przykryj rdzeń kręgowy kawałkiem zwilżonej tkanki lub gąbką sprasowaną żelatyną.
  9. Stwórz studzienkę do przechowywania płynu immersyjnego, najpierw uszczelniając skórę i tkankę za pomocą Vetbond, a następnie używając akrylu dentystycznego, aby zbudować studzienkę między dwoma zaciskami uchwytu rdzenia kręgowego a bokami zwierzęcia. Poczekaj, aż akryl utwardzi się.
  10. Napełnij studzienkę sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (aCSF) i ponownie sprawdź, czy nie ma krwawienia wokół miejsca operacji.
  11. Opcjonalnie w tym momencie wstrzyknąć dożylnie fluorescencyjne barwniki naczyniowe przez wstrzyknięcie do żyły ogonowej, aby uwydatnić naczynia krwionośne podczas obrazowania.
    UWAGA: Często stosuje się dekstran fluorescencyjny o stężeniu powyżej 70 kDa, chociaż kropki kwantowe i znakowane fluorescencyjnie lektyny również służą jako użyteczne barwniki naczyniowe. 50 μl 150 000 WM TRITC-dekstranu jest zwykle wstrzykiwane dożylnie.
  12. Aby uzyskać fizjologicznie istotną ruchliwość komórek odpornościowych, temperatura myszy musi być utrzymywana na poziomie 37 °C. Przenieś mysz do środowiska o kontrolowanej temperaturze pod mikroskopem w celu obrazowania i monitoruj zwierzę pod kątem prawidłowego poziomu znieczulenia za pomocą częstości oddechów i szczypania stopy. Często monitoruj zwierzę podczas obrazowania, aby określić głębokość znieczulenia, dążąc do osiągnięcia częstości oddechów 60-100 oddechów na minutę.
  13. Zlokalizuj miejsce obrazowania przez okular mikroskopu.
  14. Dostosuj 2-fotonowy laserowy mikroskop skaningowy tak, aby wykonywał obraz z-stack co 30-60 sekund, aby uzyskać dynamiczne dane obrazowania.
  15. Po zakończeniu sesji obrazowania wyjmij zwierzę z podgrzewanego pudełka.
  16. Poluzuj zaciski kręgosłupa i wyjmij mysz z zacisków. Odciągnij akryl od skóry, jednocześnie usuwając zaciski.
  17. Jeśli mysz ma zostać ponownie zobrazowana, umieść na rdzeniu kręgowym nasączoną solą fizjologiczną gąbkę sprasowaną żelatyną. Zamknij mięsień i skórę nad miejscem operacji. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki lub w obecności innych zwierząt podczas rekonwalescencji po znieczuleniu. Jeśli zwierzę wykazuje jakiekolwiek oznaki deficytu neurologicznego po wyzdrowieniu, zwierzę powinno zostać poddane eutanazji. W przeciwnym razie należy poddać mysz eutanazji w komorze CO2 przed wyjściem ze znieczulenia zgodnie z zatwierdzonym przez IACUC protokołem eutanazji.
  18. Analizuj obrazy fluorescencyjne za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schematycznego rysunku przedstawiającego zmiażdżenie słupów tylnych rdzenia kręgowego pokazano na Ryc. 1A. Po wykonaniu urazu zwierzę jest przygotowywane i stabilizowane do mikroskopii intravitalnej przy użyciu klamer do rdzenia (Ryc. 1B). Obraz wykonany bezpośrednio po zmiażdżeniu słupów tylnych ukazuje wyraźnie widoczną prostokątną zmianę z łatwo identyfikowalnymi punktami wprowadzenia ramion pęsety. Aksony w miejscu urazu są przerwane w obrębie całego słupa tylnego (Ryc. 1C). Integralność naczyń krwionośnych zostaje zachowana, a w badaniu fluorescencyjnym nie stwierdzono wycieku barwnika z naczyń. Aby przeprowadzić seryjne obrazowanie tej samej zmiany w ciągu kilku tygodni, mięśnie i skórę można zaszyć nad miejscem laminektomii w celu późniejszej ponownej ekspozycji. Podobna morfologia zmiany jest widoczna w późniejszych punktach czasowych (Ryc. 1D, E). 5 dni po urazie miejsca wprowadzenia pęsety są nadal widoczne, ale zmiana zaczęła zwiększać swoje rozmiary z powodu urazu wtórnego spowodowanego stanem zapalnym. Aksony na końcu ogonowym zmiany wycofały się z pierwotnego miejsca urazu w procesie zwanym „axonal dieback”. Aksony na końcu głowowym zmiany wykazywały degenerację typu Wallera (Ryc. 1D, E). Między 5. a 22. dniem po urazie rozmiar zmiany ustabilizował się. Jednocześnie w tych punktach czasowych można zaobserwować duży napływ komórek CX3CR1+ infiltrujących zmianę zmiażdżeniową i jej okolice, choć w preparacie przedstawionym na Ryc. 1 nie można rozróżnić tożsamości tych komórek (mikroglej a makrofagi).

Aby odróżnić zachowanie mikrogleju i makrofagów w mikrośrodowisku zmiany po zmiażdżeniu, zastosowano model chimery radiacyjnej (przedstawiony na ryc. 2A). Po pierwsze, komórki progenitorowe szpiku kostnego myszy CX3CR1+/GFP zostają zastąpione niefluorescencyjnymi komórkami dawcy, dzięki czemu w obrazowaniu fluorescencyjnym widoczne są jedynie GFP+ mikroglej rezydentny w OUN. Wydajność rekonstrukcji szpiku można potwierdzić za pomocą cytometrii przepływowej krwi obwodowej 8 tygodni po przeszczepie szpiku (ryc. 2B, C). Na ryc. 2B u myszy chimerycznej CX3CR1+/GFP → C57BL/6 wykryto makrofagi dodatnie pod względem F4/80 i GFP, zaznaczone na niebiesko, w których obecne są również niektóre monocyty GFP-ujemne, ale F4/80-dodatnie. Na ryc. 2C po zastąpieniu szpiku kostnego biorcy CX3CR1+/GFP szpikiem kostnym typu dzikiego nie pozostały żadne komórki podwójnie dodatnie dla F4/80 i GFP. Przed urazem mikroglej jest równomiernie rozłożony w rdzeniu kręgowym, wykazując spoczynkową, rozgałęzioną morfologię (ryc. 2D). 8 dni po urazie w obrębie i wokół zmiany można wykryć tylko kilka komórek mikrogleju. Komórki te wykazują morfologię ameboidalną (ryc. 2E). Po drugie, komórki progenitorowe szpiku kostnego u niefluorescencyjnej myszy zostają zastąpione komórkami szpiku z myszy CX3CR1+/GFP, co czyni monocyty/makrofagi CX3CR1+ pochodzące ze szpiku kostnego widocznymi w fluorescencji GFP (ryc. 2A). Przed urazem jedyne wykryte komórki GFP+ znajdują się głównie w obrębie naczyniowym; zgłoszono, że pochodzą one ze szpiku kostnego i podlegają ciągłej wymianie28 (ryc. 2F). Po urazie zmiażdżeniowym komórki CX3CR1+/GFP są widoczne wzdłuż wewnętrznej ściany naczyń krwionośnych otaczających zmianę (ryc. 2H-J), a centrum zmiany jest wypełnione infiltrującymi makrofagami CX3CR1+/GFP (ryc. 2G).

Obrazowanie time-lapse słupów tylnych można prowadzić do 6 hr. Na Rysunku 3 przedstawiamy niechimeryczną mysz CX3CR1+/GFP bezpośrednio po urazie, w której widać komórki z krążenia przemieszczające się z naczynia krwionośnego w stronę centrum zmiany oraz poruszające się w obrębie miejsca urazu (Rysunek 3A, B; Film uzupełniający 1). Analiza obrazu z wykorzystaniem intensywności fluorescencji do identyfikacji komórek pozwala śledzić trasy przemieszczania się makrofagów (Rysunek 3A, B; Film uzupełniający 1). Statystyki wynikające z analizy obrazowania wykazują, że średnia ruchliwość makrofagów w obrębie zmiany wynosi 3,6 µm/min (Rysunek 3D). Ostatecznie, 22 dni po urazie w obrębie zmiany nadal można wykryć aksony, mikroglej i makrofagi, co dowodzi, że obszar obrazowania jest stabilny w długich okresach czasu (Film uzupełniający 2).

Proces zmiażdżenia rdzenia kręgowego, użycie pęsety, schemat osi czasu urazu, badanie odpowiedzi mikrogleju.
Rysunek 1: Wywołanie i sekwencyjne obrazowanie urazu zmiażdżeniowego słupów tylnych. (A) Uraz zmiażdżeniowy słupów tylnych jest wykonywany poprzez usunięcie wyrostka kolczystego kręgu na interesującym nas poziomie. Pęsetę wprowadza się do słupów tylnych rdzenia kręgowego w odstępie 1 mm, a następnie zamyka się ją 3 razy, aby wywołać zmianę zaznaczoną kolorem fioletowym. (B) Następnie zwierzę jest unieruchamiane za pomocą klamer do rdzenia kręgowego w celu uzyskania stabilności niezbędnej do obrazowania intravitalnego. (C) Bezpośrednio po urazie można wyraźnie zidentyfikować miejsca wprowadzenia pęsety (czerwona owal) oraz prostokątną objętość urazu zmiażdżeniowego (szare pole). Widoczne są aksony w korzeniach tylnych (białe strzałki), a także uszkodzone końce aksonów po stronie ogonowej zmiany (pełne groty strzałek). (D) 5 dni po urazie wciąż można łatwo zwizualizować miejsca wprowadzenia pęsety (czerwona owal) oraz zasięg zmiany (szare pole). Od momentu początkowego urazu rozmiar zmiany uległ zwiększeniu. Przed zmianą (otwarte groty strzałek) widoczne są aksony ulegające degeneracji typu Wallera, a także aksony w korzeniach tylnych (białe strzałki) i końce uszkodzonych aksonów (białe groty strzałek). (E) 22 dni po urazie miejsce zmiany jest nadal identyfikowalne i ma wymiary zbliżone do tych z 5. dnia po urazie. Zwróć uwagę na dużą liczbę komórek CX3CR1+ w miejscu urazu i wokół niego. Oznaczenia elementów są takie same jak w (D). Wszystkie paski skali = 200 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Eksperyment na modelu mysim z oznakowaną mikrogleją i makrofagami, schematy uszkodzeń aksonów, mikroskopia.
Rycina 2: Konstrukcja myszy chimerycznych w celu śledzenia mikroglei rezydującej w OUN lub makrofagów pochodzenia szpikowego wykazujących ekspresję CX3CR1+/GFP w miejscu zmiażdżeniowego uszkodzenia słupa tylnego. (A) Schemat generowania myszy chimerycznych z mikrogleją lub makrofagami wykazującymi ekspresję CX3CR1+/GFP. Po pierwsze, myszy Thy-1 YFP H są naświetlane, a szpik kostny jest rekonstruowany komórkami szpiku wyizolowanymi z myszy CX3CR1+/GFP, co daje mysz chimerę, której makrofagi są GFP+. Po drugie, myszy Thy-1 YFP H / CX3CR1+/GFP są naświetlane, a szpik kostny jest rekonstruowany komórkami szpiku wyizolowanymi z myszy niefluorescencyjnej, co daje mysz chimerę, której mikrogleja jest GFP+. (B) Przykład danych z cytometrii przepływowej z komórkami F4/80+ i CX3CR1 GFP+ we krwi zwierzęcia chimerycznego z donorem szpiku CX3CR1+/GFP przeszczepionym do naświetlonego biorcy C57BL/6. Komórki pochodzące od donorów CX3CR1 dodatnich, które są dodatnie zarówno dla GFP, jak i F4/80, są pokazane w obszarze wyróżnionym na niebiesko. (C) Przykład danych z cytometrii przepływowej z komórkami F4/80+ i CX3CR1 GFP+ u zwierzęcia chimerycznego ze szpikiem donora C57BL6 przeszczepionym do naświetlonego biorcy CX3CR1+/GFP. Należy zwrócić uwagę na brak komórek podwójnie dodatnich CX3CR1+/GFP i F4/80 w obszarze wyróżnionym na niebiesko. (D) Intrawitalny obraz z mikroskopii dwufotonowej myszy z pierwszego schematu chimerycznego, pokazujący GFP+ mikrogleję o morfologii rozgałęzionej w obrębie słupa tylnego (grot strzałki). Komórki te są rozmieszczone pomiędzy aksonami (żółty) w korzeniu tylnym i słupie tylnym. Pasek skali = 100 µm. (E) Obrazowanie intrawitalne tej samej myszy co w (B) 8 dni po uszkodzeniu słupa tylnego ujawnia kilka mikroglej CX3CR1+ o dużych, ameboidalnych ciałach komórkowych pozbawionych wypustek (grot strzałki). Pasek skali = 100 µm. (F) Obraz myszy z drugiego schematu chimerycznego z (A), pokazujący nieliczne makrofagi GFP+ w obrębie miąższu OUN. Pasek skali = 100 µm. (G) Obrazowanie intrawitalne tej samej myszy co w (F) 8 dni po uszkodzeniu słupa tylnego ujawnia duży napływ makrofagów do miejsca uszkodzenia i wokół niego. Pasek skali = 100 µm. (H) Zdjęcie przy większym powiększeniu przedstawiające komórki CX3CR1+ pochodzenia krwi w kontakcie z naczyniami u nieuszkodzonego zwierzęcia. Pasek skali = 30 µm. (I) Rekonstrukcja komórek CX3CR1 w kontakcie z naczyniem, widziana z wnętrza naczynia. Pasek skali = 30 µm. (J) Rekonstrukcja komórek CX3CR1 w kontakcie z naczyniem, widziana z zewnątrz naczynia. Pasek skali = 20 µm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej ryciny.

Eksperyment na modelu mysim z oznakowaną mikrogleją i makrofagami, schematy uszkodzenia aksonów, mikroskopia.
Rysunek 3:. Reprezentatywne dane z trackingu komórek u niechimerycznej myszy CX3CR1+/GFP bezpośrednio po urazie zmiażdżeniowym kolumny grzbietowej. (A) Migawka z mikrogleją i makrofagami CX3CR1+ wokół uszkodzonych aksonów (żółte) z Supplementary Movie 1 bezpośrednio po urazie zmiażdżeniowym kolumny grzbietowej. (B) Ścieżki (szare) przebyte przez komórki CX3CR1+ z panelu (A) podczas 110-minutowej sesji obrazowania intravitalnego. (C) Reprezentacja ścieżek z panelu (B) zakodowana czasowo. Ścieżki są pokolorowane w zależności od czasu ich wystąpienia w całym 110-minutowym filmie, zgodnie z paskiem czasu. (D) Histogram całkowitej ruchliwości komórek CX3CR1+ . Wszystkie paski skali wynoszą 30 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Film uzupełniający 1: Reprezentatywny film intravitalny bezpośrednio po zmiażdżeniu sznura tylnego u myszy podwójnie heterozygotycznej Thy-1YFP/+ / CX3CR1GFP/+ . Obrazowanie intravitalne rdzenia kręgowego przeprowadzono bezpośrednio po zmiażdżeniu sznura tylnego na poziomie T11. Prawy panel pokazuje ruch mikrogleju i makrofagów CX3CR1+. Ścieżki ruchu komórek przedstawiono jako białe linie na lewym panelu. Miejsce urazu znajduje się w górnym lewym rogu. Widać komórki CX3CR1+ przemieszczające się w stronę miejsca urazu wzdłuż tych ścieżek. Aksony przedstawiono w kolorze żółtym. Pasek skali = 40 µm. Czas całkowity: 110 min. Prędkość odtwarzania: 300x.

Film uzupełniający 2: Reprezentatywne nagranie intravitalne 22 dni po zmiażdżeniu słupów tylnych u myszy podwójnej heterozygoty Thy-1YFP/+ / CX3CR1GFP/+ . Przedstawiono reprezentatywny film zarejestrowany u myszy 22 dni po pierwotnym urazie zmiażdżeniowym słupów tylnych na poziomie T11 rdzenia kręgowego. Miejsce urazu znajduje się w prawym górnym rogu kadru. W prawym dolnym rogu widoczne są aksony (żółte) biegnące w kierunku rostralnym. Żyła grzbietowa oraz naczynia krwionośne zostały oznakowane TRITC-dekstraną (czerwone). Komórki CX3CR1+ w obrębie zmiany przemieszczają się z mniejszą prędkością w porównaniu do komórek bezpośrednio po urazie. Pasek skali = 50 µm. Czas całkowity: 90 min. Prędkość odtwarzania: 600x.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie interakcji różnych typów komórek w ich natywnych przedziałach tkankowych podczas późniejszej patologii w czasie rzeczywistym wzbudziło duże zainteresowanie. W gęstej sieci OUN kontakt komórka-komórka i sygnalizacja z sąsiednimi komórkami są niezbędne do prawidłowego funkcjonowania i zrozumienia patologii OUN. W tym miejscu opisaliśmy zastosowanie 2-fotonowej laserowej mikroskopii skaningowej do obserwacji ruchu komórek w obrębie zmiany mechanicznej w rdzeniu kręgowym. Oprócz jakości operacji i przygotowania tkanek, stabilność mechaniczna tkanki ma kluczowe znaczenie dla udanej mikroskopii poklatkowej, a w szczególności izolacji rdzenia kręgowego od artefaktu ruchu oddechowego. Stabilność można ocenić, szukając ruchu rdzenia kręgowego pod mikroskopem preparacyjnym, który odpowiada częstości akcji serca lub oddechowi zwierzęcia. Stabilność należy oceniać zarówno podczas wykonywania zabiegu, jak i bezpośrednio przed rozpoczęciem obrazowania. Jeśli zwierzę nie jest stabilne, należy dostosować rozmieszczenie i szczelność zacisków rdzenia kręgowego. Specyficzne dla typu komórki fluorescencyjne modele myszy reporterowych w połączeniu z metodami chimery szpiku kostnego umożliwiły identyfikację komórek monocytowych w porównaniu z mikroglejem i aksonami. Wcześniejsze badania wykazały, że to monocyty pochodzące z krwi, a nie mikroglej, są odpowiedzialne za wtórne uszkodzenie aksonów po urazie przy użyciu metodologii opisanej tutaj43. Sprzężony z dekstranem barwnik naczyniowy pozwala na identyfikację naczyń zarówno w celu zapewnienia punktów orientacyjnych, jak i identyfikacji naruszeń integralności naczyń. Wybór odpowiedniego fluorescencyjnego modelu myszy reporterowej ma kluczowe znaczenie dla umożliwienia prawidłowej identyfikacji pożądanych typów komórek, które mają zostać zobrazowane.

Opracowanie fluorescencyjnych modeli myszy, które są odpowiednie dla podejmowanych badań, ma również kluczowe znaczenie dla powodzenia eksperymentów. Rozróżnienie między dwiema populacjami fagocytarnymi komórek CX3CR1 + / GFP w OUN tradycyjnie było trudne. Jak pokazano tutaj, powszechna technika immunologiczna, chimery napromieniające, może być wykorzystana do odróżnienia odpornego na promieniowanie mikrogleju rezydującego w OUN od makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego. Procedura napromieniania może potencjalnie uszkodzić barierę krew-mózg i zmienić fenotypy komórek, dlatego należy dokładnie rozważyć użycie tego modelu. Zakres tych zmian różni się w zależności od dawki napromieniowania, a także czasu trwania okresu rekonwalescencji, a ich wpływ na różne modele stanu zapalnego nie został w pełni zbadany. Wpływ napromieniania na barierę krew-mózg OUN można zminimalizować poprzez osłonę głowy podczas napromieniania, a wykazano, że zmniejsza to infiltrację komórek do rdzenia kręgowego po napromieniowaniu, nawet jeśli rdzeń kręgowy nie jest bezpośrednioekranowany. Tutaj zaobserwowaliśmy, że liczba komórek naciekających do OUN w stanie stacjonarnym w wyniku generacji chimer jest nieznaczna w porównaniu z liczbą komórek wchodzących do zmiany. Inne alternatywne modele, które należy rozważyć, obejmują chimery indukowane lekami52 lub parabiotyczne modele myszy53.

W tym miejscu przedstawiliśmy specyficzny, prosty i powtarzalny model małego urazu, który powoduje uszkodzenie grzbietowej istoty białej rdzenia kręgowego, które jest łatwe do zobrazowania za pomocą mikroskopii 2-fotonowej. Metoda ta zapewnia również wymierną zmianę do oznaczania stopnia zamierania aksonów w kolumnach grzbietowych, które w literaturze zostały sprzężone z komplementarną analizą tkanek stałych16,18,43,48,54. W tym modelu zwierzęta wykazują jedynie minimalne deficyty i nie wymagają specjalnej opieki po kontuzji. Przyszłe badania wykorzystujące uraz zmiażdżenia kręgosłupa i opisane tutaj techniki obrazowania mogą być potężnymi narzędziami przesiewowymi do oceny skuteczności leczenia urazu rdzenia kręgowego. Leczenie to może obejmować inhibitory małocząsteczkowe, leki, produkty komórkowe, przeszczepy tkanek i terapie skojarzone. Wzajemne oddziaływanie między makrofagami, mikroglejem i neuronami może również odgrywać rolę w innych modelach chorób rdzenia kręgowego, w tym stwardnieniu rozsianym, guzach, zapaleniu opon mózgowych i stwardnieniu zanikowym bocznym, a technika ta może być również przydatna w badaniu tych chorób.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Następujące agencje zapewniły kluczowe wsparcie finansowe dla tego badania: MSTP T32 GM007250 (T.A.E.), 5T32EB7509 (D.S.B.), NCI R01 CA154656 (A.Y.H.), Dana Foundation (A.Y.H.), St. Baldrick's Foundation (A.Y.H.), Alex's Lemonade Stand Foundation (A.Y.H.), Gabrielle's Angel Foundation (A.Y.H.) i Hyundai Hope-on-Wheels Program (A.Y.H.). Autorzy są wdzięczni za niezastąpioną pomoc Jerry'ego Silvera i Sarah Busch w poznaniu kontuzji zmiażdżenia kolumny grzbietowej (DCC). Autorzy są również wdzięczni Jingquang You, Elisabeth Hare i Hongmei Hu za pomoc techniczną w genotypowaniu oraz Rossowi Andersonowi za montaż jednostki stabilizującej kręgosłup.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
CX3CR1 Myszy GFPLaboratoria Jacksona5582
Myszy Thy-1 YFP HLaboratoria Jacksona3782
Klatka do ciasta dla myszyBraintree ScientificMPC 2 zestaw
60 mm2 szalka PetriegoCorning430166Do izolacji szpiku kostnego
Falcon 40 μ m filtr komórkowyFisher Scientific08-771-1Do izolacji szpiku kostnego
1 x 15 ml i 1 x 50 ml rurka stożkowaFisher ScientificDo izolacji szpiku kostnego
Igła o rozmiarze 21 BD305177Do izolacji szpiku kostnego
1 ml strzykawkaBD309628Do izolacji szpiku kostnego
Bufor do lizy ACKGibcoA10492-01Do kości izolacja szpiku
HBSSCorning Cellgro21-022-CVDo izolacji szpiku kostnego
RPMI mediaSigmaR8758Do izolacji szpiku kostnego
Przeciwciało F4/80Ebioscience12-4801 PEDo weryfikacji chimer FACS
Strzykawka insulinowa o rozmiarze 30BD328280Do wstrzykiwania żyły ogonowej
Zaciski rdzenia kręgowegoNarshingeSTS-ADo obrazowania
Ortho-Jet Dental Proszek akrylowyLang DentalREF1320Do obrazowania
Ortho-Jet Dental Płyn akrylowyLang DentalREF1404Do obrazowania
Gąbki żelatynowe żelpiankowePfizer9034201Do obrazowania
4-0 NiciEthilon1667GDo operacji
Klipsy refleksyjne, 7 mmKent ScientificINS750344Do chirurgii. Sterylizuj przed użyciem
Nożyczki do tęczówkiFine Science Tools14061-09Do operacji
45/5 Kleszcze, DumoxelFine Science Tools11251-35Do operacji
RongeursFine Science Tools16021-14Do chirurgii
Igła o rozmiarze 30BD305106Do wykonywania otworów dostępowych w oponie twardej
Kleszcze Dumont #4 Wskazówki biologiczneDumont11242-40Do chirurgii
Sterowniki igiełFine Science Tools12002-12Do operacji
Michel Szczypce do przycinania ranKent Scientific INS700753Do operacji
Środek do usuwania klipsów do ranFine Science Tools12033-00Do chirurgii
O-ringi do kleszczyFine Science Tools11200-00Do operacji, często wyposażone w kleszcze #4, mogą również należy zamawiać osobno
Akumulatorowy trymer dla zwierzątWahlSeries 8900do operacji
Vetbond3M1469SBDo operacji
Roztwór Betadine (10% roztwór miejscowy Providine-Jod)Purdue Products L.P.NDC 67618-150-08Do zabiegu chirurgicznego
Nair Balsam do depilacjiChurch & Dwight Co., Inc.NRSL-22329-05Do zabiegu chirurgicznego
IsofluraneButler ScheinNDC 11695-6776-2Leki – do zabiegu chirurgicznego
MarcaineHenry ScheinNDC 0409-1587-50Leki – do zabiegu chirurgicznego 1,0 mg/kg podawane podskórnie
BupernexHenry Schein121-7793Leki – do operacji buprenorfina 0,1 mg/kg
aCSFChemikalia firmy Sigma119 mM NaCl
26,2 mM NaHCO3
2,5 mM KCl
1 mM NaH2PO4
1,3 mM MgCl2
10 mM		glukozy Do zabiegu chirurgicznego
Z protokołów Cold Spring Harbor
TRITC-dekstran 150 000 MWSigmaT1287Do podawania dożylnego w celu oznaczenia naczyń krwionośnych

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
  2. Kerschensteiner, M., Schwab, M., Lichtman, E., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11 (5), 572-577 (2005).
  3. Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Vis Exp. (59), 2760(2012).
  4. Davalos, D., et al. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169 (1), 1-7 (2008).
  5. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).
  6. Figley, S. A., et al. A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model. PLoS One. 8 (3), 58081(2013).
  7. Steffens, H., Nadrigny, F., Kirchhoff, F. In vivo two-photon imaging of neurons and glia in the mouse spinal cord. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (12), (2012).
  8. Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nat Med. 18 (1), 166-171 (2012).
  9. Dibaj, P., et al. In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS. PLoS One. 6 (3), (2011).
  10. Dibaj, P., et al. NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo. Glia. 58 (9), 1133-1144 (2010).
  11. Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Long- and short-term intravital imaging reveals differential spatiotemporal recruitment and function of myelomonocytic cells after spinal cord injury. J Physiol. 591 (19), 4895-4902 (2013).
  12. Fenrich, K. K., et al. Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows). J Physiol. 590 (16), 3665-3675 (2012).
  13. Dray, C., Rougon, G., Debarbieux, F. Quantitative analysis by in vivo imaging of the dynamics of vascular and axonal networks in injured mouse spinal cord). Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (23), 9459-9464 (2009).
  14. Popovich, P. G., Jones, T. B. Manipulating neuroinflammatory reactions in the injured spinal cord: back to basics. Trends Pharmacol Sci. 24 (1), 13-17 (2003).
  15. Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Exp Neurol. 209 (2), 378-388 (2008).
  16. Horn, K. P., Busch, S. A., Hawthorne, A. L., van Rooijen, N., Silver, J. Another barrier to regeneration in the CNS: activated macrophages induce extensive retraction of dystrophic axons through direct physical interactions. J Neurosci. 28 (38), 9330-9341 (2008).
  17. Fitch, M. T., Silver, J. CNS injury, glial scars, and inflammation: Inhibitory extracellular matrices and regeneration failure. Exp Neurol. 209, 294-301 (2008).
  18. Busch, S. A., Horn, K. P., Silver, D. J., Silver, J. Overcoming macrophage-mediated axonal dieback following CNS injury. J Neurosci. 29 (2), 9967-9976 (2009).
  19. Popovich, P. G., van Rooijen, N., Hickey, W. F., Preidis, G., McGaughy, V. Hematogenous macrophages express CD8 and distribute to regions of lesion cavitation after spinal cord injury. Exp Neurol. 182 (2), 275-287 (2003).
  20. Popovich, P. G., et al. Depletion of hematogenous macrophages promotes partial hindlimb recovery and neuroanatomical repair after experimental spinal cord injury. Exp Neurol. 158 (2), 351-365 (1999).
  21. Kigerl, K. A., et al. Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord. J Neurosci. 29 (43), 13435-13444 (2009).
  22. Gensel, J. C., et al. Macrophages promote axon regeneration with concurrent neurotoxicity. J Neurosci. 29 (12), 3956-3968 (2009).
  23. Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
  24. Shechter, R., et al. Infiltrating blood-derived macrophages are vital cells playing an anti-inflammatory role in recovery from spinal cord injury in mice. PLoS Med. 6 (7), 1000113(2009).
  25. Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells. Science. 327 (5966), 656-661 (2010).
  26. Popovich, P. G., Hickey, W. F. Bone marrow chimeric rats reveal the unique distribution of resident and recruited macrophages in the contused rat spinal cord. J Neuropathol Exp Neurol. 60 (7), 676-685 (2001).
  27. Ransohoff, R. M. Microglia and monocytes: 'tis plain the twain meet in the brain. Nat Neurosci. 14 (9), 1098-1100 (2011).
  28. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
  29. Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration. Nat Neurosci. 14 (10), 1227-1235 (2011).
  30. Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. Physiology of microglia. Physiol Rev. 91 (2), 461-553 (1152).
  31. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nat Neurosci. 16 (3), 273-280 (2013).
  32. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  33. Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154 (9), 4309-4321 (1995).
  34. Herber, D. L., et al. Diverse microglial responses after intrahippocampal administration of lipopolysaccharide. Glia. 53 (4), 382-391 (2006).
  35. Saederup, N., et al. Selective chemokine receptor usage by central nervous system myeloid cells in CCR2-red fluorescent protein knock-in mice. PLoS One. 5 (10), 13693(2010).
  36. Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. J Immunol. 188 (1), 29-36 (2012).
  37. Iwasaki, A. The use of bone marrow-chimeric mice in elucidating immune mechanisms. Methods Mol Med. 127, 281-292 (2006).
  38. Spangrude, G. J. Assessment of lymphocyte development in radiation bone marrow chimeras. Curr Protoc Immunol. 4 (4.6), (2008).
  39. Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48 (1), 11-22 (2009).
  40. Koon, H. W., Ho, S., Cheng, M., Ichikawa, R., Pothoulakis, C. Differentiating functional roles of gene expression from immune and non-immune cells in mouse colitis by bone marrow transplantation. J Vis Exp. e4208. , 4208(2012).
  41. London, A., Cohen, M., Schwartz, M. Microglia and monocyte-derived macrophages: functionally distinct populations that act in concert in CNS plasticity and repair. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
  42. Jung, S., Schwartz, M. Non-identical twins - microglia and monocyte-derived macrophages in acute injury and autoimmune inflammation. Front Immunol. 3, 89(2012).
  43. Evans, T. A., et al. High-resolution intravital imaging reveals that blood-derived macrophages but not resident microglia facilitate secondary axonal dieback in traumatic spinal cord injury. Exp Neurol. 254, 109-120 (2014).
  44. Butovsky, O., et al. Identification of a unique TGF-β-dependent molecular and functional signature in microglia. Nat Neurosci. 17 (1), 131-143 (2014).
  45. Lee, J. H., et al. A contusive model of unilateral cervical spinal cord injury using the infinite horizon impactor. J Vis Exp. 65, 3313-3310 (2012).
  46. Krishna, V., et al. A contusion model of severe spinal cord injury in rats. J Vis Exp. (78), (2013).
  47. Zhang, Y. P., et al. Controlled cervical laceration injury in mice. J Vis Exp. 75, 50030(2013).
  48. Shen, Y., et al. PTPsigma is a receptor for chondroitin sulfate proteoglycan, an inhibitor of neural regeneration. Science. 326 (5952), 592-596 (1126).
  49. Ek, C. J., et al. Spatio-temporal progression of grey and white matter damage following contusion injury in rat spinal cord. PLoS One. 5 (8), e12021(2010).
  50. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  51. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
  52. Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. J Neurosci. 31 (31), 11159-11171 (2011).
  53. Kierdorf, K., Katzmarski, N., Haas, C. A., Bone Prinz, M. marrow cell recruitment to the brain in the absence of irradiation or parabiosis bias. PLoS One. 8 (3), e58544(2013).
  54. Filous, A. R., Evans, T. A., Lang, B. T., Silver, J. Synaptic-like connections between dystrophic axons and NG2+ cells: Another reason for regeneration failure after spinal cord injury. Neuroscience 2013, Society for Neuroscience. , Abstracts. San Diego. (2013).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Uraz rdzenia kr gowegomikroglej i makrofagichimera szpiku kostnegomikroskopia dwufotonowaznakowanie fluorescencyjnestabilizacja rdzenia kr gowegoanaliza interakcji kom rkowychmyszy reporterowe GFP

Powiązane artykuły