Perfuzja płuc Ex-Vivo (EVLP) umożliwiła przeszczep płuc u ludzi dzięki umożliwieniu oceny narządów i rozszerzeniu puli dawców. W tym miejscu opisujemy rozwój programu EVLP dla szczurów i udoskonalenia, które pozwalają na stworzenie powtarzalnego modelu do przyszłej rozbudowy.
Artykuł metodologiczny
Metoda izolowanej perfuzji płuc ex vivo w modelu szczurzym: wnioski wyciągnięte z opracowania programu EVLP dla szczurów
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Liczba akceptowalnych płuc dawców dostępnych do przeszczepu płuc jest poważnie ograniczona ze względu na niską jakość. Ex Vivo Perfuzja płuc (EVLP) sprawiła, że przeszczep płuc u ludzi stał się łatwiej dostępny, umożliwiając ocenę narządów i rozszerzenie puli dawców. Wraz z rozwojem i ulepszaniem tej technologii, możliwość potencjalnej oceny i poprawy jakości płuc niespełniających norm przed przeszczepem staje się krytyczną potrzebą. W celu bardziej rygorystycznej oceny tych podejść konieczne jest stworzenie powtarzalnego modelu zwierzęcego, który pozwoliłby na testowanie ulepszonych technik i postępowania z płucami dawcy, a także z biorcą przeszczepu płuc. Ponadto zwierzęcy model EVLP powiązanych patologii, np. uszkodzenia płuc wywołanego wentylacją (VILI), zapewniłby nową metodę oceny leczenia tych patologii. W tym miejscu opisujemy rozwój programu płuc EVLP u szczurów i udoskonalenia tej metody, które pozwalają na stworzenie powtarzalnego modelu dla przyszłej ekspansji. Opisano również zastosowanie tego systemu EVLP do modelowania VILI w płucach szczurów. Celem jest dostarczenie społeczności naukowej kluczowych informacji i "pereł mądrości"/technik, które powstały w wyniku prób i błędów i mają kluczowe znaczenie dla ustanowienia systemu EVLP, który jest solidny i powtarzalny.
Wprowadzenie
Znaczenie kliniczne
Obecnie brakuje odpowiednich płuc do przeszczepu, a tylko 19% płuc może być wykorzystanych w kraju, co prowadzi do wydłużenia czasu oczekiwania na przeszczep lub śmierci pacjentów oczekujących na przeszczep1. Niedobór może być spowodowany starszymi dawcami, urazami, infekcjami, niewydolnością wielonarządową, a czasem uszkodzonymi płucami dawcy po pobraniu2. Ponadto płuco jest kruchym narządem znajdującym się poza jamą piersiową, a standardowe techniki transportu i konserwacji mogą prowadzić do pogorszenia stanu płuc i ich niezdolności do życia. W związku z tym utrzymanie i poprawa żywotności płuc ex-vivo stała się ostatnio głównym celem medycyny transplantacyjnej płuc.
Perfuzja płuc ex-vivo (EVLP)
Izolowane systemy perfuzji płuc były używane u małych zwierząt do powodowania uszkodzeń płuc, odtwarzania chorób układu oddechowego i perfuzji płuc różnymi roztworami, aby zapobiec uszkodzeniom niedokrwiennym. Badacze stworzyli model przeszczepu płuc na małych zwierzętach, wykorzystując izolowany system perfuzji płuc do naśladowania protokołów EVLP, które mogą być stosowane u ludzi i większych zwierząt16-18. Jednak ten eksperymentalny model wiąże się z wieloma wyzwaniami w odniesieniu do różnych technik i parametrów stosowanych do naśladowania fizjologii człowieka. W szczególności istnieje wiele subtelności w utrzymaniu żywotności płuc podczas EVLP. Te subtelności mogą wynikać z różnic w technice zbioru, ustawieniach wentylacji nadciśnieniowej, składzie perfuzatu i warunkach przepływu oraz kaniulacji płuc. Dlatego celem jest dostarczenie społeczności badawczej szeregu wskazówek dotyczących rozwiązywania problemów i wdrażania, które, jak znaleźliśmy, prowadzą do solidnej metody implementacji EVLP w modelu gryzoni.
Protokół
UWAGA: Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Institutional Animal Care oraz National Research Council's Guide for the Humane Care and Use of Laboratory Animals (IACUC) i przeszły zatwierdzenie przez komitet IACUC Uniwersytetu Stanowego Ohio.
1. Wstępna konfiguracja
- Ustawić obwód EVLP i sprawić, aby ciepły (37 °C) perfuzat krążył w systemie przed włączeniem wcześniej posadzonego płuca (rysunek 1).
- Ustawić ciepłą kąpiel wodną, używaną do osłony zbiornika perfuzatu, wymiennika ciepła i sztucznej klatki piersiowej, na temperaturę 37 °C i krążyć (rysunek 1).
- Uruchom licznik roztworu odtleniającego (np. 6% O2, 8% CO2, 84% N2) przez perfuzat w filtrze gazu, aby upewnić się, że perfuzat ma ~ 6% rozpuszczonego tlenu do eksperymentu.
UWAGA: Ten odtleniony perfuzat umożliwia ocenę funkcji płuc poprzez pomiar tlenu wprowadzonego do perfuzatu po narządzie. - Otwórz program do akwizycji danych i podłącz przetwornik ciśnienia w tętnicy płucnej, przetwornik różnicy ciśnień tchawicy, przetwornik różnicy ciśnień przepływu oddechowego, przetwornik masy płuc i przetwornik prędkości pompy do obwodu EVLP i skrzynki przetwornika akwizycji danych / przetwornika analogowo-cyfrowego (rysunek 2).
- Ustaw stół operacyjny i narzędzia operacyjne w obwodzie EVLP (Rysunek 3).
- Ustaw mały pojemnik z ciekłym azotem w pobliżu obwodu EVLP, jeśli chcesz uzyskać próbki.
UWAGA: System autora został zmodyfikowany tak, aby zbierać perfuzat przed i po narządach bez przerywania dynamiki przepływu-ciśnienia, która może potencjalnie uszkodzić płuca.
2. Przygotowanie środków znieczulających i heparyny, Znieczulenie szczura
- Przed kontaktem ze szczurami i tkankami szczurów należy założyć następujące środki ochrony osobistej (PPE): maskę chirurgiczną, rękawiczki chirurgiczne i jednorazowy fartuch.
- Zważ szczura i zapisz jego wagę.
- Przygotować 1 200 j./kg heparyny.
- Przygotować zarówno 60 mg/kg ketaminy, jak i 5 mg/kg ksylazyny w tej samej strzykawce, przygotowując najpierw ketaminę.
- Dootrzewnowo wstrzyknąć szczurowi mieszaninę ketaminy i ksylazyny i odczekać, aż szczur straci przytomność przez 5 minut.
- Potwierdź prawidłowe znieczulenie, sprawdzając odruch szczypania palców u stóp. Jeśli szczur nie wycofuje palca u nogi, nie odczuwa bólu.
- Przenieś szczura na stół operacyjny, zabezpiecz w pozycji leżącej i spryskaj alkoholem w celu sterylizacji.
3. Ekstrakcja i wstępna wentylacja płuc szczura
- Przygotuj szwy jedwabne o długości 4-20 cm (powinny wystarczyć 3-0 lub 4-0).
- Rozpocznij rejestrowanie danych za pomocą programu do akwizycji danych.
- Sprawdź, czy znieczulenie jest odpowiednie, za pomocą nożyczek chirurgicznych wprowadź się do jamy otrzewnej przez laparotomię w linii środkowej i wstrzyknij heparynę do żyły głównej dolnej.
- Przenieś nacięcie czaszką obok manubrium do szyi, aż tchawica zostanie odsłonięta. Nie należy rozsadzać klatki piersiowej (ryc. 4A).
- Wyciąć tył tchawicy w linii środkowej i wsunąć jedwabny szew z tyłu do tchawicy (ryc. 4B).
- Podnieś przednią część tchawicy i wykonaj poprzeczne nacięcie między pierścieniami chrzęstnymi, wysoko na tchawicy. Nie przecinaj w tym miejscu tylnej błoniastej części tchawicy (ryc. 4C).
- Kankaniuj tchawicę za pomocą kaniuli tchawicy i zabezpiecz jedwabnym szwem (ryc. 4D). Upewnij się, że więzadło szwu jest zabezpieczone w nacięciu, aby złagodzić migrację kaniuli.
- Podłącz kaniulę tchawicy do obwodu wentylacyjnego.
- Włączyć wentylator mechaniczny, aby rozpocząć mechaniczną wentylację płuc.
UWAGA: Początkowe ustawienia zostały wybrane jako objętość oddechowa 4 ml/kg i dodatnie ciśnienie wydechowe (PEEP) 2 cmH2O. Ustawienia te są ustawieniami początkowymi i w zależności od warunków eksperymentalnych mogą być dostosowywane, gdy narząd znajdzie się w systemie perfuzji ex-vivo. - Wejdź do jamy piersiowej przez mostek/ksyloid i kontynuuj czaszkowo w kierunku wcięcia nadmostkowego. Uważaj, aby nie dotykać płuc.
UWAGA: Ponieważ płuco szczura jest delikatne, każda niezamierzona manipulacja może prowadzić do urazu i obrzęku płuc (ryc. 5A). - Za pomocą 2 zwijaczy cofnij klatkę piersiową, aby prawidłowo odsłonić anatomię (ryc. 5A). Jeszcze raz uważaj, aby nie dotykać płuc.
- Usuń grasicę z lekkim uniesieniem i rozwarstwieniem.
- Przesuń zawartość jamy brzusznej na bok, aby odsłonić żyłę główną dolną (IVC) lub żyłę krezkową (MV).
- Naciąć IVC lub MV, aby wykrwawić szczura, zapewniając eutanazję.
- Umieść jedwabny szew z tyłu tętnicy płucnej i aorty w celu przygotowania do zabezpieczenia kaniuli tętnicy płucnej (ryc. 5B).
- Wykonać nacięcie o średnicy 2-3 mm na przedniej powierzchni drogi odpływu prawej komory i umieścić kaniulę w nacięciu oraz w głównej tętnicy płucnej i zabezpieczyć szwem jedwabnym (ryc. 5C).
- Przeciąć wierzchołek serca, aby umożliwić dostęp do lewej komory i wypłukać wszelkie skrzepy w unaczynieniu płuc, przepływając ~ 15 ml roztworu elektrolitu o niskiej zawartości K + przez tętnicę płucną i na zewnątrz przez wierzchołek serca do jamy klatki piersiowej (ryc. 5D).
- Podłącz kaniulę tętnicy płucnej (PA) do obwodu EVLP. Upewnij się, że przewód dolotowy wychodzący z obwodu do kaniuli PA jest zalany perfuzatem, aby zapobiec przedostawaniu się powietrza do serca i płuc.
- Włącz główną pompę perystaltyczną i ustaw ją na niską (~2 ml/min) prędkość, aby perfuzat mógł przepływać przez tętnicę płucną i wychodzić przez lewą komorę do jamy klatki piersiowej. **KROK KRYTYCZNY** Upewnij się, że ciśnienie PA nie wzrasta, ponieważ jest to oznaką zatoru lub słabej kaniulacji (ryc. 6).
- Wyłącz pompę perystaltyczną.
- Umieść jedwabny szew za sercem, wokół komór (ryc. 7).
- Rozpocznij proces kaniulacji lewego przedsionka, wprowadzając małą parę kleszczy chirurgicznych do wierzchołka, przez zastawkę mitralną i do lewego przedsionka.
UWAGA: Spowoduje to rozszerzenie zastawki mitralnej i ułatwi kaniulację. Agresywne rozszerzenie lub zbyt głębokie rozszerzenie może nieumyślnie uszkodzić lewy przedsionek, czyniąc zaopatrzenie nieskutecznym. - Usuń kleszcze z serca.
- Włóż kaniulę lewego przedsionka do wierzchołka przez zastawkę mitralną i do lewego przedsionka.
- Zabezpiecz kaniulę lewego przedsionka jedwabnym szwem za sercem (ryc. 8).
UWAGA: Ten szew może być "wstępnie zawiązany", aby ułatwić kaniulację. - Podłącz kaniulę tętnicy płucnej do obwodu perfuzji płuc ex-vivo (ryc. 9A). Nie należy podłączać lewej kaniuli przedsionka do obwodu EVLP, dopóki blok płuco-serce nie zostanie całkowicie usunięty z organizmu.
- Zacisnąć przełyk hemostatem i przeciąć poniżej zacisku (między zaciskiem a przeponą), tak aby przełyk mógł być wykorzystany do podniesienia struktur krążeniowo-oddechowych głowa.
- Tępo wypreparuj otaczającą tkankę i przetnij zstępującą aortę i naczynia pomocnicze, aby uwolnić blok płuco-serce, gdy jest on podnoszony przez przełyk (ryc. 9B).
- Przeciąć głowo tchawicy do kaniuli tchawicy, aby całkowicie uwolnić blok płuco-serce.
- Wyjmij blok płuco-serce i umieść go w wyznaczonym miejscu w obwodzie EVLP (Rysunek 9C).
- Podłącz lewą kaniulę przedsionka do przewodu odpływowego i uruchom główną pompę perystaltyczną (rysunek 9D).
4. Perfuzja płuc ex vivo
- Szybko wyjmij przewód wentylacyjny z górnej części aparatu EVLP i przymocuj obudowę do czujników ciśnienia, a następnie włóż przewód wentylacyjny na górze obudowy na górze aparatu EVLP.
UWAGA: Umożliwi to rejestrowanie danych wentylacji i monitorowanie ciśnienia. - Upewnij się, że pułapka bąbelkowa jest wypełniona odpowiednią ilością perfuzatu, aby do płuc nie dostały się pęcherzyki powietrza (tj. zatory powietrzne).
- Powoli zmieniaj ustawienia wentylacji i perfuzji na żądane poziomy eksperymentalne w ciągu początkowych 15 minut. Dodatkowo, podczas tej początkowej fazy rozruchu, zwiększ szybkość przepływu perfuzji do pożądanej szybkości i/lub ciśnienia.
UWAGA: Zaleca się zaprogramowanie respiratora tak, aby wytwarzał przerywane oddechy, które ułatwiają przepływ płynu z przestrzeni płuc, a tym samym opóźniają wystąpienie obrzęku. Mogą one być wytwarzane przez wentylatory wyposażone w funkcję westchnienia. - Zdefiniuj "Czas 0" jako czas, w którym parametry wentylacji wynoszą 4 ml/kg, PEEP 2 O wynosi 2 cm, a parametry perfuzji osiągają oczekiwany poziom i pozostają stałe.
- W razie potrzeby należy pobrać próbki z portu próbki, błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i zanotować czas pobierania próbek.
- Po zakończeniu eksperymentu wyizolować wszelkie niezbędne fragmenty anatomiczne do pobrania i albo błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie, albo umieścić w roztworze utrwalającym do dalszych badań.
Wyniki
Dane mechaniczne zbierane w czasie rzeczywistym za pomocą programu do akwizycji danych mogą być łatwo analizowane w celu przetestowania dowolnej liczby hipotez. Na przykład Rysunek 10A przedstawia średnią masę płuc w ciągu 60 min w 10 eksperymentach na szczurach, w których zwierzęta wentylowano z niską objętością oddechową i niskim PEEP wynoszącym 4 ml/kg oraz 2 cmH2O. Mimo że w trakcie eksperymentu następuje bardzo niewielki wzrost masy płuc, wzrost ten nie jest istotny statystycznie (ANOVA, p = 0,92). Rysunek 10B przedstawia średnie ciśnienie w tętnicy płucnej (PAP) w ciągu 60 min w 12 eksperymentach na szczurach. Niższe PAP w punkcie czasowym 0 min jest wynikiem niższego przepływu i ustawień wentylacji stosowanych na początku wszystkich eksperymentów, a PAP pozostaje stałe po tym punkcie czasowym, bez statystycznie istotnych zmian po t=10 min (ANOVA na rangach, p = 0,89). Rysunek 10C przedstawia opór naczyniowy płuc (PVR) w ciągu 60 min w 12 eksperymentach na szczurach i choć po t=20 min następuje niewielki spadek PVR, w trakcie tego eksperymentu nie odnotowano statystycznie istotnej różnicy w PVR (ANOVA na rangach, p= 0,65). W porównaniu do przedstawionych tutaj danych PVR, Noda et al. wykazali, że PVR nieznacznie wzrasta w czasie w ciągu 4 h. Autorzy ci raportują jednak dane PVR zaczynając od 1 h zamiast od początku eksperymentu i nie podano wartości odchylenia standardowego7. Noda et al. nie przedstawili również danych dotyczących obrzęku płuc dla eksperymentów 4-godzinnych, więc nie można ich porównać z danymi zaprezentowanymi tutaj na Rysunku 10A. Główne różnice w procedurze Noda et al. w porównaniu do opisanej w niniejszej pracy obejmują: 1 h konserwacji w zimnym roztworze LPS przed EVLP, wstępną wentylację szczurów mieszaniną gazów zawierającą izofluran w celu utraty przytomności, uzupełnienie roztworu perfuzyjnego o 50 mg metyloprednizolonu i 50 mg cefalosporyny, zdefiniowanie całkowitego przepływu jako 20% obliczonego rzutu serca, pobieranie próbek perfuzatu dopiero po uprzedniej 5-minutowej wentylacji płuc 100% O2 oraz czas trwania eksperymentu wynoszący 4 h.
Próbki perfuzatu pobierane podczas eksperymentu mogą być również analizowane w wielu celach. Przykładowo, na Rysunku 11 demonstrujemy, w jaki sposób wentylacja z wysoką objętością oddechową/wysokim PEEP może wywołać odpowiedź prozapalną w ciągu 60 min. W tych eksperymentach perfuzat od 4 szczurów wentylowanych w warunkach urazowych, t.j. przy wysokiej objętości oddechowej 10 ml/kg i wysokim PEEP 8 cmH2O, analizowano pod kątem cytokin prozapalnych i przeciwzapalnych IL1β, TNFα oraz IL4 z wykorzystaniem standardowych technik ELISA. Jak pokazano na Rysunku 11, w porównaniu do poziomów cytokin przed wentylacją (0 min), 60 min wentylacji urazowej spowodowało statystycznie istotny wzrost stężenia IL-1β i TNFα (cytokin prozapalnych) oraz brak zmian w stężeniu IL-4 (cytokiny przeciwzapalnej). Zatem ten system EVLP jest w stanie generować profile uszkodzenia płuc powszechnie obserwowane podczas wentylacji mechanicznej.
Rysunek 1. Schemat i zdjęcie układu do perfuzji płuc ex-vivo (EVLP) u małych zwierząt. Litery na schemacie odpowiadają literom na zdjęciu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2. Wszystkie przetworniki są bezpiecznie podłączone do modułów sterujących. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 3. Stół operacyjny dla szczura jest stabilnie ustawiony obok układu do perfuzji płuc ex vivo (EVLP). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 4. (A) Wykonuje się nacięcie w kierunku głowowym w celu odsłonięcia tchawicy. Jama klatki piersiowej nie jest odsłaniana. (B) Za tchawicą umieszcza się jedwabną szuturę. (C) Tchawicę przecina się częściowo, aby przygotować ją do kaniulacji. (D) Kaniulę tchawiczą umieszcza się w odpowiedniej pozycji i mocuje jedwabną szuturą. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 5. (A) Jamę klatki piersiowej odciąga się, aby umożliwić dostęp do serca i płuc. (B) Przygotowanie do umieszczenia szwu za tętnicą płucną. (C) Tętnica płucna zostaje zakanulowana i związana wcześniej umieszczonym jedwabnym szwem. (D) Roztwór elektrolitów o niskim stężeniu K+ jest przepłukiwany przez tętnicę płucną i wyprowadzany przez lewy przedsionek w celu usunięcia skrzepów krwi. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 6. Zwiększenie przepływu w tętnicy płucnej podczas płukania płuc może spowodować gwałtowny wzrost ciśnienia w tętnicy płucnej. Jeśli kanulacja została wykonana prawidłowo i nie występuje poważna niedrożność, ciśnienie powinno spaść. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.
Rycina 7. Jedwabna szewka zostanie umieszczona wokół całego serca w ramach przygotowania do kaniulacji lewego przedsionka. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 8. Kaniula lewego przedsionka zostaje zamocowana na miejscu za pomocą jedwabnego szwu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 9. (A) Kanula tętnicy płucnej jest połączona z układem do perfuzji płuc ex-vivo. (B) Przełyk zostaje zaklemowany, a tkanka łączna rozdzielona tępym rozcieciem w celu usunięcia bloku serce-płuca. (C) Blok serce-płuca zostaje usunięty z jamy klatki piersiowej i umieszczony w układzie do perfuzji płuc ex-vivo. (D) Lewy przedsionek zostaje połączony z układem do perfuzji płuc ex-vivo. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 10. (A) Masa płuc samców szczurów Sprague Dawley podczas 60 min perfuzji płuc ex vivo (n=10). (B) Ciśnienie w tętnicy płucnej samców szczurów Sprague Dawley podczas 60 min perfuzji płuc ex vivo (n=12). (C) Opór naczyniowy płuc samców szczurów Sprague Dawley podczas 60 min perfuzji płuc ex vivo (n=12), N.S. oznacza brak statystycznie istotnej różnicy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 11. Wpływ 1-godzinnej wentylacji przy wysokich objętościach oddechowych (10 ml/kg) i wysokim PEEP (8 cmH2O) na stężenia cytokin prozapalnych i przeciwzapalnych w perfuzacie. n=4, * oznacza statystycznie istotną różnicę w stosunku do próbki z 0 h (p < 0.05). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 12. (A) Płuco poddawane prawidłowej wentylacji i perfuzji podłączone do obiegu EVLP. (B) Wysokie dodatnie ciśnienie końcowowydechowe (PEEP) powoduje pęknięcie w miejscu rozwidlenia tchawicy, co prowadzi do powstania pęcherzyków powietrza w miejscu urazu i wypełnienia nimi sztucznego klatki piersiowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 13. (A) Kanula tętnicy płucnej. Kanula ta jest mniejsza od kanuli lewego przedsionka. (B) Kanula lewego przedsionka. Kanula ta jest znacznie większa od kanuli tętnicy płucnej. (C) Kanula tchawicy. Kanula ta posiada żeberka ułatwiające zabezpieczenie tchawicy za pomocą jedwabnego szwu. Końcówka wprowadzana do tchawicy jest również lekko zaostrzona, aby ułatwić wprowadzenie kanuli do tchawicy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 14. (A) Wierzchołek serca jest podtrzymywany pęsetą przed nacięciem prawej komory w celu kaniulacji tętnicy płucnej. (B) Rozszerzenie pierścienia zastawki mitralnej za pomocą małej pęsety tępej ułatwia wizualizację drogi do lewego przedsionka. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Dyskusja
MONITOROWANIE SYSTEMU
Jak to wygląda, gdy eksperyment przebiega prawidłowo:
Po umieszczeniu kaniul w obwodzie i wentylacji płuc istnieje wiele sposobów na zapewnienie prawidłowego działania systemu. W całej linii nie powinno być żadnych wycieków perfuzatu. Opór naczyniowy płuc (PVR) powinien pozostać względnie stały (przy założeniu stałego przepływu). Wymiana tlenu powinna wzrosnąć, gdy respirator będzie działał prawidłowo i rozszerzał płuca, aby rekrutować więcej pęcherzyków płucnych do wymiany gazowej. Rycina 12A przedstawia prawidłowo wentylowane i ukrwione płuca podłączone do obwodu EVLP wewnątrz sztucznej klatki piersiowej.
Jak to wygląda, gdy eksperyment nie działa dobrze:
Istnieje kilka typowych problemów, które występowały najczęściej na początkowych etapach eksperymentu EVLP. Pierwszym i najłatwiejszym do naprawienia jest nieszczelność w przewodzie wychodzącym z płuc. Jest to zauważalne przez kałużę perfuzatu gromadzącą się pod częścią obwodu i stale obniżający się poziom w zbiorniku. Sprawdź i dokręć wszystkie złącza rurek wokół obszaru rozlania i sprawdź, czy sama rurka nie jest szczelna. Jeśli ten wyciek nastąpi przed płucem, może również wprowadzić pęcherzyki do płuca. Należy temu zaradzić tak szybko, jak to możliwe, ponieważ pęcherzyki powietrza w perfuzacie spowodują uszkodzenie tkanek i znaczny wzrost PVR. Może również dojść do wycieku z płuc lub jednej z kaniuli. Może to być spowodowane poślizgiem kaniuli lub przeszkodą w przewodzie wyjściowym powodującą wzrost ciśnienia. Sprawdź położenie obu kaniul, aby upewnić się, że żadna z nich nie ześlizgnęła się ani nie skręciła. Ciśnienie PA powinno być również monitorowane podczas tego procesu, ponieważ natychmiastowy wzrost ciśnienia PA jest oczywistym znakiem, że niedawno wystąpiła jakaś przeszkoda. Rycina 12B przedstawia pęknięte płuco, które pękło z powodu wysokiego ciśnienia. Wyciek z samego płuca może być również spowodowany rozdarciem tkanki. Ten problem może, ale nie musi być naprawialny, ale zmiana położenia i ponowne dokręcenie kaniul jest najlepszą opcją w tym scenariuszu.
Kluczowe punkty/możliwości, do których należy się uczyć:
Opracowanie metodą prób i błędów systemu perfuzji płuc ex-vivo pozwoliło nam zidentyfikować kilka kluczowych problemów, które tutaj przedstawiamy, aby ułatwić sprawne wdrożenie systemu EVLP. Po pierwsze, w odniesieniu do pobierania, ważne jest, aby przestrzegać standardowych technik znieczulenia w celu prawidłowego znieczulenia zwierząt (wystarczająca ilość znieczulenia, wstrzyknięcie do otrzewnej) i wymagane jest przestrzeganie wszystkich zasad IACUC. Kaniule (pokazane na rysunku 13 A, B i C) powinny być wielokrotnie płukane w celu usunięcia wszelkich skrzepów i/lub zanieczyszczeń w obrębie układu naczyniowego płuc. Jeśli chodzi o dobór zwierząt, sugerujemy użycie szczurów Sprague Dawley lub Lewis o wadze 250–350 g. Należy zachować szczególną ostrożność podczas kaniulacji szczurów o wadze blisko 250 g, ponieważ naczynia będą mniejsze, a zatem znacznie trudniejsze do kaniulacji bez uszkodzenia naczyń krwionośnych. Jeśli ma być użyty mniejszy szczur lub model myszy, może być konieczne użycie mniejszej kaniuli.
Kaniulacja tchawicy zazwyczaj nie jest trudna, o ile szew jest odpowiednio zabezpieczony, najpierw przesuwając jedwabny szew z tyłu tchawicy po wypreparowaniu otaczającej powięzi, a przed kaniulacją. Następnie wykonaj przednie nacięcie 1-2 pierścienie tchawicy nad szwem, aby przejść przez kaniulę. Zawiąż kwadratowe węzły między pierścieniami tchawicy, aby zabezpieczyć je w rowku dla lepszego bezpieczeństwa (Rysunek 4C). Kaniulacja tętnicy płucnej (PA) jest trudniejsza w porównaniu z kaniulą tchawiczą. W tym badaniu zastosowano następujące kroki dla tej procedury. Najpierw chwyć wierzchołek serca parą kleszczy. Przełóż kolejną parę kleszczyków w zatoce poprzecznej i nawlecz szew, aby zabezpieczyć kaniulę w bliższym PA. Naciąć prawą komorę bezpośrednio przed drogą odpływu prawej komory (RVOT) (ryc. 14A). Po wcięciu w RVOT kaniula zostanie skierowana w stronę drogi odpływu z tętnicy płucnej. Założenie szwu za tętnicą płucną/aortą przed prawą wentrikulotomią zwiększa skuteczność (ryc. 5C). Kaniula powinna być przymocowana na miejscu za pomocą szwu, aby zapobiec przemieszczeniu. Poważna komplikacja może wystąpić, jeśli kaniula PA nie jest w prawidłowej orientacji anatomicznej. Kaniula może być wprowadzona zbyt głęboko i ulegać perfuzji tylko jednej gałęzi lub ulec zniekształceniu w wyniku skręcenia próbki płucoserca po wyjęciu z jamy klatki piersiowej. Można go łatwo ustawić z powrotem do pierwotnej pozycji, aby zachować właściwy kąt pozycji anatomicznej. Wreszcie, kaniulacja lewego przedsionka (LA) jest najtrudniejszą częścią procedury. Kaniulę LA należy umieścić w lewym przedsionku. Ponieważ tkanki są niezwykle kruche, należy pamiętać, aby nie używać znacznej siły ani skręcania, aby zapobiec rozdarciu w żyle płucnej i lewym przedsionku, co sprawiłoby, że eksperyment byłby nie do uratowania. Kaniulę PA najlepiej umieścić przed kaniulą LA. Wykazano, że lewa komora brzuszna z usunięciem wierzchołka przerywa ścięgna kordowe i umożliwia łatwiejszy dostęp przez płatki mitralne. Ponadto wentrikulotomia ułatwia rozszerzenie i wizualizację zastawki mitralnej oraz wprowadzenie kaniuli przez zastawkę mitralną. Rozszerzenie pierścienia zastawki mitralnej za pomocą pary małych tępo zakończonych pick-upów można wykonać w celu uwidocznienia przewodu do LA (ryc. 14B). Szew należy założyć za sercem przed kaniulacją. Można to zrobić po prostu podnosząc serce do góry za pomocą pary małych tępo zakończonych pick-upów i umieszczając szew pod spodem i w poprzek serca. LA jest teraz gotowy do kaniulacji. Przeprowadź kaniulę LA przez pick-upy, aby prawidłowo zobrazować umieszczenie kaniuli w lewym przedsionku. Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie przesunąć kaniuli z powrotem do lewej komory. Szew powinien być następnie szczelnie zamocowany wzdłuż mięśnia sercowego lewej komory. Przymocowanie szwu do lewego przedsionka może zatkać całą kaniulę lub jej część.
Podczas zabiegu ważne jest, aby w części nawiewnej aparatu nie pozostało żadne powietrze. Każde znaczące powietrze może wytworzyć zator powietrzny, zwiększyć PVR (w rzeczywistości "śluzę powietrzną"), co spowoduje znacznie niższy przepływ perfuzatu przy danym ciśnieniu. Do usuwania powietrza z systemu można użyć różnych punktów. Powietrze w sekcji odpływowej jest oczekiwane i nie powinno mieć żadnego szkodliwego wpływu na płuca. Wykazano, że świński model nadciśnienia płucnego odtwarza patologię z ciągłych niewielkich ilości powietrza przez okres 8 tygodni. Zwiększone powietrze zmniejsza ilość obecnej perfuzji, powodując jednocześnie stan zapalny otaczających tkanek 19.
Inicjacja perfuzji może nastąpić po zakończeniu kaniulacji, ale przed podłączeniem rurki pochodzącej z LA do linii EVLP. Perfuzat powinien być przepuszczony, aby usunąć wszelkie skrzepy krwi, a perfuzat ten może bez problemu opróżnić się do ściany klatki piersiowej. Przełączenie pompy perfuzatu w tryb ręczny i powolne zwiększanie natężenia przepływu do ~2 ml/min pozwala na ścisłe monitorowanie ciśnienia PA. Ciśnienie powyżej 20-30 cmH2O może wskazywać na przeszkodę, a obserwowanie perfuzatu wydostającego się z LA jest również wskaźnikiem, ale może to być bardzo trudne do zauważenia. Jeśli ciśnienie wzrośnie do ponad 20-30 cmH2O, zatrzymaj pompę i ponownie sprawdź obie kaniulacje. Gdy ciśnienie osiągnie stałe około 10-20 cmH2O, pozwól perfuzatowi przepływać przez i do jamy klatki piersiowej przez 2 minuty. W tym czasie linia z LA może być podłączona do obwodu EVLP. Prędkość pompy perfuzatu można zwiększyć do 5-10 ml/min. W miarę jak głowica płynu przechodzi przez obwód, nastąpi wzrost ciśnienia PA ze względu na wzrost wysokości głowicy płynu, a tym samym ciśnienia statycznego. Jeśli płyn nie może przepłynąć przez najwyższy punkt linii, może być konieczne przyłożenie siły ssącej na przeciwległym końcu linii lub próba obniżenia najwyższej części linii. Gdy ten problem zostanie rozwiązany, perfuzat powinien krążyć bez żadnych problemów.
Należy monitorować kilka kwestii związanych z respiratorem. Po pierwsze, może dojść do skręcenia oskrzeli/tchawicy i położenia płuco-serce, gdy płuca stają się bardziej obrzęknięte, a waga wzrasta. Ważne jest, aby kaniule pozostawały w stosunkowo bliskiej pozycji anatomicznej, dlatego może być konieczna zmiana jednej lub obu kaniuli. Z tym systemem EVLP można stosować wentylatory z regulacją ciśnienia lub objętości, a także wentylację dodatnią lub ujemną. W przypadku modelu szczurzego odkryliśmy, że przy użyciu nadciśnienia wentylacja o kontrolowanej objętości działa dobrze przy objętościach oddechowych w zakresie 4-10 ml / kg i przy dodatnim ciśnieniu końcowo-wydechowym (PEEP) w zakresie 2-8 cmH2O. Jednak PEEP wynoszący 8 cmH2O może spowodować możliwe pęknięcie przy rozwidleniu tchawicy. Po każdym eksperymencie (lub zestawie doświadczeń, jeśli są wykonywane jeden po drugim), przewód wentylacyjny prowadzący do tchawicy powinien zostać oczyszczony z płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL), który mógł przemieszczać się w górę tchawicy. Płyn ten stwardnieje, jeśli pozostanie nietknięty i może całkowicie zablokować przewód wentylacyjny.
Kompozycja perfuzacyjna ma kluczowe znaczenie dla udanego eksperymentu EVLP. Mieszanina 5% dekstranu pozwala na perfuzję płuc zbliżoną do warunków fizjologicznych, utrzymuje stabilne ciśnienie onkotyczne, aby skierować płyn z powrotem do naczyń krwionośnych, aby zapobiec obrzękowi i zapobiega zakrzepicy w naczyniach płucnych. Ważne jest, aby pamiętać, że niektóre gatunki szczurów mogą być uczulone na dekstran, który może powodować obrzęk płuc20. Zawartość perfuzatu była spójna we wszystkich grupach eksperymentalnych w tym badaniu, dlatego zawartość dekstranu nie powinna być czynnikiem zakłócającym. Ciśnienie onkotyczne jest krytyczną zmienną, która może poprawić lub wywołać obrzęk tkanek. W tym systemie zastosowano dostępne na rynku roztwory perfuzyjne, które są zoptymalizowane pod kątem przechowywania statycznego w niskiej temperaturze lub perfuzji normotermicznych, aby wydłużyć czas żywotności płuc. Zauważamy, że niektóre z tych roztworów zawierają albuminę, a jednym z problemów jest możliwość wywołania przez albuminę bydlęcą reakcji zapalnej w płucach gryzoni. Chociaż optymalny skład perfuzatu jest przedmiotem ciągłych badań, perfuzat musi uwzględniać ciśnienie onkotyczne, ciśnienie osmotyczne i zdolność buforową. Zalecamy, aby roztwór był oparty na zmodyfikowanym roztworze Krebsa-Henseleita lub pożywce do hodowli komórkowych. Ciśnienie onkotyczne powinno być utrzymywane przez dekstran lub albuminę, w zależności od zastosowania. Ciśnienie perfuzji i natężenie przepływu wpływają na narząd, a suprafizjologiczne parametry perfuzji mogą sprawić, że narząd będzie podatny na urazy mechaniczne.
Wskaźniki wizualne podczas eksperymentu:
Istnieje wiele wskazówek wizualnych, a także wskazówek z danych w czasie rzeczywistym, które można wykorzystać do określenia, czy eksperyment EVLP przebiega prawidłowo. Płuco pozostanie tej samej wielkości i opróżni się do tej samej objętości po każdym oddechu. Nie będzie również wycieku z samego płuca. PVR, masa płuc i podatność pozostaną względnie stałe. Produkcja tlenu pozostanie stała lub nieznacznie wzrośnie.
Istnieje wiele wizualnych wskaźników, kiedy płuco zostaje naruszone podczas eksperymentu. Płuca stają się obrzęknięte i szybko rosną pod względem wielkości i wagi. Zmienia się kolor płuc (od jasnobrązowego do białego), a w tkance można zidentyfikować kieszenie płynu. Jeśli tchawica lub płuco pęknie w wyniku barotraumy lub nadmiernego rozdęcia, od miejsca urazu będzie bulgotać (ryc. 12B). Produkcja tlenu zmniejszy się, a PVR i zgodność również znacznie wzrosną.
Potencjał wykorzystania modelu EVLP na małych zwierzętach, takich jak gryzonie, otwiera drzwi do przyszłych badań poprawiających leczenie przeszczepów płuc. Jednak model małego zwierzęcia wymaga lepszego zrozumienia, aby naprawdę naśladować przeszczep płuc. Model ten może być wykorzystany w przyszłości do ulepszenia metod leczenia i określenia parametrów wyjściowych dla przyszłych badań nad przeszczepami płuc.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować za pomoc Harvard Apparatus, szczególnie Stephanie Pazniokas, MS (Physiology Systems & Regenerative Medicine) za pomoc w montażu, modyfikacji i rozwiązywaniu problemów obwodu perfuzji oraz XVIVO Perfusion (Daniel Martinelli, CCP, CTP) za zapewnienie nieklinicznego zastosowania plegii płucnej.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| IPL-2 Podstawowy system perfuzji płuc | Pęseta do aparatów | ||
| #5 ze stali nierdzewnej, zakrzywiona 11 cm | Kent Scientific Corporation | IND500232 | |
| Pęseta #5 Dumostar, 11 cm | Kent Scientific Corporation | INS500085-Pęseta A | |
| #7 Tytan, 12 cm zakrzywione końcówki | Kent Scientific Corporation | INS600187 | |
| Nożyczki McPherson-Vannas 8 cm, Str 5 mm | Kent Scientific Corporation | INS14124 | |
| Nożyczki Vannas 8 cm Str 5 mm | Kent Scientific Corporation | INS14003 | |
| Taca do sterylizacji instrumentów 5 "x 7" | Kent Scientific Corporation | INS800101 | |
| Heparyna 30 000 jednostek na 30 ml | APP Farmaceutyki | dostarczane z OSU Pharmacy | |
| Ketamina 500 mg na 5 ml | JHP Pharmaceuticals | Dostarczane z OSU Pharmacy | |
| Ksylazyna 100 mg na 1 ml | Akorn | Dostarczane z Apteki | |
| 10 Strzykawka insulinowa CC 29 Igła G x 1/2" | B-D | 309301 | |
| Hyflex NBR | Ansell | S-17310M | Rękawice odporne na gryzienie |
| BL1500 | Sartarius | Practum 1102-1S | Scale |
| Duży płaski dno Ogranicznik | Braintree Scientific Inc | FB L 3,375 fi x 8,5, 250-500gm rat | Tunel dla szczurów do wstrzykiwań |
| Bezpudrowe rękawice egzaminacyjne Sterling nitryl, duże | Kiberly-Clark | 50708 | |
| Rapidpoint 405 | Analizator parametrów krytycznych | Siemens | |
| Fiberoxygenator D150 | Hugo Sachs Elektronik | PY2 73-3762 | |
| LabChart v7.3.7 | ADInstruments | ||
| Kaniula tchawicy | Aparat Harvard | 733557 | |
| Płucny Kaniula tętnicza | Aparat Harvard | 730710 | |
| Kaniula lewego przedsionka | Aparat Harvard | 730712 | |
| Pompa perystaltyczna | Ismatec | ISM 827B | |
| Wentylator dla małych zwierząt model 683 | Aparatura Harvarda | 55-000 | |
| Ecoline Star Edition 003, E100 | Lauda | LCK 1879 | |
| Kaseta węży | Cole-Parmer | IS 0649 | |
| Zestaw połączeniowy D150 | Cole-Parmer | VK 73-3763 | |
| PowerLab 8/35 | ADInstruments | 730045 | |
| Moduł wzmacniacza przetwornika TAM-A typ 705/1 | Hugo Sachs - Harvard Apparatus | 73-0065 | |
| Wzmacniacz przetwornika TAM-D typ 705/2 | Hugo Sachs - Aparat Harvarda | 73-1793 | |
| SCP Servokontroler do perfuzji typu 704 | Hugo Sachs - Aparatura Harvarda | 732806 | |
| Wzmacniacz mostka częstotliwości nośnej CFBA typ 672 | Hugo Sachs - Aparatura Harvarda | ||
| Moduł sterujący wentylatora VCM typ 681 | Hugo Sachs - Aparatura Harvarda | 731741 | |
| Moduł sterowania czasem TCM typ 686 | Hugo Sachs - Aparatura Harvarda | 731750 | |
| IL2 Zestaw rurek do perfuzacji | Aparat Harvard | 733842 | |
| Zestaw rurek do komory wilgotnej | Aparat Harvard | 73V83157 | |
| Tygon E-3603 Rurka 2.4 mm ID | Harvard Apparatus | 721017 | linia perfuzacyjna wchodząca do płuc |
| Tygon E-3603 Rurka 3.2 mm ID | Aparat Harvard 721019 | linię perfuzyjną opuszczającą płuca | |
| roztwór glukozy | który przepłukuje płuca |
Bibliografia
- United States Organ Transplantation, Organ Procurement and Transplantation Network & Scientific Registry for Transplant Recipients Annual Report 2011. , Available from: http://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2011 (2011).
- Maathuis, M. H., Leuvenink, H. G., Ploeg, R. J. Perspectives in organ preservation. Transplantation. 83, 1289-1298 (2007).
- Cardoso, P. F. New perspectives in lung transplantation: from conventional preservation to ex vivo lung perfusion and lung reconditioning. Jornal brasileiro de pneumologia : publicacao oficial da Sociedade Brasileira de Pneumologia e Tisilogia. 35, 1057-1059 (2009).
- DeCampos, K. N., Keshavjee, S., Liu, M., Slutsky, A. S. Optimal inflation volume for hypothermic preservation of rat lungs. The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 17, 599-607 (1998).
- Perrot, M., et al. Report of the ISHLT Working Group on Primary Lung Graft Dysfunction part III: donor-related risk factors and markers. The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 24, 1460-1467 (2005).
- Mulloy, D. P., et al. Ex vivo rehabilitation of non-heart-beating donor lungs in preclinical porcine model: delayed perfusion results in superior lung function. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 144, 1208-1215 (2012).
- Noda, K., et al. Successful prolonged ex vivo lung perfusion for graft preservation in rats. European journal of cardio-thoracic surgery : official journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 45, e54-e60 (2014).
- Perrot, M., Liu, M., Waddell, T. K., Keshavjee, S. Ischemia-reperfusion-induced lung injury. American journal of respiratory and critical care medicine. 167, 490-511 (2003).
- Steen, S., et al. Transplantation of lungs from a non-heart-beating donor. The Lancet. 357, 825-829 (2001).
- Perrot, M., et al. Strategies to optimize the use of currently available lung donors. The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 23, 1127-1134 (2004).
- Cypel, M., et al. Technique for prolonged normothermic ex vivo lung perfusion. The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 27, 1319-1325 (2008).
- Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo perfusion prevents lung injury compared to extended cold preservation for transplantation. American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 9, 2262-2269 (2009).
- Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation. The New England journal of medicine. 364, 1431-1440 (2011).
- Cypel, M., et al. Normothermic Human Ex Vivo Lung Perfusion (EVLP) for Improved Assessment of Extended Criteria Donor Lungs for Transplantation. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 28, S126-S126 (2009).
- Sanchez, P. G., et al. Normothermic Ex Vivo Lung Perfusion as an Assessment of. Marginal Donor Lungs - The NOVEL Lung Trial. J Heart Lung Transpl. 32, S16-S17 (2013).
- Pego-Fernandes, P. M., et al. Experimental model of isolated lung perfusion in rats: first Brazilian experience using the IL-2 isolated perfused rat or guinea pig lung system. Transplantation proceedings. 42, 444-447 (2010).
- Pego-Fernandes, P. M., et al. Experimental model of isolated lung perfusion in rats: technique and application in lung preservation studies. Jornal brasileiro de pneumologia : publicacao oficial da Sociedade Brasileira de Pneumologia e Tisilogia. 36, 490-493 (2010).
- Niemeier, R. W. The isolated perfused lung. Environmental health perspectives. 56, 35-41 (1984).
- Zhou, X., et al. A pulmonary hypertension model induced by continuous pulmonary air embolization. The Journal of surgical research. 170, e11-e16 (2011).
- Harris, J. M. Differences in responses between rat strains and colonies. Food and cosmetics toxicology. 3, 199-202 (1965).
Przedruki i uprawnienia
