Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zautomatyzowany pomiar rozedmy płuc i przebudowy małych dróg oddechowych u myszy narażonych na dym papierosowy

13K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52236

⸱

16 stycznia 2015

 ,  ,  ,  , 
1Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Brigham and Women's Hospital - Harvard Medical School, 2Department of Respiratory Medicine, University of Cambridge - Addenbrooke's Hospital, 3Lung Transplant Program, Brigham and Women's Hospital - Harvard Medical School, 4COPD and IPF Programs, Lovelace Respiratory Research Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest dostarczenie zautomatyzowanych metod ilościowego określania przewlekłych patologii płuc w mysim modelu POChP. Protokół obejmuje wystawienie myszy na dym papierosowy (CS), pomiar czynności płuc, napompowanie płuc oraz zastosowanie metod morfometrycznych do pomiaru rozedmy płuc i przebudowy małych dróg oddechowych u myszy.

Streszczenie

Przewiduje się, że POChP będzie trzecią najczęstszą przyczyną śmiertelności na świecie do 2020 roku(1). Modele zwierzęce POChP są wykorzystywane do identyfikacji cząsteczek, które przyczyniają się do procesu chorobowego oraz do testowania skuteczności nowych terapii POChP. Naukowcy wykorzystują szereg modeli POChP z wykorzystaniem różnych gatunków, w tym gryzoni, świnek morskich, królików i psów(2). Jednak najczęściej stosowanym modelem jest ten, w którym myszy są narażone na dym papierosowy. Myszy są szczególnie użytecznym gatunkiem do modelowania POChP, ponieważ ich genomem można łatwo manipulować w celu uzyskania zwierząt, które mają niedobór lub nadmierną ekspresję pojedynczych białek. Badania myszy ukierunkowanych na geny, które były narażone na dym papierosowy, dostarczyły cennych informacji na temat udziału poszczególnych cząsteczek w różnych patologiach płuc w POChP (3-5). Większość badań koncentrowała się na szlakach zaangażowanych w rozwój rozedmy płuc, która przyczynia się do niedrożności przepływu powietrza, która jest charakterystyczna dla POChP. Jednak małe zwłóknienie dróg oddechowych również znacząco przyczynia się do niedrożności przepływu powietrza u pacjentów z POChP (6), ale znacznie mniej wiadomo na temat patogenezy tej zmiany u zwierząt narażonych na dym tytoniowy. Aby wypełnić tę lukę w wiedzy, protokół ten określa ilościowo zarówno rozwój rozedmy płuc, jak i zwłóknienie małych dróg oddechowych u myszy narażonych na dym tytoniowy. Protokół ten wystawia myszy na działanie CS przy użyciu techniki ekspozycji całego ciała, a następnie mierzy mechanikę oddechową u myszy, napełnia płuca myszy do standardowego ciśnienia i mocuje płuca w formalinie. Następnie badacz barwi skrawki płuc barwnikiem Gilla, aby zmierzyć średnią długość struny wyrostka zębodołowego (jako odczyt ciężkości rozedmy płuc), lub barwnikiem trichromowym Massona, aby zmierzyć odkładanie się białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) wokół małych dróg oddechowych (jako odczyt zwłóknienia małych dróg oddechowych). Badania nad wpływem szlaków molekularnych na obie te patologie płuc doprowadzą do lepszego zrozumienia patogenezy POChP.

Wprowadzenie

Wykorzystanie modeli zwierzęcych do badania POChP jest wyzwaniem, ponieważ żaden model nie jest w stanie idealnie odtworzyć wszystkich cech ludzkiej choroby(2). Większość badaczy używa myszy do modelowania POChP ze względu na podobieństwa między myszami a ludźmi w ich fizjologii płuc, patologii, genetyce i metabolitach. Ponadto myszy są stosunkowo niedrogie w badaniu, a zarówno rozedma płuc, jak i przebudowa małych dróg oddechowych rozwijają się w ciągu 6 miesięcy od ekspozycji na CS (5,7-9).

POChP wywołana dymem papierosowym: Kilka metod może wywołać POChP u myszy. Większość badaczy naraża myszy na CS, który jest głównym czynnikiem etiologicznym POChP u ludzi. Ekspozycja na CS przez 6 miesięcy powoduje rozwój rozedmy płuc i przebudowy małych dróg oddechowych (SAR) u myszy, ale nasilenie wywoływanej choroby różni się w zależności od badanego szczepu myszy. Na przykład myszy NZWLacZ są odporne na rozwój rozedmy płuc wywołanej przez CS, podczas gdy myszy AKR/J są niezwykle wrażliwe (10). Większość badaczy bada myszy szczepu C57BL / 6 w modelu ekspozycji CS, ponieważ wiele myszy ukierunkowanych na gen jest dostępnych w tym szczepie. Po 6 miesiącach ekspozycji na CS rozedma płuc i zwłóknienie małych dróg oddechowych rozwijają się u myszy C57BL / 6 typu dzikiego (WT), a obie zmiany są stosunkowo łagodne pod względem nasilenia (5,10). Naukowcy stosują dwa rodzaje ekspozycji na CS: ekspozycję tylko na nos i ekspozycję na całe ciało. Główne wady techniki naświetlania tylko przez nos to, że: 1) jest to metoda bardziej pracochłonna; oraz 2) myszy muszą być trzymane w małych komorach, co może wywołać reakcję stresową i hipertermię u zwierząt [11]. Główną wadą ekspozycji na całe ciało (opisaną w niniejszym dokumencie) jest to, że zwierzęta mogą spożywać (a także wdychać) produkty nikotynowe i smoliste podczas czyszczenia sierści. Myszy narażone na CS całego ciała mają również niższy poziom karboksyhemoglobiny i zmniejszoną utratę masy ciała w porównaniu ze zwierzętami narażonymi na CS tylko przez nos (12).

Test czynnościowy płuc (PFT): Miary podatności płuc i elastancji są zwykle podobne u myszy C57BL/6 typu dzikiego (WT) wystawionych na działanie powietrza lub CS przez 6 miesięcy ze względu na stosunkowo łagodną rozedmę płuc, która rozwija się, gdy ten szczep jest narażony na CS(10). Jednakże, gdy zniszczenie rozedmy płuc jest poważniejsze, można wykryć wzrost podatności płuc i przesunięcia w lewo w pętlach przepływu ciśnienie-objętość (PV). To ostatnie można zaobserwować, na przykład, u szczepów mysich, które są bardziej podatne na działanie CS (10), u myszy z genem C57BL / 6 narażonych na CS, które mają cięższy typ rozedmy płuc niż myszy C57BL / 6 WT (13) lub u myszy narażonych na CS poddanych zmianom środowiskowym, które czynią je bardziej podatnymi na działanie CS (14). Protokół ten wykorzystuje respirator dla małych zwierząt do pomiaru zmniejszenia elastycznego odrzutu płuc (wzrost quasistatycznej podatności płuc [Cst] i zmniejszenie elastyczności tkanek [H]), pętle przepływu PV oraz zmiany w oporze dróg oddechowych i tkanek u znieczulonych myszy (15,16).

Pomiary rozedmy płuc: Analiza rozwoju rozedmy płuc u myszy ze szczepem C56BL/6 narażonym na CS jest trudna, ponieważ jej rozkład jest przestrzennie niejednorodny. Kilka różnych metod określa ilościowo powiększenie przestrzeni powietrznej u myszy. Pierwszą zastosowaną metodą było średnie przecięcie liniowe (Lm) [17]. Metoda Lm jest jednak powolnym, ręcznym procesem, który może nie uchwycić niejednorodności choroby (chyba że wszystkie odcinki płuc są losowo pobierane próbki), a zatem jej stosowanie może wprowadzić do analizy stronniczość obserwatora. Wskaźnik destrukcyjny [DI,(18)] określa również ilościowo powiększenie przestrzeni powietrznej za pomocą przezroczystego arkusza z 50 równomiernie rozmieszczonymi punktami umieszczonymi na wydrukowanym cyfrowym obrazie wycinka płuc zabarwionego hematoksyliną i eozyną. Metoda PI ocenia obszar otaczający każdy punkt w zależności od stopnia, w jakim przewody pęcherzykowe i ściany wyrostka zębodołowego w tym obszarze są zniszczone. Główną wadą metody DI jest to, że jest czasochłonna i nie jest dokładniejsza niż inne metody (19,20).

Ten protokół mierzy średnią długość cięciwy zębodołowej i obszar wyrostka zębodołowego na zatopionych w parafinie odcinkach płuc zabarwionych barwnikiem Gilla. Oprogramowanie morfometryczne konwertuje obrazy przekrojów płuc na obrazy binarne (w których tkanka jest biała, a przestrzeń powietrzna), a następnie nakłada jednolitą siatkę poziomych i pionowych linii (cięciw), a następnie oprogramowanie określa ilościowo długość każdej cięciwy w obszarach zidentyfikowanych przez oprogramowanie jako przestrzeń powietrzna. Za pomocą tej metody możliwe jest zmierzenie wielkości pęcherzyków płucnych we wszystkich częściach płuc w sposób znormalizowany i stosunkowo zautomatyzowany (21).

Przebudowa małych dróg oddechowych (SAR): Zwiększone odkładanie się białek ECM (zwłaszcza kolagenów śródmiąższowych) wokół małych dróg oddechowych występuje u zwierząt narażonych na CS i przyczynia się do niedrożności przepływu powietrza. Naukowcy nie badają SAR w zwierzęcych modelach POChP tak często, jak rozwój rozedmy płuc (22). Aby określić ilościowo SAR u myszy narażonych na CS, protokół ten wykorzystuje oprogramowanie do analizy obrazu do pomiaru grubości warstwy białek ECM, która osadza się wokół małych dróg oddechowych (drogi oddechowe o średniej średnicy od 300 do 899 m) w zatopionych w parafinie odcinkach płuc wybarwionych barwieniem trychromowym Massona.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Realizacja protokołu trwa ~25 tygodni. W protokole myszy były wystawione na działanie powietrza lub dymu przez 24 tygodnie. Pod koniec ekspozycji na dym tytoniowy protokół mierzy czynność płuc u myszy, a płuca są napełniane do ustalonego ciśnienia, ustalane i usuwane tego samego dnia. Dodatkowy czas jest potrzebny badaczowi na osadzenie, wycięcie i zabarwienie skrawków płuc (2-3 dni) oraz uchwycenie i przeanalizowanie obrazów (2-4 dni w zależności od liczby badanych zwierząt). Protokół ten może być również stosowany do pomiaru związanego z wiekiem powiększenia przestrzeni powietrznej u myszy.

Wszystkie procedury opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania w Brigham and Women's Hospital/Harvard Medical School.

1. Narażenie na dym papierosowy całego ciała

  1. Wystaw myszy na działanie dymu w urządzeniu do ekspozycji na dym całego ciała (patrz rysunek 1) zainstalowanym w dygestorium.
    UWAGA: Urządzenie automatycznie ładuje papierosy badawcze do koła, zapala papierosy i zbiera dym ze strumienia bocznego w komorze zbierania dymu w strumieniu bocznym i wyrzuca papierosy. Maszyna łączy dym ze strumienia bocznego z dymem głównym usuwanym z papierosa przez pompę, tworząc mieszaninę dymu głównego i bocznego. Wentylator w komorze mieszania i rozcieńczania miesza dym z powietrzem otoczenia i kieruje dym do komór ekspozycyjnych.
  2. Umieść klatki zawierające myszy bez zdjętych pokryw klatek (rysunek 1) w komorze ekspozycyjnej. Pozwól myszom swobodnie poruszać się w klatkach i mieć dostęp do jedzenia i wody na czas ekspozycji na dym (~ 1,75 h).
  3. Umieść wiadro wypełnione wodą pod komorą na papierosy, aby zgasić wyrzucone papierosy. Przepuść etanol (100%) przez pompę i podłącz go do urządzenia. Włącz element mikroprocesorowy urządzenia, który inicjuje automatyczne ładowanie papierosów, zaciąganie się pompą i podgrzewanie przewodu zapalającego papierosy.
  4. Urządzenie ładuje, zapala i pali jednorazowo 10 papierosów, a następnie wyrzuca zużyte papierosy i zastępuje je nową partią 10 papierosów i powtarza ten proces. Każdy cykl trwa 9 minut.
  5. Przyzwyczaj myszy do palenia, wystawiając je na dym z 20 papierosów pierwszego dnia, 40 papierosów drugiego dnia, 60 papierosów trzeciego dnia, 80 papierosów czwartego dnia i 100 papierosów piątego dnia. W okresie aklimatyzacji uważnie obserwuj myszy pod kątem oznak niepokoju.
  6. Po 5 dniach aklimatyzacji wystawiaj myszy na 100 papierosów dziennie, 5 lub 6 dni w tygodniu przez 6 miesięcy. Ten poziom ekspozycji na dym jest potrzebny do wywołania stosunkowo niewielkiego powiększenia przestrzeni powietrznej u myszy C57BL / 6 typu dzikiego (23,24). Myszy kontrolne należy wystawiać na działanie powietrza w pomieszczeniu przez 6 miesięcy. Zważ myszy przed aklimatyzacją dymu, a następnie co tydzień, aby ocenić wpływ narażenia na dym na masę ciała.
  7. Monitorować całkowitą zawartość pyłu zawieszonego (TSPM) w komorach ekspozycyjnych po wypaleniu pierwszych 60 papierosów:
    1. Zważyć bibułę filtracyjną i umieścić ją w uchwycie filtra liniowego, który jest podłączony do próbnika filtra z pomiarem czasu i miernika suchego gazu. Próbnik z filtrem czasowym zasysa powietrze z komory ekspozycyjnej przez bibułę filtracyjną, a gazomierz mierzy przepływ powietrza podczas pobierania próbek.
      UWAGA: Filtr wychwytuje cząstki stałe, gdy przez filtr przechodzi 20m3 powietrza w komorze ekspozycyjnej (mierzone na suchym gazomierzu).
    2. Obliczyć liczbę TPM jako zmianę masy filtra przed i po pobraniu próbek (w mg) nam3 powietrza. Idealna liczba TPM wynosi od 150 do 200 mg/m3.
  8. Po wypaleniu wszystkich papierosów wyjmij klatki z komory ekspozycyjnej i obserwuj myszy pod kątem oznak niepokoju przez 20 minut.
  9. Po każdym użyciu wyczyść pompę 100% etanolem i czyść wszystkie porty i pręty w maszynie co dwa tygodnie, aby pobudzić cyrkulację powietrza i zapobiec gromadzeniu się smoły.

2. Test czynnościowy płuc (PFTS) i inflacja płuc

  1. Pod koniec ekspozycji znieczulij każdą mysz, podając koktajl ketaminy (100 mg / kg), ksylazyny (10 mg / kg) i acepromazyny (3 mg / kg) drogą dootrzewnową w 200 μl soli fizjologicznej (klasa USP) i użyj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec ich wysuszeniu. Poczekaj, aż zwierzę znajdzie się w chirurgicznej płaszczyźnie znieczulenia, ocenia metodą szczypania palców.
  2. Ogolić skórę przed tchawicą i zdezynfekować obszar roztworem zawierającym jod, a następnie etanolem. Wykonaj nacięcie w linii środkowej przez skórę i tkankę podskórną przed tchawicą za pomocą autoklawowanych nożyczek i oddziel mięśnie mostkowo-tarczycowe kleszczami, aby odsłonić tchawicę.
  3. Przełóż 2-calowy jedwabny szew z tyłu do tchawicy, wykonaj tracheotomię na przedniej stronie tchawicy za pomocą autoklawowanych nożyczek tchawicy, włóż kaniulę tchawicy (18 G) do tracheotomii i zabezpiecz ją na miejscu za pomocą szwu.
  4. Podłącz mysz do rurki Y adaptera respiratora mechanicznego za pomocą kaniuli tchawicy i rozpocznij wentylację mechaniczną przy użyciu objętości oddechowej 10 ml/kg i częstości oddechów 150 oddechów/min.
    UWAGA: Na tym etapie ważne jest, aby upewnić się, że mysz jest odpowiednio znieczulona, aby uzyskać dokładne pomiary PFT. Ponownie dozuj mysz środki znieczulające, jeśli zwierzę nie znajduje się w znieczuleniu chirurgicznym. Cały czas trwania wszystkich manewrów PFT wynosi około 7,5 minuty, więc zwykle nie jest konieczne ponowne dawkowanie myszom środków znieczulających po osiągnięciu chirurgicznej płaszczyzny znieczulenia. Całkowity czas od indukcji znieczulenia do eutanazji wynosi ~20 minut.
  5. Napompuj płuca do całkowitej pojemności płuc (TLC) 3 razy, aby uzyskać wywiad objętościowy, aby zmierzyć pojemność wdechową (IC) i zmniejszyć niedodmę płuc. Następnie wykonaj manewr wymuszonej oscylacji o pojedynczej częstotliwości (perturbacja SnapShot-150) i oceń opór dynamiczny (R), elastancję (Ers) i podatność (Crs) układu oddechowego, a następnie manewr wymuszonej oscylacji o częstotliwości szerokopasmowej (perturbacja Quick Prime-3) i zmierz opór ośrodka dróg oddechowych (Rn), opór tkanek (G), elastan tkanek (H) i stosunek G/N (). Na koniec należy zarejestrować podatność quaszyczno-statyczną (Cst) podczas manewrów przepływu objętościowo-ciśnieniowego.
  6. Powtórz każdy z tych manewrów pięć razy (lub wykonaj dodatkowe pomiary, aż do uzyskania spójnych odczytów) i napompuj do TLC trzy razy między każdym powtórzonym zestawem pomiarów. Zapisz średnią wartość dla każdego parametru dla każdej myszy.
  7. Wyjmij mysz z respiratora mechanicznego i poddaj ją eutanazji za pomocą narkozy CO2, a następnie zwichnięcia szyjki macicy [ta metoda eutanazji została zatwierdzona przez nasz Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt]. Przetnij przeponę, otwórz klatkę piersiową w linii środkowej i usuń przednie żebra, aby odsłonić płuca. Rozetnij skórę i tkankę podskórną wokół tchawicy i przełóż drugi 2-calowy jedwabny szew za tchawicą.
  8. Przygotuj sprzęt do napełniania płuc (ryc. 2):
    1. Napełnić stożkową kolbę Erlenmeyera o pojemności 500 ml do 3/4 sterylnym PBS, zamknąć gumowym korkiem, odwrócić i zawiesić na stojaku pierścieniowym (tak, aby menisk buforowanego fosforanem soli fizjologicznej o pH 7,4 (PBS) znajdował się 25 cm powyżej serca myszy).
    2. Włożyć jeden koniec zestawu do podawania dożylnego do PBS w kolbie przez gumowy korek. Włożyć plastikową pipetę serologiczną o długości 6 cali przez gumowy korek tak, aby jej otwór znajdował się powyżej menisku PBS, aby umożliwić wymianę PBS powietrza opuszczającego kolbę.
    3. Otwórz zawór zestawu podającego i przepuść PBS przez system, aby wypłukać powietrze z zestawu podającego.
  9. Podłącz zestaw do podawania dożylnego do kaniuli tchawicy, otwórz zastawkę i pozwól, aby PBS przepływał do płuc grawitacyjnie, aż płuca całkowicie się napełnią. Zamknij zastawkę, zwiąż tchawicę za pomocą szwu chirurgicznego dystalnego do kaniuli tchawicy i wyjmij kaniulę.
  10. Podnieś tchawicę kleszczami i przetnij tchawicę proksymalnie do węzła i wypreparuj tkankę łączną za tchawicą i płucami. Ostrożnie usuń płuca (bez ich nacinania) i umieść płuca w probówce zawierającej 10% formaliny buforowanej solą fizjologiczną. Ustal płuca O/N w RT, a następnego dnia przemyj je dwukrotnie PBS.
  11. Zanurz płuca w parafinie, wytnij odcinki o grubości 5 μm, a następnie zabarwij skrawki barwnikiem Gilla, jak opisano poniżej.

3. Rozedma płuc

  1. Barwienie skrawków płuc zatopionych w parafinie
    1. Umieść szkiełka w plastikowym ruszcie i inkubuj je w temperaturze 70ºC przez 20-30 minut w piekarniku.
    2. De-pariffinizacja szkiełek poprzez inkubację przez 2 minuty w każdej z czterech przemian ksylenu.
    3. Ponownie uwodnić szkiełka, inkubując je przez 2-3 minuty w każdej z dwóch przemian 100% etanolu, a następnie 2-3 minuty w każdej z dwóch zmian 95% etanolu, a następnie umyć szkiełka dwukrotnie w PBS przez 2-3 minuty na każdą zmianę roztworu.
    4. Inkubować szkiełka przez 18-48 godzin w mieszaninie 1:1 hematoksyliny Gilla i zmodyfikowanej hematoksyliny Harrisa.
    5. Myć szkiełka przez 2 minuty w każdej z pięciu podmian wody destylowanej i odwodnić szkiełka, inkubując następnie przez 2-3 minuty w każdej z dwóch przemian 95% etanolu, a następnie 2-3 minuty w każdej z 2 zmian 100% etanolu.
    6. Oczyścić szkiełka, inkubując je przez 2 minuty w każdej z czterech przemian ksylenu.
    7. Zamontuj szkiełka z przezroczystym nośnikiem montażowym i dodaj szkiełko nakrywkowe bez wprowadzania pęcherzyków, które utrudnią późniejszą analizę.
  2. Losowa akwizycja obrazu:
    1. Rejestruj czarno-białe obrazy w formacie TIFF za pomocą mikroskopu, obiektywu 20X oraz aparatu i oprogramowania, które może rejestrować wysokiej jakości obrazy cyfrowe.
    2. Uchwyć ~20-30 obrazów (powiększenie X 200) na mysz w sposób losowy, z obserwatorem zaślepionym na warunki eksperymentalne, unikając niedopompowanych obszarów płuc.
    3. Przyklej do szkiełka wizjer z mikroprowadnicą. Szukacz terenowy ma siatkę zawierającą serię kwadratów, które są oznaczone literą (w kierunku pionowym) i cyfrą (w kierunku poziomym), a każdy kwadrat ma krzyżyk (+) pośrodku i jest oznaczony jedną literą i cyfrą (np. A1, A2,......Z25).
    4. Użyj arkusza kalkulacyjnego Excel Generatora pól losowych, aby losowo wybrać kwadrat do przechwycenia obrazu. Aby utworzyć losową literę, wpisz EFGHJKLMNPQRSTU w komórce B1 w arkuszu kalkulacyjnym (badacz może dostosować ten zakres liter, aby objąć zakres kwadratów oznaczonych literą, które pokrywają płuca). Następnie dodaj formułę [=MID($B$1,1+INT(RAND()*LEN($B$1)] do komórki C1, aby losowo wybrać literę w C1. Skopiuj i wklej C1 do C2, C3, C4 i tak dalej, aby wygenerować kolumnę losowych liter.
    5. Aby utworzyć liczbę losową w sąsiedniej kolumnie, wpisz formułę =RANDBETWEEN(5,25) w D1 (gdzie 5-25 to typowy zakres tkanki na slajdzie). Opcjonalnie dostosuj ten zakres, aby objąć zakres kwadratów oznaczonych liczbą, która pokrywa płuca.
    6. Skopiuj i wklej D1 do D2, D3, D4 i tak dalej, aby wygenerować kolumnę liczb losowych obok kolumny zawierającej losowe litery. W ten sposób każdy wiersz zawiera parę losowo wygenerowanych liter i cyfr odpowiadających etykietom na kwadratach w szukaczu terenowym (np. E17, H24....).
    7. Umieść szkiełko na mikroskopie. Za pomocą obiektywu mikroskopu 4X znajdź odpowiedni kwadrat na szkiełku szukacza pola (np. E17, H24...) i umieść ten kwadrat na środku pola mikroskopu.
    8. Wyrównaj środek mikroskopijnego pola z znakiem "+" na środku wybranego kwadratu. Wyjmij szukacz terenowy, ustaw ostrość na płucu za pomocą obiektywu mikroskopu 20X i uzyskaj obraz jako plik TIF w skali szarości. Jeśli tkanka płucna pokrywa <50% pola mikroskopowego, wybierz następny losowo wygenerowany kwadrat. Powtarzaj, aż zostanie zrobionych ~20-30 obrazów dla każdego zwierzęcia. Zapisz wszystkie obrazy dla każdego zwierzęcia w jednym folderze oznaczonym numerem znacznika zwierzęcia, aby makro raportu programu Excel rozpoznało pliki.

4. Morfometria do pomiaru rozedmy płuc

Protokół wykorzystuje Scion Image i niestandardowe makra do analizy powiększenia przestrzeni powietrznej. Scion Image to kompatybilna z systemem Windows wersja oryginalnej aplikacji NIH Image, która działa w systemie operacyjnym Macintosh. Scion Image działa pod kontrolą systemu Windows XP i jest nadal dostępny online za pośrednictwem Wikiversity.org, gdzie wyszukiwanie "Scion Image" przekieruje użytkownika do linków do podręcznika i wersji beta 4.0.2 Scion Image. Instalacja i obsługa oprogramowania są szczegółowo opisane w instrukcji uzupełnienia online i podsumowane poniżej. Makro długości cięciwy wyrostka zębodołowego zostało zaadaptowane z makra dostępnego w NIH Image.

  1. Przygotuj obraz TIFF barwionego wycinka płuca Gilla do analizy obrazu Scion:
    1. Uruchom Scion Image i załaduj makra zgodnie z opisem w suplemencie online. Wybierz makro Otwórz obraz w jasnym polu [1], aby wybrać i otworzyć plik TIFF obrazu. Następnie użyj narzędzi do edycji obrazu, aby przygotować obraz do analizy.
    2. Użyj narzędzia Pędzel malarski, aby wymusić traktowanie obszarów obrazu, które nie są przestrzenią powietrzną lub ścianami wyrostków zębodołowych, jako przestrzeni powietrznej lub tkanki. Na przykład pomaluj oskrzela i naczynia na czarno, aby były analizowane jako tkanka. Pomaluj komórki zapalne (lub kurz) zajmujące przestrzeń w pęcherzykach płucnych na biało, aby były analizowane jako przestrzeń powietrzna.
    3. Wybierz kolor pędzla malarskiego, klikając wskaźnik myszy na słowa lub Biały u dołu okna LUT. Następnie kliknij narzędzie pędzla. Aby zmienić rozmiar pędzla, kliknij dwukrotnie narzędzie pędzla i wprowadź odpowiedni rozmiar pędzla. Kliknij i przeciągnij myszką nad obrazem, aby pomalować struktury na wybrany kolor (patrz #1 powyżej).
  2. Pomiar średniej długości cięciwy w przestrzeni powietrznej
    1. Wybierz makro Długość cięciwy Air [2], aby zmierzyć długości cięciwy przestrzeni powietrznej.
    2. Określ próg obrazu, klikając najpierw myszą w pobliżu środka obrazu, a następnie przeciągnij myszą w górę lub w dół, aby dostosować wartość progową (liczbę z zakresu od 0 do 255, która jest wyświetlana w oknie Informacje). Kliknij myszą po raz drugi, aby zaakceptować wartość progową. Dostosuj próg, aby ścianki wyrostka zębodołowego miały taką samą grubość jak na oryginalnych obrazach.
      UWAGA: Bardzo ważne jest, aby badacz nie zaniżał progu, a tym samym nie tworzył przerw w ściankach wyrostka zębodołowego, które nie występują na oryginalnym obrazie, co spowoduje sztucznie zawyżone wartości długości cięciwy.
    3. Program automatycznie usuwa pojedyncze piksele (pojedyncze czarne piksele otoczone 8 białymi pikselami).
    4. EM>4.2.4. Obserwuj okno, które monituje użytkownika o ponowne ustawienie progu obrazu binarnego, kontynuowanie makra lub anulowanie makra. Aby ponownie przekroczyć próg, odpowiedz Y na monit i wybierz przycisk OK.
    5. EM>4.2.5. Wizualizuj poziome i pionowe okno siatki z liniami oddalonymi od siebie o 5 pikseli utworzonymi przez makra. Program mierzy długości linii poziomych i pionowych, które nakładają się na przestrzeń powietrzną.
    6. Zapisz plik w dowolnym folderze, ale nie zmieniaj nazwy domyślnej, w przeciwnym razie makra raportu programu Excel nie znajdą pliku (format to nazwa obrazu dołączona do "CLa.txt" dla długości cięciwy przestrzeni powietrznej.
      UWAGA: Jeśli program nie wykonuje pomiarów, wartość progowa może być zbyt niska (musi wynosić > 1). W takim przypadku badacz ponownie proguje obraz przy użyciu wyższej wartości.
    7. EM>4.2.7. W przypadku pomiarów powierzchni wyrostka zębodołowego (oprócz długości cięciwy) uruchom również dodatkowe makra [4] i [5].
    8. EM>4.2.8. Kontynuuj, aż wszystkie obrazy zostaną przeanalizowane.
  3. Analizowanie wyników za pomocą makr raportów programu Excel
    1. Otwórz 20x.xls Raport programu Excel. W razie potrzeby ręcznie włącz makra, w zależności od domyślnego ustawienia zabezpieczeń w używanej wersji programu Excel.
    2. Obserwuj listę makr w oknie Makro (patrz Tabela 1).
      UWAGA: CL_Air_1 podaje długość cięciwy przestrzeni powietrznych dla pojedynczego zwierzęcia (folder). CL_Air_Multi informuje o długości cięciwy przestrzeni powietrznej dla wielu zwierząt (folderów). AP_No_Edge_1 podaje obszar pęcherzyków płucnych bez styków krawędziowych dla pojedynczego zwierzęcia (folder). AP_No_Edge_Multi raportuje obszar pęcherzyków płucnych bez styków krawędziowych dla wielu zwierząt (foldery). AP_With_Edge_1 raportuje obszar pęcherzyków płucnych z kontaktami krawędziowymi dla pojedynczego zwierzęcia (folder). AP_With_Edge_Multi raportuje obszar pęcherzyków płucnych z kontaktami krawędziowymi dla wielu folderów.
    3. Wybierz makro CL_Air_Multi, aby raportować pomiary długości cięciwy wyrostka zębodołowego dla wielu folderów odpowiadających obrazom z wielu myszy. Program zgłasza wszystkie pliki _CLa.txt w wybranych folderach. Pomiń plik _CLa.txt (w razie potrzeby), przenosząc go do podfolderu bieżącego folderu lub zmieniając nazwę _CLa części.
    4. W oknie pliku wybierz jeden folder na raz, podświetlając folder, a następnie wybierając OK (program nie obsługuje wielokrotnego wyboru jednocześnie). Gdy każdy folder jest wybierany, obserwuj go w arkuszu. Wybierz "Anuluj" lub zamknij okno pliku, aby kontynuować.
      UWAGA: W zależności od wersji programu Excel badacz może być zmuszony do cofnięcia się o jeden poziom folderu po wybraniu każdego folderu.
    5. Obserwuj oddzielny arkusz dla każdego folderu, pokazujący statystyki dla każdego pliku _CLa.txt, a następnie statystyki dla danych długości cięciwy połączonych ze wszystkich _CLa.txt plików.
    6. Oddzielny arkusz "Wszystkie CL" zawiera wszystkie dane ze wszystkich arkuszy.
    7. Zmień nazwę arkusza kalkulacyjnego i zapisz go. Domyślna nazwa pliku to nazwa folderu nadrzędnego z dołączoną nazwą _CLa.xls. Zamknij arkusz przed wybraniem innego makra.

5. Przebudowa małych dróg oddechowych

  1. Barwienie i akwizycja obrazu
    1. Wybarwić skrawki płuc barwnikiem trichromowym Massona za pomocą zestawu komercyjnego i postępować zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Uchwyć obrazy wszystkich dróg oddechowych w obu płucach, które mogą być całkowicie akomodowane (w tym niebieska warstwa na zewnątrz dróg oddechowych, która jest warstwą białek ECM, które są zdeponowane) w obszarze obrazu za pomocą obiektywu 20X w mikroskopie.
      UWAGA: Większe drogi oddechowe nie są związane ze zwiększonym odkładaniem się białek ECM u myszy narażonych na CS.
    3. Zapisz kolorowe obrazy jako pliki jpeg.
  2. Analiza obrazu: Otwórz plik obrazu w oprogramowaniu do analizy obrazu.
    1. Otwórz plik dziennika i nazwij go, aby zarejestrować pomiary.
    2. Wybierz narzędzie do rysowania linii. Narysuj 4 linie przecinające światło drogi oddechowej (średnicę wewnętrzną), aby zmierzyć rozmiar drogi oddechowej i uwzględnij w analizie tylko te drogi oddechowe, które mają pożądany rozmiar. Następnie narysuj 12 równomiernie rozmieszczonych linii (w miejscu w drogach oddechowych odpowiadającym cyfrom zegara) rozciągających się od krawędzi warstwy przybyszowej przylegającej do drogi oddechowej do krawędzi zabarwionego na niebiesko obszaru otaczającego drogi oddechowe, aby zmierzyć grubość warstwy białek ECM zdeponowanych na zewnątrz dróg oddechowych (ryc. 5). Unikaj mierzenia obszarów, w których drogi oddechowe wchodzą w interakcje z innymi drogami oddechowymi lub naczyniami.
    3. Najpierw zapisz wszystkie linie średnicy wewnętrznej w pliku dziennika, a następnie zapisz 12 linii, które mierzą grubość niebieskiej warstwy ECM wokół dróg oddechowych.
    4. Zamknij obraz, a następnie otwórz następny obraz.
    5. Powtarzaj te kroki, aż wszystkie obrazy zwierzęcia zostaną zarejestrowane w jednym folderze.
    6. Zacznij od kroku 5.2 dla następnego folderu, który zawiera obrazy wykonane na wycinkach płuc od następnego zwierzęcia. Wyjdź z programu po zakończeniu analizy wszystkich dróg oddechowych w odcinkach płuc od wszystkich zwierząt biorących udział w doświadczeniu.
    7. Wprowadź do arkusza kalkulacyjnego Excel 4 pomiary średnicy wewnętrznej i 12 pomiarów grubości warstwy białka ECM zarejestrowanych dla każdej drogi oddechowej dla każdej myszy w plikach dziennika danych. Uśrednić pomiary średnicy i grubości warstwy białka ECM dla każdego zwierzęcia.
    8. Przekonwertuj pomiary z pikseli na mikrony.
    9. Pogrupuj drogi oddechowe według ich średnicy wewnętrznej (np. 300-399 μm, 400-499 μm itp.) i porównaj pomiary grubości warstwy białka ECM wokół dróg oddechowych o podobnych rozmiarach dla myszy narażonych na działanie powietrza i myszy narażonych na dym (np. drogi oddechowe o średnicy 300-899 μm; Rysunek 5).
    10. W razie potrzeby należy immunowybarwić skrawki płuc dla poszczególnych białek (w tym kolagenów śródmiąższowych i białka błony podstawnej) i przeprowadzić podobną analizę w celu ilościowego określenia depozycji białek będących przedmiotem zainteresowania przy użyciu tej metody.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół rozpoczyna się od ekspozycji całego ciała myszy na dym papierosowy (CS). Odpowiedni nadzór i konserwacja urządzenia oraz monitorowanie liczby TPM zapewniają spójność ekspozycji na dym (Rysunek 1). Ważne jest, aby badacz przećwiczył technikę zapawania płuc przy użyciu urządzenia do inflacji

Protokół rozpoczyna się od ekspozycji całego ciała myszy na dym papierosowy (CS). Odpowiedni nadzór i konserwacja urządzenia oraz monitorowanie liczby cząstek TPM zapewnia...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Większość badaczy wykorzystuje myszy do modelowania głównych przewlekłych patologii płuc i nieprawidłowej fizjologii płuc w POChP (powiększenie przestrzeni powietrznej, SAR i wzrost podatności płuc) występujących w chorobie ludzkiej. Kompleksowe podejście do oceny wpływu interesujących cząsteczek zarówno na rozwój rozedmy płuc, jak i SAR jest potrzebne u myszy, aby kompleksowo ocenić aktywność cząsteczek będących przedmiotem zainteresowania w tych przewlekłych procesach chorobowych.

W tym pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie mamy żadnych konfliktów interesów, które moglibyśmy ujawnić.

Podziękowania

Pragniemy podziękować Francesce Polverino, doktorowi naukowemu w Brigham and Women's Hospital za jej wkład w ten artykuł, a także Monice Yao, BS i Kate Rydell, BS za pomoc w hodowli myszy i wystawieniu myszy na dym papierosowy.

Ta praca była wspierana przez Public Health Service, National Heart, Lung, and Blood Institute Grants HL111835, HL105339, HL114501, Flight Attendants Medical Research Institute Grant #CIA123046, Brigham and Women's Hospital-Lovelace Respiratory Research Institute oraz Cambridge NIHR Biomedical Research Centre.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Urządzenie do ekspozycji na dym tytoniowy całego ciałaTeague EnterpriseTE-10zNarażenie na przewlekły dym w celu wywołania przewlekłej choroby płuc u myszy
Papieros badawczyUniversity of KentuckyPapierosy referencyjne 3R4F Pallflex
® Filtry do monitorowania powietrza, Emfab Filters TX40HI20WW, 25 mmPall Corporation7219Do pomiaru TPM
Uchwyt filtra 25 mmPall Corporation
Próbnik filtrówIntermaticMetal T100
GazomierzAEMGazomierze G1.6; G2.5; G4
Kaniula tchawicy dla myszy 18 gaugeLabinventionAnaliza funkcji płuc
Wentylator mechanicznyScireqFlexiVent
Roztwór hematoksyliny Gilla Sigma-AldrichGSH316Do barwienia skrzeli pracuj pod wyciągiem
Roztwór hematoksyliny, zmodyfikowany przez HarrisaSigma-AldrichHHS16
Cytoseal-60Thermo Scientific8310-16
Micro-Slide-Field-FinderAndwin Scientific INC50-949-582Do analizy rozedmy płuc
Scion Image ProgramScion Corporation
Barwienie trichromowe MasonaSigma-AldrichHT15Do analizy zwłóknienia małych dróg oddechowych
MetaMorp Offline wersja 7.0Molecullar Devices LLC31032

Bibliografia

  1. Murray, C. J., Lopez, A. D. Measuring the global burden of disease. N. Engl. J Med. 369, 448-457 (2013).
  2. Wright, J. L., Cosio, M., Churg, A. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Am. J Physiol Lung Cell Mol. Physiol. 295, 1-15 (2008).
  3. Hautamaki, R. D., Kobayashi, D. K., Senior, R. M., Shapiro, S. D. Requirement for macrophage elastase for cigarette smoke-induced emphysema in mice. Science. 277, 2002-2004 (1997).
  4. Churg, A., et al. Late intervention with a myeloperoxidase inhibitor stops progression of experimental chronic obstructive pulmonary disease. Am. J. Respir. Crit Care Med. 185, 34-43 (2012).
  5. Churg, A., Zhou, S., Wang, X., Wang, R., Wright, J. L. The role of interleukin-1beta in murine cigarette smoke-induced emphysema and small airway remodeling. Am J Respir. Cell Mol. Biol. 40, 482-490 (2009).
  6. Hogg, J. C., et al. The nature of small-airway obstruction in chronic obstructive pulmonary disease. N. Engl. J. Med. 350, 2645-2653 (2004).
  7. Paigen, K. A miracle enough: the power of mice. Nat. Med. 1, 215-220 (1995).
  8. Vlahos, R., Bozinovski, S. Recent advances in pre-clinical mouse models of COPD. Clin. Sci. (Lond). 126, 253-265 (2014).
  9. Churg, A., Tai, H., Coulthard, T., Wang, R., Wright, J. L. Cigarette smoke drives small airway remodeling by induction of growth factors in the airway wall). Am. J. Respir. Crit Care Med. 174, 1327-1334 (2006).
  10. Guerassimov, A., et al. The development of emphysema in cigarette smoke-exposed mice is strain dependent. Am. J. Respir. Crit Care Med. 170, 974-980 (2004).
  11. van Eijl, S., van Oorschot, R., Olivier, B., Nijkamp , F. P., Bloksma, N. Stress and hypothermia in mice in a nose-only cigarette smoke exposure system. Inhal. Toxicol. 18, 911-918 (2006).
  12. Mauderly, J. L., et al. Comparison of 3 methods of exposing rats to cigarette smoke. Exp. Pathol. 37, 194-197 (1989).
  13. Yao, H., et al. Extracellular superoxide dismutase protects against pulmonary emphysema by attenuating oxidative fragmentation of ECM. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 15571-15576 (2010).
  14. Crane-Godreau, M. A., et al. Modeling the influence of vitamin D deficiency on cigarette smoke-induced emphysema. Front Physiol. 4, 132(2013).
  15. McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. J Vis. Exp. , e50172(2013).
  16. De Vleeschauwer, S. I., et al. Repeated invasive lung function measurements in intubated mice: an approach for longitudinal lung research. Lab Anim. 45, 81-89 (2011).
  17. Dunnill, M. S. Quantitative methods in the study of pulmonary pathology. Thorax. 17, 320-328 (1962).
  18. Saetta, M., et al. Destructive index: a measurement of lung parenchymal destruction in smokers. Am Rev. Respir. Dis. 131, 764-769 (1985).
  19. Saito, K., Cagle, P., Berend, N., Thurlbeck, W. M. The 'destructive index' in nonemphysematous and emphysematous lungs. Morphologic observations and correlation with function. Am Rev. Respir. Dis. 139, 308-312 (1989).
  20. Robbesom, A. A., et al. Morphological quantification of emphysema in small human lung specimens: comparison of methods and relation with clinical data. Mod. Pathol. 16, 1-7 (2003).
  21. Moghadaszadeh, B., et al. Selenoprotein N deficiency in mice is associated with abnormal lung development. FASEB J. 4, 1585-1599 (2013).
  22. Churg, A., Sin, D. D., Wright, J. L. Everything prevents emphysema: are animal models of cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease any use. Am J Respir. Cell Mol. Biol. 45, 1111-1115 (2011).
  23. McComb, J. G., et al. CX3CL1 up-regulation is associated with recruitment of CX3CR1+ mononuclear phagocytes and T lymphocytes in the lungs during cigarette smoke-induced emphysema. Am. J. Pathol. 173, 949-961 (2008).
  24. Mizumura, K., et al. Mitophagy-dependent necroptosis contributes to the pathogenesis of COPD. J. Clin. Invest. 124, 3987-4003 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekspozycja na dym papierosowybadanie funkcji płucwentylacja mechanicznaanaliza barwienia skrzelibarwienie trichromem Massonadługość strun pęcherzykowychodkładanie macierzy zewnątrzkomórkowejzautomatyzowana analiza obrazu
Zautomatyzowany pomiar rozedmy płuc i przebudowy małych dróg oddechowych u myszy narażonych na dym papierosowy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.