Artykuł metodologiczny

Metoda izolowanej perfuzji płuc ex vivo w modelu szczurzym: wnioski wyciągnięte z opracowania programu EVLP dla szczurów

DOI:

10.3791/52309

⸱

25 lutego 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Ohio State University Wexner Medical Center, 2Davis Heart & Lung Research Institute, Ohio State University Wexner Medical Center, 3The Collaboration for Organ Perfusion, Protection, Engineering and Regeneration (COPPER) Laboratory, Ohio State University Wexner Medical Center, 4Division of Cardiac Surgery, Department of Surgery, Ohio State University Wexner Medical Center, 5Departments of Pediatrics and Internal Medicine, Ohio State University, 6Advanced Lung Disease Program, Lung and Heart-Lung Transplant Programs, Nationwide Children's Hospital, 7Division of Transplantation, Department of Surgery, Ohio State University Wexner Medical Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Perfuzja płuc Ex-Vivo (EVLP) umożliwiła przeszczep płuc u ludzi dzięki umożliwieniu oceny narządów i rozszerzeniu puli dawców. W tym miejscu opisujemy rozwój programu EVLP dla szczurów i udoskonalenia, które pozwalają na stworzenie powtarzalnego modelu do przyszłej rozbudowy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Liczba akceptowalnych płuc dawców dostępnych do przeszczepu płuc jest poważnie ograniczona ze względu na niską jakość. Ex Vivo Perfuzja płuc (EVLP) sprawiła, że przeszczep płuc u ludzi stał się łatwiej dostępny, umożliwiając ocenę narządów i rozszerzenie puli dawców. Wraz z rozwojem i ulepszaniem tej technologii, możliwość potencjalnej oceny i poprawy jakości płuc niespełniających norm przed przeszczepem staje się krytyczną potrzebą. W celu bardziej rygorystycznej oceny tych podejść konieczne jest stworzenie powtarzalnego modelu zwierzęcego, który pozwoliłby na testowanie ulepszonych technik i postępowania z płucami dawcy, a także z biorcą przeszczepu płuc. Ponadto zwierzęcy model EVLP powiązanych patologii, np. uszkodzenia płuc wywołanego wentylacją (VILI), zapewniłby nową metodę oceny leczenia tych patologii. W tym miejscu opisujemy rozwój programu płuc EVLP u szczurów i udoskonalenia tej metody, które pozwalają na stworzenie powtarzalnego modelu dla przyszłej ekspansji. Opisano również zastosowanie tego systemu EVLP do modelowania VILI w płucach szczurów. Celem jest dostarczenie społeczności naukowej kluczowych informacji i "pereł mądrości"/technik, które powstały w wyniku prób i błędów i mają kluczowe znaczenie dla ustanowienia systemu EVLP, który jest solidny i powtarzalny.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Znaczenie kliniczne

Obecnie brakuje odpowiednich płuc do przeszczepu, a tylko 19% płuc może być wykorzystanych w kraju, co prowadzi do wydłużenia czasu oczekiwania na przeszczep lub śmierci pacjentów oczekujących na przeszczep1. Niedobór może być spowodowany starszymi dawcami, urazami, infekcjami, niewydolnością wielonarządową, a czasem uszkodzonymi płucami dawcy po pobraniu2. Ponadto płuco jest kruchym narządem znajdującym się poza jamą piersiową, a standardowe techniki transportu i konserwacji mogą prowadzić do pogorszenia stanu płuc i ich niezdolności do życia. W związku z tym utrzymanie i poprawa żywotności płuc ex-vivo stała się ostatnio głównym celem medycyny transplantacyjnej płuc.

Perfuzja płuc ex-vivo (EVLP)

Izolowane systemy perfuzji płuc były używane u małych zwierząt do powodowania uszkodzeń płuc, odtwarzania chorób układu oddechowego i perfuzji płuc różnymi roztworami, aby zapobiec uszkodzeniom niedokrwiennym. Badacze stworzyli model przeszczepu płuc na małych zwierzętach, wykorzystując izolowany system perfuzji płuc do naśladowania protokołów EVLP, które mogą być stosowane u ludzi i większych zwierząt16-18. Jednak ten eksperymentalny model wiąże się z wieloma wyzwaniami w odniesieniu do różnych technik i parametrów stosowanych do naśladowania fizjologii człowieka. W szczególności istnieje wiele subtelności w utrzymaniu żywotności płuc podczas EVLP. Te subtelności mogą wynikać z różnic w technice zbioru, ustawieniach wentylacji nadciśnieniowej, składzie perfuzatu i warunkach przepływu oraz kaniulacji płuc. Dlatego celem jest dostarczenie społeczności badawczej szeregu wskazówek dotyczących rozwiązywania problemów i wdrażania, które, jak znaleźliśmy, prowadzą do solidnej metody implementacji EVLP w modelu gryzoni.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Institutional Animal Care oraz National Research Council's Guide for the Humane Care and Use of Laboratory Animals (IACUC) i przeszły zatwierdzenie przez komitet IACUC Uniwersytetu Stanowego Ohio.

1. Wstępna konfiguracja

  1. Ustawić obwód EVLP i sprawić, aby ciepły (37 °C) perfuzat krążył w systemie przed włączeniem wcześniej posadzonego płuca (rysunek 1).
  2. Ustawić ciepłą kąpiel wodną, używaną do osłony zbiornika perfuzatu, wymiennika ciepła i sztucznej klatki piersiowej, na temperaturę 37 °C i krążyć (rysunek 1).
  3. Uruchom licznik roztworu odtleniającego (np. 6% O2, 8% CO2, 84% N2) przez perfuzat w filtrze gazu, aby upewnić się, że perfuzat ma ~ 6% rozpuszczonego tlenu do eksperymentu.
    UWAGA: Ten odtleniony perfuzat umożliwia ocenę funkcji płuc poprzez pomiar tlenu wprowadzonego do perfuzatu po narządzie.
  4. Otwórz program do akwizycji danych i podłącz przetwornik ciśnienia w tętnicy płucnej, przetwornik różnicy ciśnień tchawicy, przetwornik różnicy ciśnień przepływu oddechowego, przetwornik masy płuc i przetwornik prędkości pompy do obwodu EVLP i skrzynki przetwornika akwizycji danych / przetwornika analogowo-cyfrowego (rysunek 2).
  5. Ustaw stół operacyjny i narzędzia operacyjne w obwodzie EVLP (Rysunek 3).
  6. Ustaw mały pojemnik z ciekłym azotem w pobliżu obwodu EVLP, jeśli chcesz uzyskać próbki.
    UWAGA: System autora został zmodyfikowany tak, aby zbierać perfuzat przed i po narządach bez przerywania dynamiki przepływu-ciśnienia, która może potencjalnie uszkodzić płuca.

2. Przygotowanie środków znieczulających i heparyny, Znieczulenie szczura

  1. Przed kontaktem ze szczurami i tkankami szczurów należy założyć następujące środki ochrony osobistej (PPE): maskę chirurgiczną, rękawiczki chirurgiczne i jednorazowy fartuch.
  2. Zważ szczura i zapisz jego wagę.
  3. Przygotować 1 200 j./kg heparyny.
  4. Przygotować zarówno 60 mg/kg ketaminy, jak i 5 mg/kg ksylazyny w tej samej strzykawce, przygotowując najpierw ketaminę.
  5. Dootrzewnowo wstrzyknąć szczurowi mieszaninę ketaminy i ksylazyny i odczekać, aż szczur straci przytomność przez 5 minut.
  6. Potwierdź prawidłowe znieczulenie, sprawdzając odruch szczypania palców u stóp. Jeśli szczur nie wycofuje palca u nogi, nie odczuwa bólu.
  7. Przenieś szczura na stół operacyjny, zabezpiecz w pozycji leżącej i spryskaj alkoholem w celu sterylizacji.

3. Ekstrakcja i wstępna wentylacja płuc szczura

  1. Przygotuj szwy jedwabne o długości 4-20 cm (powinny wystarczyć 3-0 lub 4-0).
  2. Rozpocznij rejestrowanie danych za pomocą programu do akwizycji danych.
  3. Sprawdź, czy znieczulenie jest odpowiednie, za pomocą nożyczek chirurgicznych wprowadź się do jamy otrzewnej przez laparotomię w linii środkowej i wstrzyknij heparynę do żyły głównej dolnej.
  4. Przenieś nacięcie czaszką obok manubrium do szyi, aż tchawica zostanie odsłonięta. Nie należy rozsadzać klatki piersiowej (ryc. 4A).
  5. Wyciąć tył tchawicy w linii środkowej i wsunąć jedwabny szew z tyłu do tchawicy (ryc. 4B).
  6. Podnieś przednią część tchawicy i wykonaj poprzeczne nacięcie między pierścieniami chrzęstnymi, wysoko na tchawicy. Nie przecinaj w tym miejscu tylnej błoniastej części tchawicy (ryc. 4C).
  7. Kankaniuj tchawicę za pomocą kaniuli tchawicy i zabezpiecz jedwabnym szwem (ryc. 4D). Upewnij się, że więzadło szwu jest zabezpieczone w nacięciu, aby złagodzić migrację kaniuli.
  8. Podłącz kaniulę tchawicy do obwodu wentylacyjnego.
  9. Włączyć wentylator mechaniczny, aby rozpocząć mechaniczną wentylację płuc.
    UWAGA: Początkowe ustawienia zostały wybrane jako objętość oddechowa 4 ml/kg i dodatnie ciśnienie wydechowe (PEEP) 2 cmH2O. Ustawienia te są ustawieniami początkowymi i w zależności od warunków eksperymentalnych mogą być dostosowywane, gdy narząd znajdzie się w systemie perfuzji ex-vivo.
  10. Wejdź do jamy piersiowej przez mostek/ksyloid i kontynuuj czaszkowo w kierunku wcięcia nadmostkowego. Uważaj, aby nie dotykać płuc.
    UWAGA: Ponieważ płuco szczura jest delikatne, każda niezamierzona manipulacja może prowadzić do urazu i obrzęku płuc (ryc. 5A).
  11. Za pomocą 2 zwijaczy cofnij klatkę piersiową, aby prawidłowo odsłonić anatomię (ryc. 5A). Jeszcze raz uważaj, aby nie dotykać płuc.
  12. Usuń grasicę z lekkim uniesieniem i rozwarstwieniem.
  13. Przesuń zawartość jamy brzusznej na bok, aby odsłonić żyłę główną dolną (IVC) lub żyłę krezkową (MV).
  14. Naciąć IVC lub MV, aby wykrwawić szczura, zapewniając eutanazję.
  15. Umieść jedwabny szew z tyłu tętnicy płucnej i aorty w celu przygotowania do zabezpieczenia kaniuli tętnicy płucnej (ryc. 5B).
  16. Wykonać nacięcie o średnicy 2-3 mm na przedniej powierzchni drogi odpływu prawej komory i umieścić kaniulę w nacięciu oraz w głównej tętnicy płucnej i zabezpieczyć szwem jedwabnym (ryc. 5C).
  17. Przeciąć wierzchołek serca, aby umożliwić dostęp do lewej komory i wypłukać wszelkie skrzepy w unaczynieniu płuc, przepływając ~ 15 ml roztworu elektrolitu o niskiej zawartości K + przez tętnicę płucną i na zewnątrz przez wierzchołek serca do jamy klatki piersiowej (ryc. 5D).
  18. Podłącz kaniulę tętnicy płucnej (PA) do obwodu EVLP. Upewnij się, że przewód dolotowy wychodzący z obwodu do kaniuli PA jest zalany perfuzatem, aby zapobiec przedostawaniu się powietrza do serca i płuc.
  19. Włącz główną pompę perystaltyczną i ustaw ją na niską (~2 ml/min) prędkość, aby perfuzat mógł przepływać przez tętnicę płucną i wychodzić przez lewą komorę do jamy klatki piersiowej. **KROK KRYTYCZNY** Upewnij się, że ciśnienie PA nie wzrasta, ponieważ jest to oznaką zatoru lub słabej kaniulacji (ryc. 6).
  20. Wyłącz pompę perystaltyczną.
  21. Umieść jedwabny szew za sercem, wokół komór (ryc. 7).
  22. Rozpocznij proces kaniulacji lewego przedsionka, wprowadzając małą parę kleszczy chirurgicznych do wierzchołka, przez zastawkę mitralną i do lewego przedsionka.
    UWAGA: Spowoduje to rozszerzenie zastawki mitralnej i ułatwi kaniulację. Agresywne rozszerzenie lub zbyt głębokie rozszerzenie może nieumyślnie uszkodzić lewy przedsionek, czyniąc zaopatrzenie nieskutecznym.
  23. Usuń kleszcze z serca.
  24. Włóż kaniulę lewego przedsionka do wierzchołka przez zastawkę mitralną i do lewego przedsionka.
  25. Zabezpiecz kaniulę lewego przedsionka jedwabnym szwem za sercem (ryc. 8).
    UWAGA: Ten szew może być "wstępnie zawiązany", aby ułatwić kaniulację.
  26. Podłącz kaniulę tętnicy płucnej do obwodu perfuzji płuc ex-vivo (ryc. 9A). Nie należy podłączać lewej kaniuli przedsionka do obwodu EVLP, dopóki blok płuco-serce nie zostanie całkowicie usunięty z organizmu.
  27. Zacisnąć przełyk hemostatem i przeciąć poniżej zacisku (między zaciskiem a przeponą), tak aby przełyk mógł być wykorzystany do podniesienia struktur krążeniowo-oddechowych głowa.
  28. Tępo wypreparuj otaczającą tkankę i przetnij zstępującą aortę i naczynia pomocnicze, aby uwolnić blok płuco-serce, gdy jest on podnoszony przez przełyk (ryc. 9B).
  29. Przeciąć głowo tchawicy do kaniuli tchawicy, aby całkowicie uwolnić blok płuco-serce.
  30. Wyjmij blok płuco-serce i umieść go w wyznaczonym miejscu w obwodzie EVLP (Rysunek 9C).
  31. Podłącz lewą kaniulę przedsionka do przewodu odpływowego i uruchom główną pompę perystaltyczną (rysunek 9D).

4. Perfuzja płuc ex vivo

  1. Szybko wyjmij przewód wentylacyjny z górnej części aparatu EVLP i przymocuj obudowę do czujników ciśnienia, a następnie włóż przewód wentylacyjny na górze obudowy na górze aparatu EVLP.
    UWAGA: Umożliwi to rejestrowanie danych wentylacji i monitorowanie ciśnienia.
  2. Upewnij się, że pułapka bąbelkowa jest wypełniona odpowiednią ilością perfuzatu, aby do płuc nie dostały się pęcherzyki powietrza (tj. zatory powietrzne).
  3. Powoli zmieniaj ustawienia wentylacji i perfuzji na żądane poziomy eksperymentalne w ciągu początkowych 15 minut. Dodatkowo, podczas tej początkowej fazy rozruchu, zwiększ szybkość przepływu perfuzji do pożądanej szybkości i/lub ciśnienia.
    UWAGA: Zaleca się zaprogramowanie respiratora tak, aby wytwarzał przerywane oddechy, które ułatwiają przepływ płynu z przestrzeni płuc, a tym samym opóźniają wystąpienie obrzęku. Mogą one być wytwarzane przez wentylatory wyposażone w funkcję westchnienia.
  4. Zdefiniuj "Czas 0" jako czas, w którym parametry wentylacji wynoszą 4 ml/kg, PEEP 2 O wynosi 2 cm, a parametry perfuzji osiągają oczekiwany poziom i pozostają stałe.
  5. W razie potrzeby należy pobrać próbki z portu próbki, błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i zanotować czas pobierania próbek.
  6. Po zakończeniu eksperymentu wyizolować wszelkie niezbędne fragmenty anatomiczne do pobrania i albo błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie, albo umieścić w roztworze utrwalającym do dalszych badań.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dane mechaniczne zebrane w czasie rzeczywistym za pomocą programu do akwizycji danych mogą być łatwo analizowane w celu przetestowania dowolnej liczby hipotez. Na przykład rysunek 10A pokazuje średnią masę płuc w ciągu 60 minut z 10 eksperymentów na szczurach, w których zwierzęta były wentylowane przy niskiej objętości oddechowej/niskim PEEP wynoszącym 4 ml / kg i 2 cmH2O. Chociaż w całym eksperymencie występuje bardzo niewielki wzrost masy płuc, wzrost ten nie jest statystycznie istotny (ANOVA, p = 0,92). Rycina 10B przedstawia średnie ciśnienie w tętnicy płucnej (PAP) przez 60 minut z 12 eksperymentów na szczurach. Dolny PAP w punkcie czasowym 0 min jest wynikiem niższych ustawień przepływu i wentylacji zastosowanych na początku wszystkich eksperymentów i PAP pozostaje stały po tym punkcie czasowym bez statystycznie istotnych zmian po t=10 min (ANOVA na rangach, p = 0,89). Rycina 10C pokazuje opór naczyniowy płuc (PVR) przez 60 minut z 12 eksperymentów na szczurach i chociaż występuje niewielki spadek PVR po t = 20 minutach, nie było statystycznie istotnej różnicy w PVR podczas tego eksperymentu (ANOVA na rangach, p = 0,65). W porównaniu z danymi PVR przedstawionymi tutaj, Noda i wsp. wykazał, że PVR nieznacznie wzrasta w czasie przez 4 godziny. Jednak autorzy ci podają dane w PVR począwszy od 1 godziny zamiast od początku eksperymentu i nie podano żadnych wartości odchylenia standardowego7. Noda i wsp. również nie pokazuje danych dotyczących obrzęku płuc dla 4-godzinnych eksperymentów, więc nie można dokonać porównania z danymi przedstawionymi tutaj na rysunku 10A. Główne różnice w Noda i wsp. procedura w porównaniu z tym, co pokazano w tej pracy, obejmują: 1-godzinną konserwację w zimnie w roztworze LPS przed EVLP, szczury początkowo wentylowano mieszaniną gazów zawierającą izofluran, aby pozbawić je przytomności, roztwór perfuzatu uzupełniono 50 mg metyloprednizolonu i 50 mg cefalosporyny, całkowity przepływ określono jako 20% obliczonej pojemności minutowej serca, Próbki perfuzatu pobrano dopiero po wentylacji płuc na 100%O2 przez 5 minut wcześniej, a eksperyment prowadzono przez 4 godziny.

Próbki pobrane podczas eksperymentu z perfuzatu mogą być również analizowane do wielu celów. Na przykład na rycinie 11 pokazujemy, jak duża objętość oddechowa/wentylacja o wysokim PEEP może wywołać reakcję prozapalną w ciągu 60 minut. W tych eksperymentach perfuzat od 4 szczurów wentylowanych w szkodliwych warunkach, tj. o dużej objętości oddechowej 10 ml / kg i wysokim PEEP 8 cmH2O, analizowano pod kątem cytokin pro- i przeciwzapalnych IL1β, TNFα i IL4 przy użyciu standardowych technik ELISA. Jak pokazano na rycinie 11, w porównaniu z poziomami cytokin przed wentylacją (0 min), 60 minut szkodliwej wentylacji spowodowało statystycznie istotny wzrost IL-1β i TNFα (cytokin prozapalnych) i brak zmiany stężenia IL-4 (cytokiny przeciwzapalnej). Dlatego ten system EVLP jest w stanie generować profile uszkodzeń płuc powszechnie obserwowane podczas wentylacji mechanicznej.

figure-results-1
Rysunek 1. Schemat i fotografia obwodu perfuzji płuc ex-vivo (EVLP) u małych zwierząt. Litery na schemacie pokrywają się z literami na zdjęciu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2. Wszystkie przetworniki są bezpiecznie podłączone do skrzynek sterowniczych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3. Stół operacyjny dla szczurów jest bezpiecznie ustawiony w pobliżu obwodu perfuzji płuc ex vivo (EVLP). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4. (A) Wykonuje się nacięcie czaszki w celu odsłonięcia tchawicy. Jama klatki piersiowej nie jest odsłonięta. (B) Jedwabny szew umieszcza się za tchawicą. (C) Tchawica jest częściowo przecinana w celu przygotowania do kaniulacji. (D) Kaniulę tchawicy umieszcza się na miejscu i zabezpiecza jedwabnym szwem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5. (A) Jama klatki piersiowej jest odciągnięta do tyłu, aby umożliwić dostęp do serca i płuc. (B) Przygotowanie do założenia szwu za tętnicą płucną. (C) Tętnica płucna jest kaniulowana i wiązana wcześniej założonym szwem jedwabnym. (D) Roztwór elektrolitu o niskiej zawartości K+ jest przepłukiwany przez tętnicę płucną i przez lewe przedsionki w celu usunięcia wszelkich skrzepów krwi. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6. Zwiększenie przepływu w tętnicy płucnej podczas płukania płuc może spowodować dramatyczny wzrost ciśnienia w tętnicy płucnej. Jeśli kaniulacja została wykonana prawidłowo i nie ma większej blokady, ciśnienie powinno się zmniejszyć. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7. Jedwabny szew zakłada się wokół całego serca w ramach przygotowań do kaniulacji lewego przedsionka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 8. Lewa kaniula przedsionka jest zabezpieczona na miejscu za pomocą jedwabnego szwu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-9
Rysunek 9. (A) Kaniula tętnicy płucnej jest połączona z obwodem perfuzji płuc ex-vivo. (B) Przełyk jest zaciśnięty, a tkanka łączna jest tępo wycinana w celu usunięcia bloku płuco-serce. (C) Blok płuco-serce usuwa się z jamy klatki piersiowej i umieszcza w obwodzie perfuzji płuc ex-vivo. (D) Lewy przedsionek jest połączony z obwodem perfuzji płuc ex-vivo. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-10
Rysunek 10. (A) Masa płuc samców szczurów Sprague Dawley przez 60 minut perfuzji płuc ex vivo (n = 10). (B) Ciśnienie tętnicze w płucach samców szczurów Sprague Dawley przez 60 minut perfuzji płuc ex vivo (n = 12). (C) Opór naczyniowy płuc samców szczurów Sprague Dawley przez 60 minut perfuzji płuc ex vivo (n = 12), N.S. nie wskazuje na statystycznie istotną różnicę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-11
Rysunek 11. Wpływ 1-godzinnej wentylacji przy dużych objętościach oddechowych (10 ml/kg) i wysokim PEEP (8 cmH2O) na stężenia cytokin pro- i przeciwzapalnych w perfuzacie. n=4, * oznacza statystycznie istotną różnicę w odniesieniu do próby 0 H (p < 0,05). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-12
Rysunek 12. (A) Prawidłowo wentylowane i ukrwiające płuco podłączone do obwodu EVLP. (B) Wysokie dodatnie ciśnienie końcowo-wydechowe (PEEP) powoduje rozdarcie rozwidlenia tchawicy, powodując tworzenie się pęcherzyków w miejscu urazu i wypełnianie sztucznej klatki piersiowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-13
Rysunek 13. (A) Kaniula tętnicy płucnej. Ta kaniula jest mniejsza niż lewa kaniula przedsionka. (B) Kaniula lewego przedsionka. Ta kaniula jest znacznie większa niż kaniula tętnicy płucnej. (C) Kaniula tchawicy. Ta kaniula ma żebra, które pomagają w zabezpieczeniu tchawicy za pomocą jedwabnego szwu. Koniec, który jest wkładany do tchawicy, jest również lekko spiczasty, aby pomóc we wprowadzeniu kaniuli do tchawicy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-14
Rysunek 14. (A) Wierzchołek serca jest przytrzymywany przez parę kleszczy, gdy prawa komora ma zostać nacięta w celu kaniulacji tętnicy płucnej. (B) Rozszerzenie pierścienia zastawki mitralnej za pomocą pary małych tępo zakończonych podbieraczy ułatwia wizualizację drogi do lewego przedsionka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MONITOROWANIE SYSTEMU

Jak to wygląda, gdy eksperyment przebiega prawidłowo:

Po umieszczeniu kaniul w obwodzie i wentylacji płuc istnieje wiele sposobów na zapewnienie prawidłowego działania systemu. W całej linii nie powinno być żadnych wycieków perfuzatu. Opór naczyniowy płuc (PVR) powinien pozostać względnie stały (przy założeniu stałego przepływu). Wymiana tlenu powinna wzrosnąć, gdy respirator będzie działał prawidłowo i rozszerzał płuca, aby rekrutować więcej pęcherzyków płucnych do wymiany gazowej. Rycina 12A przedstawia prawidłowo wentylowane i ukrwione płuca podłączone do obwodu EVLP wewnątrz sztucznej klatki piersiowej.

Jak to wygląda, gdy eksperyment nie działa dobrze:

Istnieje kilka typowych problemów, które występowały najczęściej na początkowych etapach eksperymentu EVLP. Pierwszym i najłatwiejszym do naprawienia jest nieszczelność w przewodzie wychodzącym z płuc. Jest to zauważalne przez kałużę perfuzatu gromadzącą się pod częścią obwodu i stale obniżający się poziom w zbiorniku. Sprawdź i dokręć wszystkie złącza rurek wokół obszaru rozlania i sprawdź, czy sama rurka nie jest szczelna. Jeśli ten wyciek nastąpi przed płucem, może również wprowadzić pęcherzyki do płuca. Należy temu zaradzić tak szybko, jak to możliwe, ponieważ pęcherzyki powietrza w perfuzacie spowodują uszkodzenie tkanek i znaczny wzrost PVR. Może również dojść do wycieku z płuc lub jednej z kaniuli. Może to być spowodowane poślizgiem kaniuli lub przeszkodą w przewodzie wyjściowym powodującą wzrost ciśnienia. Sprawdź położenie obu kaniul, aby upewnić się, że żadna z nich nie ześlizgnęła się ani nie skręciła. Ciśnienie PA powinno być również monitorowane podczas tego procesu, ponieważ natychmiastowy wzrost ciśnienia PA jest oczywistym znakiem, że niedawno wystąpiła jakaś przeszkoda. Rycina 12B przedstawia pęknięte płuco, które pękło z powodu wysokiego ciśnienia. Wyciek z samego płuca może być również spowodowany rozdarciem tkanki. Ten problem może, ale nie musi być naprawialny, ale zmiana położenia i ponowne dokręcenie kaniul jest najlepszą opcją w tym scenariuszu.

Kluczowe punkty/możliwości, do których należy się uczyć:

Opracowanie metodą prób i błędów systemu perfuzji płuc ex-vivo pozwoliło nam zidentyfikować kilka kluczowych problemów, które tutaj przedstawiamy, aby ułatwić sprawne wdrożenie systemu EVLP. Po pierwsze, w odniesieniu do pobierania, ważne jest, aby przestrzegać standardowych technik znieczulenia w celu prawidłowego znieczulenia zwierząt (wystarczająca ilość znieczulenia, wstrzyknięcie do otrzewnej) i wymagane jest przestrzeganie wszystkich zasad IACUC. Kaniule (pokazane na rysunku 13 A, B i C) powinny być wielokrotnie płukane w celu usunięcia wszelkich skrzepów i/lub zanieczyszczeń w obrębie układu naczyniowego płuc. Jeśli chodzi o dobór zwierząt, sugerujemy użycie szczurów Sprague Dawley lub Lewis o wadze 250–350 g. Należy zachować szczególną ostrożność podczas kaniulacji szczurów o wadze blisko 250 g, ponieważ naczynia będą mniejsze, a zatem znacznie trudniejsze do kaniulacji bez uszkodzenia naczyń krwionośnych. Jeśli ma być użyty mniejszy szczur lub model myszy, może być konieczne użycie mniejszej kaniuli.

Kaniulacja tchawicy zazwyczaj nie jest trudna, o ile szew jest odpowiednio zabezpieczony, najpierw przesuwając jedwabny szew z tyłu tchawicy po wypreparowaniu otaczającej powięzi, a przed kaniulacją. Następnie wykonaj przednie nacięcie 1-2 pierścienie tchawicy nad szwem, aby przejść przez kaniulę. Zawiąż kwadratowe węzły między pierścieniami tchawicy, aby zabezpieczyć je w rowku dla lepszego bezpieczeństwa (Rysunek 4C). Kaniulacja tętnicy płucnej (PA) jest trudniejsza w porównaniu z kaniulą tchawiczą. W tym badaniu zastosowano następujące kroki dla tej procedury. Najpierw chwyć wierzchołek serca parą kleszczy. Przełóż kolejną parę kleszczyków w zatoce poprzecznej i nawlecz szew, aby zabezpieczyć kaniulę w bliższym PA. Naciąć prawą komorę bezpośrednio przed drogą odpływu prawej komory (RVOT) (ryc. 14A). Po wcięciu w RVOT kaniula zostanie skierowana w stronę drogi odpływu z tętnicy płucnej. Założenie szwu za tętnicą płucną/aortą przed prawą wentrikulotomią zwiększa skuteczność (ryc. 5C). Kaniula powinna być przymocowana na miejscu za pomocą szwu, aby zapobiec przemieszczeniu. Poważna komplikacja może wystąpić, jeśli kaniula PA nie jest w prawidłowej orientacji anatomicznej. Kaniula może być wprowadzona zbyt głęboko i ulegać perfuzji tylko jednej gałęzi lub ulec zniekształceniu w wyniku skręcenia próbki płucoserca po wyjęciu z jamy klatki piersiowej. Można go łatwo ustawić z powrotem do pierwotnej pozycji, aby zachować właściwy kąt pozycji anatomicznej. Wreszcie, kaniulacja lewego przedsionka (LA) jest najtrudniejszą częścią procedury. Kaniulę LA należy umieścić w lewym przedsionku. Ponieważ tkanki są niezwykle kruche, należy pamiętać, aby nie używać znacznej siły ani skręcania, aby zapobiec rozdarciu w żyle płucnej i lewym przedsionku, co sprawiłoby, że eksperyment byłby nie do uratowania. Kaniulę PA najlepiej umieścić przed kaniulą LA. Wykazano, że lewa komora brzuszna z usunięciem wierzchołka przerywa ścięgna kordowe i umożliwia łatwiejszy dostęp przez płatki mitralne. Ponadto wentrikulotomia ułatwia rozszerzenie i wizualizację zastawki mitralnej oraz wprowadzenie kaniuli przez zastawkę mitralną. Rozszerzenie pierścienia zastawki mitralnej za pomocą pary małych tępo zakończonych pick-upów można wykonać w celu uwidocznienia przewodu do LA (ryc. 14B). Szew należy założyć za sercem przed kaniulacją. Można to zrobić po prostu podnosząc serce do góry za pomocą pary małych tępo zakończonych pick-upów i umieszczając szew pod spodem i w poprzek serca. LA jest teraz gotowy do kaniulacji. Przeprowadź kaniulę LA przez pick-upy, aby prawidłowo zobrazować umieszczenie kaniuli w lewym przedsionku. Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie przesunąć kaniuli z powrotem do lewej komory. Szew powinien być następnie szczelnie zamocowany wzdłuż mięśnia sercowego lewej komory. Przymocowanie szwu do lewego przedsionka może zatkać całą kaniulę lub jej część.

Podczas zabiegu ważne jest, aby w części nawiewnej aparatu nie pozostało żadne powietrze. Każde znaczące powietrze może wytworzyć zator powietrzny, zwiększyć PVR (w rzeczywistości "śluzę powietrzną"), co spowoduje znacznie niższy przepływ perfuzatu przy danym ciśnieniu. Do usuwania powietrza z systemu można użyć różnych punktów. Powietrze w sekcji odpływowej jest oczekiwane i nie powinno mieć żadnego szkodliwego wpływu na płuca. Wykazano, że świński model nadciśnienia płucnego odtwarza patologię z ciągłych niewielkich ilości powietrza przez okres 8 tygodni. Zwiększone powietrze zmniejsza ilość obecnej perfuzji, powodując jednocześnie stan zapalny otaczających tkanek 19.

Inicjacja perfuzji może nastąpić po zakończeniu kaniulacji, ale przed podłączeniem rurki pochodzącej z LA do linii EVLP. Perfuzat powinien być przepuszczony, aby usunąć wszelkie skrzepy krwi, a perfuzat ten może bez problemu opróżnić się do ściany klatki piersiowej. Przełączenie pompy perfuzatu w tryb ręczny i powolne zwiększanie natężenia przepływu do ~2 ml/min pozwala na ścisłe monitorowanie ciśnienia PA. Ciśnienie powyżej 20-30 cmH2O może wskazywać na przeszkodę, a obserwowanie perfuzatu wydostającego się z LA jest również wskaźnikiem, ale może to być bardzo trudne do zauważenia. Jeśli ciśnienie wzrośnie do ponad 20-30 cmH2O, zatrzymaj pompę i ponownie sprawdź obie kaniulacje. Gdy ciśnienie osiągnie stałe około 10-20 cmH2O, pozwól perfuzatowi przepływać przez i do jamy klatki piersiowej przez 2 minuty. W tym czasie linia z LA może być podłączona do obwodu EVLP. Prędkość pompy perfuzatu można zwiększyć do 5-10 ml/min. W miarę jak głowica płynu przechodzi przez obwód, nastąpi wzrost ciśnienia PA ze względu na wzrost wysokości głowicy płynu, a tym samym ciśnienia statycznego. Jeśli płyn nie może przepłynąć przez najwyższy punkt linii, może być konieczne przyłożenie siły ssącej na przeciwległym końcu linii lub próba obniżenia najwyższej części linii. Gdy ten problem zostanie rozwiązany, perfuzat powinien krążyć bez żadnych problemów.

Należy monitorować kilka kwestii związanych z respiratorem. Po pierwsze, może dojść do skręcenia oskrzeli/tchawicy i położenia płuco-serce, gdy płuca stają się bardziej obrzęknięte, a waga wzrasta. Ważne jest, aby kaniule pozostawały w stosunkowo bliskiej pozycji anatomicznej, dlatego może być konieczna zmiana jednej lub obu kaniuli. Z tym systemem EVLP można stosować wentylatory z regulacją ciśnienia lub objętości, a także wentylację dodatnią lub ujemną. W przypadku modelu szczurzego odkryliśmy, że przy użyciu nadciśnienia wentylacja o kontrolowanej objętości działa dobrze przy objętościach oddechowych w zakresie 4-10 ml / kg i przy dodatnim ciśnieniu końcowo-wydechowym (PEEP) w zakresie 2-8 cmH2O. Jednak PEEP wynoszący 8 cmH2O może spowodować możliwe pęknięcie przy rozwidleniu tchawicy. Po każdym eksperymencie (lub zestawie doświadczeń, jeśli są wykonywane jeden po drugim), przewód wentylacyjny prowadzący do tchawicy powinien zostać oczyszczony z płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL), który mógł przemieszczać się w górę tchawicy. Płyn ten stwardnieje, jeśli pozostanie nietknięty i może całkowicie zablokować przewód wentylacyjny.

Kompozycja perfuzacyjna ma kluczowe znaczenie dla udanego eksperymentu EVLP. Mieszanina 5% dekstranu pozwala na perfuzję płuc zbliżoną do warunków fizjologicznych, utrzymuje stabilne ciśnienie onkotyczne, aby skierować płyn z powrotem do naczyń krwionośnych, aby zapobiec obrzękowi i zapobiega zakrzepicy w naczyniach płucnych. Ważne jest, aby pamiętać, że niektóre gatunki szczurów mogą być uczulone na dekstran, który może powodować obrzęk płuc20. Zawartość perfuzatu była spójna we wszystkich grupach eksperymentalnych w tym badaniu, dlatego zawartość dekstranu nie powinna być czynnikiem zakłócającym. Ciśnienie onkotyczne jest krytyczną zmienną, która może poprawić lub wywołać obrzęk tkanek. W tym systemie zastosowano dostępne na rynku roztwory perfuzyjne, które są zoptymalizowane pod kątem przechowywania statycznego w niskiej temperaturze lub perfuzji normotermicznych, aby wydłużyć czas żywotności płuc. Zauważamy, że niektóre z tych roztworów zawierają albuminę, a jednym z problemów jest możliwość wywołania przez albuminę bydlęcą reakcji zapalnej w płucach gryzoni. Chociaż optymalny skład perfuzatu jest przedmiotem ciągłych badań, perfuzat musi uwzględniać ciśnienie onkotyczne, ciśnienie osmotyczne i zdolność buforową. Zalecamy, aby roztwór był oparty na zmodyfikowanym roztworze Krebsa-Henseleita lub pożywce do hodowli komórkowych. Ciśnienie onkotyczne powinno być utrzymywane przez dekstran lub albuminę, w zależności od zastosowania. Ciśnienie perfuzji i natężenie przepływu wpływają na narząd, a suprafizjologiczne parametry perfuzji mogą sprawić, że narząd będzie podatny na urazy mechaniczne.

Wskaźniki wizualne podczas eksperymentu:

Istnieje wiele wskazówek wizualnych, a także wskazówek z danych w czasie rzeczywistym, które można wykorzystać do określenia, czy eksperyment EVLP przebiega prawidłowo. Płuco pozostanie tej samej wielkości i opróżni się do tej samej objętości po każdym oddechu. Nie będzie również wycieku z samego płuca. PVR, masa płuc i podatność pozostaną względnie stałe. Produkcja tlenu pozostanie stała lub nieznacznie wzrośnie.

Istnieje wiele wizualnych wskaźników, kiedy płuco zostaje naruszone podczas eksperymentu. Płuca stają się obrzęknięte i szybko rosną pod względem wielkości i wagi. Zmienia się kolor płuc (od jasnobrązowego do białego), a w tkance można zidentyfikować kieszenie płynu. Jeśli tchawica lub płuco pęknie w wyniku barotraumy lub nadmiernego rozdęcia, od miejsca urazu będzie bulgotać (ryc. 12B). Produkcja tlenu zmniejszy się, a PVR i zgodność również znacznie wzrosną.

Potencjał wykorzystania modelu EVLP na małych zwierzętach, takich jak gryzonie, otwiera drzwi do przyszłych badań poprawiających leczenie przeszczepów płuc. Jednak model małego zwierzęcia wymaga lepszego zrozumienia, aby naprawdę naśladować przeszczep płuc. Model ten może być wykorzystany w przyszłości do ulepszenia metod leczenia i określenia parametrów wyjściowych dla przyszłych badań nad przeszczepami płuc.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować za pomoc Harvard Apparatus, szczególnie Stephanie Pazniokas, MS (Physiology Systems & Regenerative Medicine) za pomoc w montażu, modyfikacji i rozwiązywaniu problemów obwodu perfuzji oraz XVIVO Perfusion (Daniel Martinelli, CCP, CTP) za zapewnienie nieklinicznego zastosowania plegii płucnej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
IPL-2 Podstawowy system perfuzji płucPęseta do aparatów
#5 ze stali nierdzewnej, zakrzywiona 11  cmKent Scientific CorporationIND500232
Pęseta #5 Dumostar, 11  cmKent Scientific CorporationINS500085-Pęseta A
#7 Tytan, 12  cm zakrzywione końcówkiKent Scientific CorporationINS600187
Nożyczki McPherson-Vannas 8  cm, Str 5  mmKent Scientific CorporationINS14124
Nożyczki Vannas 8  cm Str 5  mmKent Scientific CorporationINS14003
Taca do sterylizacji instrumentów 5 "x 7"Kent Scientific CorporationINS800101
Heparyna 30 000 jednostek na 30 mlAPP Farmaceutykidostarczane z OSU Pharmacy
Ketamina 500  mg na 5  mlJHP PharmaceuticalsDostarczane z OSU Pharmacy
Ksylazyna 100  mg na 1  mlAkornDostarczane z Apteki
10  Strzykawka insulinowa CC 29  Igła G x 1/2"B-D309301
Hyflex NBRAnsellS-17310MRękawice odporne na gryzienie
BL1500SartariusPractum 1102-1SScale
Duży płaski dno OgranicznikBraintree Scientific IncFB L 3,375 fi x 8,5, 250-500gm rat Tunel dla szczurów do wstrzykiwań
Bezpudrowe rękawice egzaminacyjne Sterling nitryl, dużeKiberly-Clark50708
Rapidpoint 405Analizator parametrów krytycznychSiemens
Fiberoxygenator D150Hugo Sachs ElektronikPY2 73-3762
LabChart v7.3.7ADInstruments
Kaniula tchawicyAparat Harvard733557
Płucny Kaniula tętniczaAparat Harvard730710
Kaniula lewego przedsionkaAparat Harvard730712
Pompa perystaltyczna IsmatecISM 827B
Wentylator dla małych zwierząt model 683Aparatura Harvarda55-000
Ecoline Star Edition 003, E100LaudaLCK 1879
Kaseta wężyCole-ParmerIS 0649
Zestaw połączeniowy D150Cole-ParmerVK 73-3763
PowerLab 8/35ADInstruments730045
Moduł wzmacniacza przetwornika TAM-A typ 705/1Hugo Sachs - Harvard Apparatus73-0065
Wzmacniacz przetwornika TAM-D typ 705/2Hugo Sachs - Aparat Harvarda73-1793
SCP Servokontroler do perfuzji typu 704Hugo Sachs - Aparatura Harvarda732806
Wzmacniacz mostka częstotliwości nośnej CFBA typ 672Hugo Sachs - Aparatura Harvarda
Moduł sterujący wentylatora VCM typ 681Hugo Sachs - Aparatura Harvarda731741
Moduł sterowania czasem TCM typ 686Hugo Sachs - Aparatura Harvarda731750
IL2 Zestaw rurek do perfuzacjiAparat Harvard733842
Zestaw rurek do komory wilgotnejAparat Harvard73V83157
Tygon E-3603 Rurka 2.4  mm IDHarvard Apparatus721017linia perfuzacyjna wchodząca do płuc
Tygon E-3603 Rurka 3.2  mm IDAparat Harvard 721019linię perfuzyjną opuszczającą płuca
roztwór glukozyktóry przepłukuje płuca
HarvardOSU podgrzewacza wody 731747 o niskim poziomie dekstranu potasu,

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. United States Organ Transplantation, Organ Procurement and Transplantation Network & Scientific Registry for Transplant Recipients Annual Report 2011. , Available from: http://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2011 (2011).
  2. Maathuis, M. H., Leuvenink, H. G., Ploeg, R. J. Perspectives in organ preservation. Transplantation. 83, 1289-1298 (2007).
  3. Cardoso, P. F. New perspectives in lung transplantation: from conventional preservation to ex vivo lung perfusion and lung reconditioning. Jornal brasileiro de pneumologia : publicacao oficial da Sociedade Brasileira de Pneumologia e Tisilogia. 35, 1057-1059 (2009).
  4. DeCampos, K. N., Keshavjee, S., Liu, M., Slutsky, A. S. Optimal inflation volume for hypothermic preservation of rat lungs. The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 17, 599-607 (1998).
  5. Perrot, M., et al. Report of the ISHLT Working Group on Primary Lung Graft Dysfunction part III: donor-related risk factors and markers. The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 24, 1460-1467 (2005).
  6. Mulloy, D. P., et al. Ex vivo rehabilitation of non-heart-beating donor lungs in preclinical porcine model: delayed perfusion results in superior lung function. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 144, 1208-1215 (2012).
  7. Noda, K., et al. Successful prolonged ex vivo lung perfusion for graft preservation in rats. European journal of cardio-thoracic surgery : official journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 45, e54-e60 (2014).
  8. Perrot, M., Liu, M., Waddell, T. K., Keshavjee, S. Ischemia-reperfusion-induced lung injury. American journal of respiratory and critical care medicine. 167, 490-511 (2003).
  9. Steen, S., et al. Transplantation of lungs from a non-heart-beating donor. The Lancet. 357, 825-829 (2001).
  10. Perrot, M., et al. Strategies to optimize the use of currently available lung donors. The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 23, 1127-1134 (2004).
  11. Cypel, M., et al. Technique for prolonged normothermic ex vivo lung perfusion. The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 27, 1319-1325 (2008).
  12. Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo perfusion prevents lung injury compared to extended cold preservation for transplantation. American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 9, 2262-2269 (2009).
  13. Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation. The New England journal of medicine. 364, 1431-1440 (2011).
  14. Cypel, M., et al. Normothermic Human Ex Vivo Lung Perfusion (EVLP) for Improved Assessment of Extended Criteria Donor Lungs for Transplantation. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 28, S126-S126 (2009).
  15. Sanchez, P. G., et al. Normothermic Ex Vivo Lung Perfusion as an Assessment of. Marginal Donor Lungs - The NOVEL Lung Trial. J Heart Lung Transpl. 32, S16-S17 (2013).
  16. Pego-Fernandes, P. M., et al. Experimental model of isolated lung perfusion in rats: first Brazilian experience using the IL-2 isolated perfused rat or guinea pig lung system. Transplantation proceedings. 42, 444-447 (2010).
  17. Pego-Fernandes, P. M., et al. Experimental model of isolated lung perfusion in rats: technique and application in lung preservation studies. Jornal brasileiro de pneumologia : publicacao oficial da Sociedade Brasileira de Pneumologia e Tisilogia. 36, 490-493 (2010).
  18. Niemeier, R. W. The isolated perfused lung. Environmental health perspectives. 56, 35-41 (1984).
  19. Zhou, X., et al. A pulmonary hypertension model induced by continuous pulmonary air embolization. The Journal of surgical research. 170, e11-e16 (2011).
  20. Harris, J. M. Differences in responses between rat strains and colonies. Food and cosmetics toxicology. 3, 199-202 (1965).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model EVLP u szczur wkaniulacja t tnicy p ucnejkaniulacja lewego przedsionkawentylacja mechanicznaroztw r Perfuse Eightczujniki ci nieniaprzetworniki masyanalizator gazometrii krwiuszkodzenie p uc indukowane wentylacj

Powiązane artykuły